Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

בידוד של תאי שריר חלק אבי העורקים העיקריים הספציפיים למטופל ומדידות כיווץ חצי-קוונטיטיביות בזמן אמת במבחנה

Published: February 15, 2022 doi: 10.3791/63122
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2, 1,2
1Department of Vascular Surgery, Amsterdam UMC, Vrije Universiteit Amsterdam, 2Department of Physiology, Amsterdam Cardiovascular Sciences, Amsterdam UMC, Vrije Universiteit Amsterdam, 3Laboratory of Experimental Cardiology, Department of Cardiology, Leiden University Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

מאמר זה מתאר שיטה מבוססת תרבית אקספלנט לבידוד וגידול של תאי שריר חלקים ראשוניים של אבי העורקים האנושיים הספציפיים לחולה ופיברובלסטים עוריים. יתר על כן, מוצגת שיטה חדשנית למדידת התכווצות תאים וניתוח לאחר מכן, אשר ניתן להשתמש בה כדי לחקור הבדלים ספציפיים לחולה בתאים אלה.

Abstract

תאי שריר חלקים (SMCs) הם סוג התא השולט במדיה אבי העורקים. המכונות החוזיות שלהם חשובות להעברת כוח באבי העורקים ומווסתות את כלי הדם ואת הרחבת כלי הדם. מוטציות בגנים המקודדים לחלבונים של מנגנון החוזה SMC קשורות למחלות אבי העורקים, כגון מפרצות אבי העורקים החזי. מדידת התכווצות SMC במבחנה היא מאתגרת, במיוחד באופן בעל תפוקה גבוהה, החיוני לסינון חומר המטופל. השיטות הזמינות כיום אינן מתאימות למטרה זו. מאמר זה מציג שיטה חדשנית המבוססת על חישת עכבה חשמלית של מצע התא (ECIS). ראשית, פרוטוקול אקספלנט מתואר כדי לבודד את ה-SMCs הראשוניים האנושיים הספציפיים למטופל מביופסיות אבי העורקים ופיברובלסטים עוריים ראשוניים אנושיים ספציפיים למטופל לצורך חקר מפרצות אבי העורקים. לאחר מכן, תיאור מפורט של שיטת כיווץ חדשה ניתן כדי למדוד את תגובת ההתכווצות של תאים אלה, כולל הניתוח הבא והצעה להשוואת קבוצות שונות. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לחקור את התכווצות התאים הדבקים בהקשר של מחקרים תרגומיים (לב וכלי דם) ומחקרי סינון חולים ותרופות.

Introduction

תאי שריר חלקים (SMCs) הם סוג התא השולט בשכבה המדיאלית של אבי העורקים, השכבה העבה ביותר של אבי העורקים. בתוך הקיר, הם מכוונים רדיאלית ומעורבים, בין שאר הפונקציות, vasoconstriction ו vasodlitation1. מנגנון התכווצות SMC מעורב בהעברת כוח באבי העורקים באמצעות הקשר הפונקציונלי עם המטריצה החוץ-תאית2. מוטציות בגנים המקודדים לחלבונים של מנגנון התכווצות SMC, כגון שרשרת כבדה של מיוזין שרירי חלק (MYH11) ואקטין שריר חלק (ACTA2), היו קשורות למקרים של מפרצות אבי העורקים החזי המשפחתי, מה שמדגיש את הרלוונטיות של התכווצות SMC בשמירה על השלמות המבנית והתפקודית של אבי העורקים 1,2 . יתר על כן, מוטציות במסלול האיתות TGFβ קשורות גם למפרצת אבי העורקים, וניתן לחקור את השפעותיהן בפתופיזיולוגיה של מפרצת אבי העורקים גם בפיברובלסטים בעור3.

מדידת תפוקה גבוהה של התכווצות SMC במבחנה היא מאתגרת. מכיוון שלא ניתן למדוד את התכווצות ה-SMC in vivo בבני אדם, בדיקות במבחנה על תאים אנושיים מהוות חלופה אפשרית. יתר על כן, התפתחות מפרצת אבי העורקים הבטני (AAA) במודלים של בעלי חיים מושרית כימית על ידי, למשל, זלוף אלסטאז, או נגרמת על ידי מוטציה ספציפית. לכן, נתוני בעלי חיים אינם דומים להתפתחות AAA בבני אדם, שלרוב יש לה גורם רב-גורמי, כגון עישון, גיל ו/או טרשת עורקים. במבחנה התכווצות SMC נמדדה עד כה בעיקר על ידי מיקרוסקופיית כוח מתיחה 4,5, כימות של שטפי סידן תוך תאיים פלואורסצנטיים של Fura-26, ומבחני קולגן מתקתקים7. בעוד שמיקרוסקופיית כוח המתיחה מספקת תובנה מספרית שלא תסולא בפז לגבי הכוחות הנוצרים על ידי תא יחיד, היא אינה מתאימה לסינון בתפוקה גבוהה בשל עיבוד הנתונים המתמטי המורכבים וניתוח של תא אחד בכל פעם, כלומר לוקח זמן רב למדוד מספר מייצג של תאים לכל תורם. מבחני צבע Fura-2 וקירור קולגן מאפשרים קביעה שטחית של התכווצות ואינם נותנים תפוקה מספרית מדויקת, מה שהופך אותם לפחות מתאימים להבחנה בהבדלים ספציפיים למטופל. פגיעה בהתכווצות SMC בתאים שמקורם באבי העורקים של חולי מפרצת באבי העורקים הבטני הודגמה לראשונה על ידי אופטימיזציה של שיטה חדשנית למדידת התכווצות SMC במבחנה8. זה נעשה על ידי ייעוד מחדש של שיטת חישת העכבה של המצע התא החשמלי (ECIS). ECIS הוא מבחן בתפוקה בינונית בזמן אמת לכימות התנהגות התאים הדבקים והתכווצות 9,10,11 כגון גדילה והתנהגות של SMC במבחני ריפוי ונדידה של פצעים 12,13,14. השיטה המדויקת מתוארת בסעיף הפרוטוקול. בדרך אופטימלית זו, ניתן להשתמש ב- ECIS גם כדי לחקור התכווצות פיברובלסטים בשל גודלם ומורפולוגיה דומים.

