Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

En epitelial nötningsmodell för att studera hornhinnans sårläkning

Published: December 29, 2021 doi: 10.3791/63112
Automatic Translation
1, 1, 2, 2,3, 1,2
1College of Optometry, University of Houston, 2Children’s Nutrition Research Center, Baylor College of Medicine, 3Center for Translational Research on Inflammatory Diseases (CTRID), Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center

Summary

Här beskrivs ett protokoll för att skapa ett centralt hornhinneepitelialt nötningssår i musen med hjälp av en trefin och en trubbig golfklubbspud. Denna hornhinne sårläkningsmodell är mycket reproducerbar och används nu för att utvärdera komprometterad hornhinne sårläkning i samband med sjukdomar.

Abstract

Hornhinnan är kritisk för synen och står för cirka två tredjedelar av ögats brytningskraft. Avgörande för hornhinnans roll i synen är dess transparens. På grund av sin yttre position är hornhinnan emellertid mycket mottaglig för en mängd olika skador som kan leda till förlust av hornhinnans genomskinlighet och eventuell blindhet. Effektiv hornhinnesårläkning som svar på dessa skador är avgörande för att upprätthålla hornhinnans homeostas och bevara hornhinnans transparens och brytningsförmåga. I händelse av komprometterad hornhinne sårläkning blir hornhinnan sårbar för infektioner, sår och ärrbildning. Med tanke på den grundläggande betydelsen av hornhinnans sårläkning för bevarandet av hornhinnans transparens och syn, är en bättre förståelse av den normala hornhinnans sårläkningsprocess en förutsättning för att förstå nedsatt hornhinnesårläkning i samband med infektion och sjukdom. Mot detta mål har murina modeller av hornhinnesår visat sig vara användbara för att främja vår förståelse av hornhinnans sårläkningsmekanismer som fungerar under normala fysiologiska förhållanden. Här beskrivs ett protokoll för att skapa en central hornhinneepitel nötning i mus med hjälp av en trefin och en trubbig golfklubba spud. I denna modell används en cirkulär trefin med en diameter på 2 mm, centrerad över hornhinnan, för att avgränsa sårområdet. Golfklubbspuden används med försiktighet för att debridera epitelet och skapa ett cirkulärt sår utan att skada hornhinnans epiteliala källarmembran. Det resulterande inflammatoriska svaret fortskrider som en väl karakteriserad kaskad av cellulära och molekylära händelser som är avgörande för effektiv sårläkning. Denna enkla hornhinnesårläkningsmodell är mycket reproducerbar och välpublicerad och används nu för att utvärdera komprometterad hornhinnesårläkning i samband med sjukdom.

Introduction

Hornhinnan är den genomskinliga främre tredjedelen av ögat. Hornhinnan fyller flera funktioner, inklusive att skydda ögats inre strukturer och bilda en strukturell barriär som skyddar ögat mot infektioner1. Ännu viktigare är att hornhinnan är kritisk för synen och ger cirka två tredjedelar av ögats brytningskraft 2,3. Avgörande för hornhinnans roll i synen är dess transparens. På grund av sin yttre position utsätts hornhinnan dock för en mängd olika skador dagligen som kan leda till störningar i dess barriärfunktion, förlust av transparens och eventuell blindhet. Förlust av hornhinnans genomskinlighet är en ledande orsak till synnedsättning över hela världen 4,5. Nötningar i hornhinnan är en vanlig orsak till besök på akuten (ER) och står för hälften av de ögonrelaterade fall som presenteras vid ER6. Över 1 miljon individer beräknas drabbas av ögonrelaterade skador årligen i USA7. Effektiv hornhinnesårläkning som svar på dessa skador är avgörande för att upprätthålla hornhinnans homeostas och bevara dess transparens och brytningsförmåga. I händelse av komprometterad hornhinne sårläkning blir hornhinnan sårbar för infektioner, sår och ärrbildning 8,9. Den ökande populariteten för brytningsoperationer placerar också en unik traumatisk utmaning på hornhinnan10. Med tanke på den grundläggande betydelsen av hornhinnans sårläkning för bevarandet av hornhinnans transparens och syn, är en bättre förståelse av den normala hornhinnans sårläkningsprocess en förutsättning för att förstå nedsatt hornhinnesårläkning i samband med infektion och sjukdom.

För detta ändamål har flera djurmodeller av hornhinnans sårläkning utvecklats 11,12,13,14,15. Murina modeller av hornhinnesårläkning har visat sig vara användbara för att främja vår förståelse av hornhinnans sårläkningsmekanismer som fungerar under normala fysiologiska förhållanden. Olika typer av hornhinnesår har använts för att studera hornhinnans sårläkning, var och en lämplig för att undersöka olika aspekter av sårläkningsprocessen. De vanligaste typerna av sårmodeller som används i hornhinnans sårläkningsstudier är de mekaniska och kemiska sårmodellerna. Kemiska hornhinnesår, som mestadels involverar skapandet av alkaliska brännskador på hornhinnan, är användbara för att studera hornhinnesår, opacifiering och neovaskularisering13. Mekaniska hornhinnesår involverar debrideringssår (nötning) och keratektomi sår 14,15,16. Ett intakt eller brutet hornhinneepitelialt källarmembran definierar debridering respektive keratektomi sår. I debrideringssår förblir epitelialt källarmembran intakt, medan i keratektomi sår bryts källarmembranet med penetration mestadels i den främre stroma. Debrideringssår är mest användbara för att studera reepitelisering, epitelcellsproliferation, immunsvar och nervregenerering efter hornhinnesår. Keratektomi sår, å andra sidan, är mest användbara för att studera hornhinnans ärrbildning14,15.

