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Medicine

Ein epitheliales Abriebmodell zur Untersuchung der Hornhautwundheilung

Published: December 29, 2021 doi: 10.3791/63112
Automatic Translation
1, 1, 2, 2,3, 1,2
1College of Optometry, University of Houston, 2Children’s Nutrition Research Center, Baylor College of Medicine, 3Center for Translational Research on Inflammatory Diseases (CTRID), Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center

Summary

Hier wird ein Protokoll zur Erzeugung einer zentralen Hornhautepithelabriebwicklung in der Maus mit einem Trephin und einem stumpfen Golfschläger-Spud beschrieben. Dieses Hornhautwundheilungsmodell ist hochgradig reproduzierbar und wird nun verwendet, um eine kompromittierte Hornhautwundheilung im Zusammenhang mit Krankheiten zu bewerten.

Abstract

Die Hornhaut ist entscheidend für das Sehen und macht etwa zwei Drittel der Brechkraft des Auges aus. Entscheidend für die Rolle der Hornhaut im Sehvermögen ist ihre Transparenz. Aufgrund ihrer äußeren Position ist die Hornhaut jedoch sehr anfällig für eine Vielzahl von Verletzungen, die zum Verlust der Hornhauttransparenz und schließlich zur Erblindung führen können. Eine effiziente Hornhautwundheilung als Reaktion auf diese Verletzungen ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Hornhauthomöostase und die Erhaltung der Hornhauttransparenz und der Brechungsfähigkeiten. Bei kompromittierter Hornhautwundheilung wird die Hornhaut anfällig für Infektionen, Ulzerationen und Narbenbildung. Angesichts der grundlegenden Bedeutung der Hornhautwundheilung für die Erhaltung der Transparenz und des Sehvermögens der Hornhaut ist ein besseres Verständnis des normalen Hornhautwundheilungsprozesses eine Voraussetzung für das Verständnis der mit Infektionen und Krankheiten verbundenen beeinträchtigten Hornhautwundheilung. Um dieses Ziel zu erreichen, haben sich murine Modelle der Hornhautwunde als nützlich erwiesen, um unser Verständnis der Hornhautwundheilungsmechanismen unter normalen physiologischen Bedingungen zu verbessern. Hier wird ein Protokoll zur Erzeugung eines zentralen Hornhautepithelabriebs bei der Maus mit einem Trephin und einem stumpfen Golfschläger-Spud beschrieben. In diesem Modell wird ein kreisförmiges Trephin mit einem Durchmesser von 2 mm, zentriert über der Hornhaut, verwendet, um den Wundbereich abzugrenzen. Der Golfschläger-Spud wird mit Vorsicht verwendet, um das Epithel zu debriden und eine kreisförmige Wunde zu erzeugen, ohne die Hornhautepithel-Basalmembran zu beschädigen. Die resultierende Entzündungsreaktion verläuft als eine gut charakterisierte Kaskade von zellulären und molekularen Ereignissen, die für eine effiziente Wundheilung entscheidend sind. Dieses einfache Hornhautwundheilungsmodell ist hochgradig reproduzierbar und gut veröffentlicht und wird nun verwendet, um eine kompromittierte Hornhautwundheilung im Zusammenhang mit Krankheiten zu bewerten.

Introduction

Die Hornhaut ist das transparente vordere Drittel des Auges. Die Hornhaut erfüllt mehrere Funktionen, einschließlich des Schutzes der inneren Strukturen des Auges und der Bildung einer strukturellen Barriere, die das Auge vor Infektionen schützt1. Noch wichtiger ist, dass die Hornhaut für das Sehen entscheidend ist und etwa zwei Drittel der Brechkraft des Auges liefert 2,3. Entscheidend für die Rolle der Hornhaut im Sehvermögen ist ihre Transparenz. Aufgrund ihrer äußeren Position ist die Hornhaut jedoch täglich einer Vielzahl von Verletzungen ausgesetzt, die zu einer Störung ihrer Barrierefunktion, einem Verlust der Transparenz und schließlich zur Erblindung führen können. Der Verlust der Transparenz der Hornhaut ist weltweit eine der Hauptursachen für Sehstörungen 4,5. Hornhautabschürfungen sind ein häufiger Grund für Besuche in der Notaufnahme (ER) und machen die Hälfte der augenbezogenen Fälle aus, die in der Notaufnahme6 vorgestellt wurden. Es wird geschätzt, dass in den Vereinigten Staaten jährlich über 1 Million Menschen an Augenverletzungen leiden7. Eine effiziente Hornhautwundheilung als Reaktion auf diese Verletzungen ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Hornhauthomöostase und die Erhaltung ihrer Transparenz und Brechungsfähigkeiten. Bei kompromittierter Hornhautwundheilung wird die Hornhaut anfällig für Infektionen, Ulzerationen und Narbenbildung 8,9. Auch die zunehmende Beliebtheit von refraktiven Operationen stellt eine einzigartige traumatische Herausforderung an die Hornhaut10 dar. Angesichts der grundlegenden Bedeutung der Hornhautwundheilung für die Erhaltung der Transparenz und des Sehvermögens der Hornhaut ist ein besseres Verständnis des normalen Hornhautwundheilungsprozesses eine Voraussetzung für das Verständnis der mit Infektionen und Krankheiten verbundenen beeinträchtigten Hornhautwundheilung.

Zu diesem Zweck wurden mehrere Tiermodelle der Hornhautwundheilung entwickelt 11,12,13,14,15. Murine Modelle der Hornhautwundheilung haben sich als nützlich erwiesen, um unser Verständnis der Hornhautwundheilungsmechanismen unter normalen physiologischen Bedingungen zu verbessern. Verschiedene Arten von Hornhautwunden wurden bei der Untersuchung der Hornhautwundheilung eingesetzt, die jeweils für die Untersuchung verschiedener Aspekte des Wundheilungsprozesses geeignet sind. Die häufigsten Arten von Wundmodellen, die in Hornhautwundheilungsstudien verwendet werden, sind die mechanischen und chemischen Wundmodelle. Chemische Hornhautwunden, die meist die Entstehung von alkalischen Verbrennungen an der Hornhaut beinhalten, sind nützlich für die Untersuchung von Hornhautgeschwüren, Trübung und Neovaskularisation13. Mechanische Hornhautwunden betreffen Debridement (Abrieb) Wunden und Keratektomiewunden14,15,16. Eine intakte oder gebrochene Hornhautepithel-Basalmembran definiert Debridement- bzw. Keratektomie-Wunden. Bei Debridementwunden bleibt die epitheliale Basalmembran intakt, während bei Keratektomiewunden die Basalmembran mit Penetration meist in das vordere Stroma durchbrochen wird. Debridement-Wunden sind am nützlichsten für die Untersuchung der Re-Epithelisierung, der Epithelzellproliferation, der Immunantwort und der Nervenregeneration nach Hornhautwunden. Keratektomie-Wunden hingegen sind am nützlichsten für die Untersuchung der Hornhautnarben14,15.