מטרת מאמר זה היא לספק תיאור מעמיק של השיטה למדידת התכווצות SMC במבחנה באמצעות ECIS8 והשוואת ההתכווצות בין בקרת עסקים קטנים ובינוניים למטופלים. ראשית, מוסבר הבידוד והתרבות של עסקים קטנים ובינוניים ראשוניים מביופסיות בקרה ואבי העורקים של המטופל, אשר יכולות לשמש למדידת התכווצות. שנית, מתוארים מדידות וניתוחים של התכווצות, לצד אימות ביטוי סמן SMC. יתר על כן, מאמר זה מתאר את השיטה לבידוד של פיברובלסטים עוריים ספציפיים לחולה, אשר ניתן למדוד את התכווצותם באמצעות אותה מתודולוגיה. תאים אלה יכולים לשמש למחקרים ספציפיים לחולה המתמקדים במפרצת אבי העורקים או בפתולוגיות קרדיווסקולריות אחרות15 או למחקרים פרוגנוסטיים באמצעות פרוטוקול טרנסדיפרנטיזציה המאפשר מדידת התכווצות לפני ניתוח מפרצת16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: ביופסיות אבי העורקים התקבלו במהלך תיקון מפרצת פתוחה במרכזים הרפואיים של אוניברסיטת אמסטרדם, המרכז הרפואי של אוניברסיטת VU, אמסטרדם, זאנס מדיש צנטרום, בית החולים זאנדאם ודייקלנדר, הורן, הולנד. רקמת אבי העורקים של הבקרה התקבלה מחתיכת אבי העורקים המחוברת לעורק הכליה שנקטפה להשתלת כליה. רק חולים מעל גיל 18 נכללו, וכל המטופלים נתנו את הסכמתם מדעת להשתתף במחקר. כל החומר נאסף בהתאם לתקנות הצהרת WMA של הלסינקי ולהנחיות המוסדיות של הוועדה האתית הרפואית של המרכז הרפואי VU. כל הניסויים והפרוטוקולים הניסוייים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות ואושרו על ידי הוועדה האתית הרפואית של המרכז הרפואי VU. לקבלת מידע מלא על קווי הבקרה ותאי המטופל שבהם נעשה שימוש, עיין ב - 8.

1. בידוד עסקים קטנים ובינוניים אנושיים ראשוניים מביופסיות אבי העורקים

הערה: בצע את השלבים הבאים תחת מכסה מנוע זרימה למינרי סטרילי של תרבית רקמה. ללבוש כפפות ולהשתמש בטכניקות אספטיות סטנדרטיות בעת טיפול בדגימות דם אנושיות ורקמות אנושיות. עסקים קטנים ובינוניים מתורבתים ב-231 תווך בסיסי של תאי שריר חלק בכלי דם אנושיים בתוספת 100 פניצילין U/mL, סטרפטומיצין של 100 מיקרוגרם/מ"ל, ותוסף גדילת שרירים חלק המכונה מדיום SMC.

  1. לעקר שני זוגות מלקחיים כירורגיים ואזמל על ידי טבילתם ב-70% אתנול ולאחר מכן לנגב אותם יבשים.
  2. פיפט 2 מ"ל של מדיום SMC בצלחת פטרי שבה תבוצע כריתת הרקמה.
  3. פיפט 2.5 מ"ל של SMC בינוני לתוך שני צלוחיות T25. סובבו את הצלוחיות כך שהנפח הקטן של המדיום יכסה את כל פני השטח.
  4. להעביר את הביופסיה של דופן אבי העורקים האנושי שנקטפה מחדר הניתוח למעבדה על קרח בצינור פלסטיק סטרילי עם תמיסת העברת רקמות קרה וסטרילית (ראו טבלת החומרים) או 0.9% NaCl.
  5. פתחו את הצינור עם הרקמה בתוך מכסה המנוע של תרבית הרקמה. הוציאו את הביופסיה מהצינור באמצעות המלקחיים המעוקרים והניחו אותה בצלחת פטרי (איור 1A).
  6. בדקו באופן חזותי את הביופסיה כדי לזהות את שלוש השכבות של אבי העורקים, את ה-tunica intima (הפנימי), המדיה (האמצעית) והאדוונטיטיה (השכבה החיצונית). חפשו את נוכחותם של פלאקים טרשת עורקים בצד האינטימה ורקמת חיבור דקה בצד ההרפתקני (איור 1B) כדי להבחין בין השכבות.
  7. כדי לבודד עסקים קטנים ובינוניים מהמדיה, הסר את שתי השכבות האחרות. הניחו תחילה את הרקמה עם רובד האינטימה בצד למעלה (איור 1B). הסר את הרובד המוצק על ידי משיכתו מהרקמה באמצעות מלקחיים תוך דחיפת הרקמה כלפי מטה עם זוג המלקחיים האחרים. הסר את השכבות הבאות של לוח עד שהשכבה המדיאלית הוורודה והאחידה נראית לעין.
  8. הפוך את הרקמה (איור 1C). חזור על אותו הליך, כמו בשלב 1.7, על-ידי משיכת השכבה ההרפתקנית (איור 1D). הקפד להסיר את כל החלקים הגלויים בכמה ניסיונות שיידרשו, מכיוון ששכבה זו לא תתנתק מהתקשורת בקלות.
    הערה: חיוני להסיר כראוי את השכבות האינטימיות וההרפתקניות כדי להשיג אוכלוסיית SMC נקייה ככל האפשר.
  9. לאחר בידוד השכבה המדיאלית, חותכים את הרקמה לקוביות של כ-1 מ"מ x 1 מ"מ x 1 מ"מ. לחץ את המדיה כלפי מטה עם מלקחיים וחתך את הרקמה בכיוון אחד באמצעות האזמל. אל תקצצו הלוך ושוב; לבצע חיתוכים נקיים וחד כיווניים כדי למזער נזקים. נסו ליצור כמה שיותר קוביות, בהתחשב בגודל הביופסיה (איור 1E).
  10. מקם את חלקי הרקמה ברבע העליון של בקבוק T25 באמצעות המלקחיים. הניחו 10-20 קוביות לכל בקבוק אם כמות החומר מאפשרת זאת (איור 1F).
    הערה: השתמש במלקחיים חלקים כדי למזער את ההידבקות של הרקמה לצלעות המלקחיים ולנתק בקלות את הרקמה לתוך הבקבוקון.
  11. דגירה של קוביות הרקמה בצלוחיות T25 למשך כ-10 ימים ב-5% CO2 ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור.
    הערה: צמיחת תאים ראשונה צפויה בערך באותו זמן. התאים הנודדים בתחילה עשויים להיראות קטנים יותר מ-SMCs רגילים.
  12. לאחר שנצפתה צמיחת התאים, הוסיפו 2.5 מ"ל של מדיום לבקבוקון, והקפידו לא לטפטף אותו על חלקי הרקמה כדי למנוע מהם להתנתק.
  13. לאחר כ-5 ימים נוספים, כאשר מקבצים של תאים נצפים סביב חלקי הרקמה, משנים את מדיום התרבית. אם חתיכות טישו מתנתקות, הסר אותן מכיוון שהן לא יתחברו מחדש.
  14. ברגע שהתאים נפגשים ב-80-90%, מעבירים אותם לבקבוקון T75 וממשיכים להתרבות בפורמט זה.
    הערה: מומלץ יחס מפוצל של 1:2 או 1:3. להקפיא גיבוי של התאים במעבר מוקדם. התאים בדרך כלל שומרים על תכונותיהם עד מעבר 10; אין להשתמש בקטעים מאוחרים יותר לניסויים.

