Summary
Este artículo describe un método basado en el cultivo de explantes para el aislamiento y cultivo de células primarias del músculo liso aórtico humano específico del paciente y fibroblastos dérmicos. Además, se presenta un nuevo método para medir la contracción celular y el análisis posterior, que se puede utilizar para estudiar las diferencias específicas del paciente en estas células.
Abstract
Las células del músculo liso (SMC) son el tipo de célula predominante en los medios aórticos. Su maquinaria contráctil es importante para la transmisión de la fuerza en la aorta y regula la vasoconstricción y la vasodilatación. Las mutaciones en los genes que codifican para las proteínas del aparato contráctil SMC están asociadas con enfermedades aórticas, como los aneurismas de la aorta torácica. Medir la contracción de SMC in vitro es un desafío, especialmente de una manera de alto rendimiento, que es esencial para la detección de material del paciente. Los métodos actualmente disponibles no son adecuados para este propósito. Este artículo presenta un nuevo método basado en la detección de impedancia célula-sustrato eléctrico (ECIS). En primer lugar, se describe un protocolo de explante para aislar las SMC primarias humanas específicas del paciente a partir de biopsias aórticas y fibroblastos dérmicos primarios humanos específicos del paciente para el estudio de los aneurismas aórticos. A continuación, se da una descripción detallada de un nuevo método de contracción para medir la respuesta contráctil de estas células, incluido el análisis posterior y la sugerencia para comparar diferentes grupos. Este método se puede utilizar para estudiar la contracción de las células adherentes en el contexto de estudios traslacionales (cardiovasculares) y estudios de detección de pacientes y fármacos.
Introduction
Las células del músculo liso (SMC) son el tipo de célula predominante en la capa medial aórtica, la capa más gruesa de la aorta. Dentro de la pared, están orientados radialmente y están implicados, entre otras funciones, en la vasoconstricción y vasodilatación1. La maquinaria contráctil SMC está implicada en la transmisión de la fuerza en la aorta a través del enlace funcional con la matriz extracelular2. Las mutaciones en genes que codifican para las proteínas del aparato contráctil SMC, como la cadena pesada de miosina del músculo liso (MYH11) y la actina del músculo liso (ACTA2), se han relacionado con casos de aneurismas aórticos torácicos familiares, lo que subraya la relevancia de la contracción SMC en el mantenimiento de la integridad estructural y funcional de la aorta 1,2 . Además, las mutaciones en la vía de señalización TGFβ también se asocian con aneurismas aórticos, y sus efectos en la fisiopatología del aneurisma aórtico también se pueden estudiar en fibroblastos cutáneos3.
La medición de alto rendimiento de la contracción de SMC in vitro es un desafío. Como la contractilidad de SMC no se puede medir in vivo en humanos, los ensayos in vitro en células humanas presentan una alternativa factible. Además, el desarrollo del aneurisma aórtico abdominal (AAA) en modelos animales es inducido químicamente por, por ejemplo, la perfusión de elastasa o causado por una mutación específica. Por lo tanto, los datos en animales no son comparables al desarrollo de AAA en humanos, que en su mayoría tiene una causa multifactorial, como fumar, la edad y / o la aterosclerosis. In vitro Hasta ahora, la contractilidad de SMC se ha medido principalmente mediante microscopía de fuerza de tracción 4,5, cuantificación de flujos de calcio intracelulares de fluorescencia Fura-26 y ensayos de arrugas de colágeno7. Si bien la microscopía de fuerza de tracción proporciona una visión numérica invaluable de las fuerzas generadas por una sola célula, no es adecuada para la detección de alto rendimiento debido al complejo procesamiento matemático de datos y el análisis de una célula a la vez, lo que significa que lleva mucho tiempo medir un número representativo de células por donante. Los ensayos de colorante Fura-2 y arrugas de colágeno permiten la determinación superficial de la contracción y no dan una salida numérica precisa, lo que los hace menos adecuados para discriminar las diferencias específicas del paciente. La alteración de la contracción de SMC en células derivadas de la aorta de pacientes con aneurisma aórtico abdominal se demostró por primera vez mediante la optimización de un nuevo método para medir la contracción de SMC in vitro8. Esto se hizo reutilizando el método de detección de impedancia célula-sustrato eléctrico (ECIS). ECIS es un ensayo en tiempo real de rendimiento medio para la cuantificación del comportamiento y la contracción de las células adherentes 9,10,11, como el crecimiento y el comportamiento de SMC en ensayos de cicatrización de heridas y migración 12,13,14. El método exacto se describe en la sección de protocolo. De esta manera optimizada, el ECIS también se puede utilizar para estudiar la contracción de los fibroblastos debido a su tamaño y morfología similares.
El objetivo de este artículo es proporcionar una descripción gradual del método para medir la contracción de SMC in vitro utilizando ECIS8 y comparar la contracción entre los SMC de control y pacientes. En primer lugar, se explica el aislamiento y el cultivo de los SMC primarios a partir de biopsias de control y aórticas de pacientes, que pueden utilizarse para la medición de la contracción. En segundo lugar, se describen las mediciones y el análisis de la contracción, junto con la verificación de la expresión del marcador SMC. Además, en este trabajo se describe el método para el aislamiento de fibroblastos dérmicos específicos del paciente cuya contracción puede medirse utilizando la misma metodología. Estas células pueden ser utilizadas para estudios específicos del paciente centrados en el aneurisma aórtico u otras patologías cardiovasculares15 o estudios pronósticos utilizando un protocolo de transdiferenciación que permite la medición de la contracción antes de la cirugía de aneurisma16.
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Protocol
NOTA: Las biopsias aórticas se obtuvieron durante la reparación de aneurismas abiertos en los Centros Médicos de la Universidad de Ámsterdam, el Centro Médico de la Universidad VU, Ámsterdam, zaans Medisch Centrum, el hospital Zaandam y Dijklander, Hoorn, Países Bajos. El tejido aórtico de control se obtuvo a partir de la pieza de la aorta unida a la arteria renal cosechada para trasplantes renales. Solo se incluyeron pacientes mayores de 18 años, y todos los pacientes dieron su consentimiento informado para participar en el estudio. Todo el material fue recolectado de acuerdo con las regulaciones de la Declaración de Helsinki de la AMM y las pautas institucionales del Comité de Ética Médica del Centro Médico VU. Todos los experimentos y protocolos experimentales se realizaron de acuerdo con las pautas institucionales y fueron aprobados por el Comité de Ética Médica del Centro Médico VU. Para obtener información completa sobre el control y las líneas celulares de pacientes utilizadas, consulte 8.
1. Aislar los SMC humanos primarios de biopsias aórticas
NOTA: Realice los siguientes pasos bajo una campana de flujo laminar de cultivo de tejido estéril. Use guantes y use técnicas asépticas estándar cuando manipule muestras de sangre humana y tejido humano. Los SMC se cultivan en 231 medios basales de células del músculo liso vascular humano suplementados con penicilina de 100 U / ml, estreptomicina de 100 μg / ml y suplemento de crecimiento muscular liso conocido como medio SMC.
- Esteriliza dos pares de pinzas quirúrgicas y un bisturí sumergiéndolas en etanol al 70% y posteriormente secándolas.
- Pipeta 2 mL de medio SMC en una placa de Petri en la que se realizará la disección tisular.
- Pipete 2,5 mL de medio SMC en dos matraces T25. Gire los matraces alrededor para que el pequeño volumen de medio cubra toda la superficie.
- Transportar la biopsia de la pared aórtica humana recolectada desde el quirófano hasta el laboratorio en hielo en un tubo de plástico estéril con solución de transferencia de tejido frío y estéril (consulte la Tabla de materiales) o NaCl al 0,9%.
- Abra el tubo con el tejido dentro de la campana de cultivo de tejidos. Saque la biopsia del tubo con los fórceps esterilizados y colóquela en la placa de Petri (Figura 1A).
- Inspeccione visualmente la biopsia para identificar las tres capas aórticas, la túnica íntima (interna), media (media) y adventicia (capa externa). Busque la presencia de placas ateroscleróticas en el lado íntimo y tejido conectivo viscoso en el lado adventicio (Figura 1B) para distinguir las capas.
- Para aislar las SMC de los medios, quite las otras dos capas. Coloque primero el tejido con el lado de la placa íntima hacia arriba (Figura 1B). Retire la placa sólida alejándola del tejido con fórceps mientras empuja el tejido hacia abajo con el otro par de fórceps. Retire las capas posteriores de placa hasta que la capa medial rosada y uniforme sea visible.
- Voltee el tejido (Figura 1C). Repita el mismo procedimiento, como en el paso 1.7, sacando la capa adventitial (Figura 1D). Asegúrese de eliminar todas las partes visibles en tantos intentos como sea necesario, ya que esta capa no se separará fácilmente de los medios.
NOTA: Es esencial que las capas íntimas y adventicias se eliminen adecuadamente para obtener una población SMC lo más limpia posible. - Una vez aislada la capa medial, cortar el tejido en cubos de aproximadamente 1 mm x 1 mm x 1 mm. Presione los medios hacia abajo con fórceps y corte el tejido en una dirección con el bisturí. No corte hacia adelante y hacia atrás; hacer cortes limpios y unidireccionales para minimizar el daño. Trate de hacer tantos cubos como sea posible, dado el tamaño de la biopsia (Figura 1E).
- Coloque las piezas de tejido en el cuarto superior del matraz T25 usando las pinzas. Coloque 10-20 cubos por matraz si la cantidad de material lo permite (Figura 1F).
NOTA: Use fórceps lisos para minimizar la adhesión del tejido a las costillas de los fórceps y separe fácilmente el tejido en el matraz. - Incubar los cubos de tejido en los matraces T25 durante aproximadamente 10 días al 5% de CO2 a 37 °C en una incubadora.
NOTA: Se espera el primer crecimiento celular alrededor de ese momento. Las células que migran inicialmente pueden parecer más pequeñas que las SMC normales. - Una vez que se observe el crecimiento celular, agregue 2.5 ml de medio al matraz, asegurándose de no pipetearlo sobre las piezas de tejido para evitar que se desprendan.
- Después de aproximadamente 5 días más, cuando se observan grupos de células alrededor de las piezas de tejido, cambie el medio de cultivo. Si las piezas de tejido se desprenden, retírelas ya que no se volverán a unir.
- Una vez que las células sean 80-90% confluentes, transfiéralas a un matraz T75 y continúe cultivando en este formato.
NOTA: Se recomienda una relación de división de 1:2 o 1:3. Congele una copia de seguridad de las células en un pasaje temprano. Las células generalmente mantienen sus propiedades hasta el paso 10; los pasajes posteriores no deben usarse para experimentos.
2. Aislar fibroblastos dérmicos primarios de biopsias de piel
NOTA: Realice los siguientes pasos bajo una campana de flujo laminar de cultivo de tejido estéril. Use guantes y use técnicas asépticas estándar cuando manipule muestras de sangre humana y tejido humano. Los fibroblastos se cultivan en medio basal suplementado con 10% de suero fetal bovino, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina, conocida como medio de fibroblastos.
- Esterilizar dos pares de pinzas quirúrgicas y un bisturí sumergiéndolas en etanol al 70 % y posteriormente secándolas.
- Pipeta 2 mL de medio fibroblástico en una placa de Petri en la que se realizará la disección tisular.
- Pipetear 2,5 ml de medio fibroblasto en dos matraces T25. Gire los matraces alrededor para que el pequeño volumen de medio cubra toda la superficie.
- Transportar la biopsia de piel recolectada desde el quirófano hasta el laboratorio sobre hielo en solución de transferencia de tejido estéril y fría (consulte la Tabla de materiales) o NaCl al 0,9% en un tubo de plástico estéril.
- Abra el tubo con el tejido dentro de la campana de cultivo de tejidos. Saque la biopsia del tubo con los fórceps esterilizados y colóquela en la placa de Petri (Figura 2A).
- Inspeccione visualmente la biopsia para identificar las tres capas de la piel, la epidermis, la dermis y la grasa subcutánea. Busque una superficie de piel reconocible, a veces con vello visible, para identificar la epidermis. En el lado opuesto, busque la grasa subcutánea, que a menudo es amarilla y viscosa. Identificar la capa entre la epidermis y la grasa subcutánea como la dermis, la fuente de fibroblastos viables (Figura 2B).
- Para aislar los fibroblastos de la dermis, retire las otras dos capas y coloque el tejido de lado para que las tres capas sean visibles.
NOTA: A diferencia del tejido aórtico, las capas de la piel no se pueden separar entre sí; por lo tanto, deben cortarse. El tejido también es más gomoso, lo que hace que sea más difícil de cortar. Use un bisturí afilado. - Sostenga el tejido con fórceps. Corte en paralelo al borde entre la epidermis y la dermis. Cortar toda la epidermis. Trate de cortar en una línea limpia y no se mueva hacia adelante y hacia atrás para evitar daños en los tejidos.
- Voltee el tejido. Repita el mismo procedimiento que en el paso 2.8; esta vez, cortado dentro de la dermis paralela al borde con la grasa subcutánea.
- Una vez aislada la dermis, cortar el tejido en cubos de aproximadamente 1 x 1 x 1 mm3. Presione el tejido hacia abajo con fórceps y corte el tejido en una dirección con el bisturí. No corte hacia adelante y hacia atrás; hacer cortes limpios y unidireccionales para minimizar el daño. Trate de hacer tantos cubos como sea posible, dado el tamaño de la biopsia (Figura 2C).
- Coloque las piezas de tejido en el cuarto superior del matraz T25 usando las pinzas. Coloque 10-20 cubos por matraz si la cantidad de material lo permite (Figura 2D).
NOTA: Use fórceps lisos para minimizar la adhesión del tejido a las costillas de los fórceps y separe fácilmente el tejido en el matraz. - Incubar los cubos de tejido en los matraces T25 durante aproximadamente 10 días al 5% de CO2 a 37 °C en una incubadora.
NOTA: Se espera el primer crecimiento celular alrededor de entonces. Las células que migran inicialmente pueden parecer más pequeñas que los fibroblastos normales. - Una vez que se observe el crecimiento celular, agregue 2.5 ml de medio al matraz, asegurándose de no pipetearlo sobre las piezas de tejido para evitar que se desprendan.
- Después de aproximadamente 5 días más, cuando se puedan observar grupos de células alrededor de las piezas de tejido, cambie el medio de cultivo. Si las piezas de tejido se desprenden, retírelas ya que no se volverán a unir.
- Una vez que las células sean 80-90% confluentes, transfiéralas a un matraz T75 y continúe cultivando en este formato.
NOTA: Se recomienda una relación de división de 1:2 o 1:3. Congele una copia de seguridad de las células en un pasaje temprano. Las células generalmente mantienen sus propiedades hasta el paso 10; los pasajes posteriores no deben usarse para experimentos.
3. Medición de la contracción (ejemplos de SMC)
- Prepare una matriz ECIS 96w10e (consulte la Figura 3A para obtener una imagen representativa de la matriz con electrodos y celdas ampliadas sembrados en los electrodos).
NOTA: Realice los siguientes pasos bajo una campana de flujo laminar de cultivo de tejido estéril.- Cubra una matriz estéril 96w10e con 200 μL de L-cisteína de 10 mM por pozo durante 30 min a temperatura ambiente.
- Lave el plato dos veces con agua estéril. Deje que la placa se seque durante la noche en la campana de cultivo de tejidos con la tapa ligeramente abierta.
NOTA: El recubrimiento de la placa con L-cisteína solo es necesario cuando se usa la placa por primera vez. - Al día siguiente, esterilizar uv la placa y la tapa durante 30 min. Gire la tapa hacia arriba para que el interior esté esterilizado. Una vez esterilizada la placa, no la abra fuera de la campana de flujo.
- Células de siembra en la matriz ECIS
- Precalentar la solución de gelatina estéril al 1% en el baño de agua durante 30 min.
NOTA: La solución se almacena en el refrigerador y puede solidificarse, lo que dificulta la pipeta. - Posteriormente, cubra los pocillos con 100 μL de la solución de gelatina al 1 % por pocillo e incube la placa a 37 °C durante al menos 1 h.
- Aspirar la gelatina de los pozos.
- Cuente las células utilizando un contador celular automatizado y sembra los SMC por triplicado a una densidad de siembra de 30,000 células / pozo en 200 μL de medio SMC.
- Coloque la placa con los SMC en el soporte de 96 pocillos ECIS en la incubadora de cultivo celular. Haga doble clic en el software ECIS Applied Biophysics para abrir el programa y pulse el botón Configuración .
- Compruebe si todos los electrodos tienen contacto con el soporte (verde; rojo si no hay conexión) en el panel inferior izquierdo etiquetado como Configuración de pozo. Si los electrodos no están conectados correctamente, ajuste la placa en el soporte antes de comenzar la medición.
- Seleccione el tipo de placa (matriz de 96 pocillos) en el mismo panel haciendo clic en Tipo de matriz.
- En el panel superior derecho Configuración de recopilación de datos, haga clic en frecuencia única y cambie el valor de impedancia a 4000 Hz y el intervalo a 8 s.
- Haga clic en el botón Inicio para iniciar las mediciones. Espere a que se abra un nuevo panel, donde se puede guardar el archivo ECIS.
- Permita que las células se adhieran y establezca una monocapa durante 48 h.
NOTA: La fijación y propagación de celdas en los electrodos generan un valor de resistencia de referencia (Figura 3B).
- Precalentar la solución de gelatina estéril al 1% en el baño de agua durante 30 min.
- Estimulación de las células para inducir la contracción
- Inducir la contracción de SMC estimulando las células con 10 μg/mL del ionóforo de calcio, ionomicina.
NOTA: La ionomicina inducirá la afluencia de Ca2+ extracelular, activando la cascada contráctil; ver Figura 4A para imágenes representativas de células contraídas no estimuladas y estimuladas. - Diluir 1 mg de ionomicina en polvo en 100 μL de dimetilsulfóxido para hacer una solución madre de 10 mg/ml, y almacenar 10 μL de alícuotas a -20 °C. Antes de usar, diluya la solución de ionomicina 1:10 en medio SMC para preparar la solución de trabajo que se agregará a las células.
- Realice la estimulación celular mientras la matriz todavía está en el soporte de la matriz dentro de la incubadora de cultivo celular y los electrodos están conectados al sistema.
- Para estimular las células, retire la tapa y colóquela sobre una superficie estéril dentro de la incubadora. Preparar dos pipetas, fijadas a 2 μL y 150 μL.
- Antes de iniciar la estimulación, presione Marcar en el software y coloque un comentario.
NOTA: Esto hará que sea más fácil encontrar el momento exacto de la estimulación al analizar los datos. - Pipetear 2 μL de la solución de trabajo de ionomicina en cada pozo lo más rápido posible. Una vez que todas las células hayan sido estimuladas, mezcle el medio en los pocillos usando la segunda pipeta.
NOTA: Debido a los efectos rápidos, no es necesario cambiar las puntas entre diferentes líneas celulares y condiciones. Trabaja rápidamente mientras estimulas y mezclas porque la ionomicina tiene un efecto agudo. Al estimular una placa llena, estimule un máximo de 3 columnas a la vez. Después de cada estimulación, espere al menos 30 minutos hasta la siguiente estimulación para permitir que las células se recuperen de la temperatura y el cambio de CO2 causado por la apertura de la puerta de la incubadora. - Inmediatamente después de que se realice la estimulación, presione Marcar nuevamente para agregar un comentario de que la estimulación está hecha.
- Finalizando el experimento de estimulación
- Registre los valores de impedancia durante aproximadamente 5 minutos después de la estimulación con ionomicina. Finalice la grabación presionando Finalizar.
- Reutilice las matrices ECIS hasta tres veces: lave los pozos dos veces con agua estéril e incube la placa a 37 °C durante 2-3 h con tripsina o un reactivo similar. Repita los pasos 3.1.2 y 3.1.3.
- Inducir la contracción de SMC estimulando las células con 10 μg/mL del ionóforo de calcio, ionomicina.
- Exportación de los datos
- Para exportar los datos, haga clic en archivo | Exportar datos | A Excel (seleccionado). Seleccione una carpeta para guardar el archivo.
- Haga clic en Separar cuando el programa le pida combinar o separar hojas.
- Análisis de la salida contráctil
- Para calcular la respuesta contráctil, utilice la siguiente ecuación (1), donde C indica contracción (expresada en % de cambio en comparación con el valor basal), la prestimulación (PrS) indica el valor de resistencia (expresado en Ω) justo antes de la estimulación con ionomicina y la postestimulación (PoS) indica la resistencia (expresada en Ω) 2 min después de finalizar la estimulación.
(1)
NOTA: Como se muestra en la ecuación (1), el valor de impedancia de un medio de cultivo bien lleno de células sin ninguna celda adjunta (valor de 290 Ω) se resta de todos los resultados en el cálculo final. Se recomienda medir las respuestas contráctiles por triplicado en cada experimento y realizar tres experimentos independientes con la misma línea celular para tener en cuenta cualquier variación inter e intraexperimental. - Una vez realizados los tres experimentos independientes, agrupe los datos calculando el promedio de las tres mediciones, incluida la desviación estándar (DE).
- Para calcular la respuesta contráctil, utilice la siguiente ecuación (1), donde C indica contracción (expresada en % de cambio en comparación con el valor basal), la prestimulación (PrS) indica el valor de resistencia (expresado en Ω) justo antes de la estimulación con ionomicina y la postestimulación (PoS) indica la resistencia (expresada en Ω) 2 min después de finalizar la estimulación.
- Comparación de diferentes grupos
- Para definir el rango de contracción normal e investigar preguntas de investigación específicas posteriores, use el grupo de control para definir la "contracción normal" y compararla con la respuesta contráctil de los pacientes o grupos de tratamiento.
- Calcule la media y la SD de todo el grupo de control, es decir, de los valores finales para todas las líneas celulares, como se describe en el paso 3.5.2.
- Utilice el rango de la media ± 2SD para identificar las células del otro grupo que se encuentran fuera de este rango, lo que indica que tienen una respuesta contráctil alterada.
NOTA: El mecanismo detrás de la respuesta contráctil alterada está sujeto a preguntas de investigación específicas y depende de las células y la condición y no se discutirá en este protocolo.
(1)4. Detección de la presencia de marcadores específicos de SMC
- Aislamiento de ARN
- Sembrar las mismas líneas celulares específicas del paciente utilizadas para las mediciones de contracción en placas de 6 pocillos, un pocillo por línea celular. Cuente las células utilizando un contador celular automatizado y siembre las células a una densidad de siembra de 200,000 células / pozo en medio SMC y permita que se adhieran durante la noche.
- Lave las células una vez con PBS estéril.
- Lisa las células y aíslalas de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Síntesis de ADNc
- Realizar la síntesis de ADNc en 20 μL de una mezcla de reacción de transcripción inversa. Diluya las concentraciones de ARN aislado total de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante.
- qPCR
- Medir la expresión génica de los genes marcadores SMC, por ejemplo, ACTA2, CNN1, SMTN y TAGLN para confirmar que las células aisladas son realmente SMC y detectar marcadores SMC. Compruebe la correlación de los resultados con la salida contráctil.
- Use al menos dos genes de limpieza para normalizar los datos, por ejemplo, YWHAZ y TBP.
NOTA: La ejecución y el análisis de qPCR se pueden realizar utilizando diferentes máquinas de PCR y software compatible, dependiendo de lo que esté disponible y optimizado en el laboratorio. Consulte la Tabla suplementaria S1 para ver las secuencias de imprimación.
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Representative Results
Para probar la reproducibilidad de este método, el método se validó primero utilizando SMC de control solamente. Para determinar la reproducibilidad de la medición interexperimental, se trazaron dos mediciones independientes de todas las líneas celulares de control y pacientes incluidas como una gráfica de Bland-Altman (Figura 3B). La gráfica demostró que este método no muestra variabilidad fuera del intervalo de confianza, a excepción de una línea celular atípica. Además, estos resultados demostraron que dos pozos sembrados dentro del mismo experimento y estimulados simultáneamente muestran prácticamente la misma curva de respuesta contráctil (Figura 4C). Para validar si la respuesta mostrada es contracción y no estrés osmótico debido a la estimulación de la ionomicina, el medio se reemplazó después de la estimulación y se registró el comportamiento de las células. Esto muestra que las células estimuladas comenzaron a extenderse sobre el electrodo nuevamente (Figura 4D).
Como primera aplicación de este novedoso método, la respuesta contráctil en SMC deriva de pacientes sanos, no dilatados aortas (n=6) y aneurisma aórtico abdominal (AAA) (n=21; Figura 5A) se midió, como se mostró anteriormente8. La mediana de respuesta del grupo control fue del 61% (46-77%), en comparación con la mediana de respuesta, 52% (15-75%), del grupo de pacientes. Los valores no fueron significativamente diferentes, y se observó una mayor variabilidad en el grupo de pacientes. Debido a la novedad del método, se utilizó el grupo de control para determinar la contracción "normal". La Figura 5B muestra la media y la ± rango de 2SD del grupo de control y cómo este rango se utiliza para identificar a cuatro pacientes que tienen valores de contracción más bajos que los valores "normales". Determinar la causa de la contracción deteriorada es el objetivo de un estudio mecanicista separado. Se realizó un análisis de bot occidental para determinar si el SMC utilizado para el experimento expresa marcadores contráctiles SMC. El análisis de western blot (Figura 6A) y la posterior cuantificación (Figura 6B) confirman que las células expresan marcadores SMC. La expresión del marcador en todos los grupos fue variable y no se correlacionó con la salida contráctil. Para determinar la capacidad proliferativa del SMC, se realizó qPCR para Ki67 (Figura 6C). La expresión de Ki67 fue detectable en todas las células, pero no se correlacionó con la salida contráctil.
Figura 1: Aislamiento SMC del tejido AAA aórtico. (A) Materiales necesarios para el aislamiento de SMC del tejido aórtico: tejido aórtico en una placa de Petri, medio SMC, dos matraces T25 llenos de medio SMC, bisturí y dos pares de fórceps quirúrgicos. (B) Lado intimal de la pared aórtica que muestra placas ateroscleróticas. (C) Capa adventicia de la pared aórtica. (D) Separación de la túnica media y la túnica adventicia tirando con los fórceps. (E) Después de aislar el medio de la túnica, el tejido se corta en trozos pequeños con fórceps y el bisturí. F) Piezas de tejido colocadas en el matraz T25. Abreviaturas: AAA = aneurisma aórtico abdominal; SMC = célula del músculo liso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Aislamiento de fibroblastos del tejido dérmico. (A) Materiales necesarios para el aislamiento de fibroblastos del tejido dérmico: tejido dérmico en una placa de Petri, medio de fibroblastos, dos matraces T25 llenos de medio de fibroblastos, bisturí y dos pares de pinzas quirúrgicas. (B) Biopsia de piel que muestra grasa subcutánea en la parte superior. (C) Después de aislar la dermis, el tejido se corta en trozos pequeños usando fórceps y el bisturí. (D) Piezas de tejido colocadas en el matraz T25. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Configuración de la placa ECIS y representación gráfica de la contracción aórtica de SMC. (A) Izquierda; una placa ECIS de 96 pocillos. Medio; aumento de un pozo de la placa ECIS, mostrando los diez electrodos en el fondo del pozo. Correcto; imagen de microscopio de luz de los SMC sembrados en la placa ECIS; aumento 10x. (B) Curvas de resistencia medidas por ECIS después de la siembra de SMC de control por triplicado. La línea azul gruesa representa la media del triplicado, y las líneas punteadas representan la SD de los triplicados. En las primeras 4-5 h después de la siembra, los SMC se extienden por toda la superficie y se mide una alta resistencia (~ 1000 Ω). Una vez que se forma una monocapa SMC estable, la resistencia se reduce con el tiempo a alrededor de 500 Ω. Esta cifra se modifica de 8. Abreviaturas: ECIS = detección de impedancia célula-sustrato eléctrico; SMC = célula del músculo liso; DE = desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Medición de la contracción de SMC utilizando ECIS. (A) Izquierda; SMC monocapa de SMC de control de SMC antes de la estimulación para la contracción. Correcto; controlar los SMC después de la estimulación para la contracción. Ampliación 10x. (B) Gráfica de diferencia que demuestra la reproducibilidad de la medición interexperimental entre dos mediciones de contracción separadas. Las líneas punteadas representan el intervalo de confianza del 95%, y la línea medial gruesa representa la media de dos mediciones interexperimentales. Cada punto de datos representa la desviación de la media de dos mediciones independientes de todo el conjunto de datos de controles y pacientes (Púrpura ●; n = 27). (C) Reproducibilidad intraexperimental de las mediciones de contracción ecis. Curvas de resistencia generadas por control SMC sembradas en dos pozos. La línea punteada vertical marca la estimulación. (D) Recuperación celular después de la estimulación de la contracción. La línea azul gruesa representa el valor de resistencia de un SMC de control no estimulado. La línea azul punteada representa el valor de resistencia de la misma línea SMC de control, después de la estimulación marcada por la línea negra punteada vertical. Aproximadamente 1 h después de la estimulación (gruesa línea negra punteada vertical), el medio en ambas condiciones se actualizó para eliminar el estímulo, y la recuperación de las células se rastreó durante otras 3,5 h. Los valores de resistencia se normalizaron a los valores de prestimulación para monitorizar el comportamiento de las células tras la estimulación. Esta cifra se modifica de 8. Abreviaturas: ECIS = detección de impedancia célula-sustrato eléctrico; SMC = célula del músculo liso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Contracción de SMC en control y SMC de pacientes AAA tras la estimulación con ionomicina. (A) Respuesta contráctil media de los SMC control (Azul ●; n = 6) y AAA (Rojo ●; n = 21) sobre la estimulación con ionomicina derivada de múltiples experimentos. (B) Respuesta contráctil media de Control (Azul ●; n = 6), Contracción normal (Rojo ●; n = 15) y Baja contracción (Rojo ●; n = 6) SMC de pacientes AAA derivados de múltiples experimentos. La contracción se expresa en porcentajes de disminución en comparación con el valor basal antes de la estimulación. La línea negra horizontal representa la respuesta contráctil media de los SMC de control. Las líneas horizontales punteadas marcan dos SD por encima y por debajo de la media del grupo de control. El grupo de baja contracción se define como la contracción inferior a dos DE por debajo de la media del grupo de control. Boxplot se muestra como mediana con rango. Esta cifra se modifica de 8. Abreviaturas: AAA = aneurisma aórtico abdominal; ECIS = detección de impedancia célula-sustrato eléctrico; SMC = célula del músculo liso; DE = desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Expresión del marcador SMC. Se analizaron marcadores contráctiles y proliferativos de SMC en SMC de control (Δ; n = 6), contracción normal (●; n = 15) y baja contracción (○; n = 6). (A) Análisis de Western blot de SMC utilizado para los experimentos de contracción. Se cuantificaron aSMA, calponina y SM22, y se utilizó Tubulin como control de carga. (B) Cuantificación de western blot representada en (A). (C) Análisis qPCR del marcador de proliferación Ki67. Esta cifra se modifica de 8. Abreviaturas: SMC = célula del músculo liso; aSMA = alfa actina del músculo liso; qPCR = PCR cuantitativa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla suplementaria S1: Secuencias de imprimación. Secuencias de cebadores de qPCR hacia adelante y hacia atrás de los genes de limpieza y marcadores SMC analizados. Esta tabla se modifica de 8. Abreviaturas: SMC = célula del músculo liso; qPCR = PCR cuantitativa. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
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Discussion
Este artículo presenta un método para medir la contracción de SMC in vitro, basado en los cambios en la impedancia y la ocupación de la superficie. Primero, se describe el aislamiento, el cultivo y la expansión de los SMC humanos primarios específicos del paciente y los fibroblastos de la piel, seguidos de cómo usarlos para las mediciones de contracción.
Una limitación del estudio está relacionada con la obtención de las células a través de un protocolo de explante. Las células que proliferan a partir de la biopsia pueden tener propiedades diferentes a las del tejido original in vivo. Además, los protocolos de explante presentados aquí no son innovadores, pero se incluyen para presentar un flujo de trabajo completo desde, en este caso, el material de aneurisma aórtico específico del paciente hasta las mediciones de contracción. El cultivo de las células in vitro también podría afectar algunas de sus propiedades debido a la falta de factores sistémicos y la diferente rigidez del sustrato. Esto podría explicar la variabilidad en la expresión del marcador SMC. Debido a la ausencia de marcadores de fibroblastos confiables, los fibroblastos generalmente se distinguen en función de la ausencia de marcadores en comparación con otras células. Por lo tanto, no hemos caracterizado los fibroblastos aislados con este protocolo. Otra limitación es que medir la contracción como factor de la superficie sigue siendo algo indirecto. Las posibles consecuencias son que la salida proviene de promediar la respuesta de todo el pozo que contiene miles de células. Por lo tanto, no se puede determinar si todas las células se contraen menos o si hay células que bajan el promedio.
La contractilidad SMC se estudió previamente utilizando diferentes técnicas. En comparación con la microscopía de fuerza de tracción4, ECIS tiene múltiples ventajas, principalmente, un mayor rendimiento y eficiencia en el tiempo. Como se indica en las limitaciones, la compensación es que las mediciones de contracción se obtienen indirectamente, lo que hace que ECIS sea más adecuado para detectar un mayor número de líneas celulares y grupos y medir la fuerza de tracción para estudios mecanicistas de una sola célula más profundos. Los gradientes de calcio6 se utilizaron anteriormente como indicadores de contracción; ECIS proporciona una medición de contracción más confiable, ya que mide la locomoción de la célula. La cuantificación de imágenes de arrugas de colágeno causadas por la contracción de las células sembradas dentro del gel5 proporciona un promedio de toda la población de células sembradas, similar a ECIS. Sin embargo, las mediciones obtenidas a través de ECIS son mucho más precisas y proporcionan un monitoreo en tiempo real durante todo el curso de la observación, lo que las hace significativamente más informativas.
En conclusión, este artículo describe una nueva aplicación para el sistema ECIS, que se puede utilizar para medir la contracción de las células adherentes, como las SMC y los fibroblastos. Este método se puede utilizar para estudiar múltiples líneas celulares de manera oportuna y eficiente, por lo que es adecuado para la detección de pacientes o medicamentos. En línea con la investigación sobre aneurismas aórticos, este método también podría usarse para detectar SMC de pacientes con otros trastornos cardiovasculares, como disecciones y aterosclerosis.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer a Tara van Merrienboer, Albert van Wijk, Jolanda van der Velden, Jan D. Blankensteijn, Lan Tran, Peter L. Hordijk, el equipo PAREL-AAA y todos los cirujanos vasculares de la UMC de Ámsterdam, Zaans Medisch Centrum y el hospital Dijklander por proporcionar materiales y apoyo para este estudio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well Array | Applied Biophysics | 96W10idf PET | Array used to measure contraction in the ECIS setup |
| Custodiol | Dr. Franz Höhler Chemie GmbH | RVG 12801 | Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | Solution used to dilute ionomycin |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140079 | Addition to cell culture medium |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Gibco | 11550043 | Medium used to culture skin fibroblasts |
| Human Vascular Smooth Muscle Cell Basal Medium (formerly ''Medium 231'') | Gibco | M231500 | Medium used to culture smooth muscle cells |
| Invitrogen countess II | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | Automated cell counter |
| Ionomycin calcium salt from Streptomyces conglobatus | Sigma-Aldrich | I0634-1MG | Compound used for contraction stimulation |
| NaCl 0.9% | Fresenius Kabi | B230561 | Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Antibiotics used for cell culture medium |
| Phospathe buffered saline | Gibco | 10010023 | Used to wash cells |
| Quick-RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R1055 | Kit used for RNA isolation |
| Smooth Muscle Growth Supplement (SMGS) | Gibco | S00725 | Supplement which is added to smooth muscle cell culture medium |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | 11754250 | Kit used for cDNA synthesis |
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | Reagent for qPCR |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | Used to trypsinize cells |
| ZTheta | Applied Biophysics | ZTheta | ECIS instrument used for contraction measurements |
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