Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isolering av primära patientspecifika aorta glatta muskelceller och semikvantitiva realtidskontraktionsmätningar in vitro

Published: February 15, 2022 doi: 10.3791/63122
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2, 1,2
1Department of Vascular Surgery, Amsterdam UMC, Vrije Universiteit Amsterdam, 2Department of Physiology, Amsterdam Cardiovascular Sciences, Amsterdam UMC, Vrije Universiteit Amsterdam, 3Laboratory of Experimental Cardiology, Department of Cardiology, Leiden University Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

Denna uppsats beskriver en explantkulturbaserad metod för isolering och odling av primära, patientspecifika humana aorta glatta muskelceller och dermala fibroblaster. Vidare presenteras en ny metod för att mäta cellkontraktion och efterföljande analys, som kan användas för att studera patientspecifika skillnader i dessa celler.

Abstract

Glattmuskelceller (SMC) är den dominerande celltypen i aortamediet. Deras kontraktila maskineri är viktigt för överföring av kraft i aortan och reglerar vasokonstriktion och vasodilatation. Mutationer i gener som kodar för SMC-kontraktila apparatproteiner är associerade med aortasjukdomar, såsom thoraxaortaaneurysmer. Att mäta SMC-sammandragning in vitro är utmanande, särskilt på ett sätt med hög genomströmning, vilket är viktigt för screening av patientmaterial. För närvarande tillgängliga metoder är inte lämpliga för detta ändamål. Detta dokument presenterar en ny metod baserad på elektrisk cell-substratimpedansavkänning (ECIS). Först beskrivs ett explantprotokoll för att isolera patientspecifika humana primära SMC från aortabiopsier och patientspecifika humana primära dermala fibroblaster för studier av aorta aneurysmer. Därefter ges en detaljerad beskrivning av en ny sammandragningsmetod för att mäta kontraktilresponsen hos dessa celler, inklusive efterföljande analys och förslag till jämförelse av olika grupper. Denna metod kan användas för att studera sammandragningen av vidhäftande celler i samband med translationella (kardiovaskulära) studier och patient- och läkemedelsscreeningstudier.

Introduction

Glattmuskelceller (SMC) är den dominerande celltypen i aortamedialskiktet, det tjockaste lagret av aortan. Inom väggen är de radiellt orienterade och är involverade i bland annat vasokonstriktion och vasodilatation1. SMC-kontraktilmaskineriet är involverat i överföringen av kraft i aortan genom den funktionella länken med den extracellulära matrisen2. Mutationer i gener som kodar för proteinerna i SMC-kontraktilapparaten, såsom glattmuskel myosin tung kedja (MYH11) och glattmuskelaktin (ACTA2), har varit relaterade till fall av familjära thoraxaortaaneurysmer, vilket understryker relevansen av SMC-sammandragning för att upprätthålla den strukturella och funktionella integriteten hos aortan 1,2 . Vidare är mutationer i TGFβ-signalvägen också associerade med aortaaneurysmer, och deras effekter i aortaaneurysm patofysiologi kan också studeras i hudfibroblaster3.

Mätning med hög genomströmning av SMC-sammandragning in vitro är utmanande. Eftersom SMC-kontraktilitet inte kan mätas in vivo hos människor, utgör in vitro-analyser på mänskliga celler ett genomförbart alternativ. Dessutom är utvecklingen av bukaortaaneurysm (AAA) i djurmodeller antingen kemiskt inducerad av exempelvis elastasperfusion eller orsakad av en specifik mutation. Därför är djurdata inte jämförbara med AAA-utveckling hos människor, som oftast har en multifaktoriell orsak, såsom rökning, ålder och/eller ateroskleros. In vitro SMC-kontraktilitet har hittills huvudsakligen mätts med dragkraftsmikroskopi 4,5, kvantifiering av Fura-2 fluorescens intracellulära kalciumflöden6 och kollagenrynkningsanalyser7. Medan dragkraftsmikroskopi ger ovärderlig numerisk inblick i de krafter som genereras av en enda cell, är den inte lämplig för screening med hög genomströmning på grund av den komplexa matematiska databehandlingen och analysen av en cell i taget, vilket innebär att det är mycket tidskrävande att mäta ett representativt antal celler per givare. Fura-2-färgämnes- och kollagenrynkningsanalyser möjliggör ytlig bestämning av sammandragning och ger inte en exakt numerisk utgång, vilket gör dem mindre lämpliga för att diskriminera patientspecifika skillnader. Försämrad SMC-sammandragning i celler härledda från aorta hos patienter med bukaortaaneurysm demonstrerades för första gången genom att optimera en ny metod för att mäta SMC-sammandragning in vitro8. Detta gjordes genom att återanvända ECIS-metoden (Electric Cell-Substrate Impedance Sensing). ECIS är en realtidsanalys med medelhög genomströmning för kvantifiering av vidhäftande cellbeteende och sammandragning 9,10,11 såsom SMC-tillväxt och beteende i sårläknings- och migrationsanalyser 12,13,14. Den exakta metoden beskrivs i protokollavsnittet. På detta optimerade sätt kan ECIS också användas för att studera fibroblastkontraktion på grund av deras liknande storlek och morfologi.