2. בידוד פיברובלסטים עוריים ראשוניים מביופסיות עור

הערה: בצע את השלבים הבאים תחת מכסה מנוע זרימה למינרי סטרילי של תרבית רקמה. ללבוש כפפות ולהשתמש בטכניקות אספטיות סטנדרטיות בעת טיפול בדגימות דם אנושיות ורקמות אנושיות. פיברובלסטים מתורבתים במדיום בזלתי בתוספת 10% סרום בקר עוברי, 100 פניצילין U/mL ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין, המכונה מדיום פיברובלסט.

  1. לעקר שני זוגות מלקחיים כירורגיים ואזמל על ידי טבילתם ב-70% אתנול ולאחר מכן ניגובם יבש.
  2. פיפטה 2 מ"ל של מדיום פיברובלסט בצלחת פטרי שבה תבוצע כריתת הרקמה.
  3. פיפטה 2.5 מ"ל של מדיום פיברובלסט לשני צלוחיות T25. סובבו את הצלוחיות כך שהנפח הקטן של המדיום יכסה את כל פני השטח.
  4. העבירו את ביופסיית העור שנקטפה מחדר הניתוח למעבדה על קרח בתמיסת העברת רקמות קרה וסטרילית (ראו טבלת החומרים) או 0.9% NaCl בצינור פלסטיק סטרילי.
  5. פתחו את הצינור עם הרקמה בתוך מכסה המנוע של תרבית הרקמה. הוציאו את הביופסיה מהצינור באמצעות המלקחיים המעוקרים והניחו אותה בצלחת פטרי (איור 2A).
  6. בדקו ויזואלית את הביופסיה כדי לזהות את שלוש שכבות העור, האפידרמיס, הדרמיס והשומן התת עורי. חפשו משטח עור מוכר, לפעמים עם שיער גלוי, כדי לזהות את האפידרמיס. בצד הנגדי, חפשו את השומן התת עורי, שהוא לעתים קרובות צהוב ורזה. זהה את השכבה שבין האפידרמיס לשומן התת-עורי כדרמיס - המקור לפיברובלסטים בני קיימא (איור 2B).
  7. כדי לבודד פיברובלסטים מהדרמיס, הסירו את שתי השכבות האחרות והניחו את הרקמה על צידה כך שכל שלוש השכבות יהיו גלויות לעין.
    הערה: שלא כמו רקמת אבי העורקים, לא ניתן להפריד בין שכבות העור זו מזו; לפיכך, יש לחתוך אותם. הרקמה היא גם גומי יותר, מה שמקשה על החיתוך. השתמשו באזמל חד.
  8. החזיקו את הרקמה עם מלקחיים. חותכים במקביל לגבול בין האפידרמיס לדרמיס. חותכים את כל האפידרמיס. נסו לחתוך בקו נקי אחד ואל תזוזו קדימה ואחורה כדי למנוע נזק לרקמות.
  9. להפוך את הרקמה. חזור על אותו הליך כמו בשלב 2.8; הפעם, לחתוך בתוך דרמיס במקביל לגבול עם השומן התת עורי.
  10. לאחר בידוד הדרמיס, חתכו את הרקמה לקוביות בערך 1 x 1 x 1 x 1 מ"מ3. לחץ את הרקמה כלפי מטה עם מלקחיים וחתך את הרקמה בכיוון אחד באמצעות האזמל. אל תקצצו הלוך ושוב; לבצע חיתוכים נקיים וחד כיווניים כדי למזער נזקים. נסו ליצור כמה שיותר קוביות, בהתחשב בגודל הביופסיה (איור 2C).
  11. מקם את חלקי הרקמה ברבע העליון של בקבוק T25 באמצעות המלקחיים. הניחו 10-20 קוביות לכל בקבוק אם כמות החומר מאפשרת זאת (איור 2D).
    הערה: השתמש במלקחיים חלקים כדי למזער את ההדבקה של הרקמה לצלעות המלקחיים ולנתק בקלות את הרקמה לתוך הבקבוקון.
  12. דגירה של קוביות הרקמה בצלוחיות T25 למשך כ-10 ימים ב-5% CO2 ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור.
    הערה: צמיחת התאים הראשונה צפויה בערך אז. התאים הנודדים בתחילה עשויים להיראות קטנים יותר מפיברובלסטים רגילים.
  13. לאחר שנצפתה צמיחת התאים, הוסיפו 2.5 מ"ל של מדיום לבקבוקון, והקפידו לא לטפטף אותו על חלקי הרקמה כדי למנוע מהם להתנתק.
  14. לאחר כ -5 ימים נוספים, כאשר ניתן לראות אשכולות של תאים סביב חלקי הרקמה, לשנות את מדיום התרבית. אם חתיכות טישו מתנתקות, הסר אותן מכיוון שהן לא יתחברו מחדש.
  15. ברגע שהתאים נפגשים ב-80-90%, מעבירים אותם לבקבוקון T75 וממשיכים להתרבות בפורמט זה.
    הערה: מומלץ יחס מפוצל של 1:2 או 1:3. להקפיא גיבוי של התאים במעבר מוקדם. התאים בדרך כלל שומרים על תכונותיהם עד מעבר 10; אין להשתמש בקטעים מאוחרים יותר לניסויים.

3. מדידת התכווצות (דוגמה לעסקים קטנים ובינוניים)

  1. הכינו מערך ECIS של 96w10e (ראו איור 3A לתמונה מייצגת של המערך עם אלקטרודות מוגדלות ותאים שנזרעו על האלקטרודות).
    הערה: בצע את השלבים הבאים תחת מכסה מנוע זרימה למינרי סטרילי של תרבית רקמה.
    1. מצפים מערך סטרילי של 96w10e עם 200 μL של 10 mM L-ציסטאין לבאר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. שטפו את הצלחת פעמיים במים סטריליים. תנו לצלחת להתייבש למשך הלילה במכסה הרקמה עם המכסה מעט פתוח.
      הערה: ציפוי הצלחת ב- L-ציסטאין נחוץ רק בעת שימוש בצלחת בפעם הראשונה.
    3. למחרת, צלחת ומכסה לעקר UV במשך 30 דקות. סובבו את המכסה כלפי מעלה כך שהחלק הפנימי מעוקר. לאחר עיקור הצלחת, אין לפתוח את הצלחת מחוץ למכסה המנוע.
  2. זריעת תאים במערך ECIS
    1. תמיסת ג'לטין סטרילית מלפני חימום 1% באמבט המים למשך 30 דקות.
      הערה: התמיסה מאוחסנת במקרר ועלולה להתמצק, מה שמקשה על פיפטה.
    2. לאחר מכן, מצפים את הבארות עם 100 μL של תמיסת ג'לטין 1% לכל באר ודגירה את הצלחת ב 37 °C (64 °F) למשך שעה אחת לפחות.
    3. לשאוף את הג'לטין מהבארות.
    4. ספרו את התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי וזרעו את ה-SMCs במשולש בצפיפות זריעה של 30,000 תאים/באר ב-200 μL של מדיום SMC.
    5. מניחים את הצלחת עם ה-SMCs לתוך מחזיק הבאר ECIS 96 בחממת תרביות התאים. לחץ פעמיים על תוכנת ECIS Applied Biophysics כדי לפתוח את התוכנית וללחוץ על כפתור ההתקנה .
    6. בדוק אם לכל האלקטרודות יש מגע עם המחזיק (ירוק; אדום אם אין חיבור) בלוח התחתון השמאלי שכותרתו תצורת Well. אם האלקטרודות אינן מחוברות כראוי, התאם את הלוחית במחזיק לפני תחילת המדידה.
    7. בחר את סוג הלוח (מערך 96 בארות) באותו פאנל על-ידי לחיצה על סוג מערך.
    8. בהגדרת איסוף הנתונים של הלוח העליון הימני, לחץ על תדר יחיד ושנה את ערך העכבה ל - 4000 הרץ ואת המרווח ל - 8 שניות.
    9. לחץ על לחצן התחל כדי להתחיל מדידות. המתן עד שייפתח פאנל חדש, שבו ניתן לשמור את קובץ ה- ECIS.
    10. אפשרו לתאים להתחבר ולהקים חד שכבתי במשך 48 שעות.
      הערה: החיבור וההתפשטות של תאים על האלקטרודות יוצרים ערך התנגדות בסיסי (איור 3B).
  3. גירוי של תאים כדי לגרום להתכווצות
    1. לגרום להתכווצות SMC על ידי גירוי התאים עם 10 מיקרוגרם /מ"ל של יונופור סידן, יונומיצין.
      הערה: Ionomycin יגרום לזרם של Ca2+ חוץ-תאי, ויפעיל את מפל ההתכווצות; ראו איור 4A לתמונות מייצגות של תאים מכווצים שאינם מגורה ומעוררים.
    2. יש לדלל 1 מ"ג של אבקת יונומיצין ב-100 μL של דימתיל-סולפוקסיד כדי ליצור תמיסת מלאי של 10 מ"ג/מ"ל, ולאחסן 10 μL aliquots בטמפרטורה של -20°C. לפני השימוש, יש לדלל את תמיסת היונומיצין 1:10 במדיום SMC כדי להכין את תמיסת העבודה שתתווסף לתאים.
    3. בצע את גירוי התא כאשר המערך עדיין נמצא במערך בתוך חממת תרביות התאים והאלקטרודות מחוברות למערכת.
      1. כדי לעורר את התאים, להסיר את המכסה ולהניח אותו על משטח סטרילי בתוך האינקובטור. הכינו שתי פיפטות, ברזולוציה של 2 μL ו-150 μL.
      2. לפני שתתחיל את הגירוי, לחץ על מארק בתוכנה והנח הערה.
        הערה: פעולה זו תקל על מציאת התזמון המדויק של הגירוי בעת ניתוח הנתונים.
      3. פיפט 2 μL של תמיסת העבודה של היונומיצין לתוך כל באר במהירות האפשרית. לאחר שכל התאים היו מגורה, ערבבו את המדיום בבארות באמצעות הפיפטה השנייה.
        הערה: בשל ההשפעות המהירות, אין צורך לשנות עצות בין קווי תאים שונים ותנאים שונים. לעבוד במהירות תוך כדי גירוי וערבוב כי ionomycin יש השפעה חריפה. בעת גירוי צלחת מלאה, לעורר מקסימום של 3 עמודים בבת אחת. לאחר כל גירוי, המתן לפחות 30 דקות עד לגירוי הבא כדי לאפשר לתאים להתאושש מהטמפרטורה ושינוי ה- CO2 שנגרם על ידי פתיחת דלת האינקובטור.
      4. מיד לאחר סיום הגירוי, לחץ שוב על מארק כדי להוסיף הערה שהגירוי נעשה.
    4. סיום ניסוי הגירוי
      1. רשום את ערכי העכבה במשך כ-5 דקות לאחר גירוי היונומיצין. סיים את ההקלטה על-ידי הקשה על סיום.
      2. השתמש שוב במערכי ECIS עד שלוש פעמים: לשטוף את הבארות פעמיים עם מים סטריליים, ולדגום את הצלחת ב 37 °C (74 °F) במשך 2-3 שעות עם טריפסין או מגיב דומה. חזור על שלבים 3.1.2 ו- 3.1.3.
  4. ייצוא הנתונים
    1. כדי לייצא את הנתונים, לחץ על קובץ | ייצוא נתונים | ל- Excel (נבחר). בחר תיקיה לשמירת הקובץ.
    2. לחץ על הפרד כאשר התוכנית מבקשת לשלב או להפריד גליונות.
  5. ניתוח פלט ההתכווצות
    1. כדי לחשב את תגובת ההתכווצות, השתמש במשוואה הבאה (1), כאשר C מציין כיווץ (המבוטא באחוזי שינוי בהשוואה לנקודת ההתחלה), פרסטימולציה (PrS) מציינת את ערך ההתנגדות (המבוטא Ω) ממש לפני גירוי יונומיצין ולאחר גירוי (PoS) מציין את ההתנגדות (המתבטאת Ω) 2 דקות לאחר סיום הגירוי.
      Equation 1 (1)
      הערה: כפי שמוצג במשוואה (1), ערך העכבה של מדיום תרבית מלא היטב ללא תאים מחוברים (ערך של 290 Ω) מופחת מכל התוצאות בחישוב הסופי. מומלץ למדוד תגובות התכווצות במשולש בכל ניסוי ולבצע שלושה ניסויים עצמאיים עם אותו קו תאים כדי להסביר כל וריאציה בין-ניסויית ותוך-ניסיונית.
    2. לאחר ביצוע שלושת הניסויים הבלתי תלויים, קבץ את הנתונים יחד על ידי חישוב הממוצע של שלוש המדידות, כולל סטיית התקן (SD).
  6. השוואת קבוצות שונות
    1. כדי להגדיר את טווח ההתכווצות הנורמלית ולחקור את שאלות המחקר הספציפיות הבאות, השתמש בקבוצת הביקורת כדי להגדיר "התכווצות נורמלית" ולהשוות אותה לתגובת ההתכווצות של המטופלים או קבוצות הטיפול.
    2. חשב את הממוצע וה-SD של כל קבוצת הביקורת, כלומר של ערכי הקצה עבור כל קווי התאים, כמתואר בשלב 3.5.2.
    3. השתמש בטווח של הממוצע ± 2SD כדי לזהות תאים בקבוצה השנייה שנמצאים מחוץ לטווח זה, מה שמצביע על כך שיש להם תגובת התכווצות שונה.
      הערה: המנגנון העומד מאחורי תגובת ההתכווצות שהשתנה כפוף לשאלות מחקר ספציפיות והוא תלוי בתאים ובתנאים ולא יידון בפרוטוקול זה.

4. זיהוי נוכחות של סמנים ספציפיים ל- SMC

  1. בידוד RNA
    1. זרעו את אותם קווי תאים ספציפיים לחולה המשמשים למדידות התכווצות בצלחות של 6 בארות, באר אחת לכל קו תא. ספרו את התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי וזרעו את התאים בצפיפות זריעה של 200,000 תאים/באר במדיום SMC ואפשרו להם להתחבר למשך הלילה.
    2. לשטוף את התאים פעם אחת עם PBS סטרילי.
    3. לבודד את התאים ולבודד את התאים על פי הוראות היצרן.
  2. סינתזת cDNA
    1. בצע סינתזת cDNA ב-20 μL של תערובת תגובות שעתוק הפוכה. לדלל את הריכוזים של סך הרנ"א המבודד על פי ההוראות שסופקו על ידי היצרן.
  3. qPCR
    1. מדוד את ביטוי הגנים של גנים של סמן SMC, למשל, ACTA2, CNN1, SMTN ו - TAGLN כדי לאשר שהתאים המבודדים הם אכן SMCs ולזהות סמני SMC. בדוק את המתאם של התוצאות עם פלט התכווצות.
    2. השתמש לפחות בשני גנים של משק בית כדי לנרמל את הנתונים, למשל, YWHAZ ו - TBP.
      הערה: ניתן לבצע את הריצה והניתוח של qPCR באמצעות מכונות PCR שונות ותוכנות תואמות, בהתאם למה שזמין וממוטב במעבדה. ראה טבלה משלימה S1 עבור רצפי פריימרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי לבדוק את יכולת השכפול של שיטה זו, השיטה אומתה לראשונה באמצעות SMCs בקרה בלבד. כדי לקבוע את יכולת השכפול של מדידה בין-ניסיונית, שתי מדידות בלתי תלויות של כל קווי השליטה ותאי המטופל הכלולים הותוו כעלילה של בלנד-אלטמן (איור 3B). העלילה הראתה כי שיטה זו אינה מראה שונות מחוץ למרווח בר-סמך, למעט קו תא חריג אחד. יתר על כן, התוצאות האלה הראו ששתי בארות שנזרעו בתוך אותו ניסוי ועוררו בו זמנית מראות למעשה את אותה עקומת תגובה מתכווצת (איור 4C). כדי לאמת אם התגובה המוצגת היא התכווצות ולא מתח אוסמוטי בגלל גירוי יונומיצין, המדיום הוחלף לאחר הגירוי, והתנהגות התאים נרשמה. זה מראה שהתאים המגורים התחילו להתפשט שוב על האלקטרודה (איור 4D).

כיישום הראשון של שיטה חדשנית זו, תגובת ההתכווצות ב-SMCs נגזרה מחולי אורטות בריאות ולא מורחבות (n=6) וממפרצת באבי העורקים הבטני (AAA) (n=21; תרשים 5א) נמדד, כפי שהוצג קודם לכן8. התגובה החציונית של קבוצת הביקורת הייתה 61% (46-77%), לעומת התגובה החציונית, 52% (15-75%), מקבוצת המטופלים. הערכים לא היו שונים באופן משמעותי, והשתנות גבוהה יותר נצפתה בקבוצת המטופלים. בשל החידוש של השיטה, קבוצת הביקורת שימשה לקביעת התכווצות "נורמלית". איור 5B מדגים את הטווח הדו-ממדי הממוצע ± ± של קבוצת הביקורת וכיצד טווח זה משמש לזיהוי ארבעה מטופלים בעלי ערכי התכווצות נמוכים יותר מהערכים ה"נורמליים". קביעת הגורם לפגיעה בהתכווצות היא מטרתו של מחקר מכניסטי נפרד. בוצע ניתוח בוט מערבי כדי לקבוע אם ה-SMC המשמש לניסוי מבטא סמני התכווצות SMC. ניתוח הכתמים המערביים (איור 6A) והכימות שלאחר מכן (איור 6B) מאשרים שהתאים מבטאים סמני SMC. ביטוי הסמן בכל הקבוצות היה משתנה ולא תאם את תפוקת הצמצום. כדי לקבוע את יכולת ההתפשטות של ה-SMC, בוצע qPCR עבור Ki67 (איור 6C). ביטוי Ki67 היה ניתן לזיהוי בכל התאים, אך לא תאם את תפוקת ההתכווצות.

Figure 1
איור 1: בידוד SMC מרקמת AAA אבי העורקים. (A) חומרים הדרושים לבידוד SMC מרקמת אבי העורקים: רקמת אבי העורקים בצלחת פטרי, מדיום SMC, שני צלוחיות T25 מלאות במדיום SMC, אזמל ושני זוגות מלקחיים כירורגיים. (B) הצד האינטימי של דופן אבי העורקים מראה לוחות טרשת עורקים. (C) שכבה אדוונטיציאלית של דופן אבי העורקים. (ד) הפרדת המדיה של טוניקה וטוניקה אדוונטיטיה על ידי משיכה עם המלקחיים. (E) לאחר בידוד מדיית הטוניקה, חותכים את הרקמה לחתיכות קטנות באמצעות מלקחיים ואיזמל. (F) חלקי רקמה המונחים בבקבוקון T25. קיצורים: AAA = מפרצת אבי העורקים הבטני ; SMC = תא שריר חלק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: בידוד פיברובלסטים מרקמה עורית. (A) חומרים הדרושים לבידוד פיברובלסטים מרקמה עורית: רקמה עורית בצלחת פטרי, מדיום פיברובלסט, שני צלוחיות T25 מלאות בתווך פיברובלסט, אזמל ושני זוגות מלקחיים כירורגיים. (B) ביופסיה של העור המציגה שומן תת עורי בצד העליון. (C) לאחר בידוד הדרמיס, הרקמה נחתכת לחתיכות קטנות באמצעות מלקחיים ואיזמל. (D) חלקי רקמה המונחים בבקבוקון T25. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: הגדרת צלחת ECIS וייצוג גרפי של כיווץ SMC אבי העורקים. צלחת ECIS של 96 בארות. באמצע; הגדלה של באר אחת של לוחית ECIS, המציגה את עשר האלקטרודות בתחתית הבאר. נכון; תמונת מיקרוסקופ אור של ה-SMCs שנזרעו על צלחת ECIS; הגדלה 10x. (B) עקומות התנגדות שנמדדו על ידי ECIS לאחר זריעה של SMCs בקרה במשולש. קו כחול עבה מייצג את הממוצע של המשולש, וקווים מנוקדים מייצגים את ה-SD של המשולשים. ב-4-5 השעות הראשונות לאחר הזריעה, נמדדים עסקים קטנים ובינוניים על פני השטח כולה, ונמדדת התנגדות גבוהה (כ-1000 Ω). ברגע שנוצר מונו-שכבתי SMC יציב, ההתנגדות פוחתת עם הזמן לכ-500 Ω. נתון זה שונה מ-8. קיצורים: ECIS = חישת עכבה של מצע תא חשמלי; SMC = תא שריר חלק; SD = סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: מדידת התכווצות SMC באמצעות ECIS. (A) שמאלה; SMC monolayer של בקרת SMCs לפני גירוי להתכווצות. נכון; שליטה SMCs לאחר גירוי להתכווצות. הגדלה 10x. (B) תרשים הפרש המדגים יכולת שכפול של מדידה בין-ניסיונית בין שתי מדידות כיווץ נפרדות. קווים מנוקדים מייצגים את הרווח בר-סמך של 95%, והקו המדיאלי העבה מייצג את הממוצע של שתי מדידות בין-ניסיוניות. כל נקודת נתונים מייצגת את הסטייה מהממוצע של שתי מדידות בלתי תלויות של כל מערך הנתונים של בקרות ומטופלים (סגול ●; n = 27). (C) יכולת שכפול תוך-ניסיונית של מדידות התכווצות ECIS. עקומות התנגדות הנוצרות על ידי בקרת SMC נזרעו בשתי בארות. קו מקווקו אנכי מסמן את הגירוי. (D) שחזור תאים לאחר גירוי של התכווצות. קו כחול עבה מייצג את ערך ההתנגדות של SMC בקרה לא מגורה. קו כחול מנוקד מייצג את ערך ההתנגדות של אותו קו SMC בקרה, לאחר גירוי המסומן על ידי הקו השחור המקווקו האנכי. כשעה אחת לאחר הגירוי (קו שחור אנכי מנוקד עבה), המדיום בשני התנאים התרענן כדי להסיר את הגירוי, וההתאוששות של התאים הייתה במעקב במשך 3.5 שעות נוספות. ערכי ההתנגדות נורמלו לערכים של גירוי מראש כדי לעקוב אחר התנהגות התאים לאחר הגירוי. נתון זה שונה מ-8. קיצורים: ECIS = חישת עכבה של מצע תא חשמלי; SMC = תא שריר חלק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: התכווצות SMC בבקרה ו-SMCs של חולי AAA עם גירוי יונומיצין. (A) תגובת התכווצות ממוצעת של שליטה (כחול ●; n = 6) וחולה AAA (אדום ●; n = 21) SMCs על גירוי יונומיצין הנגזר מניסויים מרובים. (B) תגובת התכווצות ממוצעת של בקרה (כחול ●; n = 6), התכווצות רגילה (אדום ●; n = 15), והתכווצות נמוכה (אדום ●; n = 6) SMCs של חולי AAA הנגזרים מניסויים מרובים. ההתכווצות מתבטאת באחוזי ירידה בהשוואה לערך הבסיסי לפני הגירוי. קו שחור אופקי מייצג את תגובת ההתכווצות הממוצעת של SMCs לבקרה. קווים אופקיים מנוקדים מסמנים שני כונני SSD מעל ומתחת לממוצע של קבוצת הביקורת. קבוצת ההתכווצות הנמוכה מוגדרת כהתכווצות הנמוכה משני כונני SSD מתחת לממוצע של קבוצת הביקורת. Boxplot מוצג כחציון עם טווח. נתון זה שונה מ-8. קיצורים: AAA = מפרצת אבי העורקים הבטני; ECIS = חישת עכבה של מצע תא חשמלי; SMC = תא שריר חלק; SD = סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 6
איור 6: ביטוי סמן SMC. סמני התכווצות והתפשטות SMC נותחו ב-SMC של שליטה (Δ; n = 6), התכווצות נורמלית, (●; n = 15), והתכווצות נמוכה (○; n = 6). (A) ניתוח כתם מערבי של SMC המשמש לניסויי ההתכווצות. aSMA, קלפונין ו-SM22 כומתו, וטובולין שימש כבקרת טעינה. (ב) כימות הכתם המערבי המתואר ב-(א). (C) ניתוח qPCR של סמן התפשטות Ki67. נתון זה שונה מ-8. קיצורים: SMC = תא שריר חלק; aSMA = אלפא חלק שריר אקטין; qPCR = PCR כמותי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

טבלה משלימה S1: רצפי פריימרים. רצפי פריימר qPCR קדימה ואחורה של גנים של משק בית וסמן SMC מנותחים. טבלה זו משתנה מ- 8. קיצורים: SMC = תא שריר חלק; qPCR = PCR כמותי. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מאמר זה מציג שיטה למדידת התכווצות SMC במבחנה, בהתבסס על השינויים בעכבה ובעיסוק פני השטח. ראשית, מתואר הבידוד, התרבות וההתרחבות של עסקים קטנים ובינוניים אנושיים ראשוניים ספציפיים למטופל ופיברובלסטים של העור, ולאחר מכן כיצד להשתמש בהם למדידות התכווצות.

מגבלה של המחקר קשורה להשגת התאים באמצעות פרוטוקול אקספלנט. התאים שמתרבים מהביופסיה עשויים להיות בעלי תכונות שונות מאשר לרקמה המקורית in vivo. בנוסף, פרוטוקולי ההסבר המוצגים כאן אינם חדשניים אך כלולים כדי להציג זרימת עבודה מלאה, החל, במקרה זה, מחומר מפרצת אבי העורקים הספציפי למטופל ועד למדידות התכווצות. גידול התאים במבחנה עשוי גם להשפיע על חלק מתכונותיהם בשל היעדר גורמים מערכתיים וקשיחות שונה של המצע. זה עשוי להסביר את השונות בביטוי סמן SMC. בשל היעדר סמנים פיברובלסטים אמינים, פיברובלסטים נבדלים בדרך כלל על סמך היעדר סמנים בהשוואה לתאים אחרים. לפיכך לא אפיינו את הפיברובלסטים שבודדו בפרוטוקול זה. מגבלה נוספת היא שמדידת ההתכווצות כגורם של פני השטח נותרה עקיפה במקצת. ההשלכות האפשריות הן שהפלט מגיע מממוצע התגובה של הבאר כולה המכילה אלפי תאים. לפיכך, לא ניתן לקבוע אם כל התאים מתכווצים פחות או אם ישנם תאים שמורידים את הממוצע.

התכווצות SMC נחקרה בעבר בטכניקות שונות. בהשוואה למיקרוסקופיה של כוח מתיחה4, ל-ECIS יש יתרונות רבים, בעיקר, תפוקה גבוהה יותר ויעילות זמן גבוהה יותר. כפי שצוין במגבלות, הפשרה היא שמדידות ההתכווצות מתקבלות בעקיפין, מה שהופך את ECIS למתאים יותר לסינון מספר גדול יותר של קווי תאים וקבוצות ולמדידת כוח המתיחה למחקרים מכניסטיים מעמיקים יותר של תא יחיד. גרדיאנטים של סידן6 שימשו בעבר כאינדיקטורים להתכווצות; ECIS מספק מדידת כיווץ אמינה יותר מכיוון שהוא מודד את התנועה של התא. כימות של תמונות של קמטי קולגן הנגרמים על ידי התכווצות התאים שנזרעו בתוך הג'ל5 מספק ממוצע של כל אוכלוסיית התאים הזורעים, בדומה ל- ECIS. עם זאת, המדידות המתקבלות באמצעות ECIS מדויקות הרבה יותר ומספקות ניטור בזמן אמת במהלך כל מהלך התצפית, מה שהופך אותן לאינפורמטיביות יותר באופן משמעותי.

לסיכום, מאמר זה מתאר יישום חדשני עבור מערכת ECIS, אשר ניתן להשתמש בו כדי למדוד את התכווצותם של תאים חסידיים, כגון SMCs ופיברובלסטים. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לחקור קווי תאים מרובים בזמן וביעילות, מה שהופך אותה למתאימה לבדיקת חולים או תרופות. בהתאם למחקר על מפרצות אבי העורקים, שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לסנן SMCs של חולים עם הפרעות לב וכלי דם אחרות, כגון דיסקציות וטרשת עורקים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

Acknowledgments

אנו רוצים להודות תודה לטארה ואן מריינבואר, אלברט ואן ויק, יולנדה ואן דר ולדן, יאן ד. בלנקנשטיין, לאן טראן, פיטר ל. הורדייק, צוות PAREL-AAA, וכל מנתחי כלי הדם של UMC באמסטרדם, Zaans Medisch Centrum ובית החולים Dijklander על אספקת חומרים ותמיכה למחקר זה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well Array Applied Biophysics 96W10idf PET Array used to measure contraction in the ECIS setup
Custodiol Dr. Franz Höhler Chemie GmbH RVG 12801 Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich 472301 Solution used to dilute ionomycin
Fetal Bovine Serum Gibco 26140079 Addition to cell culture medium
Ham's F-10 Nutrient Mix Gibco 11550043 Medium used to culture skin fibroblasts
Human Vascular Smooth Muscle Cell Basal Medium (formerly ''Medium 231'') Gibco M231500 Medium used to culture smooth muscle cells
Invitrogen countess II Thermo Fisher Scientific AMQAX1000 Automated cell counter
Ionomycin calcium salt from Streptomyces conglobatus Sigma-Aldrich I0634-1MG Compound used for contraction stimulation
NaCl 0.9% Fresenius Kabi B230561 Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 Antibiotics used for cell culture medium
Phospathe buffered saline Gibco 10010023 Used to wash cells
Quick-RNA Miniprep Kit Zymo Research R1055 Kit used for RNA isolation
Smooth Muscle Growth Supplement (SMGS) Gibco S00725 Supplement which is added to smooth muscle cell culture medium
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit Thermo Fisher Scientific 11754250 Kit used for cDNA synthesis
SYBR Green PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific 4309155 Reagent for qPCR
Trypsin-EDTA Gibco 15400-054 Used to trypsinize cells
ZTheta Applied Biophysics ZTheta ECIS instrument used for contraction measurements

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Milewicz, D. M., et al. Genetic basis of thoracic aortic aneurysms and dissections: focus on smooth muscle cell contractile dysfunction. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 9, 283-302 (2008).
  2. Milewicz, D. M., et al. Altered smooth muscle cell force generation as a driver of thoracic aortic aneurysms and dissections. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 26-34 (2017).
  3. Groeneveld, M. E., et al. Betaglycan (TGFBR3) up-regulation correlates with increased TGF-β signaling in Marfan patient fibroblasts in vitro. Cardiovascular Pathology. 32, 44-49 (2018).
  4. Chen, J., Li, H., SundarRaj, N., Wang, J. H. C. Alpha-smooth muscle actin expression enhances cell traction force. Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (4), 248-257 (2007).
  5. Peyton, S. R., Putnam, A. J. Extracellular matrix rigidity governs smooth muscle cell motility in a biphasic fashion. Journal of Cellular Physiology. 204 (1), 198-209 (2005).
  6. Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2. Nature. 318 (6046), 558-561 (1985).
  7. Wu, D., et al. NLRP3 (nucleotide oligomerization domain-like receptor family, pyrin domain containing 3)-caspase-1 inflammasome degrades contractile proteins: implications for aortic biomechanical dysfunction and aneurysm and dissection formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (4), 694-706 (2017).
  8. Bogunovic, N., et al. Impaired smooth muscle cell contractility as a novel concept of abdominal aortic aneurysm pathophysiology. Scientific Reports. 9 (1), 1-14 (2019).
  9. Hurst, V., Goldberg, P. L., Minnear, F. L., Heimark, R. L., Vincent, P. A. Rearrangement of adherens junctions by transforming growth factor-β1: role of contraction. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 276 (4), 582-595 (1999).
  10. Hu, N., et al. Comparison between ECIS and LAPS for establishing a cardiomyocyte-based biosensor. Sensors and Actuators B: Chemical. 185, 238-244 (2013).
  11. Peters, M. F., Lamore, S. D., Guo, L., Scott, C. W., Kolaja, K. L. Human stem cell-derived cardiomyocytes in cellular impedance assays: bringing cardiotoxicity screening to the front line. Cardiovascular Toxicology. 15 (2), 127-139 (2015).
  12. Zhang, S., Yang, Y., Kone, B. C., Allen, J. C., Kahn, A. M. Insulin-stimulated cyclic guanosine monophosphate inhibits vascular smooth muscle cell migration by inhibiting Ca/calmodulin-dependent protein kinase II. Circulation. 107 (11), 1539-1544 (2003).
  13. Halterman, J. A., Kwon, H. M., Zargham, R., Bortz, P. D. S., Wamhoff, B. R. Nuclear factor of activated T cells 5 regulates vascular smooth muscle cell phenotypic modulation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (10), 2287-2296 (2011).
  14. Bass, H. M., Beard, R. S., Cha, B. J., Yuan, S. Y., Nelson, P. R. Thrombomodulin induces a quiescent phenotype and inhibits migration in vascular smooth muscle cells in vitro. Annals of Vascular Surgery. 30, 149-156 (2016).
  15. Burger, J., et al. Molecular phenotyping and functional assessment of smooth muscle like-cells with pathogenic variants in aneurysm genes ACTA2, MYH11, SMAD3 and FBN1. Human Molecular Genetics. , (2021).
  16. Yeung, K. K., et al. Transdifferentiation of human dermal fibroblasts to smooth muscle-like cells to study the effect of MYH11 and ACTA2 mutations in aortic aneurysms. Human Mutation. 38 (4), 439-450 (2017).

Tags

ביולוגיה גיליון 180 תא שריר חלק מפרצת אבי העורקים כיווץ תרגום במבחנה בדיקת התכווצות בידוד תאי ראשוני ספציפי לחולה
בידוד של תאי שריר חלק אבי העורקים העיקריים הספציפיים למטופל ומדידות כיווץ חצי-קוונטיטיביות בזמן אמת <em>במבחנה</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bogunovic, N., Rombouts, K. B.,… More

Bogunovic, N., Rombouts, K. B., Yeung, K. K. Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro. J. Vis. Exp. (180), e63122, doi:10.3791/63122 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter