Summary
Cet article décrit un test de coloration à la lectine bien établi et reproductible pour l’ensemble des préparations rétiniennes de monture et les protocoles requis pour la mesure quantitative des paramètres vasculaires fréquemment modifiés dans les rétinopathies prolifératives et non prolifératives.
Abstract
Les rétinopathies sont un groupe hétérogène de maladies qui affectent le tissu neurosensoriel de l’œil. Ils sont caractérisés par une neurodégénérescence, une gliose et un changement progressif de la fonction et de la structure vasculaires. Bien que l’apparition des rétinopathies soit caractérisée par de subtiles perturbations de la perception visuelle, les modifications du plexus vasculaire sont les premiers signes détectés par les cliniciens. L’absence ou la présence de néovascularisation détermine si la rétinopathie est classée comme non proliférative (NPDR) ou proliférative (PDR). En ce sens, plusieurs modèles animaux ont tenté d’imiter des caractéristiques vasculaires spécifiques de chaque stade pour déterminer les mécanismes sous-jacents impliqués dans les altérations de l’endothélium, la mort neuronale et d’autres événements se produisant dans la rétine. Dans cet article, nous fournirons une description complète des procédures requises pour la mesure des paramètres vasculaires rétiniens chez les adultes et les souris de naissance précoce au jour postnatal (P) 17. Nous détaillerons les protocoles pour effectuer la coloration vasculaire rétinienne avec Isolectin GSA-IB4 dans des montures entières pour une visualisation microscopique ultérieure. Les étapes clés pour le traitement de l’image avec le logiciel Image J Fiji sont également fournies, par conséquent, les lecteurs seront en mesure de mesurer la densité des vaisseaux, le diamètre et la tortuosité, la ramification vasculaire, ainsi que les zones avasculaires et néovasculaires. Ces outils sont très utiles pour évaluer et quantifier les altérations vasculaires dans les rétinopathies non prolifératives et prolifératives.
Introduction
Les yeux sont nourris par deux systèmes artério-veineux : le système vasculaire choroïdien, un réseau vasculaire externe qui irrigue l’épithélium pigmenté rétinien et les photorécepteurs ; et le système vasculaire neuro-rétinien qui irrigue la couche des cellules ganglionnaires et la couche nucléaire interne de la rétine1. Le système vasculaire rétinien est un réseau organisé de vaisseaux qui fournissent des nutriments et de l’oxygène aux cellules rétiniennes et récoltent des déchets pour assurer une transduction de signalisation visuelle appropriée. Cette vascularisation présente des caractéristiques distinctes, notamment : l’absence d’innervation autonome, la régulation du tonus vasculaire par des mécanismes rétiniens intrinsèques et la possession d’une barrière sanguine rétinienne complexe2. Par conséquent, le système vasculaire rétinien a été au centre de nombreux chercheurs qui ont étudié de manière approfondie non seulement la vasculogenèse au cours du développement, mais aussi les altérations et l’angiogenèse pathologique que ces vaisseaux subissent dans les maladies3. Les changements vasculaires les plus courants observés dans les rétinopathies sont la dilatation des vaisseaux, la néovascularisation, la perte d’arborisation vasculaire et la déformation des vaisseaux principaux de la rétine, ce qui les rend plus ziggaggy4,5,6. Une ou plusieurs des altérations décrites sont les premiers signes détectés par les cliniciens. La visualisation vasculaire fournit une méthode de dépistage rapide, non invasive et peu coûteuse7. L’étude approfondie des altérations observées dans l’arbre vasculaire déterminera si la rétinopathie est non proliférative ou proliférative et le traitement ultérieur. Les rétinopathies non prolifératives peuvent se manifester par une morphologie vasculaire aberrante, une diminution de la densité vasculaire, des capillaires acellulaires, la mort des péricytes, un œdème maculaire, entre autres. En outre, les rétinopathies prolifératives développent également une perméabilité vasculaire accrue, un remodelage extracellulaire et la formation de touffes vasculaires vers la cavité vitréenne qui se décomposent facilement ou induisent un décollement de la rétine8.
Une fois détectée, la rétinopathie peut être surveillée par ses changements vasculaires9,10. La progression de la pathologie peut être suivie à travers les changements structurels des vaisseaux, qui définissent clairement les stades de la maladie11. La quantification des altérations vasculaires dans ces modèles a permis de corréler les changements vasculaires et la mort neuronale et de tester des thérapies pharmacologiques pour les patients dans différentes phases de la maladie.
À la lumière des déclarations ci-dessus, nous considérons que la reconnaissance et la quantification des altérations vasculaires sont fondamentales dans les études sur les rétinopathies. Dans ce travail, nous allons montrer comment mesurer différents paramètres vasculaires. Pour ce faire, nous utiliserons deux modèles animaux. L’un d’eux est le modèle murin de rétinopathie induite par l’oxygène12, qui imite la rétinopathie de prématurité et certains aspects de la rétinopathie diabétique proliférative13,14. Dans ce modèle, nous mesurerons les zones avasculaires, les zones néovasculaires et la dilatation et la tortuosité des vaisseaux principaux. Dans notre laboratoire, un modèle murin de syndrome métabolique (MetS) a été développé, qui induit une rétinopathie non proliférative15. Ici, nous allons évaluer la densité vasculaire et la ramification.
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Protocol
Les souris C57BL/6J ont été manipulées conformément aux lignes directrices de la déclaration de l’ARVO pour l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle. Les procédures expérimentales ont été conçues et approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (CICUAL) de la Faculté des sciences chimiques de l’Université nationale de Cordoue (Rés. HCD 1216/18).
1. Préparation de solutions tampons et de réactifs
- Préparation de 1x solution saline tampon phosphate (PBS) : Ajouter 8 g de chlorure de sodium (NaCl), 0,2 g de chlorure de potassium (KCl), 14,4 g de dihydrate d’hydrogène-phosphate disodique (Na2HPO4 2H2O) et 0,24 g de phosphate de potassium-dihydrogène (KH2PO4) à 800 mL d’eau distillée. Remuer la solution jusqu’à dissolution complète des sels. Réglez le pH à 7,4 avec de l’acide chlorure (HCl) et réglez le volume à 1 L avec de l’eau distillée supplémentaire. Filtrer la solution et la conserver à 4 °C.
- Préparation de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % : Ajouter 40 g de PFA solide à 800 mL de PBS fraîchement préparé. Remuer la solution dans une plaque chauffante à une température constante de 60 °C. Ajouter 1 M d’hydroxyde de sodium (NaOH) jusqu’à ce que le PFA soit complètement dissous, en vérifiant que le pH est maintenu dans une plage de 7,2 à 7,4. Rechargez le volume à 1 000 mL avec DU PBS et mélangez. Éteignez la plaque chauffante et filtrez la solution lorsque sa température est inférieure à 35 °C. Conserver la solution à 4 °C jusqu’à 3 jours.
ATTENTION : Le PFA est nocif s’il est avalé ou inhalé et est probablement un composé mutagène. Utilisez des gants et un masque facial pendant tout le processus et travaillez dans une cabine de sécurité. - Préparation de 1x solution saline tamponnée tris (TBS) : Ajouter 6,1 g de Tris et 9 g de NaCl à 800 mL d’eau distillée. Remuer la solution jusqu’à dissolution complète des sels. Réglez le pH à 7,4 avec HCl et réglez le volume à 1 L avec de l’eau distillée supplémentaire. Filtrer la solution et la conserver à 4 °C.
- Préparation du TBS- 0,1% Triton X-100: Ajouter 0,1 mL de TritonX-100 à 100 mL de TBS. Mélanger doucement et conserver à 4 °C jusqu’à 1 semaine.
REMARQUE: Comme Triton est un détergent très dense, coupez légèrement la borne de la pointe pour un meilleur pipetage. - Préparation de TBS-5%-Bovine Serum Albumin (BSA) -0,1% Triton-X-100: Peser 5 g de BSA et ajouter TBS- 0,1% triton X-100 solution jusqu’à un volume final de 100 mL. Remuer doucement. Aliquote et conserver à -20 °C jusqu’à 2 mois.
- Conjugué Isolectin GSA-IB4 Alexa fluor-488 (Isolectin GSA-IB4): Poids 36,75 mg de chlorure de calcium dihydraté (CaCl2·2H2O) et ajoutez-le à 500 mL de PBS fraîchement préparé. Remuer la solution avec une barre de remuage. Pipette 500 μL de la solution de CaCl2/PBS et ajoutez-la au flacon contenant 500 μg de poudre d’isolectine GSA-IB4 lyophilisée. Mélanger doucement et alipher la solution dans des tubes de 0,5 mL. Conservez-les à -20 °C à l’abri de la lumière.
- Poly(alcool vinylique) dans le glycérol/Tris : Peser 2,4 g de Poly(alcool vinylique), ajouter 6 g de glycérol et remuer doucement. Ensuite, ajoutez 6 mL d’eau et continuez à remuer pendant plusieurs heures à température ambiante. Ajouter 12 mL de solution de Tris préchauffée de 0,2 M (pH: 8,5) et chauffer à une température constante de 50 °C pendant 10 min et mélanger de temps en temps. Enfin, centrifuger la solution à 5 000 x g pendant 15 min pour clarification.
REMARQUE: Laissez la solution refroidir à température ambiante, aliquotez-la et conservez-la à -20 ° C.
2. Coloration fluorescente à la lectine
- Lors du sacrifice de souris par inhalation de dioxyde de carbone (CO2), énucléez les yeux avec des ciseaux16. Fixez les yeux énucléés avec du PFA fraîchement préparé à 4% pendant 1 h à température ambiante (RT).
REMARQUE: La fixation peut également être effectuée en incubant les yeux dans 4% PFA pendant la nuit (ON) à 4 ° C. Les souris ont été sacrifiées conformément aux directives de la Déclaration de l’ARVO pour l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle et du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (CICUAL) de la Faculté des sciences chimiques de l’Université nationale de Cordoue (Rés. HCD 1216/18). - Sous le microscope à dissection, retirez les cornées avec des ciseaux en coupant le long des limbes et disséquez toute la rétine. Jetez le segment antérieur de l’œil, puis séparez la rétine de la choroïde RPE.
REMARQUE: Assurez-vous d’enlever les débris restants et les vaisseaux hyaloïdes de la rétine avec une pince. - Placez les rétines dans des tubes de 200 μL. Ensuite, bloquez et perméabilisez les rétines dans 100 μL de solution saline tamponnée Tris (TBS) contenant 5% d’albumine sérique bovine (BSA) et 0,1% de triton-X-100 pendant 6 h à 4 °C avec une légère agitation dans le shaker.
REMARQUE: Cette étape peut être effectuée pendant 2 h à RT. - Ensuite, inversez le tube pour placer la rétine dans le capuchon et retirez la solution bloquante avec une pipette.
- Ajouter 100 μL de la solution contenant 0,01 μg/μL d’isolectine GSA-IB4 (GSA-IB4). Enveloppez les tubes avec du papier d’aluminium pour protéger les échantillons de la lumière. Incuber les rétines avec la solution de lectine ON à 4 °C ou pendant 2 h à RT avec une légère agitation dans le shaker.
- Lavez la rétine avec 100 μL de TBS contenant 0,1% de Triton-X-100 pendant 20 min avec une légère agitation dans le shaker. Pour un lavage correct, placez la rétine dans le capuchon du tube en l’inversant. Remettre le tube en position debout et retirer le milieu restant dans le récipient. Répétez cette étape trois fois.
- Placez la rétine dans une lame et ajoutez une goutte de PBS. Sous le microscope à dissection, effectuez quatre coupes également éloignées des bords de la rétine vers le nerf optique.
- Pour déplier les pétales de la rétine, utilisez des pinces ou de petits morceaux de papier filtre. Assurez-vous que le côté photorécepteur est orienté vers le bas.
- Retirez le PBS restant de la diapositive avec du papier filtre. Ensuite, ajoutez un support de montage (Poly(alcool vinylique) dans le glycérol/Tris) et le couvercle. Laissez sécher pendant 1 h à RT.
- Rangez les glissières à 4 °C à l’abri de la lumière.
REMARQUE: Les rétines peuvent également être stockées dans PBS à 4 ° C jusqu’à la visualisation par microscopie confocale.
3. Visualisation par microscopie confocale et acquisition de microphotographies
- Avant la visualisation, incuber les diapositives pendant 10 min à RT couvertes de lumière.
- Au microscope confocal, placez la lame dans la plaque face vers le bas.
- Focalisez le plexus supérieur du système vasculaire rétinien et sélectionnez une zone pour commencer l’acquisition de l’image.
- Définissez les paramètres généraux du laser dans le logiciel: Longueur d’onde: 488 nm; Intensité du laser; HV; Décalage; Gagner.
REMARQUE: L’intensité du laser, PMT, décalage et gain peuvent varier en fonction des conditions et de l’utilisation de la lampe. Les réglages optimaux fournissent une image claire des vaisseaux évitant la saturation dans la sensibilité du tube photomultiplicateur pour avoir une relation linéaire avec le signal de fluorescence. - Définissez d’autres paramètres d’acquisition : Mode ; Taille; Objectif, sans zoom; Pas de Kalman; Taille de l’étape.
REMARQUE : Des conditions d’acquisition identiques doivent être utilisées pour l’imagerie des échantillons témoins et expérimentaux. - Définir les coordonnées sur les axes x et y : Scannez la rétine dans le focus 2x. Si la zone montre des navires, sélectionnez-la en cliquant deux fois sur la zone afin de la marquer pour une acquisition d’image ultérieure.
REMARQUE: Il est fortement recommandé de sélectionner la région rétinienne en suivant le plexus vasculaire supérieur car la fluorescence des plus gros vaisseaux est plus élevée. - Déplacez-vous dans la grille vers un carré voisin, concentrez la rétine et sélectionnez la zone si elle correspond. Répétez cette étape jusqu’à ce que la zone sélectionnée comprenne toute la rétine.
- Sélectionnez une zone et définissez les coordonnées dans l’axe z pour définir l’étendue de l’épaisseur à numériser. Pour ce faire, visualisez la rétine au point 2x; avec le micromètre, allez en haut de la rétine et cliquez sur Définir en position de départ. Ensuite, déplacez-vous vers le bas de la rétine et cliquez sur Définir à la position De fin.
- Répétez l’étape 3.8 dans chaque zone sélectionnée dans la grille.
REMARQUE: Pour vérifier la zone numérisée en profondeur, appuyez sur Aller à la position de démarrage. Si les vaisseaux sont toujours visualisés, réajustez la position en déplaçant le micromètre, puis cliquez sur Définir. Répétez le processus à la position Fin. - Initialisez l’analyse automatisée.
- Une fois le processus de numérisation terminé, ouvrez l’image.
- Sélectionnez le format Série pour enregistrer l’image en mosaïque et enregistrez-la avec l’extension préférée. Enfin, l’image cousue sera affichée à l’écran.
4. Traitement d’image
- Dans le logiciel ImageJ FIJI, allez dans la barre de menus et cliquez sur Fichier > Ouvrir. Sélectionnez l’image à traiter. Dans la fenêtre Options d’importation des bioformats , sélectionnez Afficher les métadonnées OME-XML et cliquez sur OK.
REMARQUE: Les images avec un nom similaire doivent être enregistrées dans des dossiers séparés. - Dans la fenêtre Métadonnées OME , recherchez les informations de taille de pixel, nommées PhysicalSizeX, PhysicalSizeY et PhysicalSizeZ. Copiez ces données.
- Pour l’étalonnage de l’image, accédez à la barre de menus et sélectionnez Propriétés de l’image >. Copiez les informations de l’image à l’étape 4.2 et cliquez sur OK. L’image s’ouvre sous la forme d’une fenêtre avec plusieurs photos, où chacune représente les microphotographies acquises sur un axe z.
- Attribuez un lut préféré à l’image afin de consigner une couleur sur l’étiquette fluorescente. Pour ce faire, allez dans la barre de menus et cliquez sur l’icône LUT .
- Pour visualiser toutes les piles d’une seule image, accédez à la barre de menus et sélectionnez Piles d’images > > projet Z.
- Dans la fenêtre Projection Z affichée, sélectionnez toutes les piles où les navires sont visualisés. Dans Type de projection, choisissez Intensité moyenne et cliquez sur OK.
REMARQUE: Le résultat de la somme des piles sera affiché dans une nouvelle image nommée AVG (nom de l’image). - Ajustez la luminosité et le contraste de l’image résultante pour réduire l’arrière-plan et mettre en surbrillance les vaisseaux. Allez dans la barre de menus et cliquez sur Image> Réglage> Luminosité / Contraste. Dans les fenêtres B et C, déplacez les barres jusqu’à ce qu’une meilleure intensité soit observée. Cliquez sur Appliquer et enregistrez les modifications.
- Copiez les paramètres sélectionnés pour Luminosité/Contraste ; celles-ci doivent être identiques pour toutes les images.
- Avant la quantification de l’image, définissez les paramètres qui vont être mesurés. Dans la barre de menus, accédez à Analyser > Définir les mesures. Dans les procédures décrites ici, il sera nécessaire d’obtenir la zone et le périmètre (cela est finalement également nécessaire pour mesurer les distances). Cliquez sur OK.
- Téléchargez le plugin requis pour la quantification de la densité du récipient17 et suivez les instructions d’installation fournies par le plugin.
- Continuer avec la quantification d’un paramètre vasculaire spécifique.
5. Quantification des zones avasculaires
- Dans la barre de menus, choisissez l’outil Baguette. Sélectionnez la zone rétinienne qui manque de vaisseaux.
REMARQUE: Des zones plus grandes ou plus petites peuvent être sélectionnées en fonction de la tolérance. Pour ajuster la tolérance, cliquez deux fois sur l’icône de l’outil baguette. Mode utilisé : Legacy. - Appuyez sur la lettre T du clavier pour enregistrer la zone sélectionnée dans le Gestionnaire de retour sur investissement. Répétez les étapes 5.1 et 5.2 avec toutes les zones avasculaires de la rétine.
- Cliquez sur Mesurer dans le gestionnaire de retour sur investissement pour obtenir les informations de la zone avasculaire. Le programme affichera une nouvelle fenêtre avec les informations requises. Copiez les données dans un autre programme ou enregistrez le fichier.
REMARQUE: Dans certaines images, on peut préférer sélectionner les zones avasculaires manuellement. Dans ce cas, choisissez l’outil Sélection de polygones, dessinez de courtes distances autour de la zone avasculaire et cliquez sur l’image lorsqu’une nouvelle distance est sur le point de commencer. Fermez la zone sélectionnée en cliquant sur le premier point. - Répétez les étapes 5.1, 5.2 et 5.3 pour mesurer la surface totale de la rétine.
- Calculer l’aire avasculaire de la rétine comme la somme de toutes les zones avasculaires mesurées divisée par la surface totale de la rétine.
6. Quantification des zones néovasculaires
- Dans la barre de menus, choisissez l’outil Baguette.
- Zoomez sur l’image pour mieux visualiser les néovassels. Sélectionnez les neovessels un par un avec l’outil baguette.
REMARQUE: Ajustez la tolérance ne dépassant pas 20 pour assurer la sélection d’un seul neovessel. Ce niveau de tolérance doit rester constant lors de toutes les quantifications d’images. - Appuyez sur la lettre T du clavier pour enregistrer la zone sélectionnée dans le Gestionnaire de retour sur investissement. Répétez les étapes 6.1 et 6.2 avec toutes les zones néovasculaires de la rétine.
- Cliquez sur Mesurer dans le gestionnaire de retour sur investissement pour obtenir les données de la zone. Le programme affichera une nouvelle fenêtre avec les informations requises. Copiez les données dans un autre programme ou enregistrez le fichier.
- Répétez les étapes 6.1, 6.2 et 6.3 pour quantifier la surface totale de la rétine.
- Calculez l’aire néovasculaire de la rétine comme la somme de toutes les zones de néovasétal mesurées divisée par la surface totale de la rétine.
7. Quantification du diamètre du récipient
- Dans la barre de menus, sélectionnez l’outil Ligne droite.
- Zoomez sur l’image pour mieux visualiser la paroi du navire. Effectuez trois lignes transversales jusqu’au navire principal avant la première branche. Cela doit être fait en traçant une ligne de la limite d’un mur du navire à l’opposé.
REMARQUE: La ligne doit être parfaitement perpendiculaire au récipient mural pour éviter les erreurs de quantification. - Appuyez sur la lettre T du clavier pour enregistrer la zone sélectionnée dans le Gestionnaire de retour sur investissement. Répétez les étapes 7.1 et 7.2 dans tous les récipients qui doivent être quantifiés.
- Cliquez sur Mesurer dans le gestionnaire de retour sur investissement pour obtenir les données de distance. Le programme affichera une nouvelle fenêtre avec les informations requises. Copiez les données dans un autre programme ou enregistrez le fichier.
8. Quantification de la tortuosité du navire
- Dans la barre de menus, cliquez sur l’icône Outil en ligne droite avec le bouton droit de la souris et sélectionnez Ligne segmentée ou Ligne à main levée. Tracez une ligne à l’intérieur du vaisseau à partir du nerf optique jusqu’à la ramification du premier vaisseau suivant la forme vasculaire.
REMARQUE: La ligne doit suivre la forme vasculaire pour éviter les erreurs de quantification. - Appuyez sur la lettre T du clavier pour enregistrer la zone sélectionnée dans le Gestionnaire de retour sur investissement.
- Dans la barre de menus, sélectionnez l’outil Ligne droite. Tracez une ligne à partir du nerf optique jusqu’à la première ramification du vaisseau.
- Appuyez sur la lettre T du clavier pour enregistrer la zone sélectionnée dans le Gestionnaire de retour sur investissement.
- Cliquez sur Mesurer dans le gestionnaire de retour sur investissement pour obtenir les données de distances. Le programme affichera une nouvelle fenêtre avec les informations requises. Copiez les données dans un autre programme ou enregistrez le fichier.
- Calculez l’indice de tortuosité comme suit : distance obtenue avec la ligne segmentée divisée par la distance obtenue avec la ligne droite.
9. Quantification de la ramification vasculaire
- Avec l’outil ovale de la barre de menus, définissez une zone appliquée de manière égale à toutes les conditions expérimentales. La zone sélectionnée doit être un cercle concentrique dessiné autour du nerf optique.
- Appuyez sur la lettre T du clavier pour enregistrer la zone sélectionnée dans le Gestionnaire de retour sur investissement.
REMARQUE: Dans ce cas, il est recommandé d’enregistrer le retour sur investissement car la quantification est lente et le même retour sur investissement doit être utilisé dans toutes les images. Pour ce faire, dans le gestionnaire de retour sur investissement, cliquez sur PLUS > Enregistrer. - Comptez manuellement le nombre de branches primaires provenant des navires principaux à l’intérieur de la zone de sélection.
- Répétez les étapes 9.2 et 9.3 dans les zones voisines, en maintenant les critères nerf optique-périphérie.
10. Quantification de la densité vasculaire
- Transformez l’image en mode 8 bits.
- Allez dans Plugins dans la barre de menus, sélectionnez Analyse des vaisseaux > densité vasculaire.
- Définissez une zone avec l’outil Carré de la barre de menus, où la densité du récipient doit être mesurée. Cliquez sur OK.
- Le programme affichera une nouvelle fenêtre avec les informations requises. Copiez les données dans un autre programme ou enregistrez le fichier.
- Répétez les étapes 10.2, 10.3 et 10.4 dans les zones voisines, en maintenant le retour sur investissement mais en le plaçant neuf fois englobant la périphérie et le centre de toute la rétine.
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Representative Results
Comme décrit dans la section du protocole, à partir d’un seul test de coloration fluorescente, vous pouvez obtenir la morphologie vasculaire et évaluer quantitativement plusieurs paramètres d’intérêt. La recherche d’une altération spécifique dépendra du type de rétinopathie étudié. Dans cet article, les zones avasculaires et néovasculaires, la tortuosité et la dilatation ont été évaluées dans un modèle murin de rétinopathie proliférative, tandis que la ramification vasculaire et la densité ont été analysées dans un modèle murin MetS, ce qui induit une rétinopathie non proliférative.
Dans le premier exemple expérimental, le modèle murin de rétinopathie induite par l’oxygène (OIR), a été utilisé, qui ressemble à la rétinopathie de la prématurité et à certaines caractéristiques du stade prolifératif de la rétinopathie diabétique. Dans ce modèle, les portées sont maintenues avec leur mère allaitante dans une chambre hyperoxique du jour postnatal (P)7 à P1218. Des injections intravitréennes ont été effectuées à P12 pour déterminer l’efficacité d’un médicament en tant qu’antiangiogénique (condition appelée traitement). Des souris ont été sacrifiées à P17, le point temporel de la formation maximale de neovessels19. Des souris injectées avec un véhicule ont été utilisées comme témoins. Les deux échantillons ont été fixés et colorés avec l’isolectine GSA-IB4 ensemble. Après acquisition confocale, les images ont été analysées avec le logiciel ImageJ FIJI comme indiqué ci-dessus. Avec le module d’assemblage intégré au microscope confocal, l’ensemble de la monture a été observé comme une image unique (Figure 1). A P17, il est possible d’observer le système vasculaire hyaloïde, un système vasculaire transitoire essentiel pendant la vie intra-utérine (Figure 1, flèches blanches)20.
En conséquence d’un apport excessif d’oxygène dans la chambre hyperoxique, les souris OIR arrêtent le développement vasculaire physiologique et génèrent des zones avasculaires dans la rétine. Ensuite, les zones avasculaires sont définies comme les zones dépourvues de vaisseaux sanguins rétiniens (Figure 2). À partir des images acquises, les zones avasculaires peuvent être quantifiées comme la somme des régions sans vaisseaux divisées par la surface totale de la rétine. Les zones endommagées par des dommages mécaniques montrent également l’absence de navires. Pour identifier les zones endommagées, analysez l’intégrité des couches neuronales avec la tache de Hoechst.
Les zones avasculaires de la rétine évitent l’apport d’oxygène et, par conséquent, une forte réponse pro-angiogénique est définie, induisant une néovascularisation16. Les néovaisseaux sont des vaisseaux de petit calibre qui proviennent d’un vaisseau préexistant du plexus vasculaire supérieur. Leur structure est désorganisée, par conséquent, les néovaisseaux se développent comme des touffes vers la cavité vitrée21. Nous avons calculé la surface occupée par les touffes de néovassels en quantifiant l’aire néovasculaire de la rétine divisée par l’aire totale de la rétine (Figure 3). Comme la forme et la taille des néovaisseaux sont variables, ils peuvent parfois ressembler à des débris et des artefacts. Pour distinguer les néovaisseaux, vérifiez que la touffe se développe à partir d’un récipient mature.
La dilatation vasculaire et la tortuosité sont deux autres altérations fréquentes, qui ont des effets négatifs sur la biologie vasculaire, car elles produisent une circulation sanguine turbulente. Pour l’analyse de la dilatation, nous avons mesuré le diamètre des vaisseaux principaux à trois hauteurs avant la première branche22,23 (Figure 4). Les chercheurs doivent définir une distance prédéterminée pour mesurer le diamètre des vaisseaux afin de réduire la variabilité entre les résultats. Idéalement, le point le plus éloigné du nerf optique devrait être d’environ 300 μm. Nous suggérons d’effectuer l’analyse et de prendre plus tard une moyenne d’au moins six souris par condition.
En ce qui concerne la tortuosité, nous mesurons la distance parcourue par les vaisseaux principaux suivant sa forme par rapport à la distance droite entre le nerf optique et le premier point de ramification24 (Figure 5). Comme nous pouvons le voir sur l’image, il y a une hétérogénéité dans la sinuosité des principaux vaisseaux. Pour obtenir un résultat représentatif, pas moins de six souris par condition doivent être quantifiées.
Les paramètres les plus récents, la ramification vasculaire et la densité, ont été analysés dans le modèle MetS présentant une rétinopathie non proliférative. Dans metS, les troubles des lipides et des glucides sont associés au dysfonctionnement et à la mort des péricytes rétiniens et des cellules endothéliales, entraînant la formation de capillaires acellulaires ou une diminution de la ramification vasculaire25. Dans notre modèle, les souris ApoE-KO ont été nourries avec du fructose ajouté à l’eau potable, à une concentration de 10% p / v. Les animaux de contrôle viennent de recevoir de l’eau du robinet. Après 4 mois de régime, les souris ont été sacrifiées et les rétines traitées comme indiqué précédemment. Pour la mesure de la ramification vasculaire, nous avons défini la zone de quantification en dessinant un cercle concentrique, puis nous avons compté, une par une, les branches primaires provenant d’un vaisseau central principal (Figure 6).
À partir des images acquises, la densité vasculaire a été quantifiée comme la zone occupée par les vaisseaux divisée par la surface du ROI (un carré de 0,015 mm2, voir aplati à la figure 7), qui a été positionnée à différents endroits dans chaque microphotographie, comme expliqué dans la section protocole. Évitez de quantifier les zones endommagées par des dommages mécaniques (Figure 7, flèches blanches). S’il y a plus de deux zones avec des ponctions, la rétine doit être jetée.
Figure 1 : Coloration vasculaire de la monture entière de la rétine marquée à l’isolectine GSA-IB4 : Images confocales représentatives de rétines de souris P17 OIR injectées avec véhicule ou traitement à P12. La coloration fluorescente a été réalisée dans des rétines de montage entier avec Isolectin GSA-IB4 Alexa 488 selon le protocole. Les zones avasculaires (VA) et les zones néovasculaires (NV) sont indiquées. Barre d’échelle: 500 μm. Des flèches blanches montrent le reste de la vascularisation hyaloïde. Les flèches jaunes indiquent les zones de numérisation incomplètes lors de l’acquisition d’images confocales. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Quantification des zones avasculaires : (A) Images représentatives de rétines de monture entière à P17 montrant une coloration vasculaire GSA-IB4 chez des souris traitées par OIR et OIR. Les zones avec vaso-oblitération sont indiquées en jaune. Barre d’échelle: 500 μm. (B) L’aire AV (%) a été quantifiée comme le rapport entre l’aire avasculaire centrale et l’ensemble de la région rétinienne. Le test t non apparié à deux queues a été utilisé pour la comparaison statistique. Données présentées comme moyenne ± SEM. *** p < 0,001. Au moins six animaux ont été employés pour chaque condition au cours de la période de survie examinée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Quantification des zones néovasculaires : (A) Images représentatives de rétines de monture entière à P17 montrant une coloration vasculaire GSA-IB4 chez des souris traitées par OIR et OIR. Les zones avec néovascularisation sont indiquées en blanc. Barre d’échelle: 500 μm. (B) L’aire NV (%) a été quantifiée comme le rapport entre la zone occupée par les néovaux et l’ensemble de la région rétinienne. Le test t non apparié à deux queues a été utilisé pour la comparaison statistique. Données présentées comme moyenne ± SEM. *** p < 0,001. Au moins six animaux ont été employés pour chaque condition au cours de la période de survie examinée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Quantification de la dilatation vasculaire : (A) Images représentatives de rétines de monture entière à P17 montrant une coloration vasculaire GSA-IB4 chez des souris traitées par OIR et OIR. Panneaux de gauche : Rois sélectionnés pour la quantification. Panneaux de droite: zoom des rois, montrant des lignes droites effectuées dans un récipient principal pour mesurer le diamètre du navire. Trois lignes ont été tracées transversalement jusqu’au navire et ont fait l’objet d’une moyenne. Barre d’échelle: 100 μm. (B) Le diamètre du vaisseau (%) a été quantifié comme le diamètre moyen mesuré dans les principaux vaisseaux de la rétine. Le test t non apparié à deux queues a été utilisé pour la comparaison statistique. Données présentées comme moyennes ± SEM. *p < 0,05. Au moins six animaux ont été employés pour chaque condition au cours de la période de survie examinée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Détermination de l’indice de tortuosité : (A) Images représentatives de rétines de monture entière à P17 montrant une coloration vasculaire GSA-IB4 chez des souris traitées par OIR et OIR. Panneaux de gauche : Rois sélectionnés pour la quantification. Panneaux centraux: zoom des ROI, montrant des lignes segmentées tracées dans un vaisseau principal du nerf optique au premier point de ramification. Panneaux de droite: zoom des ROI, montrant des lignes droites tracées dans un vaisseau principal du nerf optique au premier point de ramification. Barre d’échelle: 100 μm. (B) L’indice de tortuosité a été obtenu en divisant la distance de la ligne segmentée à la distance de la ligne droite. Le test t non apparié à deux queues a été utilisé pour la comparaison statistique. Données présentées comme moyennes ± SEM. ns, non significatives. Au moins six animaux ont été employés pour chaque condition au cours de la période de survie examinée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Quantification de la ramification vasculaire : (A) Images représentatives de rétines de monture entière montrant une coloration vasculaire à l’isolectine GSA-IB4 chez des souris nourries à l’ApoE-KO et à l’ApoE-KO + fructose. Les zones de quantification circulaires ont été définies en jaune. Barre d’échelle: 100 μm, grossissement 100x. (B) Le nombre de branches a été quantifié comme le nombre de branches primaires d’un vaisseau principal, depuis le nerf optique vers la périphérie. Le test t non apparié à deux queues a été utilisé pour la comparaison statistique. Données présentées comme moyennes ± SEM. ns, non significatives. Au moins six animaux ont été employés pour chaque condition. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Quantification de la densité vasculaire : (A) Images représentatives de rétines de monture entière montrant une coloration vasculaire à l’isolectine GSA-IB4 chez des souris nourries à l’ApoE-KO et à l’ApoE-KO + fructose. Le carré de la zone de quantification de 0,015 mm2 a été défini en jaune. Barre d’échelle: 100 μm, grossissement 100x. (B) La densité vasculaire a été quantifiée comme le rapport entre l’aire vasculaire et la surface de retour sur investissement totale, qui a été positionné neuf fois à différents endroits dans chaque microphotographie. Les flèches blanches montrent les zones avec des dommages mécaniques. Le test t non apparié à deux queues a été utilisé pour la comparaison statistique. Données présentées comme moyennes ± SEM. ns, non significatives. Au moins six animaux ont été employés pour chaque condition. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Les modèles animaux de rétinopathies sont des outils puissants pour étudier le développement vasculaire, le remodelage ou l’angiogenèse pathologique. Le succès de ces études sur le terrain repose sur la facilité d’accès au tissu qui permet d’effectuer une grande variété de techniques, fournissant des données provenant de souris in vivo et post-mortem26,27. De plus, une grande corrélation a été trouvée entre les études in vivo et l’analyse clinique, offrant une traçabilité et une fiabilité solides à ces modèles28. Dans cet article, nous présentons une description simple et robuste des étapes pour caractériser le réseau vasculaire dans des modèles murins de maladies vasculaires rétiniennes. Dans la littérature, les lecteurs trouveront d’autres paramètres possibles pour mesurer et des approches parallèles pour quantifier ceux sélectionnés ici. Les protocoles compilés ont de nombreux avantages par rapport aux autres car ils sont reproductibles, et ils nécessitent juste un logiciel libre pour effectuer l’analyse (Image J Fiji).
De plus, ces protocoles sont faciles à effectuer par des étudiants qui n’ont pas de connaissances approfondies sur le programme et la plupart des mesures n’ont pas besoin de plugins supplémentaires (sauf de la densité vasculaire).
L’extraction des échantillons et la technique de coloration par fluorescence sont simples et brèves29. Il est très important de travailler avec des rétines fraîches, bien qu’elles puissent être stockées à 4 ° C dans le PBS avec des inhibiteurs de la croissance bactérienne. Comme le tissu est mince et mou, les anciens échantillons se décomposent fréquemment pendant l’incubation ou lors du dépliage de l’échantillon avant le montage. En outre, une fixation excessive avec 4% de PFA rend la rétine excessivement rigide et cassante, mais cela n’affecte pas la coloration à la lectine. La coloration à l’isolectine GSA-IB4 permet de visualiser le réseau vasculaire complet à chaque couche, y compris les néovaisselles et les cellules endothéliales proliférantes. D’autres marqueurs, comme le CD 31, nécessitent l’incubation de l’échantillon avec des anticorps concentrés et ils ont plus de fond. D’autre part, en angiographie, le colorant fluorescent a tendance à diffuser hors des vaisseaux, ce qui augmente la variabilité du calibre du vaisseau et la quantification de la tortuosité. Un inconvénient de l’isolectine GSA-IB4 est qu’elle peut également marquer les cellules microgliales30. Des précautions doivent être prises lors de la réalisation d’injections intravitréennes ou d’autres procédures expérimentales qui induisent une infiltration excessive car les cellules microgliales peuvent former des agglomérats.
L’acquisition d’images peut être effectuée avec n’importe quel microscope confocal. L’utilisation d’un couple de plaques motorisées à un logiciel qui inclut le module Stitching fournira une visualisation complète de l’ensemble de la rétine montée en une seule image. Lors de la sélection de la zone rétinienne, assurez-vous que tous les extrêmes de l’échantillon sont inclus, sinon la photo sera incomplète (Figure 1, flèches jaunes). Ceci n’est pas très pertinent dans le modèle murin de l’OIR, par exemple, car les altérations vasculaires sont proches du nerf optique. Alors que dans le modèle de rat de l’OIR, cette erreur peut conduire à une quantification inexacte, car les zones avasculaire et néovasculaire sont à côté des limbes. Une autre possibilité est de prendre des microphotographies rétiniennes individuelles. L’utilisateur peut ensuite les organiser comme un puzzle avec un logiciel approprié. Il n’est pas recommandé d’utiliser un microscope à épifluorescence, en particulier lors de l’analyse des ramifications, car les vaisseaux germent sur toute l’épaisseur de la rétine et certains vaisseaux ne seront pas détectés dans une pile uniquement z.
Lors du traitement d’image avec ImageJ FIJI, il est recommandé de ne pas mettre à jour le logiciel tant que toutes les images n’ont pas été quantifiées, afin de conserver des conditions identiques dans le logiciel. L’étalonnage des images (attribution de la taille des pixels en microns) est une étape critique car ces protocoles impliquent la quantification des distances et des zones. Une fois familiarisé avec le programme, l’utilisateur peut explorer d’autres outils pour sélectionner la zone néovasculaire et avasculaire en plus de l’outil baguette. L’outil de sélection de polygones est particulièrement utile pour mesurer les zones avasculaires qui ont été coupées en deux parties à l’étape de montage. D’autres chercheurs ont créé des plugins spécifiques pour automatiser la sélection des néovaisseaux en fonction de l’intensité de fluorescence de ces structures. Ces méthodes sont plus rapides et moins laborieuses, bien qu’il soit recommandé de vérifier que de petits néovassels moins brillants ont été sélectionnés avant la quantification31. Les zones de néovaisseaux fluorescent plus intensément que les vaisseaux normaux environnants. L’outil Baguette magique sélectionne les zones de couleur similaire et la tolérance détermine la similitude des couleurs des pixels sélectionnés. Si un néovassel est d’intensité similaire à celle des vaisseaux normaux, la tolérance peut être ajustée à la baisse pour augmenter la sensibilité aux différences d’intensité subtiles. Bien que la sélection des néovaisseaux dans chaque échantillon soit effectuée avec un seuil identique, certains néovaisseaux sont caractérisés par une intensité de fluorescence mineure. Dans ce cas, une tolérance plus faible sera nécessaire pour une sélection correcte.
La tortuosité et la dilatation sont des mesures de distance. Une étude complète de l’arbre vasculaire est utile pour sélectionner des vaisseaux de type identique (artères ou veines) et de calibre identiques. Nous mesurons la dilatation dans les vaisseaux à trois hauteurs comme le montre la figure 4. L’angle de la sélection droite par rapport à la paroi du navire est un autre point pertinent à prendre en compte. Celui-ci doit être aussi proche que possible de 90° pour éviter d’éventuelles erreurs. Lors du tracé de la ligne droite, les utilisateurs peuvent utiliser l’outil de zoom pour s’approcher du navire d’intérêt.
La ramification vasculaire peut également être mesurée dans deux zones de quantification ou plus de hauteurs différentes, si vous le souhaitez. Dans ce cas, les chercheurs doivent conserver la région de la rétine analysée (côté central, moyen ou périphérique du nerf optique). Bien que la ramification soit altérée dans plusieurs modèles animaux de rétinopathie, les premiers stades de la rétinopathie associée au MetS présentés ici ne montrent toujours pas de tels changements15. Pour des études approfondies sur les capillaires rétiniens du plexus intermédiaire et profond et de la germination des vaisseaux, les méthodes de calcul 3D fournissent des données précieuses sur les variations subtiles de la morphologie vasculaire et du réseau32. Enfin, la densité vasculaire est déterminée par la surface occupée par les vaisseaux par rapport à la surface totale d’un ROI sélectionné. La mesure de ce paramètre nécessite l’utilisation d’un plugin et d’une version actualisée d’ImageJ FIJI, où les outils Auto Threshold et Geometry to Distance Map doivent être disponibles. Malgré ces étapes supplémentaires, le plugin est facile à utiliser, reproductible et fiable. Pour la mesure de la densité vasculaire, un ROI de 0,015 mm2 a été choisi, afin d’effectuer dix mesures de l’intensité de fluorescence dans différentes régions de la rétine. Cette taille nous a permis de couvrir l’ensemble de la photo, obtenant ainsi une valeur moyenne plus représentative et son écart dans chaque rétine.
Dans l’ensemble, malgré le fait que ces collections de méthodes ne sont pas automatisées et nécessitent une sélection manuelle des paramètres, elles sont en mesure de fournir des données quantitatives et rigoureuses sur les rétines. La principale limite concernant les protocoles présentés ci-dessus pour les mesures vasculaires repose sur la variabilité entre examinateurs lors de l’analyse de la même image. Pour minimiser ce biais, il est important de pré-établir le cadre général comme limites de la paroi des vaisseaux, l’identification des zones avasculaires et des néovaisseaux, ainsi que les critères d’exclusion pour les tissus endommagés. En ce qui concerne la tortuosité des vaisseaux, un point de départ convenu à côté du nerf optique est nécessaire. Pour les utilisateurs débutants, il est fortement recommandé de faire la moyenne des données collectées par deux examinateurs ou plus. Chez les utilisateurs formés, aucune différence significative n’a été constatée dans la mesure de divers paramètres, tant que l’accord dans les critères de quantification reste constant. De même, des paramètres supplémentaires peuvent être ajoutés aux protocoles énumérés, en fonction des altérations vasculaires détectées dans la rétinopathie. Dans les rétinopathies non prolifératives, la mesure du nombre capillaire acellulaire, des péricytes migrateurs, du rapport péricytes / nombre de cellules endothéliales et de la perméabilité de la barrière rétinienne sanguine sont les premiers paramètres modifiés dans le système vasculaire rétinien33,34,35. Pour les modèles chroniques et les rétinopathies légères, il est conseillé d’inclure ces mesures supplémentaires. Un grand nombre de paramètres mesurés fourniront un paysage plus fidèle des événements qui se déroulent dans le système vasculaire. En résumé, dans cet article, nous avons montré des techniques classiques, bien établies et reproductibles pour quantifier certains des paramètres les plus pertinents pris en compte dans la pratique clinique.
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Disclosures
Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence de relations commerciales ou financières qui pourraient être interprétées comme un conflit d’intérêts potentiel.
Acknowledgments
Nous remercions Carlos Mas, María Pilar Crespo et Cecilia Sampedro du CEMINCO (Centro de Micro y Nanoscopía Córdoba, CONICET-UNC, Córdoba, Argentine) pour leur assistance en microscopie confocale, Soledad Miró et Victoria Blanco pour les soins dédiés aux animaux et Laura Gatica pour l’assistance histologique. Nous remercions également Victor Diaz (Pro-Secrétaire à la Communication Institutionnelle de la FCQ) pour la production et l’édition vidéo et Paul Hobson pour sa lecture critique et sa révision linguistique du manuscrit.
Cet article a été financé par des subventions de Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT), Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (tous à M.C.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminuim foil | |||
| Bovine Serum Albumin | Merck | A4503 | quality |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | C3306 | |
| Hydrochloric acid | Biopack | 9632.08 | |
| Confocal Microscope FV1200 | Olympus | FV1200 | with motorized plate |
| Covers | Paul Marienfeld GmnH & Co. | 111520 | |
| Dissecting Microscope | NIKON | SMZ645 | |
| Disodium-hydrogen-phosphate dihydrate | Merck | 119753 | |
| 200 µL tube | Merck | Z316121 | |
| Filter paper | Merck | WHA5201090 | |
| Incubator shaker GyroMini | LabNet International | S0500 | |
| Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | I21411 | |
| Poly(vinyl alcohol) (Mowiol 4-88) | Merck | 475904 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 158127 | |
| pHmeter | SANXIN | PHS-3D-03 | |
| Potassium chloride | Merck | P9541 | |
| Potassium-dihydrogen phosphate | Merck | 1,04,873 | |
| Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Sodium chloride | Merck | S3014 | |
| Sodium hydroxide | Merck | S5881 | |
| Tris | Merck | GE17-1321-01 | |
| Triton X-100 | Merck | X100-1GA | |
| Vessel Analysis Fiji software | Mai Elfarnawany | https://imagej.net/Vessel_Analysis |
References
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