Syftet med denna uppsats är att ge en stegvis beskrivning av metoden för att mäta SMC-sammandragning in vitro med ECIS8 och jämföra sammandragningen mellan kontroll- och patient-SMC. Först förklaras isolering och odling av primära SMC från kontroll- och patientaortabiopsier, som kan användas för sammandragningsmätning. För det andra beskrivs sammandragningsmätningar och analyser, tillsammans med verifieringen av SMC-marköruttryck. Vidare beskriver denna uppsats metoden för isolering av patientspecifika dermala fibroblaster vars sammandragning kan mätas med samma metodik. Dessa celler kan användas för patientspecifika studier med fokus på aortaaneurysm eller andra kardiovaskulära patologier15 eller prognostiska studier med hjälp av ett transdifferentieringsprotokoll som möjliggör sammandragningsmätning före aneurysmkirurgi16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OBS: Aortabiopsier erhölls under öppen aneurysmreparation i Amsterdam University Medical Centers, VU University Medical Center, Amsterdam, Zaans Medisch Centrum, Zaandam och Dijklander sjukhus, Hoorn, Nederländerna. Kontroll aortavävnad erhölls från den bit av aortan fäst vid njurartären som skördades för njurtransplantationer. Endast patienter över 18 år inkluderades, och alla patienter gav sitt informerade samtycke till att delta i studien. Allt material samlades in i enlighet med bestämmelserna i WMA-deklarationen i Helsingfors och institutionella riktlinjer från VU Medical Ethical Committee of the VU Medical Center. Alla experiment och experimentella protokoll utfördes i enlighet med institutionella riktlinjer och godkändes av den medicinska etiska kommittén vid VU Medical Center. För fullständig information om de kontroll- och patientcellinjer som används, se 8.

1. Isolera primära mänskliga SMC från aortabiopsier

OBS: Utför följande steg under en steril vävnadsodling laminär flödeshuva. Använd handskar och använd vanliga aseptiska tekniker vid hantering av humant blod och mänskliga vävnadsprover. SMC odlas i 231 Human Vascular Smooth Muscle Cell Basal Medium kompletterat med 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin och Glatt muskeltillväxttillskott som kallas SMC-medium.

  1. Sterilisera två par kirurgiska pincett och en skalpell genom att nedsänka dem i 70% etanol och därefter torka dem torra.
  2. Pipett 2 ml SMC-medium i en petriskål där vävnadsdissektionen kommer att utföras.
  3. Pipettera 2,5 ml SMC-medium i två T25-kolvar. Virvla kolvarna runt så att den lilla volymen medium täcker hela ytan.
  4. Transportera den skördade humana aortaväggsbiopsin från operationssalen till laboratoriet på is i ett sterilt plaströr med kall, steril vävnadsöverföringslösning (se materialförteckningen) eller 0,9% NaCl.
  5. Öppna röret med vävnaden inuti vävnadsodlingshuven. Ta ut biopin ur röret med de steriliserade pincetterna och lägg den i petriskålen (figur 1A).
  6. Inspektera biopsin visuellt för att identifiera de tre aortaskikten, tunica intima (inre), media (mitten) och adventitia (yttre skiktet). Leta efter närvaron av aterosklerotiska plack på intima sidan och slemmig bindväv på adventitiell sida (Figur 1B) för att skilja skikten.
  7. Om du vill isolera SMC:er från mediet tar du bort de andra två lagren. Placera vävnaden med intima placksidan uppåt först (Figur 1B). Ta bort den fasta placken genom att dra bort den från vävnaden med pincett medan du trycker ner vävnaden med det andra paret av pincett. Ta bort efterföljande lager av plack tills det rosa, enhetliga mediala skiktet är synligt.
  8. Vänd vävnaden (Figur 1C). Upprepa samma procedur, som i steg 1.7, genom att dra av det oavsiktliga skiktet (figur 1D). Var noga med att ta bort alla synliga delar i så många försök som behövs, eftersom det här lagret inte lätt kommer att lossna från media.
    OBS: Det är viktigt att de intima och oavsiktliga lagren tas bort ordentligt för att få en så ren SMC-population som möjligt.
  9. När det mediala skiktet är isolerat, skär vävnaden i kuber på ca 1 mm x 1 mm x 1 mm. Tryck ner mediet med pincett och skär vävnaden i en riktning med skalpellen. Skär inte fram och tillbaka; gör rena, enkelriktade nedskärningar för att minimera skador. Försök att göra så många kuber som möjligt, med tanke på biopsiens storlek (figur 1E).
  10. Placera vävnadsbitarna i den övre fjärdedelen av T25-kolven med tången. Placera 10-20 kuber per kolv om mängden material tillåter det (Figur 1F).
    OBS: Använd släta pincett för att minimera vidhäftningen av vävnaden till tångens revben och lossa lätt vävnaden i kolven.
  11. Inkubera vävnadskuberna i T25-kolvarna i cirka 10 dagar vid 5 %CO2 vid 37 °C i en inkubator.
    OBS: Första cellens utväxt förväntas runt den tiden. Cellerna som ursprungligen migrerar kan se mindre ut än vanliga SMC: er.
  12. När celltillväxt har observerats, tillsätt 2,5 ml medium till kolven, se till att inte pipettera den på vävnadsbitarna för att förhindra att de lossnar.
  13. Efter ungefär 5 dagar, när kluster av celler observeras runt vävnadsbitarna, ändra odlingsmediet. Om vävnadsbitar lossnar, ta bort dem eftersom de inte kommer att fästas igen.
  14. När cellerna är 80-90% sammanflytande, överför dem till en T75-kolv och fortsätt odla i detta format.
    OBS: Ett delat förhållande på 1: 2 eller 1: 3 rekommenderas. Frys en säkerhetskopia av cellerna vid en tidig passage. Cellerna behåller i allmänhet sina egenskaper fram till passage 10; senare passager bör inte användas för experiment.

2. Isolera primära dermala fibroblaster från hudbiopsier

OBS: Utför följande steg under en steril vävnadsodling laminär flödeshuva. Använd handskar och använd vanliga aseptiska tekniker vid hantering av humant blod och mänskliga vävnadsprover. Fibroblaster odlas i basalt medium kompletterat med 10% fetalt bovint serum, 100 U / ml penicillin och 100 μg / ml streptomycin, kallat fibroblastmedium.

  1. Sterilisera två par kirurgiska pincett och en skalpell genom att doppa dem i 70 % etanol och därefter torka av dem torra.
  2. Pipett 2 ml fibroblastmedium i en petriskål där vävnadsdissektionen kommer att utföras.
  3. Pipett 2,5 ml fibroblastmedium i två T25-kolvar. Virvla kolvarna runt så att den lilla volymen medium täcker hela ytan.
  4. Transportera den skördade hudbiopsin från operationssalen till laboratoriet på is i kall, steril vävnadsöverföringslösning (se materialförteckningen) eller 0,9% NaCl i ett sterilt plaströr.
  5. Öppna röret med vävnaden inuti vävnadsodlingshuven. Ta ut biopin ur röret med de steriliserade pincetterna och lägg den i petriskålen (figur 2A).
  6. Inspektera biopsin visuellt för att identifiera de tre hudskikten, epidermis, dermis och subkutant fett. Leta efter en igenkännlig hudyta, ibland med synligt hår, för att identifiera överhuden. På motsatt sida, leta efter det subkutana fettet, som ofta är gult och slemmigt. Identifiera skiktet mellan epidermis och det subkutana fettet som dermis-källan till livskraftiga fibroblaster (Figur 2B).
  7. För att isolera fibroblaster från dermis, ta bort de andra två skikten och placera vävnaden på dess sida så att alla tre skikten är synliga.
    OBS: Till skillnad från aortavävnaden kan hudskikten inte dras isär från varandra; Därför måste de skäras. Vävnaden är också mer gummiaktig, vilket gör det svårare att skära. Använd en skarp skalpell.
  8. Håll ner vävnaden med pincett. Skär parallellt med gränsen mellan epidermis och dermis. Skär bort hela epidermis. Försök att skära i en ren linje och rör dig inte fram och tillbaka för att undvika vävnadsskador.
  9. Vänd vävnaden. Upprepa samma procedur som i steg 2.8. den här gången skärs inom dermis parallellt med gränsen till det subkutana fettet.
  10. När dermis är isolerad, skär vävnaden i kuber ca 1 x 1 x 1 mm3. Tryck ner vävnaden med pincett och skär vävnaden i en riktning med skalpellen. Skär inte fram och tillbaka; gör rena, enkelriktade nedskärningar för att minimera skador. Försök att göra så många kuber som möjligt, med tanke på biopsiens storlek (Figur 2C).
  11. Placera vävnadsbitarna i den övre fjärdedelen av T25-kolven med tången. Placera 10-20 kuber per kolv om mängden material tillåter det (Figur 2D).
    OBS: Använd släta pincett för att minimera vidhäftningen av vävnaden till tångens revben och lossa lätt vävnaden i kolven.
  12. Inkubera vävnadskuberna i T25-kolvarna i cirka 10 dagar vid 5 %CO2 vid 37 °C i en inkubator.
    OBS: Första cellens utväxt förväntas runt då. Cellerna som initialt migrerar kan se mindre ut än normala fibroblaster.
  13. När celltillväxt har observerats, tillsätt 2,5 ml medium till kolven, se till att inte pipettera den på vävnadsbitarna för att förhindra att de lossnar.
  14. Efter cirka 5 dagar, när kluster av celler kan observeras runt vävnadsbitarna, ändra odlingsmediet. Om vävnadsbitar lossnar, ta bort dem eftersom de inte kommer att fästas igen.
  15. När cellerna är 80-90% sammanflytande, överför dem till en T75-kolv och fortsätt odla i detta format.
    OBS: Ett delat förhållande på 1: 2 eller 1: 3 rekommenderas. Frys en säkerhetskopia av cellerna vid en tidig passage. Cellerna behåller i allmänhet sina egenskaper fram till passage 10; senare passager bör inte användas för experiment.

3. Mätning av sammandragning (t.ex. små och medelstora företag)

  1. Förbered en 96w10e ECIS-matris (se figur 3A för en representativ bild av matrisen med förstorade elektroder och celler sådda på elektroderna).
    OBS: Utför följande steg under en steril vävnadsodling laminär flödeshuva.
    1. Täck en steril 96w10e array med 200 μL av 10 mM L-cystein per brunn i 30 min vid rumstemperatur.
    2. Tvätta plattan två gånger med sterilt vatten. Låt plattan torka över natten i vävnadsodlingshuven med locket något öppet.
      OBS: Beläggning av plattan med L-cystein är endast nödvändig när du använder plattan för första gången.
    3. Nästa dag, UV-sterilisera platta och lock i 30 min. Vrid locket uppåt så att insidan steriliseras. När plattan är steriliserad, öppna inte plattan utanför flödeshuven.
  2. Såddceller på ECIS-matrisen
    1. Förvärm 1% steril gelatinlösning i vattenbadet i 30 min.
      OBS: Lösningen förvaras i kylen och kan stelna, vilket gör det svårt att pipettera.
    2. Belägg därefter brunnarna med 100 μL av 1 % gelatinlösning per brunn och inkubera plattan vid 37 °C i minst 1 timme.
    3. Aspirera gelatinet från brunnarna.
    4. Räkna cellerna med hjälp av en automatiserad cellräknare och frö SMC: erna i tre exemplar vid en sådddensitet på 30 000 celler / brunn i 200 μL SMC-medium.
    5. Placera plattan med SMC: erna i ECIS 96-brunnshållaren i cellodlingsinkubatorn. Dubbelklicka på ECIS Applied Biophysics-programvaran för att öppna programmet och tryck på Setup-knappen .
    6. Kontrollera om alla elektroder har kontakt med hållaren (grön; röd om ingen anslutning) i den vänstra nedre panelen märkt Well Configuration. Om elektroderna inte är ordentligt anslutna, justera plattan i hållaren innan du börjar mätningen.
    7. Välj platttyp (96-brunnsmatris) i samma panel genom att klicka på Matristyp.
    8. I den högra övre panelen Data Collection Setup klickar du på enkel frekvens och ändrar impedansvärdet till 4000 Hz och intervallet till 8 s.
    9. Klicka på Start-knappen för att starta mätningarna. Vänta tills en ny panel öppnas, där ECIS-filen kan sparas.
    10. Låt cellerna fästa och etablera ett monolager i 48 timmar.
      OBS: Fastsättning och spridning av celler på elektroderna genererar ett baslinjemotståndsvärde (figur 3B).
  3. Stimulering av celler för att inducera sammandragning
    1. Inducera SMC-sammandragning genom att stimulera cellerna med 10 μg/ml kalciumjonofor, jonomycin.
      OBS: Jonomycin kommer att inducera tillströmningen av extracellulär Ca2+, vilket aktiverar kontraktilkaskaden; se figur 4A för representativa bilder av icke-stimulerade och stimulerade sammandragna celler.
    2. Späd 1 mg jonomycinpulver i 100 μL dimetylsulfoxid för att göra en stamlösning på 10 mg/ml och förvara 10 μL alikvoter vid -20 °C. Späd före användning jonomycinlösningen 1:10 i SMC-medium för att bereda arbetslösningen som ska tillsättas till cellerna.
    3. Utför cellstimuleringen medan matrisen fortfarande finns i matrishållaren inuti cellodlingsinkubatorn och elektroderna är fästa vid systemet.
      1. För att stimulera cellerna, ta bort locket och placera det på en steril yta inuti inkubatorn. Förbered två pipetter, inställda på 2 μL och 150 μL.
      2. Innan du börjar stimuleringen, tryck på Mark i programvaran och lägg en kommentar.
        OBS: Detta kommer att göra det lättare att hitta den exakta tidpunkten för stimuleringen när man analyserar data.
      3. Pipett 2 μL av jonomycinarbetslösningen i varje brunn så snabbt som möjligt. När alla celler har stimulerats, blanda mediet i brunnarna med den andra pipetten.
        OBS: På grund av de snabba effekterna är det inte nödvändigt att ändra tips mellan olika cellinjer och förhållanden. Arbeta snabbt samtidigt som du stimulerar och blandar eftersom jonomycin har en akut effekt. När du stimulerar en hel platta, stimulera högst 3 kolumner samtidigt. Efter varje stimulering, vänta minst 30 minuter tills nästa stimulering för att låta cellerna återhämta sig från temperaturen och CO2-förändringen orsakad av öppningen av inkubatordörren.
      4. Direkt efter att stimuleringen är klar trycker du på Mark igen för att lägga till en kommentar om att stimuleringen är klar.
    4. Avsluta stimuleringsexperimentet
      1. Registrera impedansvärdena i cirka 5 minuter efter jonomycinstimuleringen. Avsluta inspelningen genom att trycka på Slutför.
      2. Återanvänd ECIS-matriserna upp till tre gånger: Tvätta brunnarna två gånger med sterilt vatten och inkubera plattan vid 37 °C i 2–3 timmar med trypsin eller liknande reagens. Upprepa steg 3.1.2 och 3.1.3.
  4. Exportera data
    1. Om du vill exportera data klickar du på Arkiv | Exportera data | Till Excel (markerat). Välj en mapp för att spara filen.
    2. Klicka på Separera när programmet ber om att kombinera eller separera ark.
  5. Analysera kontraktilutdata
    1. För att beräkna kontraktilresponsen, använd följande ekvation (1), där C indikerar sammandragning (uttryckt i % av förändringen jämfört med baslinjen), förstimulering (PrS) indikerar resistensvärdet (uttryckt i Ω) strax före jonomycinstimulering och efterstimulering (PoS) indikerar resistensen (uttryckt i Ω) 2 minuter efter avslutad stimulering.
      Equation 1 (1)
      OBS: Som visas i ekvation (1) subtraheras impedansvärdet för en brunn fylld med odlingsmedium utan några bifogade celler (värde på 290 Ω) från alla resultat i den slutliga beräkningen. Det rekommenderas att mäta kontraktila svar i tre exemplar i varje experiment och utföra tre oberoende experiment med samma cellinje för att ta hänsyn till eventuell inter- och intraexperimentell variation.
    2. När de tre oberoende experimenten har utförts, gruppera data tillsammans genom att beräkna genomsnittet av de tre mätningarna, inklusive standardavvikelsen (SD).
  6. Jämföra olika grupper
    1. För att definiera intervallet för normal sammandragning och undersöka efterföljande specifika forskningsfrågor, använd kontrollgruppen för att definiera "normal sammandragning" och jämföra den med kontraktilt svar hos patienter eller behandlingsgrupper.
    2. Beräkna medelvärdet och SD för hela kontrollgruppen, dvs. av slutvärdena för alla cellinjer, enligt beskrivningen i steg 3.5.2.
    3. Använd intervallet för medelvärdet ± 2SD för att identifiera celler i den andra gruppen som faller utanför detta intervall, vilket indikerar att de har ett förändrat kontraktilt svar.
      OBS: Mekanismen bakom det förändrade kontraktila svaret är föremål för specifika forskningsfrågor och är cell- och tillståndsberoende och kommer inte att diskuteras i detta protokoll.

4. Detektera närvaron av SMC-specifika markörer

  1. RNA-isolering
    1. Frö samma patientspecifika cellinjer som används för sammandragningsmätningarna i 6-brunnsplattor, en brunn per cellinje. Räkna cellerna med hjälp av en automatiserad cellräknare och frö cellerna med en sådddensitet på 200 000 celler / brunn i SMC-medium och låt dem fästa över natten.
    2. Tvätta cellerna en gång med steril PBS.
    3. Lysa cellerna och isolera cellerna enligt tillverkarens instruktioner.
  2. cDNA-syntes
    1. Utför cDNA-syntes i 20 μL av en omvänd transkriptionsreaktionsblandning. Späd koncentrationerna av totalt isolerat RNA enligt instruktionerna från tillverkaren.
  3. qPCR
    1. Mät genuttrycket av SMC-markörgener, t.ex. ACTA2, CNN1, SMTN och TAGLN för att bekräfta att de isolerade cellerna verkligen är SMC och detektera SMC-markörer. Kontrollera om resultaten är korrelerade med kontraktilutdata.
    2. Använd minst två hushållsgener för att normalisera data, t.ex. YWHAZ och TBP.
      OBS: qPCR-körningen och analysen kan utföras med olika PCR-maskiner och kompatibel programvara, beroende på vad som är tillgängligt och optimerat i laboratoriet. Se kompletterande tabell S1 för primersekvenser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att testa reproducerbarheten av denna metod validerades metoden först med hjälp av kontroll-SMC: er. För att bestämma interexperimentell mätreproducerbarhet plottades två oberoende mätningar av alla inkluderade kontroll- och patientcellinjer som ett Bland-Altman-diagram (figur 3B). Diagrammet visade att denna metod inte visar variabilitet utanför konfidensintervallet, förutom en avvikande cellinje. Vidare visade dessa resultat att två brunnar sådda inom samma experiment och stimulerade samtidigt visar praktiskt taget samma kontraktila svarskurva (Figur 4C). För att validera om det visade svaret är sammandragning och inte osmotisk stress på grund av jonomycinstimulering, ersattes mediet efter stimulering och cellernas beteende registrerades. Detta visar att de stimulerade cellerna började sprida sig över elektroden igen (Figur 4D).

Som den första tillämpningen av denna nya metod, kontraktil respons i SMC härrörande från friska, icke-dilaterade aortor (n = 6) och abdominal aortaaneurysm (AAA) patienter (n = 21; Figur 5A) mättes, som tidigarevisats 8. Mediansvaret från kontrollgruppen var 61 % (46-77 %), jämfört med mediansvaret, 52 % (15-75 %), i patientgruppen. Värdena var inte signifikant olika och en högre variabilitet märktes i patientgruppen. På grund av metodens nyhet användes kontrollgruppen för att bestämma "normal" sammandragning. Figur 5B visar medelvärdet och ± 2SD-intervallet för kontrollgruppen och hur detta intervall används för att identifiera fyra patienter som har lägre sammandragningsvärden än de "normala" värdena. Att bestämma orsaken till nedsatt sammandragning är målet med en separat mekanistisk studie. En västerländsk botanalys utfördes för att avgöra om SMC som användes för experimentet uttrycker SMC-kontraktila markörer. Western blot-analysen (figur 6A) och efterföljande kvantifiering (figur 6B) bekräftar att cellerna uttrycker SMC-markörer. Marköruttrycket i grupperna var variabelt och korrelerade inte med kontraktilutgången. För att bestämma SMC: s proliferativa kapacitet utfördes qPCR för Ki67 (figur 6C). Ki67-uttrycket var detekterbart i alla celler men korrelerade inte med kontraktilproduktionen.

Figure 1
Figur 1: SMC-isolering från aorta AAA-vävnad. (A) Material som behövs för SMC-isolering från aortavävnad: aortavävnad i en petriskål, SMC-medium, två T25-kolvar fyllda med SMC-medium, skalpell och två par kirurgiska pincett. (B) Intima sidan av aortaväggen som visar aterosklerotiska plack. (C) Adventitialt lager av aortaväggen. (D) Separation av tunikamediet och tunica adventitia genom att dra med tången. (E) Efter att tunikamediet har isolerats skärs vävnaden i små bitar med pincett och skalpellen. F) Vävnadsdelar placerade i T25-kolven. Förkortningar: AAA = abdominal aortaaneurysm ; SMC = glattmuskelcell. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Fibroblastisolering från dermal vävnad. (A) Material som behövs för fibroblastisolering från dermal vävnad: dermal vävnad i en petriskål, fibroblastmedium, två T25-kolvar fyllda med fibroblastmedium, skalpell och två par kirurgiska pincett. (B) Hudbiopsi som visar subkutant fett på ovansidan. (C) Efter att dermis har isolerats skärs vävnaden i små bitar med pincett och skalpellen. D) Vävnadsdelar placerade i T25-kolven. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: ECIS-plattans inställning och grafisk representation av aorta SMC-sammandragning. (A) Vänster; en 96-brunns ECIS-platta. Mitten; förstoring av en brunn på ECIS-plattan, som visar de tio elektroderna i botten av brunnen. Rätt; Ljusmikroskopbild av de SMC:er som såddes på ECIS-plattan. förstoring 10x. (B) Motståndskurvor uppmätta med ECIS efter sådd av kontroll-SMC i tre exemplar. Tjock blå linje representerar medelvärdet av trippeln, och prickade linjer representerar SD för tre exemplaren. Under de första 4-5 h efter sådd sprids SMC ut över hela ytan och hög resistans (~ 1000 Ω) mäts. När ett stabilt SMC-monolager har bildats minskar motståndet med tiden till cirka 500 Ω. Denna siffra ändras från 8. Förkortningar: ECIS = elektrisk cell-substratimpedansavkänning; SMC = glattmuskelcell; SD = standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Mätning av SMC-sammandragning med ECIS. (A) Vänster; SMC monolager av kontroll SMC före stimulering för sammandragning. Rätt; kontrollera SMC efter stimulering för sammandragning. Förstoring 10x. (B) Differensdiagram som visar interexperimentell mätreproducerbarhet mellan två separata sammandragningsmätningar. Prickade linjer representerar 95% konfidensintervallet, och den tjocka mediala linjen representerar medelvärdet av två interexperimentella mätningar. Varje datapunkt representerar avvikelsen från medelvärdet av två oberoende mätningar av hela datasetet av kontroller och patienter (lila ●; n = 27). (C) Intraexperimentell reproducerbarhet av ECIS-kontraktionsmätningar. Motståndskurvor genererade av kontroll SMC sådda i två brunnar. Vertikal prickad linje markerar stimuleringen. (D) Cellåtervinning efter stimulering av sammandragning. Tjock blå linje representerar motståndsvärdet för en osomulerad kontroll SMC. Prickad blå linje representerar motståndsvärdet för samma SMC-kontrolllinje, efter stimulering markerad av den vertikala prickade svarta linjen. Cirka 1 timme efter stimulering (tjock vertikal prickad svart linje), mediet under båda förhållandena uppdaterades för att avlägsna stimulansen, och återhämtningen av cellerna spårades i ytterligare 3,5 timmar. Resistensvärden normaliserades till värdena förstimulering för att övervaka cellernas beteende efter stimulering. Denna siffra ändras från 8. Förkortningar: ECIS = elektrisk cell-substratimpedansavkänning; SMC = glattmuskelcell. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: SMC-sammandragning i kontroll och AAA-patienters SMC vid jonomycinstimulering. (A) Genomsnittligt kontraktilt svar på kontroll (Blå ●; n = 6) och AAA-patient (Röd ●; n = 21) SMC vid jonomycinstimulering härledd från flera experiment. (B) Genomsnittligt kontraktilt svar på kontroll (blå ●; n = 6), normal kontrahering (röd ●; n = 15) och låg kontraherande (röd ●; n = 6) AAA-patienters SMC härledda från flera experiment. Sammandragning uttrycks i procentuell minskning jämfört med utgångsvärdet före stimulering. Horisontell svart linje representerar det genomsnittliga kontraktila svaret hos kontroll-SMC. Prickade horisontella linjer markerar två SD över och under medelvärdet av kontrollgruppen. Den lågentreprenaderande gruppen definieras som en sammandragning som är lägre än två SD:er under kontrollgruppens medelvärde. Boxplot visas som median med intervall. Denna siffra ändras från 8. Förkortningar: AAA = abdominal aortaaneurysm; ECIS = elektrisk cell-substratimpedansavkänning; SMC = glattmuskelcell; SD = standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Bild 6: SMC-marköruttryck. SMC kontraktila och proliferativa markörer analyserades i SMC för kontroll (Δ; n = 6), normal kontraktering (●; n = 15) och låg kontraktering (○; n = 6). (A) Western blot-analys av SMC som används för kontraktionsexperimenten. aSMA, calponin och SM22 kvantifierades och Tubulin användes som lastkontroll. (B) Kvantifiering av western blot avbildad i (A). (C) qPCR-analys av Ki67-proliferationsmarkören. Denna siffra ändras från 8. Förkortningar: SMC = glattmuskelcell; aSMA = alfa glattmuskelaktin; qPCR = kvantitativ PCR. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Kompletterande tabell S1: Primersekvenser. Framåt och bakåt qPCR primersekvenser av analyserade hushålls- och SMC-markörgener. Denna tabell är ändrad från 8. Förkortningar: SMC = glattmuskelcell; qPCR = kvantitativ PCR. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta dokument presenterar en metod för att mäta SMC-sammandragning in vitro, baserat på förändringar i impedans och ytockupation. Först beskrivs isolering, odling och expansion av patientspecifika primära humana SMC och hudfibroblaster, följt av hur man använder dem för sammandragningsmätningar.

En begränsning av studien är relaterad till att erhålla cellerna genom ett explantprotokoll. Cellerna som förökar sig från biopsin kan ha andra egenskaper än den ursprungliga vävnaden in vivo. Dessutom är explantprotokollen som presenteras här inte innovativa utan ingår för att presentera ett komplett arbetsflöde från, i detta fall, patientspecifikt aorta-aneurysmmaterial till sammandragningsmätningar. Odling av cellerna in vitro kan också påverka vissa av deras egenskaper på grund av bristen på systemiska faktorer och olika substratstyvhet. Detta kan förklara variationen i SMC-marköruttryck. På grund av frånvaron av tillförlitliga fibroblastmarkörer utmärks fibroblaster vanligtvis baserat på frånvaron av markörer jämfört med andra celler. Vi har således inte karakteriserat fibroblasterna isolerade med detta protokoll. En annan begränsning är att mätning av sammandragning som en faktor på ytan förblir något indirekt. De möjliga konsekvenserna är att produktionen kommer från att medelvärdet av svaret från hela brunnen som innehåller tusentals celler. Således kan det inte bestämmas om alla celler kontraherar mindre eller om det finns celler som sänker genomsnittet.

SMC-kontraktilitet studerades tidigare med olika tekniker. Jämfört med dragkraftsmikroskopi4 har ECIS flera fördelar, främst högre genomströmning och tidseffektivitet. Som anges i begränsningarna är avvägningen att sammandragningsmätningarna erhålls indirekt, vilket gör ECIS mer lämpligt för screening av större antal cellinjer och grupper och mätning av dragkraft för mer djupgående encelliga mekanistiska studier. Kalciumgradienter6 användes tidigare som indikatorer på sammandragning; ECIS ger en mer tillförlitlig sammandragningsmätning eftersom den mäter cellens rörelse. Kvantifiering av bilder av kollagenrynkor orsakade av sammandragningen av cellerna sådda inuti gelén5 ger ett genomsnitt av hela populationen av sådda celler, liknande ECIS. Mätningarna som erhålls genom ECIS är dock mycket mer exakta och ger övervakning i realtid under hela observationen, vilket gör dem betydligt mer informativa.

Sammanfattningsvis beskriver detta dokument en ny applikation för ECIS-systemet, som kan användas för att mäta sammandragningen av vidhäftande celler, såsom SMC och fibroblaster. Denna metod kan användas för att studera flera cellinjer på ett snabbt och effektivt sätt, vilket gör den lämplig för patient- eller läkemedelsscreening. I linje med forskning om aortaaneurysm kan denna metod också användas för att screena SMC hos patienter med andra hjärt-kärlsjukdomar, såsom dissektioner och ateroskleros.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.

Acknowledgments

Vi vill tacksamt tacka Tara van Merrienboer, Albert van Wijk, Jolanda van der Velden, Jan D. Blankensteijn, Lan Tran, Peter L. Hordijk, PAREL-AAA-teamet och alla kärlkirurger i Amsterdam UMC, Zaans Medisch Centrum och Dijklander sjukhus för att tillhandahålla material och stöd för denna studie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well Array Applied Biophysics 96W10idf PET Array used to measure contraction in the ECIS setup
Custodiol Dr. Franz Höhler Chemie GmbH RVG 12801 Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich 472301 Solution used to dilute ionomycin
Fetal Bovine Serum Gibco 26140079 Addition to cell culture medium
Ham's F-10 Nutrient Mix Gibco 11550043 Medium used to culture skin fibroblasts
Human Vascular Smooth Muscle Cell Basal Medium (formerly ''Medium 231'') Gibco M231500 Medium used to culture smooth muscle cells
Invitrogen countess II Thermo Fisher Scientific AMQAX1000 Automated cell counter
Ionomycin calcium salt from Streptomyces conglobatus Sigma-Aldrich I0634-1MG Compound used for contraction stimulation
NaCl 0.9% Fresenius Kabi B230561 Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 Antibiotics used for cell culture medium
Phospathe buffered saline Gibco 10010023 Used to wash cells
Quick-RNA Miniprep Kit Zymo Research R1055 Kit used for RNA isolation
Smooth Muscle Growth Supplement (SMGS) Gibco S00725 Supplement which is added to smooth muscle cell culture medium
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit Thermo Fisher Scientific 11754250 Kit used for cDNA synthesis
SYBR Green PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific 4309155 Reagent for qPCR
Trypsin-EDTA Gibco 15400-054 Used to trypsinize cells
ZTheta Applied Biophysics ZTheta ECIS instrument used for contraction measurements

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Milewicz, D. M., et al. Genetic basis of thoracic aortic aneurysms and dissections: focus on smooth muscle cell contractile dysfunction. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 9, 283-302 (2008).
  2. Milewicz, D. M., et al. Altered smooth muscle cell force generation as a driver of thoracic aortic aneurysms and dissections. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 26-34 (2017).
  3. Groeneveld, M. E., et al. Betaglycan (TGFBR3) up-regulation correlates with increased TGF-β signaling in Marfan patient fibroblasts in vitro. Cardiovascular Pathology. 32, 44-49 (2018).
  4. Chen, J., Li, H., SundarRaj, N., Wang, J. H. C. Alpha-smooth muscle actin expression enhances cell traction force. Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (4), 248-257 (2007).
  5. Peyton, S. R., Putnam, A. J. Extracellular matrix rigidity governs smooth muscle cell motility in a biphasic fashion. Journal of Cellular Physiology. 204 (1), 198-209 (2005).
  6. Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2. Nature. 318 (6046), 558-561 (1985).
  7. Wu, D., et al. NLRP3 (nucleotide oligomerization domain-like receptor family, pyrin domain containing 3)-caspase-1 inflammasome degrades contractile proteins: implications for aortic biomechanical dysfunction and aneurysm and dissection formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (4), 694-706 (2017).
  8. Bogunovic, N., et al. Impaired smooth muscle cell contractility as a novel concept of abdominal aortic aneurysm pathophysiology. Scientific Reports. 9 (1), 1-14 (2019).
  9. Hurst, V., Goldberg, P. L., Minnear, F. L., Heimark, R. L., Vincent, P. A. Rearrangement of adherens junctions by transforming growth factor-β1: role of contraction. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 276 (4), 582-595 (1999).
  10. Hu, N., et al. Comparison between ECIS and LAPS for establishing a cardiomyocyte-based biosensor. Sensors and Actuators B: Chemical. 185, 238-244 (2013).
  11. Peters, M. F., Lamore, S. D., Guo, L., Scott, C. W., Kolaja, K. L. Human stem cell-derived cardiomyocytes in cellular impedance assays: bringing cardiotoxicity screening to the front line. Cardiovascular Toxicology. 15 (2), 127-139 (2015).
  12. Zhang, S., Yang, Y., Kone, B. C., Allen, J. C., Kahn, A. M. Insulin-stimulated cyclic guanosine monophosphate inhibits vascular smooth muscle cell migration by inhibiting Ca/calmodulin-dependent protein kinase II. Circulation. 107 (11), 1539-1544 (2003).
  13. Halterman, J. A., Kwon, H. M., Zargham, R., Bortz, P. D. S., Wamhoff, B. R. Nuclear factor of activated T cells 5 regulates vascular smooth muscle cell phenotypic modulation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (10), 2287-2296 (2011).
  14. Bass, H. M., Beard, R. S., Cha, B. J., Yuan, S. Y., Nelson, P. R. Thrombomodulin induces a quiescent phenotype and inhibits migration in vascular smooth muscle cells in vitro. Annals of Vascular Surgery. 30, 149-156 (2016).
  15. Burger, J., et al. Molecular phenotyping and functional assessment of smooth muscle like-cells with pathogenic variants in aneurysm genes ACTA2, MYH11, SMAD3 and FBN1. Human Molecular Genetics. , (2021).
  16. Yeung, K. K., et al. Transdifferentiation of human dermal fibroblasts to smooth muscle-like cells to study the effect of MYH11 and ACTA2 mutations in aortic aneurysms. Human Mutation. 38 (4), 439-450 (2017).

Tags

Biologi utgåva 180 Glattmuskelcell aorta aneurysm sammandragning translationell in vitro sammandragningsanalys patientspecifik primär cellisolering
Isolering av primära patientspecifika aorta glatta muskelceller och semikvantitiva realtidskontraktionsmätningar <em>in vitro</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bogunovic, N., Rombouts, K. B.,… More

Bogunovic, N., Rombouts, K. B., Yeung, K. K. Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro. J. Vis. Exp. (180), e63122, doi:10.3791/63122 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter