Summary
Dit artikel beschrijft een op explantcultuur gebaseerde methode voor de isolatie en kweek van primaire, patiëntspecifieke menselijke aorta gladde spiercellen en dermale fibroblasten. Verder wordt een nieuwe methode gepresenteerd voor het meten van celcontractie en daaropvolgende analyse, die kan worden gebruikt om patiëntspecifieke verschillen in deze cellen te bestuderen.
Abstract
Gladde spiercellen (SMC's) zijn het overheersende celtype in de aortamedia. Hun contractiele machinerie is belangrijk voor de overdracht van kracht in de aorta en reguleert vasoconstrictie en vaatverwijding. Mutaties in genen die coderen voor de SMC contractiele apparaateiwitten zijn geassocieerd met aortaziekten, zoals thoracale aorta-aneurysma's. Het meten van SMC-contractie in vitro is een uitdaging, vooral op een high-throughput manier, wat essentieel is voor het screenen van patiëntmateriaal. De momenteel beschikbare methoden zijn niet geschikt voor dit doel. Dit artikel presenteert een nieuwe methode op basis van elektrische cel-substraat impedantie sensing (ECIS). Ten eerste wordt een explantprotocol beschreven om patiëntspecifieke menselijke primaire SMC's te isoleren van aortabiopten en patiëntspecifieke menselijke primaire dermale fibroblasten voor de studie van aorta-aneurysma's. Vervolgens wordt een gedetailleerde beschrijving gegeven van een nieuwe contractiemethode om de contractiele respons van deze cellen te meten, inclusief de daaropvolgende analyse en suggestie voor het vergelijken van verschillende groepen. Deze methode kan worden gebruikt om de samentrekking van adherente cellen te bestuderen in het kader van translationele (cardiovasculaire) studies en patiënt- en medicijnscreeningstudies.
Introduction
Gladde spiercellen (SMC's) zijn het overheersende celtype in de aortamediale laag, de dikste laag van de aorta. Binnen de muur zijn ze radiaal georiënteerd en zijn ze betrokken bij onder andere vasoconstrictie en vaatverwijding1. De SMC contractiele machinerie is betrokken bij de overdracht van kracht in de aorta via de functionele link met de extracellulaire matrix2. Mutaties in genen die coderen voor de eiwitten van het SMC-contractiele apparaat, zoals gladde spier myosine zware keten (MYH11) en gladde spier actine (ACTA2), zijn gerelateerd aan gevallen van familiale thoracale aorta-aneurysmata, wat de relevantie van SMC-contractie voor het behoud van de structurele en functionele integriteit van de aortaonderstreept 1,2 . Bovendien zijn mutaties in de TGFβ-signaleringsroute ook geassocieerd met aorta-aneurysma's en hun effecten in de pathofysiologie van aorta-aneurysma kunnen ook worden bestudeerd in huidfibroblasten3.
High-throughput meting van SMC-contractie in vitro is een uitdaging. Aangezien SMC-contractiliteit niet in vivo bij mensen kan worden gemeten, vormen in vitro testen op menselijke cellen een haalbaar alternatief. Bovendien wordt de ontwikkeling van abdominaal aorta-aneurysma (AAA) in diermodellen chemisch geïnduceerd door bijvoorbeeld elastaseperfusie, of veroorzaakt door een specifieke mutatie. Daarom zijn diergegevens niet vergelijkbaar met AAA-ontwikkeling bij mensen, die meestal een multifactoriële oorzaak heeft, zoals roken, leeftijd en / of atherosclerose. In vitro SMC-contractiliteit is tot nu toe voornamelijk gemeten door tractiekrachtmicroscopie 4,5, kwantificering van Fura-2 fluorescentie intracellulaire calciumfluxen6 en collageenrimpelingstests7. Hoewel tractiekrachtmicroscopie onschatbare numerieke inzichten biedt in de krachten die door een enkele cel worden gegenereerd, is het niet geschikt voor screening met hoge doorvoer vanwege de complexe wiskundige gegevensverwerking en de analyse van één cel tegelijk, wat betekent dat het zeer tijdrovend is om een representatief aantal cellen per donor te meten. Fura-2 kleurstof en collageen rimpeling assays maken de oppervlakkige bepaling van contractie mogelijk en geven geen precieze numerieke output, waardoor ze minder geschikt zijn voor het onderscheiden van patiëntspecifieke verschillen. Verminderde SMC-contractie in cellen afgeleid van de aorta van abdominale aorta-aneurysmapatiënten werd voor het eerst aangetoond door een nieuwe methode voor het meten van SMC-contractie in vitrote optimaliseren 8. Dit werd gedaan door de elektrische cel-substraat impedantie sensing (ECIS) methode opnieuw te gebruiken. ECIS is een real-time, medium-throughput assay voor de kwantificering van aanhangende celgedrag en contractie 9,10,11 zoals SMC-groei en -gedrag in wondgenezings- en migratietests 12,13,14. De exacte methode wordt beschreven in de protocolsectie. Op deze geoptimaliseerde manier kan het ECIS ook worden gebruikt om fibroblastcontractie te bestuderen vanwege hun vergelijkbare grootte en morfologie.
Het doel van dit artikel is om een stapsgewijze beschrijving te geven van de methode voor het meten van SMC-contractie in vitro met ecis8 en het vergelijken van de contractie tussen controle en patiënt SMC's. Eerst wordt de isolatie en kweek van primaire SMC's van controle- en patiëntaortabiopten uitgelegd, die kunnen worden gebruikt voor contractiemeting. Ten tweede worden contractiemetingen en -analyses, naast de verificatie van SMC-markerexpressie, beschreven. Verder beschrijft dit artikel de methode voor de isolatie van patiëntspecifieke dermale fibroblasten waarvan de contractie met dezelfde methodologie kan worden gemeten. Deze cellen kunnen worden gebruikt voor patiëntspecifieke studies gericht op aorta-aneurysma of andere cardiovasculaire pathologieën15 of prognostische studies met behulp van een transdifferentiatieprotocol dat contractiemeting voorafgaand aan aneurysmachirurgiemogelijk maakt 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Aortabiopten werden verkregen tijdens open aneurysmaherstel in Amsterdam Universitair Medische Centra, VU Medisch Centrum, Amsterdam, Zaans Medisch Centrum, Zaandam en Dijklander ziekenhuis, Hoorn, Nederland. Controle-aortaweefsel werd verkregen uit het stuk van de aorta dat aan de nierslagader was bevestigd en dat was geoogst voor niertransplantaties. Alleen patiënten ouder dan 18 jaar werden geïncludeerd en alle patiënten gaven hun geïnformeerde toestemming om deel te nemen aan het onderzoek. Al het materiaal werd verzameld in overeenstemming met de voorschriften van de WMA-verklaring van Helsinki en de institutionele richtlijnen van de Medisch Ethische Commissie van het VU Medisch Centrum. Alle experimenten en experimentele protocollen zijn uitgevoerd volgens institutionele richtlijnen en goedgekeurd door de Medisch Ethische Commissie van het VU Medisch Centrum. Voor volledige informatie over de gebruikte controle- en patiëntcellijnen, zie 8.
1. Primaire menselijke SMC's isoleren van aortabiopten
OPMERKING: Voer de volgende stappen uit onder een steriele weefselkweek laminaire stroomkap. Draag handschoenen en gebruik standaard aseptische technieken bij het hanteren van monsters van menselijk bloed en menselijk weefsel. SMC's worden gekweekt in 231 humane vasculaire gladde spiercel basaal medium aangevuld met 100 U / ml penicilline, 100 μg / ml streptomycine en smooth muscle growth supplement aangeduid als SMC-medium.
- Steriliseer twee paar chirurgische tangen en een scalpel door ze onder te dompelen in 70% ethanol en ze vervolgens droog te vegen.
- Pipetteer 2 ml SMC-medium in een petrischaaltje waarin de weefseldissectie zal worden uitgevoerd.
- Pipetteer 2,5 ml SMC-medium in twee T25-kolven. Draai de kolven rond zodat het kleine volume medium het hele oppervlak bedekt.
- Transporteer de geoogste menselijke aortawandbiopsie van de operatiekamer naar het laboratorium op ijs in een steriele plastic buis met koude, steriele weefseloverdrachtsoplossing (zie de tabel met materialen) of 0,9% NaCl.
- Open de buis met het weefsel in de weefselkweekkap. Haal de biopsie uit de buis met behulp van de gesteriliseerde tang en plaats deze in de petrischaal (figuur 1A).
- Inspecteer de biopsie visueel om de drie aortalagen te identificeren, de tunica intima (binnenste), media (midden) en adventitia (buitenste laag). Zoek naar de aanwezigheid van atherosclerotische plaques aan de intima-zijde en slijmerig bindweefsel aan de adventaire zijde (figuur 1B) om de lagen te onderscheiden.
- Als u SMC's wilt isoleren van de media, verwijdert u de andere twee lagen. Plaats het weefsel met de intima plaque eerst met de zijkant naar boven (figuur 1B). Verwijder de vaste plaque door deze met een tang van het weefsel weg te trekken terwijl u het weefsel met de andere tang naar beneden duwt. Verwijder de volgende lagen plaque totdat de roze, uniforme mediale laag zichtbaar is.
- Draai het weefsel om (figuur 1C). Herhaal dezelfde procedure, zoals in stap 1.7, door de adventiële laag eraf te trekken (figuur 1D). Zorg ervoor dat u alle zichtbare delen in zoveel pogingen verwijdert als nodig is, omdat deze laag niet gemakkelijk van de media loskomt.
OPMERKING: Het is essentieel dat de intimale en adventiële lagen op de juiste manier worden verwijderd om een zo schoon mogelijke SMC-populatie te verkrijgen. - Zodra de mediale laag is geïsoleerd, snijdt u het weefsel in blokjes van ongeveer 1 mm x 1 mm x 1 mm. Druk de media met een tang naar beneden en snijd het weefsel in één richting met behulp van het scalpel. Niet heen en weer snijden; maak schone, unidirectionele sneden om schade te minimaliseren. Probeer zoveel mogelijk blokjes te maken, gezien de grootte van de biopsie (figuur 1E).
- Plaats de weefselstukken met behulp van de tang in het bovenste kwart van de T25-kolf. Plaats 10-20 blokjes per kolf als de hoeveelheid materiaal dit toelaat (figuur 1F).
OPMERKING: Gebruik een gladde tang om de hechting van het weefsel aan de ribben van de tang te minimaliseren en het weefsel gemakkelijk los te maken in de kolf. - Incubeer de weefselblokjes in de T25-kolven gedurende ongeveer 10 dagen bij 5% CO2 bij 37 °C in een incubator.
OPMERKING: De eerste celuitgroei wordt rond die tijd verwacht. De cellen die in eerste instantie migreren, kunnen er kleiner uitzien dan normale SMC's. - Zodra de celgroei is waargenomen, voegt u 2,5 ml medium toe aan de kolf en zorgt u ervoor dat u deze niet op de weefselstukken pipetteert om te voorkomen dat ze losraken.
- Na nog ongeveer 5 dagen, wanneer clusters van cellen rond de weefselstukken worden waargenomen, verandert het kweekmedium. Als weefselstukken losraken, verwijder ze dan omdat ze niet opnieuw zullen hechten.
- Zodra de cellen voor 80-90% confluent zijn, breng je ze over naar een T75-kolf en ga je verder met kweken in dit formaat.
OPMERKING: Een split ratio van 1:2 of 1:3 wordt aanbevolen. Bevries een back-up van de cellen bij een vroege passage. De cellen behouden over het algemeen hun eigenschappen tot passage 10; latere passages mogen niet worden gebruikt voor experimenten.
2. Isoleren van primaire dermale fibroblasten uit huidbiopten
OPMERKING: Voer de volgende stappen uit onder een steriele weefselkweek laminaire stroomkap. Draag handschoenen en gebruik standaard aseptische technieken bij het hanteren van monsters van menselijk bloed en menselijk weefsel. Fibroblasten worden gekweekt in basaal medium aangevuld met 10% foetaal runderserum, 100 E / ml penicilline en 100 μg / ml streptomycine, aangeduid als fibroblastmedium.
- Steriliseer twee paar chirurgische tangen en een scalpel door ze in 70 % ethanol te dopen en vervolgens droog te vegen.
- Pipetteer 2 ml fibroblastmedium in een petrischaaltje waarin de weefseldissectie zal worden uitgevoerd.
- Pipetteer 2,5 ml fibroblastmedium in twee T25-kolven. Draai de kolven rond zodat het kleine volume medium het hele oppervlak bedekt.
- Transporteer de geoogste huidbiopsie van de operatiekamer naar het laboratorium op ijs in koude, steriele weefseloverdrachtsoplossing (zie de tabel met materialen) of 0,9% NaCl in een steriele plastic buis.
- Open de buis met het weefsel in de weefselkweekkap. Haal de biopsie uit de buis met behulp van de gesteriliseerde tang en plaats deze in de petrischaal (figuur 2A).
- Inspecteer de biopsie visueel om de drie huidlagen, de epidermis, dermis en onderhuids vet te identificeren. Zoek naar een herkenbaar huidoppervlak, soms met zichtbaar haar, om de opperhuid te identificeren. Zoek aan de andere kant naar het onderhuidse vet, dat vaak geel en slijmerig is. Identificeer de laag tussen de epidermis en het onderhuidse vet als de dermis - de bron van levensvatbare fibroblasten (figuur 2B).
- Om fibroblasten uit de dermis te isoleren, verwijdert u de andere twee lagen en plaatst u het weefsel op zijn kant zodat alle drie de lagen zichtbaar zijn.
OPMERKING: In tegenstelling tot het aortaweefsel kunnen huidlagen niet uit elkaar worden getrokken; daarom moeten ze worden gesneden. Het weefsel is ook rubberachtiger, waardoor het moeilijker te snijden is. Gebruik een scherp scalpel. - Houd het weefsel vast met een tang. Snijd parallel aan de grens tussen de opperhuid en de dermis. Knip de hele opperhuid weg. Probeer in één strakke lijn te snijden en beweeg niet heen en weer om weefselschade te voorkomen.
- Draai het weefsel om. Herhaal dezelfde procedure als in stap 2.8; snijd deze keer in de dermis parallel aan de grens met het onderhuidse vet.
- Zodra de dermis is geïsoleerd, snijdt u het weefsel in blokjes van ongeveer 1 x 1 x 1 mm3. Druk het weefsel met een tang naar beneden en snijd het weefsel in één richting met behulp van het scalpel. Niet heen en weer snijden; maak schone, unidirectionele sneden om schade te minimaliseren. Probeer zoveel mogelijk blokjes te maken, gezien de grootte van de biopsie (figuur 2C).
- Plaats de weefselstukken met behulp van de tang in het bovenste kwart van de T25-kolf. Plaats 10-20 blokjes per kolf als de hoeveelheid materiaal dit toelaat (figuur 2D).
OPMERKING: Gebruik een gladde tang om de hechting van het weefsel aan de ribben van de tang te minimaliseren en het weefsel gemakkelijk los te maken in de kolf. - Incubeer de weefselblokjes in de T25-kolven gedurende ongeveer 10 dagen bij 5% CO2 bij 37 °C in een incubator.
OPMERKING: De eerste celuitgroei wordt rond die tijd verwacht. De cellen die in eerste instantie migreren, kunnen er kleiner uitzien dan normale fibroblasten. - Zodra de celgroei is waargenomen, voegt u 2,5 ml medium toe aan de kolf en zorgt u ervoor dat u deze niet op de weefselstukken pipetteert om te voorkomen dat ze losraken.
- Na nog ongeveer 5 dagen, wanneer clusters van cellen rond de weefselstukken kunnen worden waargenomen, verandert het kweekmedium. Als weefselstukken losraken, verwijder ze dan omdat ze niet opnieuw zullen hechten.
- Zodra de cellen voor 80-90% confluent zijn, breng je ze over naar een T75-kolf en ga je verder met kweken in dit formaat.
OPMERKING: Een split ratio van 1:2 of 1:3 wordt aanbevolen. Bevries een back-up van de cellen bij een vroege passage. De cellen behouden over het algemeen hun eigenschappen tot passage 10; latere passages mogen niet worden gebruikt voor experimenten.
3. Meten van krimp (voorbeeld SMC's)
- Bereid een 96w10e ECIS-array voor (zie figuur 3A voor een representatief beeld van de array met vergrote elektroden en cellen die op de elektroden zijn gezaaid).
OPMERKING: Voer de volgende stappen uit onder een steriele weefselkweek laminaire stroomkap.- Coat een steriele 96w10e array met 200 μL van 10 mM L-cysteïne per put gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Was het bord twee keer met steriel water. Laat de plaat een nacht drogen in de weefselkweekkap met het deksel iets open.
OPMERKING: Het coaten van de plaat met L-cysteïne is alleen nodig wanneer u de plaat voor de eerste keer gebruikt. - De volgende dag, UV-steriliseren plaat en deksel gedurende 30 min. Draai het deksel naar boven zodat de binnenkant gesteriliseerd is. Zodra de plaat is gesteriliseerd, open de plaat niet buiten de stroomkap.
- Zaaicellen op de ECIS-array
- Verwarm 1% steriele gelatineoplossing gedurende 30 minuten voor in het waterbad.
OPMERKING: De oplossing wordt in de koelkast bewaard en kan stollen, waardoor het moeilijk te pipetteren is. - Bestrijk vervolgens de putjes met 100 μL van de 1 % gelatine-oplossing per put en incubeer de plaat bij 37 °C gedurende ten minste 1 uur.
- Zuig de gelatine uit de putjes.
- Tel de cellen met behulp van een geautomatiseerde celteller en zaai de SMC's in drievoud met een zaaidichtheid van 30.000 cellen / put in 200 μL SMC-medium.
- Plaats de plaat met de SMC's in de ECIS 96-puthouder in de celkweekincubator. Dubbelklik op de ECIS Applied Biophysics-software om het programma te openen en druk op de knop Setup (Instellingen ).
- Controleer of alle elektroden contact hebben met de houder (groen; rood als er geen verbinding is) in het linker onderste paneel met het label Well Configuration. Als de elektroden niet goed zijn aangesloten, past u de plaat in de houder aan voordat u met de meting begint.
- Selecteer het plaattype (array met 96 bronnen) in hetzelfde deelvenster door op Arraytype te klikken.
- Klik in het rechterbovenpaneel Data Collection Setup op enkele frequentie en wijzig de impedantiewaarde in 4000 Hz en het interval in 8 s.
- Klik op de knop Start om de metingen te starten. Wacht tot er een nieuw paneel wordt geopend, waar het ECIS-bestand kan worden opgeslagen.
- Laat de cellen zich hechten en stel een monolaag in gedurende 48 uur.
OPMERKING: De aanhechting en verspreiding van cellen op de elektroden genereren een basisweerstandswaarde (figuur 3B).
- Verwarm 1% steriele gelatineoplossing gedurende 30 minuten voor in het waterbad.
- Stimulatie van cellen om contractie te induceren
- Induceer SMC-contractie door de cellen te stimuleren met 10 μg / ml calciumionofoor, ionomycine.
OPMERKING: Ionomycine zal de instroom van extracellulaire Ca2+ induceren, waardoor de contractiele cascade wordt geactiveerd; zie figuur 4A voor representatieve beelden van niet-gestimuleerde en gestimuleerde gecontracteerde cellen. - Verdun 1 mg ionomycinepoeder in 100 μL dimethylsulfoxide tot een stockoplossing van 10 mg/ml en bewaar 10 μL aliquots bij -20 °C. Verdun vóór gebruik de ionomycine-oplossing 1:10 in SMC-medium om de werkoplossing te bereiden die aan de cellen moet worden toegevoegd.
- Voer de celstimulatie uit terwijl de array zich nog in de arrayhouder in de celkweekincubator bevindt en de elektroden aan het systeem zijn bevestigd.
- Om de cellen te stimuleren, verwijdert u het deksel en plaatst u het op een steriel oppervlak in de incubator. Bereid twee pipetten voor, ingesteld op 2 μL en 150 μL.
- Voordat u de stimulatie start, drukt u op Markeren in de software en plaatst u een opmerking.
OPMERKING: Dit maakt het gemakkelijker om de exacte timing van de stimulatie te vinden bij het analyseren van de gegevens. - Pipetteer 2 μL van de ionomycine-werkoplossing zo snel mogelijk in elke put. Zodra alle cellen zijn gestimuleerd, mengt u het medium in de putjes met behulp van de tweede pipet.
OPMERKING: Vanwege de snelle effecten is het niet nodig om tips tussen verschillende cellijnen en omstandigheden te veranderen. Werk snel tijdens het stimuleren en mengen omdat de ionomycine een acuut effect heeft. Stimuleer bij het stimuleren van een volle plaat maximaal 3 kolommen tegelijk. Wacht na elke stimulatie minstens 30 minuten tot de volgende stimulatie om de cellen te laten herstellen van de temperatuur- en CO2-verandering veroorzaakt door het openen van de incubatordeur. - Direct nadat de stimulatie is voltooid, drukt u nogmaals op Mark om een opmerking toe te voegen dat de stimulatie is voltooid.
- Het stimulatie-experiment afronden
- Noteer de impedantiewaarden gedurende ongeveer 5 minuten na de ionomycinestimulatie. Voltooi de opname door op Voltooien te drukken.
- Hergebruik de ECIS-arrays tot drie keer toe: was de putten tweemaal met steriel water en incubeer de plaat bij 37 °C gedurende 2-3 uur met trypsine of een vergelijkbaar reagens. Herhaal stap 3.1.2 en 3.1.3.
- Induceer SMC-contractie door de cellen te stimuleren met 10 μg / ml calciumionofoor, ionomycine.
- De gegevens exporteren
- Als u de gegevens wilt exporteren, klikt u op Bestand | Gegevens exporteren | naar Excel (geselecteerd). Selecteer een map om het bestand op te slaan.
- Klik op Scheiden wanneer het programma vraagt om bladen te combineren of te scheiden.
- Analyseren van de contractiele output
- Om de contractiele respons te berekenen, gebruikt u de volgende vergelijking (1), waarbij C contractie aangeeft (uitgedrukt in % verandering ten opzichte van baseline), prestimulatie (PrS) de weerstandswaarde aangeeft (uitgedrukt in Ω) net voor ionomycinestimulatie en poststimulatie (PoS) de weerstand aangeeft (uitgedrukt in Ω) 2 minuten na het beëindigen van de stimulatie.
(1)
OPMERKING: Zoals weergegeven in vergelijking (1), wordt de impedantiewaarde van een goed gevuld met kweekmedium zonder toegevoegde cellen (waarde van 290 Ω) afgetrokken van alle resultaten in de uiteindelijke berekening. Het wordt aanbevolen om contractiele responsen in drievoud in elk experiment te meten en drie onafhankelijke experimenten uit te voeren met dezelfde cellijn om rekening te houden met eventuele inter- en intra-experimentele variatie. - Zodra de drie onafhankelijke experimenten zijn uitgevoerd, groepeert u de gegevens samen door het gemiddelde van de drie metingen te berekenen, inclusief de standaarddeviatie (SD).
- Om de contractiele respons te berekenen, gebruikt u de volgende vergelijking (1), waarbij C contractie aangeeft (uitgedrukt in % verandering ten opzichte van baseline), prestimulatie (PrS) de weerstandswaarde aangeeft (uitgedrukt in Ω) net voor ionomycinestimulatie en poststimulatie (PoS) de weerstand aangeeft (uitgedrukt in Ω) 2 minuten na het beëindigen van de stimulatie.
- Verschillende groepen vergelijken
- Om het bereik van normale contractie te definiëren en daaropvolgende specifieke onderzoeksvragen te onderzoeken, gebruikt u de controlegroep om "normale contractie" te definiëren en te vergelijken met de contractiele respons van patiënten of behandelingsgroepen.
- Bereken het gemiddelde en de SD van de hele controlegroep, d.w.z. van de eindwaarden voor alle cellijnen, zoals beschreven in stap 3.5.2.
- Gebruik het bereik van de gemiddelde ± 2SD om cellen in de andere groep te identificeren die buiten dit bereik vallen, wat aangeeft dat ze een veranderde contractiele respons hebben.
OPMERKING: Het mechanisme achter de veranderde contractiele respons is onderhevig aan specifieke onderzoeksvragen en is cel- en conditieafhankelijk en zal niet in dit protocol worden besproken.
(1)4. Detectie van de aanwezigheid van SMC-specifieke markers
- RNA-isolatie
- Zaai dezelfde patiëntspecifieke cellijnen die worden gebruikt voor de contractiemetingen in 6-putplaten, één put per cellijn. Tel de cellen met behulp van een geautomatiseerde celteller en zaai de cellen met een zaaidichtheid van 200.000 cellen / put in SMC-medium en laat ze zich 's nachts hechten.
- Was de cellen eenmaal met steriel PBS.
- Lyse de cellen en isoleer de cellen volgens de instructies van de fabrikant.
- cDNA synthese
- Voer cDNA-synthese uit in 20 μL van een omgekeerd transcriptiereactiemengsel. Verdun de concentraties van totaal geïsoleerd RNA volgens de instructies van de fabrikant.
- QPCR
- Meet de genexpressie van SMC-markergenen, bijvoorbeeld ACTA2, CNN1, SMTN en TAGLN om te bevestigen dat de geïsoleerde cellen inderdaad SMC's zijn en SMC-markers te detecteren. Controleer op correlatie van de resultaten met de contractiele output.
- Gebruik ten minste twee huishoudgenen om de gegevens te normaliseren, bijvoorbeeld YWHAZ en TBP.
OPMERKING: De qPCR-uitvoering en -analyse kunnen worden uitgevoerd met behulp van verschillende PCR-machines en compatibele software, afhankelijk van wat beschikbaar en geoptimaliseerd is in het laboratorium. Zie aanvullende tabel S1 voor primersequenties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de reproduceerbaarheid van deze methode te testen, werd de methode eerst gevalideerd met alleen controle-SMC's. Om de reproduceerbaarheid van interexperimentele metingen te bepalen, werden twee onafhankelijke metingen van alle geïncludeerde controle- en patiëntcellijnen uitgezet als een Bland-Altman-plot (figuur 3B). De plot toonde aan dat deze methode geen variabiliteit vertoont buiten het betrouwbaarheidsinterval, behalve voor één uitschieter cellijn. Bovendien toonden deze resultaten aan dat twee putten die binnen hetzelfde experiment zijn gezaaid en tegelijkertijd zijn gestimuleerd, praktisch dezelfde contractiele responscurve vertonen (figuur 4C). Om te valideren of de getoonde respons contractie is en geen osmotische stress vanwege ionomycinestimulatie, werd het medium na stimulatie vervangen en werd het gedrag van de cellen geregistreerd. Hieruit blijkt dat de gestimuleerde cellen zich weer over de elektrode begonnen te verspreiden (figuur 4D).
Als eerste toepassing van deze nieuwe methode was de contractiele respons bij SMC's afgeleid van gezonde, niet-verwijde aorta's (n=6) en abdominale aorta-aneurysma (AAA)-patiënten (n=21; Figuur 5A) werd gemeten, zoals eerder getoond8. De mediane respons van de controlegroep was 61% (46-77%), vergeleken met de mediane respons, 52% (15-75%), van de patiëntengroep. De waarden waren niet significant verschillend en er werd een hogere variabiliteit opgemerkt in de patiëntengroep. Vanwege de nieuwheid van de methode werd de controlegroep gebruikt om "normale" contractie te bepalen. Figuur 5B toont het gemiddelde en ± 2SD-bereik van de controlegroep en hoe dit bereik wordt gebruikt om vier patiënten te identificeren die lagere contractiewaarden hebben dan de "normale" waarden. Het bepalen van de oorzaak van verminderde contractie is het doel van een afzonderlijke mechanistische studie. Een westerse botanalyse werd uitgevoerd om te bepalen of de SMC die voor het experiment werd gebruikt, SMC-contractiele markers tot expressie brengt. De western blot-analyse (figuur 6A) en de daaropvolgende kwantificering (figuur 6B) bevestigen dat de cellen SMC-markers tot expressie brengen. De markerexpressie in de groepen was variabel en correleerde niet met de contractiele output. Om de proliferatieve capaciteit van de SMC te bepalen, werd qPCR voor Ki67 uitgevoerd (figuur 6C). Ki67-expressie was detecteerbaar in alle cellen, maar correleerde niet met de contractiele output.
Figuur 1: SMC-isolatie van aorta-AAA-weefsel. (A) Materialen die nodig zijn voor SMC-isolatie van aortaweefsel: aortaweefsel in een petrischaaltje, SMC-medium, twee T25-kolven gevuld met SMC-medium, scalpel en twee paar chirurgische tangen. (B) Intimale zijde van de aortawand met atherosclerotische plaques. (C) Adventiële laag van de aortawand. (D) Scheiding van de tunica media en tunica adventitia door te trekken met de tang. (E) Nadat het tunicamedium is geïsoleerd, wordt weefsel in kleine stukjes gesneden met behulp van een tang en het scalpel. (F) Stukjes weefsel in de T25-kolf. Afkortingen: AAA = abdominal aortic aneurysm ; SMC = gladde spiercel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Fibroblastisolatie van huidweefsel. (A) Materialen die nodig zijn voor fibroblastisolatie van huidweefsel: dermale weefsel in een petrischaaltje, fibroblastmedium, twee T25-kolven gevuld met fibroblastmedium, scalpel en twee paar chirurgische tangen. (B) Huidbiopsie met onderhuids vet aan de bovenzijde. (C) Nadat de dermis is geïsoleerd, wordt weefsel in kleine stukjes gesneden met behulp van een tang en het scalpel. (D) Stukjes weefsel in de T25-kolf. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: ECIS-plaatopstelling en grafische weergave van aorta SMC-contractie. (A) Links; een 96-well ECIS plaat. Midden; vergroting van één put van de ECIS-plaat, met de tien elektroden op de bodem van de put. Juist; lichtmicroscoopbeeld van de SMC's die op de ECIS-plaat zijn gezaaid; vergroting 10x. (B) Weerstandscurven gemeten door ECIS na zaaien van controle-SMC's in drievoud. Dikke blauwe lijn vertegenwoordigt het gemiddelde van het drievoud en stippellijnen vertegenwoordigen de SD van de drievouden. In de eerste 4-5 uur na het zaaien verspreiden SMC's zich over het hele oppervlak en wordt een hoge weerstand (~ 1000 Ω) gemeten. Zodra een stabiele SMC-monolaag is gevormd, neemt de weerstand in de loop van de tijd af tot ongeveer 500 Ω. Dit cijfer is gewijzigd van 8. Afkortingen: ECIS = electric cell-substrate impedance sensing; SMC = gladde spiercel; SD = standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Het meten van SMC-contractie met ECIS. (A) Links; SMC monolaag van controle SMC's voorafgaand aan stimulatie voor contractie. Juist; controle SMC's na stimulatie voor contractie. Vergroting 10x. (B) Verschilplot dat interexperimentele meetreproduceerbaarheid aantoont tussen twee afzonderlijke contractiemetingen. Stippellijnen vertegenwoordigen het 95% betrouwbaarheidsinterval en de dikke mediale lijn vertegenwoordigt het gemiddelde van twee interexperimentele metingen. Elk datapunt vertegenwoordigt de afwijking van het gemiddelde van twee onafhankelijke metingen van de hele dataset van controles en patiënten (Paars ●; n = 27). (C) Intraexperimentele reproduceerbaarheid van ECIS-contractiemetingen. Weerstandscurven gegenereerd door controle SMC gezaaid in twee putten. Verticale stippellijn markeert de stimulatie. (D) Celherstel na stimulatie van contractie. Dikke blauwe lijn vertegenwoordigt de weerstandswaarde van een niet-gestimuleerde controle-SMC. Gestippelde blauwe lijn vertegenwoordigt de weerstandswaarde van dezelfde controle SMC-lijn, na stimulatie gemarkeerd door de verticale gestippelde zwarte lijn. Ongeveer 1 uur na stimulatie (dikke verticale gestippelde zwarte lijn), werd het medium in beide omstandigheden ververst om de stimulus te verwijderen en werd het herstel van de cellen nog eens 3,5 uur gevolgd. Weerstandswaarden werden genormaliseerd naar de waardenprestimulatie om het gedrag van cellen na stimulatie te volgen. Dit cijfer is gewijzigd van 8. Afkortingen: ECIS = electric cell-substrate impedance sensing; SMC = gladde spiercel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: SMC-contractie onder controle en SMC's van AAA-patiënten bij ionomycinestimulatie. (A) Gemiddelde contractiele respons van controle (Blauw ●; n = 6) en AAA-patiënt (Rood ●; n = 21) SMC's op ionomycinestimulatie afgeleid van meerdere experimenten. (B) Gemiddelde contractiele respons van controle (blauw ●; n = 6), normale contractering (rood ●; n = 15) en lage contractering (rood ●; n = 6) SMC's van AAA-patiënten afgeleid van meerdere experimenten. Contractie wordt uitgedrukt in percentages van afname ten opzichte van de uitgangswaarde voorafgaand aan stimulatie. Horizontale zwarte lijn vertegenwoordigt de gemiddelde contractiele respons van controle-SMC's. Gestippelde horizontale lijnen markeren twee SSD's boven en onder het gemiddelde van de controlegroep. De lage contractgroep wordt gedefinieerd als een krimp lager dan twee SSD's onder het gemiddelde van de controlegroep. Boxplot wordt weergegeven als mediaan met bereik. Dit cijfer is gewijzigd van 8. Afkortingen: AAA = abdominale aorta-aneurysma; ECIS = elektrische cel-substraat impedantie detectie; SMC = gladde spiercel; SD = standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: SMC-markerexpressie. SMC contractiele en proliferatieve markers werden geanalyseerd in SMC van controle (Δ; n = 6), normale contractering, (●; n = 15) en lage contractering (○; n = 6). (A) Western blot analyse van SMC gebruikt voor de contractie experimenten. aSMA, calponine en SM22 werden gekwantificeerd en Tubulin werd gebruikt als belastingscontrole. (B) Kwantificering van western blot afgebeeld in (A). (C) qPCR-analyse van Ki67-proliferatiemarker. Dit cijfer is gewijzigd van 8. Afkortingen: SMC = gladde spiercel; aSMA = alfa Gladde Spier Actine; qPCR = kwantitatieve PCR. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende tabel S1: Primersequenties. Voorwaartse en omgekeerde qPCR-primersequenties van geanalyseerde huishoudings- en SMC-markergenen. Deze tabel is gewijzigd van 8. Afkortingen: SMC = gladde spiercel; qPCR = kwantitatieve PCR. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit artikel presenteert een methode om SMC-contractie in vitro te meten, gebaseerd op de veranderingen in impedantie en oppervlaktebezetting. Eerst wordt de isolatie, kweek en uitbreiding van patiëntspecifieke primaire menselijke SMC's en huidfibroblasten beschreven, gevolgd door hoe ze te gebruiken voor contractiemetingen.
Een beperking van het onderzoek houdt verband met het verkrijgen van de cellen via een explantprotocol. De cellen die zich vermenigvuldigen uit de biopsie kunnen andere eigenschappen hebben dan het oorspronkelijke weefsel in vivo. Bovendien zijn de hier gepresenteerde explantprotocollen niet innovatief, maar zijn ze opgenomen om een complete workflow te presenteren van, in dit geval, patiëntspecifiek aorta-aneurysmamateriaal tot contractiemetingen. Het kweken van de cellen in vitro kan ook sommige van hun eigenschappen beïnvloeden vanwege het gebrek aan systemische factoren en verschillende substraatstijfheid. Dit kan de variabiliteit in SMC-markerexpressie verklaren. Vanwege de afwezigheid van betrouwbare fibroblastmarkers worden fibroblasten meestal onderscheiden op basis van de afwezigheid van markers in vergelijking met andere cellen. We hebben de fibroblasten dus niet gekarakteriseerd die met dit protocol zijn geïsoleerd. Een andere beperking is dat het meten van contractie als factor van het oppervlak enigszins indirect blijft. De mogelijke gevolgen zijn dat de output afkomstig is van het gemiddelde van de reactie van de hele put die duizenden cellen bevat. Het kan dus niet worden bepaald of alle cellen minder samentrekken of dat er cellen zijn die het gemiddelde verlagen.
SMC-contractiliteit werd eerder bestudeerd met behulp van verschillende technieken. In vergelijking met tractiekrachtmicroscopie4 heeft ECIS meerdere voordelen, voornamelijk een hogere doorvoer en tijdsefficiëntie. Zoals vermeld in de beperkingen, is de afweging dat de contractiemetingen indirect worden verkregen, waardoor ECIS geschikter is voor het screenen van grotere aantallen cellijnen en groepen en het meten van tractiekracht voor meer diepgaande eencellige mechanistische studies. Calciumgradiënten6 werden eerder gebruikt als indicatoren van contractie; ECIS biedt een betrouwbaardere contractiemeting omdat het de voortbeweging van de cel meet. Kwantificering van beelden van collageenrimpels veroorzaakt door de samentrekking van de cellen die in de gel zijn gezaaid5 geeft een gemiddelde van de hele populatie van gezaaide cellen, vergelijkbaar met ECIS. De metingen die via ECIS worden verkregen, zijn echter veel nauwkeuriger en bieden real-time monitoring gedurende de hele loop van de observatie, waardoor ze aanzienlijk informatiever zijn.
Concluderend beschrijft dit artikel een nieuwe toepassing voor het ECIS-systeem, dat kan worden gebruikt om de samentrekking van aanhangende cellen, zoals SMC's en fibroblasten, te meten. Deze methode kan worden gebruikt om meerdere cellijnen tijdig en efficiënt te bestuderen, waardoor het geschikt is voor screening van patiënten of geneesmiddelen. In lijn met onderzoek naar aorta-aneurysma's kan deze methode ook worden gebruikt om SMC's van patiënten met andere cardiovasculaire aandoeningen, zoals dissecties en atherosclerose, te screenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
Wij danken Tara van Merrienboer, Albert van Wijk, Jolanda van der Velden, Jan D. Blankensteijn, Lan Tran, Peter L. Hordijk, het PAREL-AAA team en alle vaatchirurgen van het Amsterdam UMC, Zaans Medisch Centrum en Dijklander ziekenhuis voor het leveren van materialen en ondersteuning voor dit onderzoek.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well Array | Applied Biophysics | 96W10idf PET | Array used to measure contraction in the ECIS setup |
| Custodiol | Dr. Franz Höhler Chemie GmbH | RVG 12801 | Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | Solution used to dilute ionomycin |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140079 | Addition to cell culture medium |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Gibco | 11550043 | Medium used to culture skin fibroblasts |
| Human Vascular Smooth Muscle Cell Basal Medium (formerly ''Medium 231'') | Gibco | M231500 | Medium used to culture smooth muscle cells |
| Invitrogen countess II | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | Automated cell counter |
| Ionomycin calcium salt from Streptomyces conglobatus | Sigma-Aldrich | I0634-1MG | Compound used for contraction stimulation |
| NaCl 0.9% | Fresenius Kabi | B230561 | Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Antibiotics used for cell culture medium |
| Phospathe buffered saline | Gibco | 10010023 | Used to wash cells |
| Quick-RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R1055 | Kit used for RNA isolation |
| Smooth Muscle Growth Supplement (SMGS) | Gibco | S00725 | Supplement which is added to smooth muscle cell culture medium |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | 11754250 | Kit used for cDNA synthesis |
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | Reagent for qPCR |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | Used to trypsinize cells |
| ZTheta | Applied Biophysics | ZTheta | ECIS instrument used for contraction measurements |
References
- Milewicz, D. M., et al. Genetic basis of thoracic aortic aneurysms and dissections: focus on smooth muscle cell contractile dysfunction. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 9, 283-302 (2008).
- Milewicz, D. M., et al. Altered smooth muscle cell force generation as a driver of thoracic aortic aneurysms and dissections. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 26-34 (2017).
- Groeneveld, M. E., et al. Betaglycan (TGFBR3) up-regulation correlates with increased TGF-β signaling in Marfan patient fibroblasts in vitro. Cardiovascular Pathology. 32, 44-49 (2018).
- Chen, J., Li, H., SundarRaj, N., Wang, J. H. C. Alpha-smooth muscle actin expression enhances cell traction force. Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (4), 248-257 (2007).
- Peyton, S. R., Putnam, A. J. Extracellular matrix rigidity governs smooth muscle cell motility in a biphasic fashion. Journal of Cellular Physiology. 204 (1), 198-209 (2005).
- Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2. Nature. 318 (6046), 558-561 (1985).
- Wu, D., et al. NLRP3 (nucleotide oligomerization domain-like receptor family, pyrin domain containing 3)-caspase-1 inflammasome degrades contractile proteins: implications for aortic biomechanical dysfunction and aneurysm and dissection formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (4), 694-706 (2017).
- Bogunovic, N., et al. Impaired smooth muscle cell contractility as a novel concept of abdominal aortic aneurysm pathophysiology. Scientific Reports. 9 (1), 1-14 (2019).
- Hurst, V., Goldberg, P. L., Minnear, F. L., Heimark, R. L., Vincent, P. A. Rearrangement of adherens junctions by transforming growth factor-β1: role of contraction. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 276 (4), 582-595 (1999).
- Hu, N., et al. Comparison between ECIS and LAPS for establishing a cardiomyocyte-based biosensor. Sensors and Actuators B: Chemical. 185, 238-244 (2013).
- Peters, M. F., Lamore, S. D., Guo, L., Scott, C. W., Kolaja, K. L. Human stem cell-derived cardiomyocytes in cellular impedance assays: bringing cardiotoxicity screening to the front line. Cardiovascular Toxicology. 15 (2), 127-139 (2015).
- Zhang, S., Yang, Y., Kone, B. C., Allen, J. C., Kahn, A. M. Insulin-stimulated cyclic guanosine monophosphate inhibits vascular smooth muscle cell migration by inhibiting Ca/calmodulin-dependent protein kinase II. Circulation. 107 (11), 1539-1544 (2003).
- Halterman, J. A., Kwon, H. M., Zargham, R., Bortz, P. D. S., Wamhoff, B. R. Nuclear factor of activated T cells 5 regulates vascular smooth muscle cell phenotypic modulation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (10), 2287-2296 (2011).
- Bass, H. M., Beard, R. S., Cha, B. J., Yuan, S. Y., Nelson, P. R. Thrombomodulin induces a quiescent phenotype and inhibits migration in vascular smooth muscle cells in vitro. Annals of Vascular Surgery. 30, 149-156 (2016).
- Burger, J., et al. Molecular phenotyping and functional assessment of smooth muscle like-cells with pathogenic variants in aneurysm genes ACTA2, MYH11, SMAD3 and FBN1. Human Molecular Genetics. , (2021).
- Yeung, K. K., et al. Transdifferentiation of human dermal fibroblasts to smooth muscle-like cells to study the effect of MYH11 and ACTA2 mutations in aortic aneurysms. Human Mutation. 38 (4), 439-450 (2017).