Här beskrivs ett protokoll för att skapa ett centralt hornhinneepitelialt nötningssår i musen med hjälp av en trefin och en trubbig golfklubbspud. Denna enkla hornhinnesårläkningsmodell är mycket reproducerbar och välpublicerad och används nu för att utvärdera komprometterad hornhinnesårläkning i samband med sjukdom17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djurprotokoll godkändes av Institutional Animal Care and Use Committees vid University of Houston och Baylor College of Medicine. Riktlinjerna som beskrivs i Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) uttalande om användning av djur i syn- och oftalmisk forskning följdes vid hantering och användning av mössen.

1. Förberedelse

  1. Framställning av fluoresceinlösning
    1. Bered 1% fluoresceinlösning genom att lösa upp 10 mg natriumfluoresceinsalt i 1 ml steril saltlösning eller steril 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
      OBS: Förbered natriumfluoresceinlösning på användningsdagen eller en dag innan för att undvika mikrobiell kontaminering. När fluoresceinlösningen bereds en dag före användning förvaras den vid 4 °C på avstånd från ljus. Vik in rör med aluminiumfolie för att förhindra fotoblekning.
    2. Dela upp lösningen i alikvoter som är lämpliga för användning i ett enda experiment. 1-1,5 μl fluoresceinlösning används per mus per tidpunkt. Använd följande formel för att beräkna volymen alikvot som är lämplig för ett enda experiment:
      Equation 1
      OBS: Till exempel, om sex möss studeras i ett enda experiment med sårstorlek övervakad vid fem tidpunkter, skulle volymen alikvot som är lämplig för det enda experimentet vara:
      Equation 2
  2. Beredning av ketamin/xylazincocktail för anestesi av möss.
    1. För att bereda 10 ml cocktail, blanda 2,0 ml ketamin (100 mg / ml) med 1,0 ml xylazin (20 mg / ml) och tillsätt 7,0 ml steril PBS. Förbered ketamin/xylazincocktail en dag före eller på operationsdagen.
      OBS: Alla lösningar ska användas vid rumstemperatur om inget annat anges.

2. Anestesi

  1. Väg musen (8-12 veckor gamla C57BL/6 vildtypsmöss) för att bestämma lämplig mängd bedövningsmedel att administrera. Använd tvåhandsmushållningstekniken för att hålla fast och hantera möss för injektion av bedövningsmedlet18. Administrera ketamin/xylazincocktail intraperitonealt (i.p.) i en slutlig koncentration av 80 mg/kg ketamin och 8 mg/kg xylazin.
  2. Vänta tills fullständig anestesi uppnås innan du utför hornhinnesår på musen. Utvärdera anestesidjupet genom att bedöma pedalreflexen efter tånypning. När adekvat anestesi uppnås bör musen inte röra sig på tånypa.
    OBS: Eftersom möss snabbt förlorar kroppsvärme under anestesi är det viktigt att ge en värmekälla för möss för att förhindra hypotermi. Placera möss på en värmekälla (värmedyna) under anestesi och återhämtningsstadier.

3. Skapande av hornhinnesår

  1. Linda endast höger eller vänster öga. Håll konsekvens med ögat (dvs vänster eller höger) som skadas när du flyttar från mus till mus.
    OBS: Eftersom nötningar skadar hornhinnans nerver och minskar skärpan kan sår i båda ögonen orsaka betydande obehag och försämring. Eftersom smärtstillande medel har potential att undertrycka inflammatoriska svar kan deras användning vara en förvirrande i vissa experiment som syftar till att förstå hornhinneinflammation. Att undvika smärtstillande medel i hornhinnesårsexperiment godkändes av vår institutionella djurvårds- och användningskommitté (IACUC).
  2. För att skapa epitelial hornhinne sår
    1. Under ett dissekeringsmikroskop, använd trefin med en diameter på 2 mm (se figur 1) för att avgränsa hornhinnans mitt och hålla ögat vidöppet med tummen och pekfingret för att hålla ögonlocken. Snurra försiktigt trefinet för att göra intryck på hornhinneepitelet.
      OBS: Var försiktig så att du inte applicerar överdrivet tryck vid användning av trefin eftersom detta kan leda till hornhinneperforering. Man måste också se till att placera trefin centralt. Eleverna kan användas som ett landmärke för att lokalisera hornhinnans centrum.
    2. Håll under ett dissekeringsmikroskop den trubbiga golfklubbspuden (se figur 1) ungefär 45 ° från hornhinnans yta inom det område som avgränsas med trefinet. Skrapa försiktigt och kontinuerligt epitelet inom det avgränsade området med spuden för att debridera epitelet.
      OBS: Använd inte överdriven kraft vid debridering eftersom det också kan orsaka hornhinneperforering. Mössens ögon kan torka upp under sårprocessen, vilket gör debridering svår. Applicera i så fall steril PBS på ögonytan för att bibehålla optimal hydrering.

Figure 1
Figur 1: 2 mm trefin och trubbig golfklubba spud. Trefinet används för att avgränsa en cirkulär region vid hornhinnans centrum, och golfklubbspuden används för att ta bort epitelet inom den avgränsade regionen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

4. Övervakning av sårförslutning och återepitelisering

  1. Pipettera 1-1,5 μL 1% fluoresceinlösning på den sårade ytan och avbilda hornhinnan med hjälp av ett digitalt mikroskop med en blå ljuskälla.
  2. Skaffa bilder inom den första minuten av tillsats av fluoresceinlösning för att undvika spridning till omgivande epitel vilket leder till överskattning av sårstorlek. Sårade hornhinnor avbildas vid specifika tidpunkter (dvs. 0 h, 12 h, 18 h, 24 h och 30 h) efter sårning.
    OBS: Vid alla tidpunkter utförs avbildning under anestesi; ketamin/xylazin används vid sårtillfället medan isofluran används vid efterföljande tidpunkter. Möss är inrymda individuellt i separata burar under hela sårstängningsövervakningen. När de hålls ihop tenderar möss att slicka kullkamratens ögon, ett beteende som har visat sig påverka sårläkning i olika vävnader19,20.
  3. Analysera tagna bilder, spåra sårområdet med hjälp av en bildanalysprogramvara. Sårområdet för varje tidpunkt uttrycks i procent av det ursprungliga sårområdet vid 0 h.

5. Immunofluorescensavbildning och analys

  1. Avliva möss med en IACUC-godkänd metod (i detta fall överdosering av koldioxid följt av cervikal dislokation) vid önskade tidpunkter efter sår.
  2. Skörda ögonbollar genom att försiktigt trycka på sidokantus för att förskjuta ögongloben med irisböjd sax. Styr saxen bakom ögongloben för att ta ett fast grepp om synnerven och skär sedan nerven, vilket gör att ögongloben kan tas bort.
  3. Fixera varje ögonglob i 1 ml 1x PBS innehållande 2% paraformaldehyd i 1 timme vid rumstemperatur och tvätta sedan tre gånger i 1 ml 1x PBS i 5 minuter vardera.
  4. Under ett dissekerande mikroskop, använd ett kirurgiskt blad för att göra ett snitt i sclera, cirka 500 μm distalt till limbus, och skär sedan genom jordklotet. Använd pincett, ta försiktigt bort irismaterialet från hornhinnan och trimma sedan försiktigt bort skleralvävnaden och se till att lämna limbus intakt.
  5. Gör fyra partiella radiella snitt, var och en cirka 1 mm lång, som sträcker sig från den perifera hornhinnan och stannar kort från mitten så att hornhinnan kan plattas ut.
  6. Permeabilisera och blockera hornhinnor i 1 ml 2% bovint serumalbumin (BSA) och 0,01% TritonX -100 i 1x PBS i 15 minuter följt av blockering i 2% BSA i 1x PBS i ytterligare 45 minuter vid rumstemperatur.
  7. Inkubera hornhinnor över natten vid 4 °C i en cocktail av direkt märkta unika fluorkromkonjugerade antikroppar framställda i 1x PBS innehållande 2 % BSA.
    OBS: Antikroppar är inriktade på att märka specifika celler och vävnader av intresse. Till exempel är endotel, neutrofiler och blodplättar märkta med anti-CD3121,22, anti-Ly-6G23,24 respektive anti-CD4125,26 antikroppar. 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) tillsätts till antikroppscocktailen för att visualisera kärnor.
  8. Tvätta hornhinnorna tre gånger i 1x PBS i 15 minuter vardera efter inkubation.
  9. Montera hornhinnor på ett mikroskopglas i en droppe anti-fade fluorescens monteringsmedium, täck med ett täckglas och bild med önskad förstoring (4x till 100x mål) med hjälp av ett fluorescensljusmikroskop. Ta bilder i full tjocklek av hornhinnan i olika regioner som illustreras i figur 2A.
    OBS: Mönstret för mikroskopisk analys som illustreras i figur 2A används för att analysera specifika regionala förändringar i inflammation och celldelning. Både DAPI- och Ly-6G-färgning används för att identifiera de extravaskulära neutrofilerna. Med DAPI-färgning har sfäriska neutrofiler en distinkt hästsko- eller munkformad kärna (figur 2B).

Figure 2
Figur 2: Corneal imaging strategy and neutrophil infiltration after central abrasion. Det grå området representerar det ursprungliga sårområdet. Bredden på varje region är 500 μm. (B) Notera den distinkta hästsko- eller munkformen hos neutrofila kärnor med DAPI-färgning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 3 visar en transmissionselektronmikrograf av ett hornhinnesår skapat med den trubbiga golfklubbspuden, vilket visar att epitelialt källarmembran verkligen är intakt efter skada.

Figure 3
Figur 3: Epitelialt källarmembran förblir intakt efter nötning av hornhinnan. Transmissionselektronmikrograf av ett hornhinnesår skapat med den trubbiga golfklubbspuden. Pilspetsarna pekar på källarmembranet under det återstående epitelet som omger såret, medan pilarna pekar på källarmembranet i det denuderade området. Detta visar kontinuiteten i källarmembranet från de oförstörda till de slitna delarna av hornhinnan, vilket visar att källarmembranet lämnas intakt efter debridering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Detta protokoll för hornhinnesår har använts för att i stor utsträckning karakterisera sårläkningsdynamiken för ett 2 mm epitelialt nötningssår 27,28,29,30,31,32,33. Möjligheten att övervaka graden av sårförslutning och reepitelisering in vivo är en central del av denna modell. Som visas i figur 4A möjliggör användningen av fluoresceinlösning och ett digitalt mikroskop med en blå ljuskälla visualisering av sårstorleken. I denna modell utförs sårstängningsövervakning vid sårning (0 h), 12 h, 18 h, 24 h och 30 h efter sårning. Figur 4B visar kinetiken för sårstängning över 30 timmar. Hos 8-12 veckor gamla C57BL / 6 vildtypsmöss är sårförslutning och återepitelisering vanligtvis fullständig 24 timmar efter sårning som illustreras i figur 4B och ett välreglerat inflammatoriskt svar är grundläggande för effektiv sårläkning 34,35,36.

Figure 4
Figur 4: Epitelsårsförslutning utvärderades med hjälp av fluoresceinfärgning. I denna modell är sårförslutningen vanligtvis fullständig 24 timmar efter sårning. Observera bristen på grön färgning i den centrala hornhinnan vid 24 timmar och 30 timmar. (B) Sårförslutningskinetik som indikerar fullständig sårförslutning med 24 timmar efter sårning. Värdet vid varje tidpunkt uttrycks som en procentandel av det ursprungliga sårområdet (dvs. sårområdet vid 0 h) (n ≥ 6). Data presenteras som medelvärde ± standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Det inflammatoriska svaret på sår i denna modell är väl karakteriserat. Epitelial nötningssåret framkallar ett snabbt inflammatoriskt svar i hornhinnans limbala vaskulatur som huvudsakligen kännetecknas av vasodilatation, extravasering av blodplättar begränsad till limbus 37,38,39 och neutrofil extravasering med migration mot mitten av hornhinnan40. Figur 5 visar den limbala vaskulaturen hos en okvinnad hornhinna med extravaskulära neutrofiler (figur 5A) och en sårad hornhinna med extravaskulära blodplättar och neutrofiler (figur 5B).

Figure 5
Figur 5: Inflammatorisk cellavbildning vid limbus. Fotomikrograf av hornhinnan limbus som visar färgning för de limbala blodkärlen med anti-CD31-antikropp (visas i rött), neutrofiler med anti-Ly-6G-antikropp (visas i grönt) och blodplättar med anti-CD41-antikropp (visas i blått). (A) ingen nötning och (B) 30 h efter nötning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

I denna modell bedöms neutrofil infiltration i hornhinnan i fem distinkta regioner som illustreras i figur 2A. För att bestämma dessa distinkta regioner fångas en bild av hela hornhinnans helmontering, vilket visualiserar limbal vaskulaturen med anti-CD31-färgning. Den innersta kanten av limbalregionen på varje kronblad markeras med hjälp av limbal vaskulaturen som vägledning. Avståndet från den innersta kanten av limbalområdet från ett kronblad till det andra i horisontell (x) eller vertikal (y) riktning mäts för varje hornhinna helmont. För 8-12 veckor gamla C57BL/6 vildtypsmöss är detta avstånd ~3,7 mm. Detta avstånd täcker de perifera till perifera regionerna. Mitten av hornhinnans helmonterade beräknas sedan som den punkt som motsvarar hälften av hela bergets horisontella eller vertikala diameter. Den paracentrala regionen är 500 μm vänster, höger, upp eller ner från det beräknade centrumet. De andra fälten är alla 500 μm från föregående fält. Både DAPI- och Ly-6G-färgning används för att identifiera de extravaskulära neutrofilerna. Neutrofilantal i varje hornhinneregion från de fyra kvadranterna är i genomsnitt och uttrycks som neutrofiler per fält.

Trombocytbedömning i denna modell utförs endast vid limbus; under hornhinnans sårläkning extravaserar och lokaliserar blodplättar till limbus27,37. Det totala antalet blodplättar vid limbus räknas och antalet uttrycks som blodplättar/mm2 limbalarea. Räkningarna från de fyra kronbladen kan summeras eller beräknas i genomsnitt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Syftet med detta metodpapper var att beskriva ett protokoll för att skapa ett centralt hornhinneepitelialt nötningssår i musen med hjälp av en trefin och en trubbig golfklubbspud. Denna murina modell har använts för att studera hornhinneinflammation och dess bidrag till sårläkning. Denna typ av modell kan användas för att studera hornhinnans sårläkningsmekanismer under normala fysiologiska förhållanden och i patologier 17,28,29,41,42. Modellen har använts för att undersöka hornhinnans sårläkning under patologiska förhållanden, vilket framgår av en studie om nedsatt hornhinnesårläkning i en musmodell av dietinducerad fetma17. En tydlig fördel med denna modell är att den skapar en exakt (2 mm) reproducerbar epitelsårstorlek med en exakt central plats utan att bryta källarmembranet. Denna modell av hornhinnesår är enkel och snabb att utföra. Förutom den trubbiga golfklubbanspud 29,39,43,44,45, den roterande burr (Algerbrush)38,46,47 och diamantbladet 32,37,40,48,49,50,51 kan båda användas för att skapa nötningssåret i denna modell. I händerna på en erfaren användare finns det ingen väsentlig skillnad i nötningssåret som skapas av något av verktygen. För träningsändamål och i händerna på en nybörjare är det ofta lättare att uppnå reproducerbara resultat med den trubbiga golfklubbspuden jämfört med det roterande burr- och diamantbladet. Den roterande borren (Algerbrush) kräver en känslig beröring annars kan den roterande borren skada epitelialt källarmembran. Detta har också rapporterats av andra utredare 52,53. Å andra sidan lämnar den trubbiga golfklubbspuden konsekvent epitelialt källarmembran intakt.

För att framgångsrikt reproducera detta hornhinnesårprotokoll och observera den efterföljande reepiteliserings- och inflammationsdynamiken måste samma stam och åldersintervall för mus användas, och sårets storlek och djup måste skapas enligt beskrivningen ovan. Hornhinnans sårläkningsdynamik och tidslinjer som beskrivs i detta protokoll är för C57BL / 6-musstammen och kanske inte delas om en annan musstam används. Pal-Ghosh et al.54 rapporterade variationer i förmågan hos C57BL/6 och BALB/c att läka hornhinnans epiteliala debrideringssår. För samma hornhinnesårstorlek är hornhinnans sårförslutning och återepitelisering långsammare hos BALB / c-möss. Tidslinjen för slutförandet av sårförslutningen och det karakteristiska inflammatoriska svaret som beskrivs här är för ett cirkulärt sår med en diameter på 2 mm. En längre slutförandetid för sårförslutning förväntas för sårdiametrar större än 2 mm medan en kortare tid förväntas för sårdiametrar mindre än 2 mm. Större hornhinnesår, särskilt de som ligger närmare limbus, förväntas också framkalla ett mer överdrivet inflammatoriskt svar, eftersom fler leukocyter rekryteras till hornhinnan16. Ännu viktigare är att såret bör begränsas till hornhinneepitelet. Sår som bryter mot epitelialt källarmembran eller tränger in i hornhinnans stroma tar längre tid att läka. Dessa sår är också associerade med ett förändrat inflammatoriskt svar, neovaskularisering, myofibroblastbildning och ärrbildning55,56.

Försiktighet måste vidtas i varje steg för att förhindra mikrobiell infektion i den slitna hornhinnan. Mikrobiell infektion förändrar det inflammatoriska svaret och kan leda till sårbildningar, ärrbildning och synförlust57. För att förhindra mikrobiell infektion i såret bör sterila verktyg och lösningar alltid användas. Om flera möss skadas åt gången ska en steril trefin användas för varje mus. Mellan mössen ska golfklubbspuden tvättas i steril PBS följt av desinfektion i 70% etanol och tvättas igen i steril PBS. Om sårning utförs på ytterligare möss under flera dagar, ska det utföras vid samma tidpunkt på dagen. Detta för att kontrollera dygnsrytmens effekt på sårläkning och inflammation. Hos C57BL/6-möss påverkar tiden på dygnet då såret tillverkas hastigheten och kvaliteten på hornhinnans sårläkning. Snabbare sårstängning och större celldelning observeras när möss skadas på morgonen jämfört med sår på eftermiddagen eller kvällen42. Den cirkadiska effekten på sårläkning har rapporterats i andra vävnader inklusive huden58,59. Sår i denna modell utförs alltid på morgonen.

Det resulterande inflammatoriska svaret på sår i denna modell fortsätter som en väl karakteriserad kaskad av cellulära och molekylära händelser som är kritiska för effektiv sårläkning. De bäst karakteriserade cellulära spelarna i den nötningsinducerade inflammationen i denna modell är neutrofiler och blodplättar. Neutrofiler är de första respondenterna på platsen för nötning av hornhinnan; signifikanta nivåer av neutrofiler detekteras i hornhinnans stroma inom 6 timmar efter sårning. Neutrofiler är ansvariga för att rensa cellskräp, en process som är inneboende för inflammation och sårreparation60. Förutom sina fagocytiska aktiviteter innehåller neutrofiler tillväxtfaktorer såsom vaskulära endoteltillväxtfaktorer (VEGF)61. VEGF är en avgörande neuroregenerativ faktor för regenerering av hornhinnenerver eftersårning av 62,63 och är också viktig för hornhinnans epitelcellsdelning45,63. Neutrofil infiltration vid limbus sker i två vågor med den första toppen vid 18 h och den andra toppen vid 30 h efter sårningav 40. Med hjälp av neutropena möss37,40 har neutrofil extravasering och efterföljande migration till mitten av hornhinnan visat sig vara avgörande för hornhinnans sårläkning. Även om det traditionellt är känt för att vara avgörande för upprätthållandet av hemostas och blodkoagulering, har blodplättar också en erkänd nyckelroll i hornhinnans sårläkning37. Blodplättar innehåller många mediatorer som bidrar till inflammation och vävnadsupplösning64,65. Hos möss med trombocytopeni har denna modell använts för att visa att blodplättar är viktiga för effektiv hornhinnesårläkning37.

Även om neutrofiler och blodplättar är de bäst karakteriserade cellerna i denna modell, har immunceller som gamma delta T-celler, naturliga mördarceller och dendritiska celler också visat sig vara involverade i immunsvaret mot sår med hjälp av denna modell 27,48. Naturlig mördarcellsextravasation i stroma28,29 och migration av gamma delta T-celler till det helande epitelet27 har rapporterats. Denna modell har också använts för att identifiera vidhäftningsmolekyler som är viktiga för extravasering av immunceller under hornhinnans sårläkning. Lymfocytfunktion antigen-1 (LFA-1)32, CD1851 och intercellulär vidhäftningsmolekyl-1 (ICAM-1)47,49 har alla visat sig vara avgörande för neutrofil extravasering och effektiv hornhinnelindring med hjälp av denna modell. Epitelcellsdelning som svar på sårbildning, vilket är avgörande för epitelial restratifiering efter sårstängning bedöms med hjälp av mitotiska figurer. Kromosomal kondensation under olika stadier av celldelning ger kärnorna ett karakteristiskt utseende som kallas en mitotisk figur. DAPI-färgning av kärnan möjliggör visualisering av dessa mitotiska figurer.

Muskorneal nötningssårsmodellen har visat sig vara anmärkningsvärt reproducerbar och gav betydande inblick i de cellulära och molekylära mekanismer som bidrar till effektiv sårläkning. Det är dock värt att notera att det finns begränsningar för modellen med avseende på dess kliniska tillämplighet. Modellen och dess resultat är endast tillämpliga på enkla, icke-penetrerande epitelskador. Som tidigare nämnts kommer hornhinneskador till följd av penetrerande sår orsakade av fysisk eller kemisk förolämpning att framkalla olika sårläkningskinetik och resultat, särskilt om såret blir infekterat, vilket ofta inträffar vid skador på den mänskliga hornhinnan. Med detta sagt ger muskorneal nötningssårmodellen en utmärkt grund för att studera grundläggande principer för inflammation som modulerar hornhinnans sårläkning.

Protokollet för sårskador i hornhinnan som beskrivs här är enkelt och lätt reproducerat. Det ger ett användbart verktyg för att undersöka grundläggande frågor om hornhinnans sårläkningsprocess och dess associerade inflammatoriska svar. Dess potential att hjälpa till att förstå hornhinnepatologier i samband med sårläkningskomplikationer är bara början.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Finansiering: Stöds av: NIH EY018239 (A.R.B., C.W.S. och R.E.R.), P30EY007551 (A.R.B.) och Sigma Xi Grant in Aid of Research (P.K.A.). Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte de officiella åsikterna från National Institutes of Health eller Sigma Xi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-CD31 antibody BD Bioscience, Pharmingen 550274
Anti-CD41 antibody BD Bioscience, Pharmingen 553847
Anti-Ly6G antibody BD Bioscience, Pharmingen 551459
Bovine serum albumin (BSA) ThermoFisher scientific B14
C57BL/6 mice Jackson Laboratories 664
DAPI Sigma Aldrich D8417
DeltaVision wide-field deconvolution fluorescence microscope GE Life Sciences
Dissecting microscope Leica microsystems
Electronic Toploading Balances (Weighing scale) Fisher Scientific
Ethanol ThermoFisher scientific T038181000CS
Golf-club spud Stephens instruments S2-1135
Iris curve scissors Fisher Scientific 31212
Isoflurane Patterson veterinary 07-893-1389
Ketamine Patterson veterinary 07-890-8598
Phospate buffered saline (PBS) ThermoFisher scientific AM9624
Sodium fluorescein salt Sigma Aldrich 46970
Surgical blade (scapel blade) Fine Science tools 10022-00
Trephine Integra Miltex 33-31
TritonX -100 Fisher Scientific 50-295-34
Forcep Fine Science tools 11923-13
Xylazine Patterson veterinary 07-808-1947

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
  2. Meek, K. M., Knupp, C. Corneal structure and transparency. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 1-16 (2015).
  3. Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmology. 66 (2), 190-194 (2018).
  4. Flaxman, S. R., et al. Global causes of blindness and distance vision impairment 1990-2020: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (12), 1221-1234 (2017).
  5. Robaei, D., Watson, S. Corneal blindness: A global problem. Clinical & Experimental Ophthalmology. 42 (3), 213-214 (2014).
  6. McGwin, G., Owsley, C. Incidence of emergency department-treated eye injury in the United States. Archives of Ophthalmology. 123 (5), 662-666 (2005).
  7. Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
  8. Wilson, S. L., Haj, A. J. E., Yang, Y. Control of scar tissue formation in the cornea: Strategies in clinical and corneal tissue engineering. Journal of Functional Biomaterials. 3 (3), 642 (2012).
  9. Vaidyanathan, U., et al. Persistent corneal epithelial defects: A review article. Medical Hypothesis, Discovery and Innovation in Ophthalmology. 8 (3), 163-176 (2019).
  10. Netto, M., et al. Wound healing in the cornea: a review of refractive surgery complications and new prospects for therapy. Cornea. 24 (5), 509-522 (2005).
  11. Friedenwald, J. S., Buschke, W. Some factors concerned in the mitotic and wound-healing activities of the corneal epithelium. Transactions of the American Ophthalmological Society. 42, 371-383 (1944).
  12. Xu, K., Yu, F. -S. X. Impaired epithelial wound healing and EGFR signaling pathways in the corneas of diabetic rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3301-3308 (2011).
  13. Bai, J. Q., Qin, H. F., Zhao, S. H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International Journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).
  14. Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Stepp, M. A., Zieske, J. D. αVβ6 integrin promotes corneal wound healing. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (11), 8505-8513 (2011).
  15. Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Zieske, J. D. Role of thrombospondin-1 in repair of penetrating corneal wounds. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (9), 6262-6268 (2013).
  16. Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
  17. Hargrave, A., et al. Corneal dysfunction precedes the onset of hyperglycemia in a mouse model of diet-induced obesity. PLoS ONE. 15, 0238750 (2020).
  18. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e2771 (2012).
  19. Bodner, L., Dayan, D. Effect of parotid submandibular and sublingual saliva on wound healing in rats. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Physiology. 100 (4), 887-890 (1991).
  20. Abbasian, B., Azizi, S., Esmaeili, A. Effects of rat's licking behavior on cutaneous wound healing. Iranian Journal of Basic Medical Sciences. 13 (1), 242-247 (2010).
  21. DeLisser, H. M., et al. Involvement of endothelial PECAM-1/CD31 in angiogenesis. The American Journal of Pathology. 151 (3), 671-677 (1997).
  22. Piali, L., et al. CD31/PECAM-1 is a ligand for alpha v beta 3 integrin involved in adhesion of leukocytes to endothelium. The Journal of Cell Biology. 130 (2), 451-460 (1995).
  23. Fleming, T. J., Fleming, M. L., Malek, T. R. Selective expression of Ly-6G on myeloid lineage cells in mouse bone marrow. RB6-8C5 mAb to granulocyte-differentiation antigen (Gr-1) detects members of the Ly-6 family. The Journal of Immunology. 151 (5), 2399-2408 (1993).
  24. Fleming, T. J., Malek, T. R. Multiple glycosylphosphatidylinositol-anchored Ly-6 molecules and transmembrane Ly-6E mediate inhibition of IL-2 production. The Journal of Immunology. 153 (5), 1955-1962 (1994).
  25. Phillips, D. R., Charo, I. F., Scarborough, R. M. GPIIb-IIIa: the responsive integrin. Cell. 65 (3), 359-362 (1991).
  26. Nieswandt, B., et al. Acute systemic reaction and lung alterations induced by an antiplatelet integrin gpIIb/IIIa antibody in mice. Blood. 94 (2), 684-693 (1999).
  27. Li, Z., Burns, A. R., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. γδ T cells are necessary for platelet and neutrophil accumulation in limbal vessels and efficient epithelial repair after corneal abrasion. American Journal of Pathology. 171 (3), 838-845 (2007).
  28. Liu, Q., Smith, C. W., Zhang, W., Burns, A. R., Li, Z. NK cells modulate the inflammatory response to corneal epithelial abrasion and thereby support wound healing. American Journal of Pathology. 181 (2), 452-462 (2012).
  29. Gao, Y., et al. NK cells are necessary for recovery of corneal CD11c+ dendritic cells after epithelial abrasion injury. Journal of Leukocyte Biology. 94 (2), 343-351 (2013).
  30. Xiao, C., et al. Acute tobacco smoke exposure exacerbates the inflammatory response to corneal wounds in mice via the sympathetic nervous system. Communications Biology. 2, 33 (2019).
  31. Wang, H., et al. Epothilone B speeds corneal nerve regrowth and functional recovery through microtubule stabilization and increased nerve beading. Scientific Reports. 8 (1), 2647 (2018).
  32. Li, Z., Burns, A. R., Smith, C. W. Lymphocyte function-associated Antigen-1-dependent inhibition of corneal wound healing. Cell Injury. 169, 1590-1600 (2006).
  33. Wu, M., et al. The neuroregenerative effects of topical decorin on the injured mouse cornea. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 1-14 (2020).
  34. Rodrigues, M., Kosaric, N., Bonham, C. A., Gurtner, G. C. Wound healing: A cellular perspective. Physiological Reviews. 99 (1), 665-706 (2019).
  35. Rennard, S. I. Inflammation and repair processes in chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160 (5), Pt 2 12-16 (1999).
  36. Landén, N. X., Li, D., Ståhle, M. Transition from inflammation to proliferation: a critical step during wound healing. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (20), 3861-3885 (2016).
  37. Li, Z., Rumbaut, R. E., Burns, A. R., Smith, C. W. Platelet response to corneal abrasion is necessary for acute inflammation and efficient re-epithelialteation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47, 4794-4802 (2006).
  38. Lam, F. W., Burns, A. R., Smith, C. W., Rumbaut, R. E. Platelets enhance neutrophil transendothelial migration via P-selectin glycoprotein ligand-1. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 300 (2), 468-475 (2011).
  39. La Cruz, A. D., et al. Platelet and erythrocyte extravasation across inflamed corneal venules depend on CD18, neutrophils, and mast cell degranulation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (14), 7360 (2021).
  40. Li, Z., Burns, A. R., Smith, C. W. Two waves of neutrophil emigration in response to corneal epithelial abrasion: Distinct adhesion molecule requirements. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (5), 1947-1955 (2006).
  41. Li, Z., Burns, A. R., Han, L., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. IL-17 and VEGF Are Necessary for Efficient Corneal Nerve Regeneration. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1106-1116 (2011).
  42. Xue, Y., et al. Modulation of circadian rhythms affects corneal epithelium renewal and repair in mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (3), 1865-1874 (2017).
  43. Zhang, W., Magadi, S., Li, Z., Smith, C. W., Burns, A. R. IL-20 promotes epithelial healing of the injured mouse cornea. Experimental Eye Research. 154, 22-29 (2017).
  44. Li, Z., Burns, A. R., Miller, S. B., Smith, C. W. CCL20, γδ T cells, and IL-22 in corneal epithelial healing. FASEB Journal. 25 (8), 2659-2668 (2011).
  45. Li, Z., Burns, A. R., Han, L., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. IL-17 and VEGF are necessary for efficient corneal nerve regeneration. American Journal of Pathology. 178 (3), 1106-1116 (2011).
  46. Reins, R. Y., Hanlon, S. D., Magadi, S., McDermott, A. M. Effects of topically applied Vitamin D during corneal wound healing. PLoS ONE. 11 (4), 0152889 (2016).
  47. Gagen, D., et al. ICAM-1 mediates surface contact between neutrophils and keratocytes following corneal epithelial abrasion in the mouse. Experimental Eye Research. 91 (5), 676-684 (2010).
  48. Li, Z., Rivera, C. A., Burns, A. R., Smith, C. W. Hindlimb unloading depresses corneal epithelial wound healing in mice. Journal of Applied Physiology. 97 (2), 641-647 (2004).
  49. Byeseda, S. E., et al. ICAM-1 is necessary for epithelial recruitment of γδ T cells and efficient corneal wound healing. American Journal of Pathology. 175 (2), 571-579 (2009).
  50. Li, Z., Burns, A. R., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. γδ T cells are necessary for platelet and neutrophil accumulation in limbal vessels and efficient epithelial repair after corneal abrasion. American Journal of Pathology. 171 (3), 838-845 (2007).
  51. Petrescu, M. S., et al. Neutrophil interactions with keratocytes during corneal epithelial wound healing: A role for CD18 integrins. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (11), 5023-5029 (2007).
  52. Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing. Experimental Eye Research. 93 (6), 927-936 (2011).
  53. Pal-Ghosh, S., et al. Cytokine deposition alters leukocyte morphology and initial recruitment of monocytes and γδT cells after corneal injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (4), 2757-2765 (2014).
  54. Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Jurjus, R. A., Zieske, J. D., Stepp, M. A. BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds. Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).
  55. Kato, T., Chang, J. H., Azar, D. T. Expression of type XVIII collagen during healing of corneal incisions and keratectomy wounds. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44 (1), 78-85 (2003).
  56. Kure, T., et al. Corneal neovascularization after excimer keratectomy wounds in matrilysin-deficient mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44 (1), 137-144 (2003).
  57. Lin, A., et al. Bacterial keratitis preferred practice pattern. Ophthalmology. 126 (1), 1-55 (2019).
  58. Cable, E. J., Onishi, K. G., Prendergast, B. J. Circadian rhythms accelerate wound healing in female Siberian hamsters. Physiology and Behavior. 171, 165-174 (2017).
  59. Lyons, A. B., Moy, L., Moy, R., Tung, R. Circadian rhythm and the skin: A review of the literature. Journal of Clinical and Aesthetic Dermatology. 12 (9), 42-45 (2019).
  60. Westman, J., Grinstein, S., Marques, P. E. Phagocytosis of Necrotic Debris at Sites of Injury and Inflammation. Frontiers in Immunology. 10, 3030 (2020).
  61. Gaudry, M., et al. Intracellular pool of vascular endothelial growth factor in human neutrophils. Blood. 90 (10), 4153-4161 (1997).
  62. Pan, Z., et al. Vascular endothelial growth factor promotes anatomical and functional recovery of injured peripheral nerves in the avascular cornea. FASEB Journal. 7, 2756-2767 (2013).
  63. Di, G., et al. VEGF-B promotes recovery of corneal innervations and trophic functions in diabetic mice. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
  64. Thomas, M. R., Storey, R. F. The role of platelets in inflammation. Thrombosis and Haemostasis. 114 (3), 449-458 (2015).
  65. Margraf, A., Zarbock, A. Platelets in inflammation and resolution. The Journal of Immunology. 203 (9), 2357-2367 (2019).

Tags

Medicin utgåva 178 hornhinna sårläkning nötning golfklubbspud trefin
En epitelial nötningsmodell för att studera hornhinnans sårläkning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Akowuah, P. K., De La Cruz, A.,… More

Akowuah, P. K., De La Cruz, A., Smith, C. W., Rumbaut, R. E., Burns, A. R. An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing. J. Vis. Exp. (178), e63112, doi:10.3791/63112 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter