Выделение первичных клеток гладкой мускулатуры аорты, специфичных для пациента, и полуколичественные измерения сокращения в режиме реального времени in vitro
Summary
В данной работе описывается метод выделения и культивирования первичных, специфичных для пациента гладкомышечных клеток аорты человека и дермальных фибробластов. Кроме того, представлен новый метод измерения сокращения клеток и последующего анализа, который может быть использован для изучения специфических для пациента различий в этих клетках.
Abstract
Гладкомышечные клетки (SMC) являются преобладающим типом клеток в аортальных средах. Их сократительный механизм важен для передачи силы в аорте и регулирует сужение сосудов и расширение сосудов. Мутации в генах, кодирующих белки сократительного аппарата SMC, связаны с заболеваниями аорты, такими как аневризмы грудной аорты. Измерение сокращения SMC in vitro является сложной задачей, особенно с высокой пропускной способностью, которая необходима для скрининга материала пациента. Доступные в настоящее время методы не подходят для этой цели. В данной работе представлен новый метод, основанный на электрическом датчике импеданса ячейки-подложки (ECIS). Во-первых, описан протокол эксплантата для выделения специфических для пациента первичных SMC человека из биопсии аорты и специфических для пациента первичных дермальных фибробластов человека для изучения аневризм аорты. Далее дается подробное описание нового метода сокращения для измерения сократительного ответа этих клеток, включая последующий анализ и предложение для сравнения различных групп. Этот метод может быть использован для изучения сокращения адгезивных клеток в контексте трансляционных (сердечно-сосудистых) исследований и исследований скрининга пациентов и лекарств.
Introduction
Гладкомышечные клетки (SMC) являются преобладающим типом клеток в медиальном слое аорты, самом толстом слое аорты. Внутри стенки они радиально ориентированы и участвуют, среди прочих функций, в сужении сосудов и вазодилатации1. Сократительный механизм SMC участвует в передаче силы в аорте через функциональную связь с внеклеточным матриксом2. Мутации в генах, кодирующих белки сократительного аппарата SMC, такие как тяжелая цепь гладкого миозина (MYH11) и актин гладких мышц (ACTA2), были связаны со случаями семейных аневризм грудной аорты, подчеркивая актуальность сокращения SMC в поддержании структурной и функциональной целостности аорты 1,2 . Кроме того, мутации в сигнальном пути TGFβ также связаны с аневризмами аорты, и их влияние в патофизиологии аневризмы аорты также может быть изучено в фибробластах кожи3.
Высокопроизводительное измерение сокращения SMC in vitro является сложной задачей. Поскольку сократимость SMC не может быть измерена in vivo у людей, анализы in vitro на клетках человека представляют собой возможную альтернативу. Более того, развитие аневризмы брюшной аорты (ААА) на животных моделях либо химически индуцируется, например, перфузией эластазы, либо вызвано специфической мутацией. Таким образом, данные животных не сопоставимы с развитием ААА у людей, которое в основном имеет многофакторную причину, такую как курение, возраст и / или атеросклероз. In vitro Сократимость SMC до сих пор в основном измерялась с помощью микроскопии силы тяги 4,5, количественной оценки флуоресцентных внутриклеточных потоков кальцияFura-2 6 и анализов сморщивания коллагена7. В то время как тракционная микроскопия дает бесценное числовое представление о силах, генерируемых одной клеткой, она не подходит для высокопроизводительного скрининга из-за сложной математической обработки данных и анализа одной клетки за раз, что означает, что измерение репрезентативного количества клеток на одного донора занимает очень много времени. Анализы красителя Fura-2 и сморщивания коллагена позволяют поверхностно определять сокращение и не дают точного численного результата, что делает их менее подходящими для распознавания специфических для пациента различий. Нарушение сокращения SMC в клетках, полученных из аорты пациентов с аневризмой брюшной аорты, было впервые продемонстрировано путем оптимизации нового метода измерения сокращения SMC in vitro8. Это было сделано путем перепрофилирования метода измерения импеданса электрической ячейки-подложки (ECIS). ECIS – это анализ средней пропускной способности в режиме реального времени для количественной оценки поведения и сокращения клеток адгезивныхклеток 9,10,11, таких как рост и поведение SMC в анализах заживления ран и миграции 12,13,14. Точный метод описан в разделе протокола. Таким оптимизированным способом ECIS также может быть использован для изучения сокращения фибробластов из-за их одинакового размера и морфологии.
Целью данной работы является пошаговое описание метода измерения сокращения SMC in vitro с использованием ECIS8 и сравнение сокращения между контролем и SMC пациента. Во-первых, объясняется выделение и культивирование первичных SMC от контрольных и пациентских биопсий аорты, которые могут быть использованы для измерения сокращения. Во-вторых, описаны измерения и анализ сокращения, наряду с проверкой экспрессии маркера SMC. Кроме того, в данной работе описан метод выделения специфических для пациента дермальных фибробластов, сокращение которых может быть измерено с использованием той же методологии. Эти клетки могут быть использованы для специфических для пациента исследований, ориентированных на аневризму аорты или другие сердечно-сосудистые патологии15 или прогностических исследований с использованием протокола трансдифференциации, который позволяет измерять сокращение до операции аневризмы16.
Protocol
Representative Results
Discussion
В данной работе представлен метод измерения сокращения SMC in vitro, основанный на изменениях импеданса и занятия поверхности. Во-первых, описывается выделение, культивирование и расширение специфических для пациента первичных человеческих SMC и фибробластов кожи, а затем то, как испол?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы с благодарностью поблагодарить Тару ван Мерриенбоер, Альберта ван Вейка, Йоланду ван дер Фельден, Яна Д. Бланкенштейна, Лана Трана, Питера Л. Хордейка, команду PAREL-AAA и всех сосудистых хирургов Амстердамского UMC, Zaans Medisch Centrum и больницы Dijklander за предоставление материалов и поддержку для этого исследования.
Materials
| 96-well Array | Applied Biophysics | 96W10idf PET | Array used to measure contraction in the ECIS setup |
| Custodiol | Dr. Franz Höhler Chemie GmbH | RVG 12801 | Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | Solution used to dilute ionomycin |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140079 | Addition to cell culture medium |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Gibco | 11550043 | Medium used to culture skin fibroblasts |
| Human Vascular Smooth Muscle Cell Basal Medium (formerly ''Medium 231'') | Gibco | M231500 | Medium used to culture smooth muscle cells |
| Invitrogen countess II | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | Automated cell counter |
| Ionomycin calcium salt from Streptomyces conglobatus | Sigma-Aldrich | I0634-1MG | Compound used for contraction stimulation |
| NaCl 0.9% | Fresenius Kabi | B230561 | Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Antibiotics used for cell culture medium |
| Phospathe buffered saline | Gibco | 10010023 | Used to wash cells |
| Quick-RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R1055 | Kit used for RNA isolation |
| Smooth Muscle Growth Supplement (SMGS) | Gibco | S00725 | Supplement which is added to smooth muscle cell culture medium |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | 11754250 | Kit used for cDNA synthesis |
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | Reagent for qPCR |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | Used to trypsinize cells |
| ZTheta | Applied Biophysics | ZTheta | ECIS instrument used for contraction measurements |
References
- Milewicz, D. M., et al. Genetic basis of thoracic aortic aneurysms and dissections: focus on smooth muscle cell contractile dysfunction. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 9, 283-302 (2008).
- Milewicz, D. M., et al. Altered smooth muscle cell force generation as a driver of thoracic aortic aneurysms and dissections. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 26-34 (2017).
- Groeneveld, M. E., et al. Betaglycan (TGFBR3) up-regulation correlates with increased TGF-β signaling in Marfan patient fibroblasts in vitro. Cardiovascular Pathology. 32, 44-49 (2018).
- Chen, J., Li, H., SundarRaj, N., Wang, J. H. C. Alpha-smooth muscle actin expression enhances cell traction force. Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (4), 248-257 (2007).
- Peyton, S. R., Putnam, A. J. Extracellular matrix rigidity governs smooth muscle cell motility in a biphasic fashion. Journal of Cellular Physiology. 204 (1), 198-209 (2005).
- Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2. Nature. 318 (6046), 558-561 (1985).
- Wu, D., et al. NLRP3 (nucleotide oligomerization domain-like receptor family, pyrin domain containing 3)-caspase-1 inflammasome degrades contractile proteins: implications for aortic biomechanical dysfunction and aneurysm and dissection formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (4), 694-706 (2017).
- Bogunovic, N., et al. Impaired smooth muscle cell contractility as a novel concept of abdominal aortic aneurysm pathophysiology. Scientific Reports. 9 (1), 1-14 (2019).
- Hurst, V., Goldberg, P. L., Minnear, F. L., Heimark, R. L., Vincent, P. A. Rearrangement of adherens junctions by transforming growth factor-β1: role of contraction. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 276 (4), 582-595 (1999).
- Hu, N., et al. Comparison between ECIS and LAPS for establishing a cardiomyocyte-based biosensor. Sensors and Actuators B: Chemical. 185, 238-244 (2013).
- Peters, M. F., Lamore, S. D., Guo, L., Scott, C. W., Kolaja, K. L. Human stem cell-derived cardiomyocytes in cellular impedance assays: bringing cardiotoxicity screening to the front line. Cardiovascular Toxicology. 15 (2), 127-139 (2015).
- Zhang, S., Yang, Y., Kone, B. C., Allen, J. C., Kahn, A. M. Insulin-stimulated cyclic guanosine monophosphate inhibits vascular smooth muscle cell migration by inhibiting Ca/calmodulin-dependent protein kinase II. Circulation. 107 (11), 1539-1544 (2003).
- Halterman, J. A., Kwon, H. M., Zargham, R., Bortz, P. D. S., Wamhoff, B. R. Nuclear factor of activated T cells 5 regulates vascular smooth muscle cell phenotypic modulation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (10), 2287-2296 (2011).
- Bass, H. M., Beard, R. S., Cha, B. J., Yuan, S. Y., Nelson, P. R. Thrombomodulin induces a quiescent phenotype and inhibits migration in vascular smooth muscle cells in vitro. Annals of Vascular Surgery. 30, 149-156 (2016).
- Burger, J., et al. Molecular phenotyping and functional assessment of smooth muscle like-cells with pathogenic variants in aneurysm genes ACTA2, MYH11, SMAD3 and FBN1. Human Molecular Genetics. , (2021).
- Yeung, K. K., et al. Transdifferentiation of human dermal fibroblasts to smooth muscle-like cells to study the effect of MYH11 and ACTA2 mutations in aortic aneurysms. Human Mutation. 38 (4), 439-450 (2017).