Hier wird ein Protokoll zur Erzeugung einer zentralen Hornhautepithelabriebwicklung in der Maus mit einem Trephin und einem stumpfen Golfschläger-Spud beschrieben. Dieses einfache Hornhautwundheilungsmodell ist hochgradig reproduzierbar und gut publiziert und wird nun verwendet, um eine kompromittierte Hornhautwundheilung im Zusammenhang mit Krankheit17 zu bewerten.

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Protocol

Alle Tierprotokolle wurden von den Institutional Animal Care and Use Committees an der University of Houston und dem Baylor College of Medicine genehmigt. Die in der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) zur Verwendung von Tieren in der Seh- und Augenforschung dargelegten Richtlinien wurden bei der Handhabung und Verwendung der Mäuse befolgt.

1. Vorbereitung

  1. Herstellung von Fluoresceinlösung
    1. Bereiten Sie 1% ige Fluoresceinlösung vor, indem Sie 10 mg Natriumfluoresceinsalz in 1 ml steriler Kochsalzlösung oder steriler 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auflösen.
      HINWEIS: Bereiten Sie Natriumfluoresceinlösung am Tag der Anwendung oder einen Tag vorher vor, um eine mikrobielle Kontamination zu vermeiden. Wenn sie einen Tag vor der Anwendung zubereitet wird, lagern Sie die Fluoresceinlösung bei 4 °C lichtgeschützt. Umwickeln Sie Rohre mit Aluminiumfolie, um Fotobleichen zu verhindern.
    2. Teilen Sie die Lösung in Aliquots auf, die für die Verwendung in einem einzigen Experiment geeignet sind. Pro Maus und Zeitpunkt werden 1-1,5 μL Fluoresceinlösung verwendet. Verwenden Sie die folgende Formel, um das Volumen von Aliquot zu berechnen, das für ein einzelnes Experiment geeignet ist:
      Equation 1
      HINWEIS: Wenn beispielsweise sechs Mäuse in einem einzigen Experiment untersucht werden, bei dem die Wundgröße zu fünf Zeitpunkten überwacht wird, wäre das für dieses einzelne Experiment geeignete Aliquot-Volumen:
      Equation 2
  2. Zubereitung von Ketamin / Xylazin Cocktail für die Anästhesie von Mäusen.
    1. Um 10 ml Cocktail zuzubereiten, mischen Sie 2,0 ml Ketamin (100 mg / ml) mit 1,0 ml Xylazin (20 mg / ml) und fügen Sie 7,0 ml steriles PBS hinzu. Bereiten Sie einen Tag vor oder am Tag der Operation einen Ketamin / Xylazin-Cocktail zu.
      HINWEIS: Alle Lösungen sollten bei Raumtemperatur verwendet werden, sofern nicht anders angegeben.

2. Anästhesie

  1. Wiegen Sie die Maus (8-12 Wochen alte C57BL / 6-Wildtyp-Mäuse), um die geeignete Menge an Anästhetikum zu bestimmen. Verwenden Sie die zweihändige Maus-Rückhaltetechnik, um Mäuse für die Injektion des Anästhetikums zurückzuhalten und zu handhaben18. Verabreichen Sie den Ketamin/Xylazin-Cocktail intraperitoneal (i.p.) in einer Endkonzentration von 80 mg/kg Ketamin und 8 mg/kg Xylazin.
  2. Warten Sie, bis eine Vollnarkose erreicht ist, bevor Sie eine Hornhautverletzung an der Maus durchführen. Bewerten Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie den Pedalreflex nach dem Einklemmen der Zehen beurteilen. Wenn eine angemessene Anästhesie erreicht ist, sollte sich die Maus nicht auf Zehenspitzen bewegen.
    HINWEIS: Da Mäuse während der Anästhesie schnell Körperwärme verlieren, ist es wichtig, eine Wärmequelle für Mäuse bereitzustellen, um Unterkühlung zu verhindern. Legen Sie Mäuse während der Anästhesie- und Erholungsphasen auf eine Wärmequelle (Heizkissen).

3. Entstehung einer Hornhautwunde

  1. Wunde nur das rechte oder linke Auge. Bewahren Sie die Konsistenz mit dem Auge (d. H. Links oder Rechts), das beim Wechsel von Maus zu Maus verwundet ist.
    HINWEIS: Da Abschürfungen die Hornhautnerven schädigen und die Sehschärfe verringern, kann das Verwunden beider Augen zu erheblichen Beschwerden und Beeinträchtigungen führen. Da Analgetika das Potenzial haben, Entzündungsreaktionen zu unterdrücken, kann ihre Verwendung in bestimmten Experimenten, die darauf abzielen, Hornhautentzündungen zu verstehen, ein Hindernis sein. Die Vermeidung von Analgetika in Hornhautwundexperimenten wurde von unserem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt.
  2. Um die Epithelhornhautwunde zu erzeugen
    1. Verwenden Sie unter einem Seziermikroskop das Trephin mit einem Durchmesser von 2 mm (siehe Abbildung 1), um die Mitte der Hornhaut abzugrenzen, und halten Sie das Auge mit Daumen und Zeigefinger weit geöffnet, um die Augenlider zu halten. Drehen Sie das Trephin vorsichtig, um einen Eindruck auf das Hornhautepithel zu machen.
      HINWEIS: Es muss darauf geachtet werden, dass bei der Verwendung von Trephin kein übermäßiger Druck ausgeübt wird, da dies zu einer Perforation der Hornhaut führen kann. Außerdem muss darauf geachtet werden, das Trephin zentral zu positionieren. Die Schüler können als Wahrzeichen genutzt werden, um das Zentrum der Hornhaut zu lokalisieren.
    2. Halten Sie unter einem Seziermikroskop den stumpfen Golfschläger-Spud (siehe Abbildung 1) auf etwa 45° von der Oberfläche der Hornhaut innerhalb des mit dem Trephin abgegrenzten Bereichs. Kratzen Sie vorsichtig und kontinuierlich das Epithel innerhalb des abgegrenzten Bereichs mit dem Spud, um das Epithel zu debridieren.
      HINWEIS: Wenden Sie im Debridement keine übermäßige Kraft an, da dies auch zu einer Hornhautperforation führen kann. Die Augen von Mäusen können während des Verwundungsprozesses austrocknen, was das Debridement erschwert. Tragen Sie in einem solchen Fall steriles PBS auf die Augenoberfläche auf, um eine optimale Hydratation aufrechtzuerhalten.

Figure 1
Abbildung 1: 2 mm Trephine und stumpfer Golfschläger-Spud. Das Trephin wird verwendet, um eine kreisförmige Region im Hornhautzentrum abzugrenzen, und der Golfschläger-Spud wird verwendet, um das Epithel innerhalb der abgegrenzten Region zu entfernen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

4. Überwachung des Wundverschlusses und der Re-Epithelisierung

  1. Pipette 1-1,5 μL 1% ige Fluoresceinlösung auf die verwundete Oberfläche und bilden Sie Hornhaut mit einem Digitalmikroskop mit einer blauen Lichtquelle ab.
  2. Erfassen Sie Bilder innerhalb der ersten Minute nach der Zugabe von Fluoresceinlösung, um eine Ausbreitung auf das umgebende Epithel zu vermeiden, was zu einer Überschätzung der Wundgröße führt. Verwundete Hornhäute werden zu bestimmten Zeiten (d. h. 0 h, 12 h, 18 h, 24 h und 30 h) nach der Verwundung abgebildet.
    HINWEIS: Zu jedem Zeitpunkt wird die Bildgebung unter Narkose durchgeführt; Ketamin / Xylazin wird zum Zeitpunkt der Wundung verwendet, während Isofluran zu späteren Zeitpunkten verwendet wird. Mäuse werden für die Dauer der Wundverschlussüberwachung einzeln in separaten Käfigen untergebracht. Wenn sie zusammen untergebracht werden, neigen Mäuse dazu, die Augen des Wurfgeschwisters zu lecken, ein Verhalten, von dem gezeigt wurde, dass es die Wundheilung in verschiedenen Geweben beeinflusst19,20.
  3. Analysieren Sie aufgenommene Bilder und verfolgen Sie den Wundbereich mit einer Bildanalysesoftware. Die Wundfläche für jeden Zeitpunkt wird als Prozentsatz der ursprünglichen Wundfläche bei 0 h ausgedrückt.

5. Immunfluoreszenzbildgebung und -analyse

  1. Euthanasieren Sie Mäuse nach einer IACUC-zugelassenen Methode (in diesem Fall Kohlendioxid-Überdosierung gefolgt von zervikaler Dislokation) zu den gewünschten Zeitpunkten nach der Verwundung.
  2. Ernten Sie Augäpfel, indem Sie vorsichtig auf die seitliche Canthus drücken, um den Augapfel mit einer gebogenen Irisschere zu verschieben. Führen Sie die Schere hinter den Augapfel, um den Sehnerv fest zu greifen, und schneiden Sie dann den Nerv durch, wodurch der Augapfel entfernt werden kann.
  3. Fixieren Sie jeden Augapfel in 1 ml 1x PBS mit 2% Paraformaldehyd für 1 h bei Raumtemperatur und waschen Sie ihn dann dreimal in 1 ml 1x PBS für jeweils 5 Minuten.
  4. Verwenden Sie unter einem Seziermikroskop eine chirurgische Klinge, um einen Schnitt in der Sklera zu machen, etwa 500 μm distal zum Limbus, und schneiden Sie dann durch den Globus. Entfernen Sie mit einer Pinzette vorsichtig die Irismaterie aus der Hornhaut und schneiden Sie dann das Skleralgewebe vorsichtig ab, wobei Sie sicherstellen, dass der Limbus intakt bleibt.
  5. Machen Sie vier partielle radiale Schnitte, die jeweils etwa 1 mm lang sind, die sich von der peripheren Hornhaut erstrecken und kurz vor der Mitte anhalten, damit die Hornhaut abflachen kann.
  6. Permeabilisieren und blockieren Sie Hornhäute in 1 ml 2% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,01% TritonX-100 in 1x PBS für 15 Minuten, gefolgt von einer Blockierung in 2% BSA in 1x PBS für weitere 45 min bei Raumtemperatur.
  7. Inkubieren Sie Hornhäute über Nacht bei 4 ° C in einem Cocktail aus direkt markierten einzigartigen fluorochromkonjugierten Antikörpern, die in 1x PBS mit 2% BSA hergestellt werden.
    HINWEIS: Antikörper zielen darauf ab, bestimmte Zellen und Gewebe von Interesse zu markieren. Zum Beispiel sind Endothel, Neutrophile und Blutplättchen mit Anti-CD31 21,22, Anti-Ly-6G 23,24 bzw. Anti-CD41 25,26 Antikörpern markiert. 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) wird dem Antikörpercocktail hinzugefügt, um Kerne sichtbar zu machen.
  8. Nach der Inkubation die Hornhaut dreimal in 1x PBS für jeweils 15 Minuten waschen.
  9. Montieren Sie Hornhäute auf einem Objektträger in einem Tropfen Anti-Fade-Fluoreszenz-Montagemedium, Abdeckung mit einem Deckglas und Bild mit der gewünschten Vergrößerung (4x bis 100x Objektiv) mit einem Fluoreszenz-Lichtmikroskop. Nehmen Sie Bilder der Hornhaut in voller Dicke in verschiedenen Regionen auf, wie in Abbildung 2A dargestellt.
    HINWEIS: Das in Abbildung 2A dargestellte Muster der mikroskopischen Analyse wird zur Analyse spezifischer regionaler Veränderungen bei Entzündungen und Zellteilung verwendet. Sowohl die DAPI- als auch die Ly-6G-Färbung werden verwendet, um die extravaskulären Neutrophilen zu identifizieren. Bei DAPI-Färbung haben sphärische Neutrophile einen ausgeprägten hufeisen- oder donutförmigen Kern (Abbildung 2B).

Figure 2
Abbildung 2: Hornhautbildgebungsstrategie und Neutrophileninfiltration nach zentralem Abrieb . (A) Schematische Darstellung eines Hornhaut-Wholemounts mit neun mikroskopisch kleinen Feldern über den Durchmesser der Hornhaut. Der graue Bereich stellt den ursprünglichen Wundbereich dar. Die Breite jeder Region beträgt 500 μm. (B) Beachten Sie die ausgeprägte Hufeisen- oder Donutform von Neutrophilenkernen mit DAPI-Färbung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Representative Results

Abbildung 3 zeigt eine Transmissionselektronenmikroskopaufnahme einer Hornhautwunde, die mit dem stumpfen Golfschläger-Spud erzeugt wurde und zeigt, dass die epitheliale Basalmembran nach einer Verletzung tatsächlich intakt ist.

Figure 3
Abbildung 3: Die epitheliale Basalmembran bleibt nach dem Hornhautabrieb intakt. Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahme einer Hornhautwunde, die mit dem stumpfen Golfschläger-Spud erstellt wurde. Die Pfeilspitzen zeigen auf die Basalmembran unter dem verbleibenden Epithel, das die Wunde umgibt, während die Pfeile auf die Basalmembran im entblößten Bereich zeigen. Dies zeigt die Kontinuität der Basalmembran von den unabgeschliffenen zu den abgeschliffenen Teilen der Hornhaut und zeigt, dass die Basalmembran nach dem Debridement intakt bleibt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Dieses Protokoll für Hornhautwunden wurde verwendet, um die Wundheilungsdynamik für eine 2 mm Epithelabriebwunde 27,28,29,30,31,32,33 umfassend zu charakterisieren. Die Fähigkeit, die Rate des Wundverschlusses und der Re-Epithelisierung in vivo zu überwachen, ist ein zentraler Bestandteil dieses Modells. Wie in Abbildung 4A gezeigt, ermöglicht die Verwendung von Fluoresceinlösung und einem Digitalmikroskop mit blauer Lichtquelle die Visualisierung der Wundgröße. Bei diesem Modell wird die Wundverschlussüberwachung zum Zeitpunkt der Wunde (0 h), 12 h, 18 h, 24 h und 30 h nach der Wunde durchgeführt. Abbildung 4B zeigt die Kinetik des Wundverschlusses über 30 h. Bei 8-12 Wochen alten C57BL/6-Wildtyp-Mäusen sind Wundverschluss und Re-Epithelisierung typischerweise 24 h nach der Wunde abgeschlossen, wie in Abbildung 4B dargestellt, und eine gut regulierte Entzündungsreaktion ist für eine effiziente Wundheilungvon grundlegender Bedeutung 34,35,36.

Figure 4
Abbildung 4: Der Epithel-Wundverschluss wurde mittels Fluorescein-Färbung bewertet . (A) Repräsentative Bilder der Fluoresceinfärbung der Hornhautwunde bei 0 h, 12 h, 18 h, 24 h und 30 h. Bei diesem Modell ist der Wundverschluss in der Regel 24 Stunden nach der Wunde abgeschlossen. Beachten Sie das Fehlen von Grünfärbungen in der zentralen Hornhaut bei 24 h und 30 h. (B) Klängenverschlusskinetik, die einen vollständigen Wundverschluss um 24 h nach der Wunde anzeigt. Der Wert zu jedem Zeitpunkt wird als Prozentsatz der ursprünglichen Wundfläche (d. h. Wundfläche bei 0 h) (n ≥ 6) ausgedrückt. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die Entzündungsreaktion auf Wunden in diesem Modell ist gut charakterisiert. Die epitheliale Abriebwunde löst eine schnelle Entzündungsreaktion im Gefäßsystem der Hornhautlimbale aus, die hauptsächlich durch Vasodilatation, auf den Limbus beschränkte Thrombozytenextravasation37,38,39 und neutrophile Extravasation mit Migration in Richtung des Zentrums der Hornhaut40 gekennzeichnet ist. Abbildung 5 zeigt das limbale Gefäßsystem einer unverwundeten Hornhaut mit extravaskulären Neutrophilen (Abbildung 5A) und einer verwundeten Hornhaut mit extravaskulären Blutplättchen und Neutrophilen (Abbildung 5B).

Figure 5
Abbildung 5: Bildgebung entzündlicher Zellen im Limbus. Photomikroskopische Aufnahme des Hornhaut-Limbus mit Färbung für die limbalen Blutgefäße mit Anti-CD31-Antikörper (rot dargestellt), Neutrophile mit Anti-Ly-6G-Antikörper (grün dargestellt) und Blutplättchen mit Anti-CD41-Antikörper (blau dargestellt). (A) kein Abrieb und (B) 30 h nach dem Abrieb. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

In diesem Modell wird die neutrophile Infiltration in die Hornhaut in fünf verschiedenen Regionen bewertet, wie in Abbildung 2A dargestellt. Um diese verschiedenen Regionen zu bestimmen, wird ein Bild des gesamten Hornhaut-Wholemounts aufgenommen, das das limbale Gefäßsystem mit Anti-CD31-Färbung visualisiert. Der innerste Rand der limbalen Region auf jedem Blütenblatt wird mit dem limbalen Gefäßsystem als Leitfaden markiert. Der Abstand vom äußersten Rand der limbalen Region von einem Blütenblatt zum anderen in horizontaler (x) oder vertikaler (y) Richtung wird für jedes Hornhaut-Wholemount gemessen. Für 8-12 Wochen alte C57BL/6 Wildtyp-Mäuse beträgt dieser Abstand ~3,7 mm. Dieser Abstand deckt die peripheren bis peripheren Regionen ab. Das Zentrum des Hornhaut-Wholemounts wird dann als der Punkt berechnet, der der Hälfte des horizontalen oder vertikalen Durchmessers des Wholemounts entspricht. Der parazentrale Bereich ist 500 μm links, rechts, oben oder unten vom berechneten Zentrum entfernt. Die anderen Felder sind alle 500 μm vom vorhergehenden Feld entfernt. Sowohl die DAPI- als auch die Ly-6G-Färbung werden verwendet, um die extravaskulären Neutrophilen zu identifizieren. Die Neutrophilenzahlen in jeder Hornhautregion aus den vier Quadranten werden gemittelt und als Neutrophile pro Feld ausgedrückt.

Die Thrombozytenbeurteilung in diesem Modell wird nur am Limbus durchgeführt; Während der Hornhautwundheilung extravasieren und lokalisieren sich die Blutplättchen im Limbus27,37. Die Gesamtzahl der Blutplättchen am Limbus wird gezählt, und die Anzahl wird als Plättchen / mm2 der limbalen Fläche ausgedrückt. Die Anzahl der vier Blütenblätter kann addiert oder gemittelt werden.

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Discussion

Der Zweck dieses Methodenpapiers war es, ein Protokoll zur Herstellung einer zentralen Hornhautepithelabriebwunde in der Maus mit einem Trephin und einem stumpfen Golfschläger-Spud zu beschreiben. Dieses murine Modell wurde verwendet, um Hornhautentzündungen und ihren Beitrag zur Wundheilung zu untersuchen. Diese Art von Modell kann verwendet werden, um Hornhautwundheilungsmechanismen unter normalen physiologischen Bedingungen und bei Pathologien 17,28,29,41,42 zu untersuchen. Das Modell wurde verwendet, um die Heilung von Hornhautwunden unter pathologischen Bedingungen zu untersuchen, wie eine Studie über eine beeinträchtigte Hornhautwundheilung in einem Mausmodell für ernährungsbedingte Fettleibigkeitbelegt 17. Ein entscheidender Vorteil dieses Modells besteht darin, dass es eine exakte (2 mm) reproduzierbare Epithelwundgröße mit einer präzisen zentralen Position erzeugt, ohne die Basalmembran zu durchbrechen. Dieses Modell der Hornhautverwundung ist unkompliziert und schnell durchzuführen. Neben dem stumpfen Golfschläger spud 29,39,43,44,45, dem rotierenden Grat (Algerbrush) 38,46,47 und der Diamantklinge32,37,40,48,49,50,51 können beide verwendet werden, um die Abriebwicklung in diesem Modell zu erzeugen. In den Händen eines erfahrenen Benutzers gibt es keinen wesentlichen Unterschied in der Abriebwicklung, die von beiden Werkzeugen erzeugt wird. Für Trainingszwecke und in den Händen eines Anfängers ist es oft einfacher, mit dem stumpfen Golfschläger-Spud im Vergleich zum rotierenden Grat und der Diamantklinge reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Der rotierende Grat (Algerbrush) erfordert eine zarte Berührung, da sonst der rotierende Grat die epitheliale Basalmembran beschädigen kann. Dies wurde auch von anderen Ermittlern berichtet52,53. Auf der anderen Seite lässt der stumpfe Golfschläger-Spud die epitheliale Basalmembran konsequent intakt.

Um dieses Hornhautwundungsprotokoll erfolgreich zu reproduzieren und die anschließende Re-Epithelisierung und Entzündungsdynamik zu beobachten, muss der gleiche Stamm und Altersbereich der Maus verwendet werden, und die Größe und Tiefe der Wunde muss wie oben beschrieben erstellt werden. Die in diesem Protokoll beschriebene Heilungsdynamik und die Zeitpläne für Hornhautwunden gelten für den Mausstamm C57BL/6 und werden möglicherweise nicht geteilt, wenn ein anderer Mausstamm verwendet wird. Pal-Ghosh et al.54 berichteten über Variationen in der Fähigkeit von C57BL/6 und BALB/c, Hornhautepithel-Debridementwunden zu heilen. Bei gleicher Hornhautwundgröße sind Hornhautwundverschluss und Re-Epithelisierung bei BALB/c-Mäusen langsamer. Der Zeitplan für die Fertigstellung des Wundverschlusses und die hier beschriebene charakteristische Entzündungsreaktion beziehen sich auf eine kreisförmige Wunde mit einem Durchmesser von 2 mm. Für Wunddurchmesser größer als 2 mm wird eine längere Fertigstellungszeit des Wundverschlusses erwartet, während für Wunddurchmesser von weniger als 2 mm eine kürzere Zeit erwartet wird. Es wird auch erwartet, dass größere Hornhautwunden, insbesondere solche, die näher am Limbus liegen, eine übertriebenere Entzündungsreaktion hervorrufen, da mehr Leukozyten in die Hornhaut16 rekrutiert werden. Noch wichtiger ist, dass die Wunde auf das Hornhautepithel beschränkt sein sollte. Wunden, die die epitheliale Basalmembran durchbrechen oder in das Hornhautstroma eindringen, brauchen länger, um zu heilen. Diese Wunden sind auch mit einer veränderten Entzündungsreaktion, Neovaskularisation, Myofibroblastenbildung und Narbenbildung verbunden55,56.

Bei jedem Schritt muss darauf geachtet werden, eine mikrobielle Infektion der abgeschliffenen Hornhaut zu verhindern. Mikrobielle Infektionen verändern die Entzündungsreaktion und können zu Ulzerationen, Narbenbildung und Sehverlust führen57. Um eine mikrobielle Infektion der Wunde zu verhindern, sollten immer sterile Werkzeuge und Lösungen verwendet werden. Wenn mehrere Mäuse gleichzeitig verwundet werden, sollte für jede Maus ein steriles Trephin verwendet werden. Zwischen den Mäusen sollte der Golfschläger-Spud in sterilem PBS gewaschen werden, gefolgt von einer Desinfektion in 70% Ethanol und erneut in sterilem PBS. Wenn die Wunde an zusätzlichen Mäusen über mehrere Tage durchgeführt wird, sollte sie zur gleichen Tageszeit durchgeführt werden. Dies dient dazu, die zirkadiane Wirkung auf Wundheilung und Entzündung zu kontrollieren. Bei C57BL/6-Mäusen beeinflusst die Tageszeit, zu der die Wunde gebildet wird, die Geschwindigkeit und Qualität der Hornhautwundheilung. Ein schnellerer Wundverschluss und eine größere Zellteilung werden beobachtet, wenn Mäuse morgens verwundet werden, verglichen mit Wunden am Nachmittag oder Abend42. Die circadiane Wirkung auf die Wundheilung wurde in anderen Geweben, einschließlich der Haut, berichtet58,59. Die Verwundung wird bei diesem Modell immer morgens durchgeführt.

Die daraus resultierende Entzündungsreaktion auf Wunden in diesem Modell verläuft als eine gut charakterisierte Kaskade von zellulären und molekularen Ereignissen, die für eine effiziente Wundheilung entscheidend sind. Die am besten charakterisierten zellulären Akteure in der abriebinduzierten Entzündung in diesem Modell sind Neutrophile und Blutplättchen. Neutrophile sind die Ersthelfer an der Stelle des Hornhautabriebs; Signifikante Konzentrationen von Neutrophilen werden innerhalb von 6 Stunden nach der Wunde im Hornhautstroma nachgewiesen. Neutrophile sind verantwortlich für die Beseitigung von Zelltrümmern, ein Prozess, der für Entzündungen und Wundreparaturen unwesentlich ist60. Zusätzlich zu ihren phagozytischen Aktivitäten enthalten Neutrophile Wachstumsfaktoren wie vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktoren (VEGF)61. VEGF ist ein entscheidender neuroregenerativer Faktor für die Regeneration der Hornhautnerven nach einer Verwundung 62,63 und ist auch wichtig für die Teilung von Hornhautepithelzellen 45,63. Neutrophile Infiltration am Limbus tritt in zwei Wellen auf, wobei der erste Peak bei 18 h und der zweite Peak bei 30 h nach40 h liegt. Unter Verwendung von neutropenischen Mäusen37,40 haben sich die Neutrophilenextravasation und die anschließende Migration zum Zentrum der Hornhaut als entscheidend für die Wundheilung der Hornhaut erwiesen. Obwohl traditionell bekannt ist, dass sie für die Aufrechterhaltung der Hämostase und Blutgerinnung von entscheidender Bedeutung sind, spielen Blutplättchen auch eine anerkannte Schlüsselrolle bei der Heilung von Hornhautwunden37. Blutplättchen enthalten zahlreiche Mediatoren, die zur Entzündung und Gewebeauflösung beitragen64,65. Bei Mäusen mit Thrombozytopenie wurde dieses Modell verwendet, um zu zeigen, dass Blutplättchen für eine effiziente Hornhautwundheilung wichtig sind37.

Obwohl Neutrophile und Blutplättchen die am besten charakterisierten Zellen in diesem Modell sind, wurde gezeigt, dass Immunzellen wie Gamma-Delta-T-Zellen, natürliche Killerzellen und dendritische Zellen mit diesem Modell27,48 auch an der Immunantwort auf Wunden beteiligt sind. Natürliche Killerzellextravasation im Stroma 28,29 und Migration von Gamma-Delta-T-Zellen in das heilende Epithel27 wurden berichtet. Dieses Modell wurde auch verwendet, um Adhäsionsmoleküle zu identifizieren, die für die Extravasation von Immunzellen während der Wundheilung der Hornhaut entscheidend sind. Lymphozytenfunktionsantigen-1 (LFA-1)32, CD1851 und interzelluläres Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1)47,49 haben sich alle als entscheidend für die Neutrophilenextravasation und effiziente Hornhautwundheilung mit diesem Modell erwiesen. Die epitheliale Zellteilung als Reaktion auf die Wunde, die für die epitheliale Restratifizierung nach dem Wundverschluss entscheidend ist, wird anhand von mitotischen Zahlen beurteilt. Die chromosomale Kondensation in verschiedenen Stadien der Zellteilung verleiht den Kernen ein charakteristisches Aussehen, das als mitotische Figur bekannt ist. Die DAPI-Färbung des Kerns ermöglicht die Visualisierung dieser mitotischen Figuren.

Das Modell der Hornhautabriebwunde der Maus hat sich als bemerkenswert reproduzierbar erwiesen und einen beträchtlichen Einblick in die zellulären und molekularen Mechanismen gegeben, die zu einer effizienten Wundheilung beitragen. Es ist jedoch erwähnenswert, dass es Einschränkungen für das Modell in Bezug auf seine klinische Anwendbarkeit gibt. Das Modell und seine Ergebnisse sind nur auf einfache, nicht penetrierende Epithelabschürfungen anwendbar. Wie bereits erwähnt, führen Hornhautverletzungen, die aus penetrierenden Wunden resultieren, die durch körperliche oder chemische Beleidigung verursacht werden, zu unterschiedlichen Wundheilungskinetiken und -ergebnissen, insbesondere wenn sich die Wunde infiziert, wie es häufig bei Verletzungen der menschlichen Hornhaut der Fall ist. Davon abgesehen bietet das Modell der Hornhautabriebwunde der Maus eine hervorragende Grundlage für die Untersuchung grundlegender Entzündungsprinzipien, die die Wundheilung der Hornhaut modulieren.

Das hier beschriebene Hornhautverletzungsprotokoll ist unkompliziert und leicht reproduzierbar. Es bietet ein nützliches Werkzeug, um grundlegende Fragen über den Heilungsprozess der Hornhautwunde und die damit verbundene Entzündungsreaktion zu untersuchen. Sein Potenzial, beim Verständnis von Hornhautpathologien im Zusammenhang mit Wundheilungskomplikationen zu helfen, ist nur der Anfang.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgments

Finanzierung: Gefördert durch: NIH EY018239 (A.R.B., C.W.S. und R.E.R.), P30EY007551 (A.R.B.) und Sigma Xi Grant in Aid of Research (P.K.A.). Der Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und stellt nicht die offiziellen Ansichten der National Institutes of Health oder Sigma Xi dar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-CD31 antibody BD Bioscience, Pharmingen 550274
Anti-CD41 antibody BD Bioscience, Pharmingen 553847
Anti-Ly6G antibody BD Bioscience, Pharmingen 551459
Bovine serum albumin (BSA) ThermoFisher scientific B14
C57BL/6 mice Jackson Laboratories 664
DAPI Sigma Aldrich D8417
DeltaVision wide-field deconvolution fluorescence microscope GE Life Sciences
Dissecting microscope Leica microsystems
Electronic Toploading Balances (Weighing scale) Fisher Scientific
Ethanol ThermoFisher scientific T038181000CS
Golf-club spud Stephens instruments S2-1135
Iris curve scissors Fisher Scientific 31212
Isoflurane Patterson veterinary 07-893-1389
Ketamine Patterson veterinary 07-890-8598
Phospate buffered saline (PBS) ThermoFisher scientific AM9624
Sodium fluorescein salt Sigma Aldrich 46970
Surgical blade (scapel blade) Fine Science tools 10022-00
Trephine Integra Miltex 33-31
TritonX -100 Fisher Scientific 50-295-34
Forcep Fine Science tools 11923-13
Xylazine Patterson veterinary 07-808-1947

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References

  1. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
  2. Meek, K. M., Knupp, C. Corneal structure and transparency. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 1-16 (2015).
  3. Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmology. 66 (2), 190-194 (2018).
  4. Flaxman, S. R., et al. Global causes of blindness and distance vision impairment 1990-2020: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (12), 1221-1234 (2017).
  5. Robaei, D., Watson, S. Corneal blindness: A global problem. Clinical & Experimental Ophthalmology. 42 (3), 213-214 (2014).
  6. McGwin, G., Owsley, C. Incidence of emergency department-treated eye injury in the United States. Archives of Ophthalmology. 123 (5), 662-666 (2005).
  7. Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
  8. Wilson, S. L., Haj, A. J. E., Yang, Y. Control of scar tissue formation in the cornea: Strategies in clinical and corneal tissue engineering. Journal of Functional Biomaterials. 3 (3), 642 (2012).
  9. Vaidyanathan, U., et al. Persistent corneal epithelial defects: A review article. Medical Hypothesis, Discovery and Innovation in Ophthalmology. 8 (3), 163-176 (2019).
  10. Netto, M., et al. Wound healing in the cornea: a review of refractive surgery complications and new prospects for therapy. Cornea. 24 (5), 509-522 (2005).
  11. Friedenwald, J. S., Buschke, W. Some factors concerned in the mitotic and wound-healing activities of the corneal epithelium. Transactions of the American Ophthalmological Society. 42, 371-383 (1944).
  12. Xu, K., Yu, F. -S. X. Impaired epithelial wound healing and EGFR signaling pathways in the corneas of diabetic rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3301-3308 (2011).
  13. Bai, J. Q., Qin, H. F., Zhao, S. H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International Journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).
  14. Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Stepp, M. A., Zieske, J. D. αVβ6 integrin promotes corneal wound healing. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (11), 8505-8513 (2011).
  15. Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Zieske, J. D. Role of thrombospondin-1 in repair of penetrating corneal wounds. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (9), 6262-6268 (2013).
  16. Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
  17. Hargrave, A., et al. Corneal dysfunction precedes the onset of hyperglycemia in a mouse model of diet-induced obesity. PLoS ONE. 15, 0238750 (2020).
  18. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e2771 (2012).
  19. Bodner, L., Dayan, D. Effect of parotid submandibular and sublingual saliva on wound healing in rats. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Physiology. 100 (4), 887-890 (1991).
  20. Abbasian, B., Azizi, S., Esmaeili, A. Effects of rat's licking behavior on cutaneous wound healing. Iranian Journal of Basic Medical Sciences. 13 (1), 242-247 (2010).
  21. DeLisser, H. M., et al. Involvement of endothelial PECAM-1/CD31 in angiogenesis. The American Journal of Pathology. 151 (3), 671-677 (1997).
  22. Piali, L., et al. CD31/PECAM-1 is a ligand for alpha v beta 3 integrin involved in adhesion of leukocytes to endothelium. The Journal of Cell Biology. 130 (2), 451-460 (1995).
  23. Fleming, T. J., Fleming, M. L., Malek, T. R. Selective expression of Ly-6G on myeloid lineage cells in mouse bone marrow. RB6-8C5 mAb to granulocyte-differentiation antigen (Gr-1) detects members of the Ly-6 family. The Journal of Immunology. 151 (5), 2399-2408 (1993).
  24. Fleming, T. J., Malek, T. R. Multiple glycosylphosphatidylinositol-anchored Ly-6 molecules and transmembrane Ly-6E mediate inhibition of IL-2 production. The Journal of Immunology. 153 (5), 1955-1962 (1994).
  25. Phillips, D. R., Charo, I. F., Scarborough, R. M. GPIIb-IIIa: the responsive integrin. Cell. 65 (3), 359-362 (1991).
  26. Nieswandt, B., et al. Acute systemic reaction and lung alterations induced by an antiplatelet integrin gpIIb/IIIa antibody in mice. Blood. 94 (2), 684-693 (1999).
  27. Li, Z., Burns, A. R., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. γδ T cells are necessary for platelet and neutrophil accumulation in limbal vessels and efficient epithelial repair after corneal abrasion. American Journal of Pathology. 171 (3), 838-845 (2007).
  28. Liu, Q., Smith, C. W., Zhang, W., Burns, A. R., Li, Z. NK cells modulate the inflammatory response to corneal epithelial abrasion and thereby support wound healing. American Journal of Pathology. 181 (2), 452-462 (2012).
  29. Gao, Y., et al. NK cells are necessary for recovery of corneal CD11c+ dendritic cells after epithelial abrasion injury. Journal of Leukocyte Biology. 94 (2), 343-351 (2013).
  30. Xiao, C., et al. Acute tobacco smoke exposure exacerbates the inflammatory response to corneal wounds in mice via the sympathetic nervous system. Communications Biology. 2, 33 (2019).
  31. Wang, H., et al. Epothilone B speeds corneal nerve regrowth and functional recovery through microtubule stabilization and increased nerve beading. Scientific Reports. 8 (1), 2647 (2018).
  32. Li, Z., Burns, A. R., Smith, C. W. Lymphocyte function-associated Antigen-1-dependent inhibition of corneal wound healing. Cell Injury. 169, 1590-1600 (2006).
  33. Wu, M., et al. The neuroregenerative effects of topical decorin on the injured mouse cornea. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 1-14 (2020).
  34. Rodrigues, M., Kosaric, N., Bonham, C. A., Gurtner, G. C. Wound healing: A cellular perspective. Physiological Reviews. 99 (1), 665-706 (2019).
  35. Rennard, S. I. Inflammation and repair processes in chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160 (5), Pt 2 12-16 (1999).
  36. Landén, N. X., Li, D., Ståhle, M. Transition from inflammation to proliferation: a critical step during wound healing. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (20), 3861-3885 (2016).
  37. Li, Z., Rumbaut, R. E., Burns, A. R., Smith, C. W. Platelet response to corneal abrasion is necessary for acute inflammation and efficient re-epithelialteation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47, 4794-4802 (2006).
  38. Lam, F. W., Burns, A. R., Smith, C. W., Rumbaut, R. E. Platelets enhance neutrophil transendothelial migration via P-selectin glycoprotein ligand-1. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 300 (2), 468-475 (2011).
  39. La Cruz, A. D., et al. Platelet and erythrocyte extravasation across inflamed corneal venules depend on CD18, neutrophils, and mast cell degranulation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (14), 7360 (2021).
  40. Li, Z., Burns, A. R., Smith, C. W. Two waves of neutrophil emigration in response to corneal epithelial abrasion: Distinct adhesion molecule requirements. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (5), 1947-1955 (2006).
  41. Li, Z., Burns, A. R., Han, L., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. IL-17 and VEGF Are Necessary for Efficient Corneal Nerve Regeneration. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1106-1116 (2011).
  42. Xue, Y., et al. Modulation of circadian rhythms affects corneal epithelium renewal and repair in mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (3), 1865-1874 (2017).
  43. Zhang, W., Magadi, S., Li, Z., Smith, C. W., Burns, A. R. IL-20 promotes epithelial healing of the injured mouse cornea. Experimental Eye Research. 154, 22-29 (2017).
  44. Li, Z., Burns, A. R., Miller, S. B., Smith, C. W. CCL20, γδ T cells, and IL-22 in corneal epithelial healing. FASEB Journal. 25 (8), 2659-2668 (2011).
  45. Li, Z., Burns, A. R., Han, L., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. IL-17 and VEGF are necessary for efficient corneal nerve regeneration. American Journal of Pathology. 178 (3), 1106-1116 (2011).
  46. Reins, R. Y., Hanlon, S. D., Magadi, S., McDermott, A. M. Effects of topically applied Vitamin D during corneal wound healing. PLoS ONE. 11 (4), 0152889 (2016).
  47. Gagen, D., et al. ICAM-1 mediates surface contact between neutrophils and keratocytes following corneal epithelial abrasion in the mouse. Experimental Eye Research. 91 (5), 676-684 (2010).
  48. Li, Z., Rivera, C. A., Burns, A. R., Smith, C. W. Hindlimb unloading depresses corneal epithelial wound healing in mice. Journal of Applied Physiology. 97 (2), 641-647 (2004).
  49. Byeseda, S. E., et al. ICAM-1 is necessary for epithelial recruitment of γδ T cells and efficient corneal wound healing. American Journal of Pathology. 175 (2), 571-579 (2009).
  50. Li, Z., Burns, A. R., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. γδ T cells are necessary for platelet and neutrophil accumulation in limbal vessels and efficient epithelial repair after corneal abrasion. American Journal of Pathology. 171 (3), 838-845 (2007).
  51. Petrescu, M. S., et al. Neutrophil interactions with keratocytes during corneal epithelial wound healing: A role for CD18 integrins. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (11), 5023-5029 (2007).
  52. Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing. Experimental Eye Research. 93 (6), 927-936 (2011).
  53. Pal-Ghosh, S., et al. Cytokine deposition alters leukocyte morphology and initial recruitment of monocytes and γδT cells after corneal injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (4), 2757-2765 (2014).
  54. Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Jurjus, R. A., Zieske, J. D., Stepp, M. A. BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds. Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).
  55. Kato, T., Chang, J. H., Azar, D. T. Expression of type XVIII collagen during healing of corneal incisions and keratectomy wounds. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44 (1), 78-85 (2003).
  56. Kure, T., et al. Corneal neovascularization after excimer keratectomy wounds in matrilysin-deficient mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44 (1), 137-144 (2003).
  57. Lin, A., et al. Bacterial keratitis preferred practice pattern. Ophthalmology. 126 (1), 1-55 (2019).
  58. Cable, E. J., Onishi, K. G., Prendergast, B. J. Circadian rhythms accelerate wound healing in female Siberian hamsters. Physiology and Behavior. 171, 165-174 (2017).
  59. Lyons, A. B., Moy, L., Moy, R., Tung, R. Circadian rhythm and the skin: A review of the literature. Journal of Clinical and Aesthetic Dermatology. 12 (9), 42-45 (2019).
  60. Westman, J., Grinstein, S., Marques, P. E. Phagocytosis of Necrotic Debris at Sites of Injury and Inflammation. Frontiers in Immunology. 10, 3030 (2020).
  61. Gaudry, M., et al. Intracellular pool of vascular endothelial growth factor in human neutrophils. Blood. 90 (10), 4153-4161 (1997).
  62. Pan, Z., et al. Vascular endothelial growth factor promotes anatomical and functional recovery of injured peripheral nerves in the avascular cornea. FASEB Journal. 7, 2756-2767 (2013).
  63. Di, G., et al. VEGF-B promotes recovery of corneal innervations and trophic functions in diabetic mice. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
  64. Thomas, M. R., Storey, R. F. The role of platelets in inflammation. Thrombosis and Haemostasis. 114 (3), 449-458 (2015).
  65. Margraf, A., Zarbock, A. Platelets in inflammation and resolution. The Journal of Immunology. 203 (9), 2357-2367 (2019).

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Medizin Ausgabe 178 Hornhaut Wundheilung Abrieb Golfschläger-Spud Trephin
Ein epitheliales Abriebmodell zur Untersuchung der Hornhautwundheilung
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Akowuah, P. K., De La Cruz, A.,… More

Akowuah, P. K., De La Cruz, A., Smith, C. W., Rumbaut, R. E., Burns, A. R. An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing. J. Vis. Exp. (178), e63112, doi:10.3791/63112 (2021).

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