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Neuroscience

गैर-प्रोलिफेरेटिव और प्रोलिफेरेटिव रेटिनोपैथी के साथ चूहों के पूरे माउंट रेटिना में संवहनी मापदंडों का परिमाणीकरण

Published: March 12, 2022 doi: 10.3791/63126
Automatic Translation
1,2, 1,2,4, 1,2, 3, 1,2, 1,2
1Departamento de Bioquímica Clínica, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Nacional de Córdoba, 2Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología (CIBICI), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), 3Vitreo-retinal Department, Centro Privado de Ojos Romagosa-Fundación VER, 4Unidad de Investigación y Desarrollo en Tecnología Farmacéutica (UNITEFA), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET)

Summary

यह आलेख पूरे माउंट रेटिना की तैयारी के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित और पुन: प्रस्तुत करने योग्य लेक्टिन दाग परख का वर्णन करता है और संवहनी मापदंडों के मात्रात्मक माप के लिए आवश्यक प्रोटोकॉल अक्सर proliferative और गैर-proliferative रेटिनोपैथी में बदल जाते हैं।

Abstract

रेटिनोपैथी बीमारियों का एक विषम समूह है जो आंख के न्यूरोसेंसरी ऊतक को प्रभावित करता है। वे neurodegeneration, gliosis और संवहनी समारोह और संरचना में एक प्रगतिशील परिवर्तन की विशेषता है। यद्यपि रेटिनोपैथी की शुरुआत दृश्य धारणा में सूक्ष्म गड़बड़ी की विशेषता है, संवहनी जाल में संशोधन चिकित्सकों द्वारा पता लगाए गए पहले संकेत हैं। नियोवैस्कुलराइजेशन की अनुपस्थिति या उपस्थिति यह निर्धारित करती है कि रेटिनोपैथी को या तो गैर-प्रोलिफेरेटिव (एनपीडीआर) या प्रोलिफेरेटिव (पीडीआर) के रूप में वर्गीकृत किया गया है या नहीं। इस अर्थ में, कई पशु मॉडल ने रेटिना में होने वाली एंडोथेलियम परिवर्तन, न्यूरोनल मृत्यु और अन्य घटनाओं में शामिल अंतर्निहित तंत्र को निर्धारित करने के लिए प्रत्येक चरण की विशिष्ट संवहनी विशेषताओं की नकल करने की कोशिश की। इस लेख में, हम प्रसवोत्तर दिन (पी) 17 में वयस्कों और प्रारंभिक जन्म चूहों में रेटिना संवहनी मापदंडों के माप के लिए आवश्यक प्रक्रियाओं का पूरा विवरण प्रदान करेंगे। हम बाद में माइक्रोस्कोपिक विज़ुअलाइज़ेशन के लिए पूरे माउंट में आइसोलेक्टिन जीएसए-आईबी 4 के साथ रेटिना संवहनी धुंधला करने के लिए प्रोटोकॉल का विस्तार करेंगे। छवि जे फिजी सॉफ्टवेयर के साथ छवि प्रसंस्करण के लिए महत्वपूर्ण कदम भी प्रदान किए जाते हैं, इसलिए, पाठक पोत घनत्व, व्यास और tortuosity, संवहनी शाखाओं, साथ ही साथ avascular और neovascular क्षेत्रों को मापने में सक्षम होंगे। ये उपकरण गैर-प्रोलिफेरेटिव और प्रोलिफेरेटिव रेटिनोपैथी दोनों में संवहनी परिवर्तनों का मूल्यांकन और मात्रा निर्धारित करने में अत्यधिक सहायक हैं।

Introduction

आंखों को दो धमनी-शिरापरक प्रणाली द्वारा पोषित किया जाता है: कोरॉइडल वास्कुलचर, एक बाहरी संवहनी नेटवर्क जो रेटिना पिगमेंटेड एपिथेलियम और फोटोरिसेप्टर की सिंचाई करता है; और न्यूरो-रेटिना वास्कुलचर जो गैंग्लियन कोशिकाओं की परत और रेटिना 1 की आंतरिक परमाणु परत की सिंचाई करता है। रेटिना वास्कुलचर जहाजों का एक संगठित नेटवर्क है जो रेटिना कोशिकाओं को पोषक तत्व और ऑक्सीजन प्रदान करता है और उचित दृश्य सिग्नलिंग ट्रांसडक्शन सुनिश्चित करने के लिए अपशिष्ट उत्पादों की कटाई करता है। इस वास्कुलचर में कुछ अलग-अलग विशेषताएं हैं, जिनमें शामिल हैं: स्वायत्त संरक्षण की कमी, आंतरिक रेटिना तंत्र द्वारा संवहनी टोन का विनियमन और एक जटिल रेटिना-रक्त बाधा 2 का कब्जा। इसलिए, रेटिना वास्कुलचर कई शोधकर्ताओं का ध्यान केंद्रित किया गया है, जिन्होंने विकास के दौरान न केवल वास्कुलोजेनेसिस का बड़े पैमाने पर अध्ययन किया है, बल्कि परिवर्तन और पैथोलॉजिकल एंजियोजेनेसिस भी किया है जो इन जहाजों को बीमारियों में गुजरते हैं3। रेटिनोपैथी में देखे गए सबसे आम संवहनी परिवर्तन पोत फैलाव, नियोवैस्कुलराइजेशन, संवहनी आर्बराइजेशन की हानि और रेटिना मुख्य वाहिकाओं के विरूपण हैं, जो उन्हें अधिक जिग्गी 4,5,6 बनाता है। वर्णित परिवर्तनों में से एक या अधिक चिकित्सकों द्वारा पता लगाए जाने वाले शुरुआती संकेत हैं। संवहनी विज़ुअलाइज़ेशन एक तेजी से, गैर-आक्रामक, और सस्ती स्क्रीनिंग विधि प्रदान करता है7। संवहनी पेड़ में देखे गए परिवर्तनों का व्यापक अध्ययन यह निर्धारित करेगा कि रेटिनोपैथी गैर-प्रोलिफेरेटिव या प्रोलिफेरेटिव है या नहीं और आगे का उपचार। गैर-प्रोलिफेरेटिव रेटिनोपैथी खुद को संवहनी आकृति विज्ञान के साथ प्रकट कर सकते हैं, संवहनी घनत्व में कमी, एसेल्युलर केशिकाओं, पेरिसाइट्स की मृत्यु, मैकुलर एडिमा, दूसरों के बीच। इसके अलावा, proliferative retinopathies भी संवहनी पारगम्यता में वृद्धि, extracellular remodeling, और vitreous गुहा है कि आसानी से टूटने या रेटिना टुकड़ी 8 प्रेरित की ओर संवहनी tufts के गठन का विकास.

एक बार पता लगाने के बाद, रेटिनोपैथी को इसके संवहनी परिवर्तन9,10 के माध्यम से मॉनिटर किया जा सकता है। पैथोलॉजी की प्रगति का पालन जहाजों के संरचनात्मक परिवर्तनों के माध्यम से किया जा सकता है, जो स्पष्ट रूप से रोग के चरणों को परिभाषित करते हैं11। इन मॉडलों में संवहनी परिवर्तनों के परिमाणीकरण ने पोत परिवर्तन और न्यूरोनल मृत्यु को सहसंबंधित करने और रोग के विभिन्न चरणों में रोगियों के लिए औषधीय उपचारों का परीक्षण करने की अनुमति दी।

उपर्युक्त कथनों के प्रकाश में, हम मानते हैं कि संवहनी परिवर्तनों की मान्यता और परिमाणीकरण रेटिनोपैथी अध्ययनों में मौलिक हैं। इस काम में, हम दिखाएंगे कि विभिन्न संवहनी मापदंडों को कैसे मापा जाए। ऐसा करने के लिए, हम दो पशु मॉडल को नियोजित करेंगे। उनमें से एक ऑक्सीजन-प्रेरित रेटिनोपैथी माउस मॉडल 12 है, जो प्रीमैच्योरिटी के रेटिनोपैथी और प्रोलिफेरेटिव डायबिटिक रेटिनोपैथी के कुछ पहलुओं की नकल करता है13,14। इस मॉडल में, हम avascular क्षेत्रों, neovascular क्षेत्रों और मुख्य जहाजों के फैलाव और tortuosity को मापने जाएगा। हमारी प्रयोगशाला में, एक मेटाबोलिक सिंड्रोम (मेट्स) माउस मॉडल विकसित किया गया है, जो एक गैर-प्रोलिफेरेटिव रेटिनोपैथी 15 को प्रेरित करता है। यहां, हम संवहनी घनत्व और ब्रांचिंग का मूल्यांकन करेंगे।

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Protocol

C57BL/6J चूहों को नेत्र और दृष्टि अनुसंधान में जानवरों के उपयोग के लिए ARVO कथन के दिशानिर्देशों के अनुसार संभाला गया था। प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को रासायनिक विज्ञान संकाय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (CICUAL) द्वारा डिजाइन और अनुमोदित किया गया था, नेशनल यूनिवर्सिटी ऑफ कॉर्डोबा (Res. HCD 1216/18)।

1. बफर समाधान और अभिकर्मकों की तैयारी

  1. 1x फॉस्फेट बफर लवणीय (PBS) की तैयारी: 8 ग्राम सोडियम क्लोराइड (NaCl), पोटेशियम क्लोराइड (KCl) के 0.2 ग्राम, डिसोडियम-हाइड्रोजन-फॉस्फेट डाइहाइड्रेट (Na2HPO4 2H2O) के 14.4 ग्राम और 0.24 ग्राम पोटेशियम-डाइहाइड्रोजन फॉस्फेट (KH2PO4) को आसुत जल के 800 मिलीलीटर में जोड़ें। लवण के पूर्ण विघटन तक घोल को हिलाएं। क्लोराइड एसिड (HCl) के साथ पीएच को 7.4 पर समायोजित करें और अतिरिक्त आसुत पानी के साथ वॉल्यूम को 1 एल में समायोजित करें। समाधान को फ़िल्टर करें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें।
  2. 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) की तैयारी: ताजा तैयार पीबीएस के 800 मिलीलीटर में 40 ग्राम ठोस पीएफए जोड़ें। 60 डिग्री सेल्सियस के एक स्थिर तापमान पर एक हीटिंग प्लेट में समाधान हिलाएं। 1 एम सोडियम हाइड्रॉक्साइड (NaOH) जोड़ें जब तक कि पीएफए पूरी तरह से भंग न हो जाए, यह जांचते हुए कि पीएच को 7.2-7.4 की सीमा पर बनाए रखा गया है। पीबीएस और मिश्रण के साथ 1,000 मिलीलीटर करने के लिए मात्रा ऊपर. हीटिंग प्लेट को बंद करें और समाधान को फ़िल्टर करें जब इसका तापमान 35 डिग्री सेल्सियस से कम हो। समाधान को 3 दिनों तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    सावधानी: पीएफए हानिकारक है यदि निगल लिया जाता है या यदि साँस ली जाती है और संभवतः एक म्यूटाजेनिक यौगिक है। पूरी प्रक्रिया के दौरान दस्ताने और फेस मास्क का उपयोग करें और एक सुरक्षा केबिन में काम करें।
  3. 1x Tris-bufferedsaline (TBS) की तैयारी: 6.1 g Tris और NaCl के 9 g को 800 mL आसुत पानी में जोड़ें। लवण के पूर्ण विघटन तक घोल को हिलाएं। HCl के साथ 7.4 करने के लिए पीएच समायोजित करें और अतिरिक्त आसुत पानी के साथ 1 एल करने के लिए मात्रा को समायोजित करें। समाधान को फ़िल्टर करें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें।
  4. TBS की तैयारी- 0.1% ट्राइटन X-100: TRITONX-100 से 100 mL TBS के 0.1 mL जोड़ें। धीरे-धीरे मिलाएं और इसे 1 सप्ताह तक 4 °C पर स्टोर करें।
    नोट: के रूप में Triton एक बहुत ही घने डिटर्जेंट है, थोड़ा बेहतर pipetting के लिए टिप के टर्मिनल में कटौती.
  5. TBS-5%-गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (BSA) -0.1% Triton-X-100 की तैयारी: BSA के 5 ग्राम वजन और 100 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा तक TBS- 0.1% ट्राइटन एक्स -100 समाधान जोड़ें। धीरे से हिलाएं। एलीकोट और 2 महीने तक के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  6. Isolectin GSA-IB4 Alexa fluor-488 conjugate (Isolectin GSA-IB4): वजन 36.75 मिलीग्राम कैल्शियम क्लोराइड डाइहाइड्रेट (CaCl2·2H2O) के मिलीग्राम और इसे ताजा तैयार पीबीएस के 500 मिलीलीटर में जोड़ें। एक हलचल पट्टी के साथ समाधान हलचल. CaCl2/PBS के समाधान के पिपेट 500 μL और इसे 500 μg लाइओफिलाइज्ड Isolectin GSA-IB4 पाउडर युक्त शीशी में जोड़ें। धीरे से मिश्रण और 0.5 mL ट्यूबों में समाधान एलीकोट. उन्हें प्रकाश से संरक्षित -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  7. ग्लिसरॉल / ट्रिस में पॉली (विनाइल अल्कोहल): पॉली (विनाइल अल्कोहल) के 2.4 ग्राम वजन करें, ग्लिसरॉल के 6 ग्राम जोड़ें और धीरे से हिलाएं। फिर, 6 मिलीलीटर पानी जोड़ें और कमरे के तापमान पर कई घंटों तक हिलाते रहें। पूर्व-गर्म 0.2 M Tris समाधान (pH: 8.5) के 12 mL जोड़ें और 10 मिनट के लिए 50 °C के स्थिर तापमान पर गर्मी और कभी-कभी मिश्रण करें। अंत में, स्पष्टीकरण के लिए 15 मिनट के लिए 5,000 x g पर समाधान को सेंट्रीफ्यूज करें।
    नोट: समाधान को कमरे के तापमान पर ठंडा होने दें, इसे एलीकोट करें और इसे -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. फ्लोरोसेंट लेक्टिन धुंधला

  1. कार्बन डाइऑक्साइड (सीओ 2) साँस लेने के द्वारा चूहों के बलिदान पर, कैंची के साथ आंखों को यूक्लिएट करें16। कमरे के तापमान (आरटी) पर 1 घंटे के लिए ताजा तैयार 4% पीएफए के साथ enucleated आंखों को ठीक करें।
    नोट: फिक्सेशन 4% पीएफए में आंखों को 4 डिग्री सेल्सियस पर रातभर (चालू) में इनक्यूबेट करके भी किया जा सकता है। चूहों को नेत्र और दृष्टि अनुसंधान में जानवरों के उपयोग के लिए एआरवीओ स्टेटमेंट के दिशानिर्देशों के अनुसार बलिदान किया गया था और रासायनिक विज्ञान संकाय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (CICUAL), कॉर्डोबा के राष्ट्रीय विश्वविद्यालय (Res. HCD 1216/18)।
  2. विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, लिम्बस के साथ काटकर कैंची के साथ कॉर्निया को हटा दें और पूरे रेटिना को विच्छेदित करें। आंख के पूर्वकाल खंड को छोड़ दें, और फिर रेटिना को आरपीई-कोरॉइड से अलग करें।
    नोट: संदंश के साथ रेटिना से शेष मलबे और hyaloid वाहिकाओं को हटाने के लिए सुनिश्चित करें।
  3. रेटिना को 200 μL ट्यूबों में रखें। फिर, ब्लॉक और tris-buffered खारा (TBS) समाधान के 100 μL में रेटिना permeabilize 5% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) और 0.1% Triton-X-100 के दौरान 6 ज के दौरान 4 °C पर शेकर में कोमल आंदोलन के साथ.
    नोट:: इस चरण को RT पर 2 ज के लिए किया जा सकता है।
  4. फिर, टोपी में रेटिना रखने के लिए ट्यूब को उलटें और एक पिपेट के साथ अवरुद्ध समाधान को हटा दें।
  5. Isolectin GSA-IB4 (GSA-IB4) के 0.01 μg/μL वाले समाधान का 100 μL जोड़ें। प्रकाश से नमूनों की रक्षा करने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ ट्यूब लपेटें। 4 डिग्री सेल्सियस पर लेक्टिन समाधान के साथ रेटिना को इनक्यूबेट करें या शेकर में कोमल आंदोलन के साथ आरटी में 2 ज के लिए।
  6. शेकर में कोमल आंदोलन के साथ 20 मिनट के लिए 0.1% ट्राइटन-एक्स -100 युक्त टीबीएस के 100 μL के साथ रेटिना को धोएं। उचित धुलाई के लिए, रेटिना को उलटा करके ट्यूब की टोपी में रखें। ट्यूब को उसकी खड़ी स्थिति में वापस कर दें और कंटेनर में शेष माध्यम को हटा दें। इस चरण को तीन बार दोहराएं।
  7. रेटिना को स्लाइड में रखें और पीबीएस की एक बूंद जोड़ें। विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, ऑप्टिक तंत्रिका की ओर रेटिना के किनारों से चार समान रूप से दूर की कटौती करें।
  8. रेटिना की पंखुड़ियों को उजागर करने के लिए, संदंश या फिल्टर पेपर के छोटे टुकड़ों का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि फोटोरिसेप्टर पक्ष नीचे का सामना कर रहा है।
  9. फ़िल्टर पेपर के साथ स्लाइड के शेष PBS को निकालें। फिर, ग्लिसरॉल / ट्राइस में एक बढ़ते माध्यम (पॉली (विनाइल अल्कोहल) और कवरस्लिप जोड़ें। इसे आरटी पर 1 घंटे के लिए सूखने दें।
  10. प्रकाश से सुरक्षित 4 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड्स स्टोर करें।
    नोट: रेटिना को 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में भी संग्रहीत किया जा सकता है जब तक कि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी विज़ुअलाइज़ेशन न हो।

3. Confocal माइक्रोस्कोपी विज़ुअलाइज़ेशन और microphotograph अधिग्रहण

  1. विज़ुअलाइज़ेशन से पहले, प्रकाश से कवर किए गए आरटी में 10 मिनट के लिए स्लाइड को इनक्यूबेट करें।
  2. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर, स्लाइड को प्लेट के चेहरे में नीचे रखें।
  3. रेटिना वास्कुलचर के बेहतर जाल पर ध्यान केंद्रित करें और छवि अधिग्रहण शुरू करने के लिए एक क्षेत्र का चयन करें।
  4. सॉफ्टवेयर में सामान्य लेजर पैरामीटर सेट करें: तरंग दैर्ध्य: 488 एनएम; लेजर तीव्रता; HV; ऑफसेट; लाभ।
    नोट:: लेजर तीव्रता, PMT, ऑफसेट, और लाभ शर्तों और लैंप के उपयोग के आधार पर भिन्न हो सकता है। इष्टतम सेटिंग्स प्रतिदीप्ति संकेत के साथ एक रैखिक संबंध रखने के लिए फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब की संवेदनशीलता में संतृप्ति से बचने वाले जहाजों की एक स्पष्ट छवि प्रदान करती हैं।
  5. अन्य अधिग्रहण पैरामीटर सेट करें: मोड; आकार; उद्देश्य, ज़ूम के बिना; कोई Kalman; चरण आकार.
    नोट:: समान अधिग्रहण शर्तों को नियंत्रण और प्रयोगात्मक नमूने इमेजिंग के लिए उपयोग किया जाना चाहिए।
  6. निर्देशांक को x और y अक्ष में सेट करें: फोकस 2x में रेटिना को स्कैन करें। यदि क्षेत्र जहाजों को दिखाता है, तो बाद में छवि अधिग्रहण के लिए इसे चिह्नित करने के लिए दो बार क्षेत्र पर क्लिक करके इसका चयन करें।
    नोट: यह अत्यधिक बेहतर संवहनी जाल का पालन करके रेटिना क्षेत्र का चयन करने के लिए सिफारिश की जाती है क्योंकि बड़े जहाजों की प्रतिदीप्ति अधिक होती है।
  7. ग्रिड में पड़ोसी वर्ग में ले जाएँ, रेटिना पर ध्यान केंद्रित करें, और यदि यह मेल खाता है तो क्षेत्र का चयन करें। इस चरण को तब तक दोहराएं जब तक कि चयनित क्षेत्र में पूरे रेटिना शामिल न हो जाएं।
  8. एक क्षेत्र का चयन करें और स्कैन करने के लिए मोटाई सीमा को परिभाषित करने के लिए z अक्ष में निर्देशांक सेट करें। ऐसा करने के लिए, फोकस 2x में रेटिना की कल्पना करें; माइक्रोमीटर के साथ, रेटिना के शीर्ष पर जाएं और प्रारंभ स्थिति में सेट पर क्लिक करें। फिर, रेटिना के नीचे ले जाएं और सेट एट द एंड पोजीशन पर क्लिक करें।
  9. ग्रिड में चयनित प्रत्येक क्षेत्र पर चरण 3.8 दोहराएँ।
    नोट:: गहराई में स्कैन किए गए क्षेत्र को सत्यापित करने के लिए, प्रारंभ स्थिति पर जाएँ दबाएँ। यदि जहाजों को अभी भी विज़ुअलाइज़ किया जाता है, तो माइक्रोमीटर को स्थानांतरित करके स्थिति को समायोजित करें, और फिर सेट पर क्लिक करें। प्रक्रिया को अंतिम स्थिति में दोहराएँ।
  10. स्वचालित स्कैनिंग प्रारंभ करें.
  11. एक बार स्कैनिंग प्रक्रिया समाप्त होने के बाद, छवि खोलें।
  12. छवि को मोज़ेक के रूप में रिकॉर्ड करने और इसे पसंदीदा एक्सटेंशन के साथ सहेजने के लिए श्रृंखला स्वरूप का चयन करें. अंत में, सिले हुए छवि को स्क्रीन पर दिखाया जाएगा।

4. छवि प्रसंस्करण

  1. ImageJ FIJI सॉफ़्टवेयर में, मेनू बार पर जाएं और फ़ाइल > ओपन पर क्लिक करें। संसाधित करने के लिए छवि का चयन करें। Bio-Format Import Options विंडो में, Display OME-XML मेटाडेटा का चयन करें और OK पर क्लिक करें।
    नोट:: समान नाम के साथ छवियों को अलग फ़ोल्डरों में सहेजा जाना चाहिए।
  2. OME मेटाडेटा विंडो में, पिक्सेल आकार जानकारी के लिए खोज, PhysicalSizeX, PhysicalSizeY, और PhysicalSizeZ के रूप में नामित। इस डेटा की प्रतिलिपि बनाएँ.
  3. छवि अंशांकन के लिए, मेनू पट्टी पर जाएँ और छवि > गुण का चयन करें। चरण 4.2 में छवि की जानकारी की प्रतिलिपि बनाएँ और ठीक पर क्लिक करें। छवि कई तस्वीरों के साथ एक खिड़की के रूप में खुलती है, जहां प्रत्येक एक जेड अक्ष पर अधिग्रहित माइक्रोफोटोग्राफ का प्रतिनिधित्व करता है।
  4. फ्लोरोसेंट लेबल के लिए एक रंग को भेजने के लिए छवि को एक पसंदीदा ल्यूट असाइन करें। ऐसा करने के लिए, मेनू बार पर जाएं और एलयूटी आइकन पर क्लिक करें।
  5. किसी एकल छवि में सभी स्टैक को विज़ुअलाइज़ करने के लिए, मेनू पट्टी पर जाएँ और Z Project > छवि > स्टैक का चयन करें.
  6. प्रदर्शित Z प्रोजेक्शन विंडो में, उन सभी स्टैक का चयन करें जहां जहाजों की कल्पना की जाती है। प्रोजेक्शन प्रकार में, औसत तीव्रता चुनें और ठीक पर क्लिक करें।
    नोट:: स्टैक के योग का परिणाम AVG (छवि नाम) नामक एक नई छवि में दिखाया जाएगा।
  7. पृष्ठभूमि को कम करने और जहाजों को हाइलाइट करने के लिए परिणामी छवि में चमक और इसके विपरीत समायोजित करें। मेनू बार पर जाएं और इमेज> एडजस्ट> ब्राइटनेस/ बी और सी खिड़कियों में सलाखों को तब तक ले जाया जाता है जब तक कि एक बेहतर तीव्रता नहीं देखी जाती है। Apply पर क्लिक करें और परिवर्तनों को सहेजें।
  8. चमक/कंट्रास्ट के लिए चयनित पैरामीटर्स की प्रतिलिपि बनाएँ; ये सभी छवियों के लिए समान होना चाहिए।
  9. छवि परिमाणीकरण से पहले, उन मापदंडों को परिभाषित करें जिन्हें मापा जा रहा है। मेनू पट्टी में, विश्लेषण करें > माप सेट करें पर जाएँ. यहां वर्णित प्रक्रियाओं में, क्षेत्र और परिधि प्राप्त करना आवश्यक होगा (यह अंततः दूरी को मापने के लिए भी आवश्यक है)। OK पर क्लिक करें।
  10. पोत घनत्व परिमाणीकरण 17 के लिए आवश्यक प्लगइन डाउनलोड करें और प्लगइन द्वारा प्रदान किए गए प्रतिष्ठानों के निर्देशों का पालन करें।
  11. एक विशिष्ट संवहनी पैरामीटर के परिमाणीकरण के साथ जारी रखें।

5. avascular क्षेत्रों का परिमाणीकरण

  1. मेनू पट्टी में, छड़ी उपकरण चुनें. रेटिना क्षेत्र का चयन करें जिसमें वाहिकाओं की कमी है।
    नोट:: सहिष्णुता के आधार पर बड़े या छोटे क्षेत्रों का चयन किया जा सकता है। सहिष्णुता को समायोजित करने के लिए, छड़ी उपकरण आइकन पर दो बार क्लिक करें। मोड नियोजित: विरासत.
  2. ROI प्रबंधक में चयनित क्षेत्र रिकॉर्ड करने के लिए कुंजीपटल पर T अक्षर दबाएँ। रेटिना के सभी avascular क्षेत्रों के साथ चरण 5.1 और 5.2 को दोहराएं।
  3. Avascular क्षेत्र की जानकारी प्राप्त करने के लिए ROI प्रबंधक में माप पर क्लिक करें। कार्यक्रम आवश्यक जानकारी के साथ एक नई विंडो प्रदर्शित करेगा। किसी अन्य प्रोग्राम में डेटा की प्रतिलिपि बनाएँ या फ़ाइल सहेजें.
    नोट:: कुछ छवियों में, कोई मैन्युअल रूप से avascular क्षेत्रों का चयन करने के लिए पसंद कर सकते हैं। इस स्थिति में, बहुभुज चयन उपकरण चुनें, avascular क्षेत्र के चारों ओर छोटी दूरी खींचें, और छवि पर क्लिक करें जब एक नई दूरी शुरू होने वाली है। पहले बिंदु पर क्लिक करके चयनित क्षेत्र को बंद करें.
  4. रेटिना के कुल क्षेत्र को मापने के लिए चरण 5.1, 5.2, और 5.3 को दोहराएँ।
  5. रेटिना के कुल क्षेत्रफल से विभाजित मापे गए सभी एवैस्कुलर क्षेत्रों के योग के रूप में रेटिना के एवैस्कुलर क्षेत्र की गणना करें।

6. neovascular क्षेत्रों का परिमाणीकरण

  1. मेनू पट्टी में, छड़ी उपकरण चुनें.
  2. बेहतर neovessels कल्पना करने के लिए छवि में ज़ूम करें. छड़ी उपकरण के साथ एक के बाद एक neovessels का चयन करें.
    नोट: एक एकल neovessel के चयन को सुनिश्चित करने के लिए 20 से अधिक सहिष्णुता समायोजित करें। यह सहिष्णुता स्तर सभी छवि परिमाणीकरण के दौरान स्थिर रहना चाहिए।
  3. ROI प्रबंधक में चयनित क्षेत्र रिकॉर्ड करने के लिए कुंजीपटल पर T अक्षर दबाएँ। रेटिना के सभी neovascular क्षेत्रों के साथ चरण 6.1 और 6.2 को दोहराएं।
  4. क्षेत्र डेटा प्राप्त करने के लिए ROI प्रबंधक में माप पर क्लिक करें। कार्यक्रम आवश्यक जानकारी के साथ एक नई विंडो प्रदर्शित करेगा। किसी अन्य प्रोग्राम में डेटा की प्रतिलिपि बनाएँ या फ़ाइल सहेजें.
  5. रेटिना के कुल क्षेत्र को मापने के लिए चरण 6.1, 6.2, और 6.3 को दोहराएँ।
  6. रेटिना के नियोवैस्कुलर क्षेत्र की गणना रेटिना के कुल क्षेत्र से विभाजित सभी नियोवेसल्स क्षेत्रों के योग के रूप में करें।

7. पोत व्यास का परिमाणीकरण

  1. मेनू पट्टी में, सीधी-रेखा उपकरण का चयन करें।
  2. पोत की दीवार को बेहतर ढंग से देखने के लिए छवि में ज़ूम करें। पहली शाखा से पहले मुख्य पोत के लिए तीन ट्रांसवर्सल लाइनों का प्रदर्शन करें। यह पोत की एक दीवार की सीमा से विपरीत तक एक रेखा खींचकर किया जाना चाहिए।
    नोट: रेखा पूरी तरह से दीवार पोत के लिए लंबवत होना चाहिए परिमाणीकरण त्रुटियों से बचने के लिए।
  3. ROI प्रबंधक में चयनित क्षेत्र रिकॉर्ड करने के लिए कुंजीपटल पर T अक्षर दबाएँ। उन सभी जहाजों में चरण 7.1 और 7.2 को दोहराएं जिन्हें परिमाणित करने की आवश्यकता है।
  4. दूरी डेटा प्राप्त करने के लिए ROI प्रबंधक में माप पर क्लिक करें। कार्यक्रम आवश्यक जानकारी के साथ एक नई विंडो प्रदर्शित करेगा। किसी अन्य प्रोग्राम में डेटा की प्रतिलिपि बनाएँ या फ़ाइल सहेजें.

8. पोत tortuosity का परिमाणीकरण

  1. मेनू पट्टी में, माउस के दाएँ बटन के साथ सीधी रेखा उपकरण आइकन पर क्लिक करें और खंडित रेखा या फ्रीहैंड लाइन का चयन करें। संवहनी आकार के बाद पहले पोत के प्रभाव तक ऑप्टिक तंत्रिका से पोत के अंदर एक रेखा खींचें।
    नोट:: रेखा को परिमाणीकरण त्रुटियों से बचने के लिए संवहनी आकृति का पालन करना चाहिए।
  2. ROI प्रबंधक में चयनित क्षेत्र रिकॉर्ड करने के लिए कुंजीपटल पर T अक्षर दबाएँ।
  3. मेनू पट्टी में, सीधी-रेखा उपकरण का चयन करें। ऑप्टिक तंत्रिका से एक रेखा खींचें जब तक कि पहले पोत का असर न हो जाए।
  4. ROI प्रबंधक में चयनित क्षेत्र रिकॉर्ड करने के लिए कुंजीपटल पर T अक्षर दबाएँ।
  5. दूरी डेटा प्राप्त करने के लिए ROI प्रबंधक में माप पर क्लिक करें। कार्यक्रम आवश्यक जानकारी के साथ एक नई विंडो प्रदर्शित करेगा। किसी अन्य प्रोग्राम में डेटा की प्रतिलिपि बनाएँ या फ़ाइल सहेजें.
  6. tortuosity सूचकांक की गणना निम्नानुसार करें: खंडित रेखा के साथ प्राप्त दूरी को सीधी रेखा के साथ प्राप्त दूरी से विभाजित किया गया है।

9. संवहनी शाखाओं का परिमाणीकरण

  1. मेनू बार के ओवल टूल के साथ, सभी प्रयोगात्मक स्थितियों के लिए समान रूप से लागू क्षेत्र को परिभाषित करें। चयनित क्षेत्र ऑप्टिक तंत्रिका के चारों ओर खींचा गया एक संकेंद्रित वृत्त होना चाहिए।
  2. ROI प्रबंधक में चयनित क्षेत्र रिकॉर्ड करने के लिए कुंजीपटल पर T अक्षर दबाएँ।
    नोट: इस मामले में, यह ROI को बचाने के लिए अनुशंसित है क्योंकि परिमाणीकरण धीमा है और समान ROI का उपयोग सभी छवियों में किया जाना चाहिए। ऐसा करने के लिए, ROI प्रबंधक में अधिक > सहेजें पर क्लिक करें।
  3. मैन्युअल रूप से, चयन क्षेत्र के अंदर मुख्य जहाजों से उत्पन्न होने वाली प्राथमिक शाखाओं की संख्या की गणना करें।
  4. पड़ोसी क्षेत्रों में चरण 9.2 और 9.3 को दोहराएं, ऑप्टिक तंत्रिका-परिधि मानदंड को बनाए रखें।

10. संवहनी घनत्व का परिमाणीकरण

  1. छवि को 8-बिट मोड में परिवर्तित करें.
  2. मेनू बार में प्लगइन्स पर जाएं, संवहनी घनत्व > पोत विश्लेषण का चयन करें।
  3. मेनू बार के स्क्वायर टूल के साथ एक क्षेत्र को परिभाषित करें, जहां पोत घनत्व को मापा जाना चाहिए। OK पर क्लिक करें।
  4. कार्यक्रम आवश्यक जानकारी के साथ एक नई विंडो प्रदर्शित करेगा। किसी अन्य प्रोग्राम में डेटा की प्रतिलिपि बनाएँ या फ़ाइल सहेजें.
  5. पड़ोसी क्षेत्रों में चरण 10.2, 10.3 और 10.4 को दोहराएं, आरओआई को बनाए रखें, लेकिन इसे परिधि और पूरे रेटिना के केंद्र को शामिल करते हुए नौ बार रखें।

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Representative Results

जैसा कि प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित है, एक एकल फ्लोरोसेंट धुंधला परख से आप संवहनी आकृति विज्ञान प्राप्त कर सकते हैं और मात्रात्मक रूप से ब्याज के कई मापदंडों का मूल्यांकन कर सकते हैं। एक विशिष्ट परिवर्तन की खोज रेटिनोपैथी के प्रकार पर निर्भर करेगी। इस लेख में, एवैस्कुलर और नियोवैस्कुलर क्षेत्रों, टॉर्टुओसिटी और फैलाव का मूल्यांकन प्रोलिफेरेटिव रेटिनोपैथी के माउस मॉडल में किया गया था, जबकि संवहनी शाखाओं और घनत्व का विश्लेषण मेट्स माउस मॉडल में किया गया था, जो एक गैर-प्रोलिफेरेटिव रेटिनोपैथी को प्रेरित करता है।

पहले प्रयोगात्मक उदाहरण में, ऑक्सीजन-प्रेरित रेटिनोपैथी (ओआईआर) माउस मॉडल को नियोजित किया गया था, जो प्रीमैच्योरिटी के रेटिनोपैथी और डायबिटिक रेटिनोपैथी के प्रोलिफेरेटिव चरण की कुछ विशेषताओं जैसा दिखता है। इस मॉडल में, प्रसवोत्तर दिन (पी) 7 से P1218 तक एक हाइपरोक्सिक कक्ष में litters को उनकी नर्सिंग मां के साथ बनाए रखा जाता है। इंट्राविट्रियल इंजेक्शन एक एंटीएंजियोजेनिक (उपचार के रूप में नामित स्थिति) के रूप में एक दवा की प्रभावशीलता को निर्धारित करने के लिए पी 12 में किए गए थे। चूहों को P17 पर बलिदान किया गया था, जो अधिकतम neovessels formation19 का समय बिंदु था। वाहन के साथ इंजेक्ट किए गए चूहों को नियंत्रण के रूप में नियोजित किया गया था। दोनों नमूनों को तय किया गया था और एक साथ Isolectin GSA-IB4 के साथ दाग दिया गया था। confocal अधिग्रहण के बाद, छवियों ImageJ फिजी सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण किया गया था जैसा कि ऊपर इंगित किया गया है। Confocal माइक्रोस्कोप के लिए एकीकृत सिलाई मॉड्यूल के साथ, पूरा माउंट एक अद्वितीय छवि (चित्रा 1) के रूप में मनाया गया था। P17 पर, अंतर्गर्भाशयी जीवन के दौरान आवश्यक एक क्षणिक संवहनी प्रणाली hyaloid vasculature का निरीक्षण करना संभव है (चित्रा 1, सफेद तीर)20।

हाइपरोक्सिक चैंबर में अत्यधिक ऑक्सीजन प्रावधान के परिणामस्वरूप, ओआईआर चूहे शारीरिक संवहनी विकास को गिरफ्तार करते हैं और रेटिना में एवैस्कुलर क्षेत्रों को उत्पन्न करते हैं। फिर, एवैस्कुलर क्षेत्रों को उन क्षेत्रों के रूप में परिभाषित किया जाता है जिनमें रेटिना रक्त वाहिकाओं की कमी होती है (चित्रा 2)। अधिग्रहित छवियों से, एवैस्कुलर क्षेत्रों को रेटिना के कुल क्षेत्र से विभाजित जहाजों के बिना क्षेत्रों के योग के रूप में परिमाणित किया जा सकता है। यांत्रिक क्षति वाले क्षेत्र भी जहाजों की अनुपस्थिति दिखाते हैं। क्षतिग्रस्त क्षेत्रों की पहचान करने के लिए, Hoechst दाग के साथ न्यूरोनल परतों की अखंडता का विश्लेषण करें।

रेटिना के एवैस्कुलर क्षेत्र ऑक्सीजन वितरण से बचते हैं और इसलिए, एक मजबूत प्रो-एंजियोजेनिक प्रतिक्रिया निर्धारित की जाती है, जो नियोवैस्कुलराइजेशन को प्रेरित करती है। Neovessels छोटे कैलिबर वाहिकाएं हैं जो बेहतर संवहनी जाल के पहले से मौजूद पोत से उत्पन्न होती हैं। उनकी संरचना अव्यवस्थित है, इसलिए, neovessels vitreous cavity21 की ओर tufts के रूप में विकसित होते हैं। हमने रेटिना के कुल क्षेत्र से विभाजित रेटिना के नियोवैस्कुलर क्षेत्र को परिमाणित करके नियोवेसल के टफ्ट्स द्वारा कब्जा किए गए क्षेत्र की गणना की (चित्रा 3)। जैसा कि नियोवेसल का आकार और आकार परिवर्तनशील है, कभी-कभी वे मलबे और कलाकृतियों के समान दिख सकते हैं। neovessels भेद करने के लिए, सत्यापित करें कि टफ्ट एक परिपक्व पोत से बढ़ता है।

संवहनी फैलाव और tortuosity अन्य दो लगातार परिवर्तन हैं, जो संवहनी जीव विज्ञान पर नकारात्मक प्रभाव डालते हैं, क्योंकि वे अशांत रक्त परिसंचरण का उत्पादन करते हैं। फैलाव के विश्लेषण के लिए, हमने पहली शाखा 22,23 (चित्रा 4) से पहले तीन ऊंचाइयों पर मुख्य जहाजों के व्यास को मापा। शोधकर्ताओं को परिणामों के बीच परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए पोत व्यास को मापने के लिए एक पूर्व निर्धारित दूरी को परिभाषित करना चाहिए। आदर्श रूप से, ऑप्टिक तंत्रिका से सबसे दूर बिंदु लगभग 300 μm होना चाहिए। हम विश्लेषण करने का सुझाव देते हैं और बाद में प्रति स्थिति कम से कम छह चूहों का औसत लेते हैं।

tortuosity के बारे में, हम ऑप्टिक तंत्रिका और पहले ब्रांचिंग बिंदु 24 (चित्रा 5) के बीच सीधी दूरी के संबंध में इसके आकार के बाद मुख्य जहाजों द्वारा तय की गई दूरी को मापते हैं। जैसा कि हम छवि में देख सकते हैं, मुख्य जहाजों की सिनुओसिटी में विषमता है। एक प्रतिनिधि परिणाम प्राप्त करने के लिए, प्रति शर्त छह चूहों से कम नहीं होना चाहिए।

नवीनतम मापदंडों, संवहनी ब्रांचिंग और घनत्व, का विश्लेषण मेट्स मॉडल में गैर-प्रोलिफेरेटिव रेटिनोपैथी का प्रदर्शन करते हुए किया गया था। मेट्स में, लिपिड और कार्बोहाइड्रेट दोनों रेटिना पेरिसाइट और एंडोथेलियल कोशिकाओं की शिथिलता और मृत्यु से जुड़े होते हैं, जिससे एसेल्युलर केशिकाओं का गठन होता है या संवहनी ब्रांचिंग में कमी आती है25। हमारे मॉडल में, ApoE-KO चूहों को पीने के पानी में जोड़े गए फ्रुक्टोज के साथ खिलाया गया था, 10% डब्ल्यू / वी की एकाग्रता पर। नियंत्रण जानवरों को सिर्फ नल का पानी मिला। आहार के 4 महीने के बाद, चूहों की बलि दी गई थी, और रेटिना को संसाधित किया गया था जैसा कि पहले संकेत दिया गया था। संवहनी शाखाओं के माप के लिए, हमने एक संकेंद्रित सर्कल खींचकर परिमाणीकरण क्षेत्र को परिभाषित किया, और फिर हमने एक-एक करके, एक मुख्य केंद्रीय पोत (चित्रा 6) से उत्पन्न होने वाली प्राथमिक शाखाओं की गणना की।

अधिग्रहित छवियों से, संवहनी घनत्व को आरओआई के क्षेत्र से विभाजित जहाजों द्वारा कब्जा किए गए क्षेत्र के रूप में परिमाणित किया गया था (0.015 मिमी 2 का एक वर्ग, चित्रा 7 में चपटा देखें), जिसे प्रत्येक माइक्रोफोटोग्राफ में अलग-अलग स्थानों पर तैनात किया गया था, जैसा कि प्रोटोकॉल अनुभाग में समझाया गया था। यांत्रिक क्षति (चित्रा 7, सफेद तीर) के साथ क्षेत्रों को परिमाणित करने से बचें। यदि पंचर के साथ दो से अधिक क्षेत्र हैं, तो रेटिना को छोड़ दिया जाना चाहिए।

Figure 1
चित्रा 1: रेटिना के संवहनी धुंधला पूरे माउंट Isolectin GSA-IB4 के साथ लेबल: P17 OIR चूहों रेटिना के प्रतिनिधि confocal छवियों P12 पर वाहन या उपचार के साथ इंजेक्शन. फ्लोरोसेंट धुंधला प्रोटोकॉल के अनुसार Isolectin GSA-IB4 Alexa 488 के साथ पूरे माउंट रेटिना में प्रदर्शन किया गया था। Avascular क्षेत्रों (AV) और neovascular क्षेत्रों (NV) को इंगित किया जाता है। स्केल बार: 500 μm. सफेद तीर अवशेष hyaloid वास्कुलचर दिखाते हैं। पीले तीर confocal छवि अधिग्रहण के दौरान अपूर्ण स्कैनिंग क्षेत्रों को दिखाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एवैस्कुलर क्षेत्रों का परिमाणीकरण: (ए) पी 17 पर पूरे माउंट रेटिना की प्रतिनिधि छवियां ओआईआर-वाहन और ओआईआर-उपचार चूहों में जीएसए-आईबी 4 संवहनी धुंधला दिखा रही हैं। वासो-विलोपन वाले क्षेत्रों को पीले रंग में इंगित किया जाता है। स्केल बार: 500 μm. (B) AV क्षेत्र (%) को पूरे रेटिना क्षेत्र के लिए केंद्रीय एवैस्कुलर क्षेत्र के अनुपात के रूप में परिमाणित किया गया था। सांख्यिकीय तुलना के लिए दो-पूंछ वाले अनपेयर्ड टी-टेस्ट का उपयोग किया गया था। डेटा SEM ± मतलब के रूप में प्रस्तुत किया गया है*** पी < 0.001. जीवित रहने के समय की जांच में प्रत्येक स्थिति के लिए कम से कम छह जानवरों को नियोजित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: neovascular क्षेत्रों का परिमाणीकरण: (ए) P17 पर पूरे माउंट रेटिना की प्रतिनिधि छवियां OIR-वाहन और OIR-उपचार चूहों में GSA-IB4 संवहनी धुंधला दिखा रही हैं। Neovascularization के साथ क्षेत्रों को सफेद में इंगित किया जाता है। स्केल बार: 500 μm. (B) NV क्षेत्र (%) को पूरे रेटिना क्षेत्र के लिए neovessels द्वारा कब्जा किए गए क्षेत्र के अनुपात के रूप में परिमाणित किया गया था। सांख्यिकीय तुलना के लिए दो-पूंछ वाले अनपेयर्ड टी-टेस्ट का उपयोग किया गया था। डेटा SEM ± मतलब के रूप में प्रस्तुत किया गया है*** पी < 0.001. जीवित रहने के समय की जांच में प्रत्येक स्थिति के लिए कम से कम छह जानवरों को नियोजित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: संवहनी फैलाव का परिमाणीकरण: (ए) पी 17 में पूरे माउंट रेटिना की प्रतिनिधि छवियां ओआईआर-वाहन और ओआईआर-उपचार चूहों में जीएसए-आईबी 4 संवहनी धुंधला दिखा रही हैं। बाएं पैनल: आरओआई को परिमाणीकरण के लिए चुना गया है। सही पैनल: आरओआई का ज़ूम, पोत व्यास को मापने के लिए एक मुख्य पोत में की गई सीधी रेखाओं को दिखाते हुए। तीन लाइनों को जहाज के लिए transversally पता लगाया गया था और औसत. स्केल बार: 100 μm. (B) पोत व्यास (%) को रेटिना के प्रमुख जहाजों में मापा गया औसत व्यास के रूप में परिमाणित किया गया था। सांख्यिकीय तुलना के लिए दो-पूंछ वाले अनपेयर्ड टी-टेस्ट का उपयोग किया गया था। डेटा SEM ± मतलब के रूप में प्रस्तुत किया गया है। * पी < 0.05. जीवित रहने के समय की जांच में प्रत्येक स्थिति के लिए कम से कम छह जानवरों को नियोजित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: tortuosity सूचकांक का निर्धारण: (ए) P17 पर पूरे माउंट रेटिना की प्रतिनिधि छवियां OIR-वाहन और OIR-उपचार चूहों में GSA-IB4 संवहनी धुंधला दिखा रही हैं। बाएं पैनल: आरओआई को परिमाणीकरण के लिए चुना गया है। केंद्र पैनल: आरओआई का ज़ूम, ऑप्टिक तंत्रिका से पहले ब्रांचिंग बिंदु तक एक मुख्य पोत में ट्रेस की गई खंडित रेखाओं को दिखाता है। सही पैनल: आरओआई का ज़ूम, ऑप्टिक तंत्रिका से पहले ब्रांचिंग बिंदु तक एक मुख्य पोत में ट्रेस की गई सीधी रेखाओं को दिखाता है। स्केल बार: 100 μm. (B) tortuosity सूचकांक को खंडित रेखा की दूरी को सीधी रेखा की दूरी पर विभाजित करके प्राप्त किया गया था। सांख्यिकीय तुलना के लिए दो-पूंछ वाले अनपेयर्ड टी-टेस्ट का उपयोग किया गया था। SEM. ns, गैर-महत्वपूर्ण ± माध्य के रूप में प्रस्तुत डेटा। जीवित रहने के समय की जांच में प्रत्येक स्थिति के लिए कम से कम छह जानवरों को नियोजित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: संवहनी शाखाओं का परिमाणीकरण: (ए) पूरे माउंट रेटिना की प्रतिनिधि छवियां जो एपोई-केओ और एपोई-केओ + फ्रुक्टोज खिलाए गए चूहों में आइसोलेक्टिन जीएसए-आईबी 4 संवहनी धुंधला दिखाती हैं। परिपत्र परिमाणीकरण क्षेत्रों को पीले रंग में परिभाषित किया गया था। स्केल बार: 100 μm, 100x आवर्धन. (बी) शाखाओं की संख्या को एक मुख्य पोत से प्राथमिक शाखाओं की संख्या के रूप में निर्धारित किया गया था, क्योंकि ऑप्टिक तंत्रिका परिधि तक थी। सांख्यिकीय तुलना के लिए दो-पूंछ वाले अनपेयर्ड टी-टेस्ट का उपयोग किया गया था। SEM. ns, गैर-महत्वपूर्ण ± माध्य के रूप में प्रस्तुत डेटा। प्रत्येक स्थिति के लिए कम से कम छह जानवरों को नियुक्त किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: संवहनी घनत्व का परिमाणीकरण: (ए) पूरे माउंट रेटिना की प्रतिनिधि छवियां जो एपोई-केओ और एपीओई-केओ + फ्रुक्टोज खिलाए गए चूहों में आइसोलेक्टिन जीएसए-आईबी 4 संवहनी धुंधला दिखा रही हैं। 0.015 मिमी 2 परिमाणीकरण क्षेत्र के वर्ग को पीले रंग में परिभाषित किया गया था। स्केल बार: 100 μm, 100x आवर्धन. (बी) संवहनी घनत्व को कुल आरओआई क्षेत्र के लिए संवहनी क्षेत्र के अनुपात के रूप में परिमाणित किया गया था, जिसे प्रत्येक माइक्रोफोटोग्राफ में विभिन्न स्थानों पर नौ बार तैनात किया गया था। सफेद तीर यांत्रिक क्षति के साथ क्षेत्रों को दिखाते हैं। सांख्यिकीय तुलना के लिए दो-पूंछ वाले अनपेयर्ड टी-टेस्ट का उपयोग किया गया था। SEM. ns, गैर-महत्वपूर्ण ± माध्य के रूप में प्रस्तुत डेटा। प्रत्येक स्थिति के लिए कम से कम छह जानवरों को नियुक्त किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

रेटिनोपैथी के पशु मॉडल संवहनी विकास, remodeling, या रोग एंजियोजेनेसिस का अध्ययन करने के लिए शक्तिशाली उपकरण हैं। क्षेत्र में इन अध्ययनों की सफलता ऊतक तक आसान पहुंच पर निर्भर करती है जो विभिन्न प्रकार की तकनीकों को करने की अनुमति देती है, जो विवो और पोस्टमॉर्टम चूहों 26,27 से डेटा प्रदान करती है। इसके अलावा, विवो अध्ययन और नैदानिक विश्लेषण के बीच महान सहसंबंध पाया गया है, जो इन मॉडलों को ठोस ट्रेसबिलिटी और विश्वसनीयता प्रदान करता है28। इस लेख में, हम रेटिना संवहनी रोगों के माउस मॉडल में संवहनी नेटवर्क को चिह्नित करने के लिए चरणों का एक सरल और मजबूत विवरण प्रस्तुत करते हैं। साहित्य में, पाठकों को यहां चयनित लोगों को मापने और समानांतर दृष्टिकोणों को मापने के लिए अन्य संभावित पैरामीटर मिलेंगे। संकलित प्रोटोकॉल के दूसरों पर कई लाभ हैं क्योंकि वे प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं, और उन्हें विश्लेषण करने के लिए केवल एक मुफ्त सॉफ़्टवेयर की आवश्यकता होती है (छवि जे फिजी)।

इसके अलावा, इन प्रोटोकॉल को उन छात्रों द्वारा किया जाना आसान है जिनके पास कार्यक्रम के बारे में व्यापक ज्ञान नहीं है और अधिकांश मापों को अतिरिक्त प्लगइन्स (संवहनी घनत्व को छोड़कर) की आवश्यकता नहीं है।

नमूना निष्कर्षण और प्रतिदीप्ति धुंधला तकनीक सरल और संक्षिप्त 29 कर रहे हैं. ताजा रेटिना के साथ काम करना बहुत महत्वपूर्ण है, हालांकि उन्हें बैक्टीरिया के विकास के अवरोधकों के साथ पीबीएस में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। चूंकि ऊतक पतला और नरम होता है, इसलिए पुराने नमूने अक्सर इनक्यूबेशन के दौरान या बढ़ते से पहले नमूने को उजागर करते समय टूट जाते हैं। इसके अलावा, 4% पीएफए के साथ अत्यधिक निर्धारण रेटिना को अत्यधिक कठोर और भंगुर बना देता है, लेकिन यह लेक्टिन स्टेनिंग को प्रभावित नहीं करता है। Isolectin GSA-IB4 धुंधला हर परत पर पूर्ण संवहनी नेटवर्क की कल्पना करने की अनुमति देता है, जिसमें नियोवेसल और एंडोथेलियल कोशिकाओं का प्रसार शामिल है। सीडी 31 के रूप में अन्य मार्करों को केंद्रित एंटीबॉडी के साथ नमूने के इनक्यूबेशन की आवश्यकता होती है और उनके पास अधिक पृष्ठभूमि होती है। दूसरी ओर, एंजियोग्राफी में, फ्लोरोसेंट डाई जहाजों से बाहर फैलती है, जो पोत कैलिबर और टॉर्टुओसिटी परिमाणीकरण में परिवर्तनशीलता को बढ़ाती है। Isolectin GSA-IB4 का एक नुकसान यह है कि यह माइक्रोग्लियल कोशिकाओं को भी लेबल कर सकता है30। इंट्राविट्रल इंजेक्शन या अन्य प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को करते समय सावधानी बरतनी चाहिए जो अत्यधिक घुसपैठ को प्रेरित करती हैं क्योंकि माइक्रोग्लियल कोशिकाएं agglomerates बना सकती हैं।

छवि अधिग्रहण किसी भी confocal माइक्रोस्कोप के साथ किया जा सकता है। एक सॉफ्टवेयर है कि सिलाई मॉड्यूल शामिल करने के लिए एक motorized प्लेट जोड़े का उपयोग एक ही छवि में पूरे घुड़सवार रेटिना का पूरा विज़ुअलाइज़ेशन प्रदान करेगा. रेटिना क्षेत्र का चयन करते समय, सुनिश्चित करें कि नमूने के सभी चरम सीमाओं को शामिल किया गया है, अन्यथा तस्वीर अधूरी होगी (चित्रा 1, पीले तीर)। यह एक उदाहरण के रूप में, ओआईआर के माउस मॉडल में बहुत प्रासंगिक नहीं है, क्योंकि संवहनी परिवर्तन ऑप्टिक तंत्रिका के पास हैं। जबकि ओआईआर के चूहे के मॉडल में, यह गलती गलत मात्रा का कारण बन सकती है, क्योंकि एवैस्कुलर और नियोवैस्कुलर क्षेत्र लिम्बस के बगल में हैं। एक और संभावना व्यक्तिगत रेटिना माइक्रोफोटोग्राफ लेना है। उपयोगकर्ता बाद में उन्हें एक उचित सॉफ्टवेयर के साथ एक पहेली के रूप में व्यवस्थित कर सकते हैं। एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करने की सिफारिश नहीं की जाती है, खासकर जब ब्रांचिंग का विश्लेषण किया जाता है, क्योंकि जहाजों को रेटिना की पूरी मोटाई में अंकुरित किया जाता है और कुछ जहाजों को पूरी तरह से जेड स्टैक में नहीं पाया जाएगा।

ImageJ FIJI के साथ छवि प्रसंस्करण के दौरान, सॉफ़्टवेयर में समान स्थितियों को रखने के लिए, सॉफ़्टवेयर में समान परिस्थितियों को रखने के लिए, जब तक कि सभी छवियों को परिमाणित नहीं किया जाता है, तब तक सॉफ़्टवेयर को अपडेट न करने की सिफारिश की जाती है। छवियों का अंशांकन (माइक्रोन में पिक्सेल आकार का असाइनमेंट) एक महत्वपूर्ण कदम है क्योंकि ये प्रोटोकॉल दूरी और क्षेत्रों के परिमाणीकरण का संकेत देते हैं। जब कार्यक्रम से परिचित होता है, तो उपयोगकर्ता छड़ी उपकरण के अलावा नियोवैस्कुलर और एवैस्कुलर क्षेत्र का चयन करने के लिए अन्य उपकरणों का पता लगा सकता है। बहुभुज चयन उपकरण विशेष रूप से एवैस्कुलर क्षेत्रों को मापने के लिए उपयोगी है जो बढ़ते चरण में दो भागों में काटा गया है। अन्य शोधकर्ताओं ने इन संरचनाओं की प्रतिदीप्ति तीव्रता के आधार पर नियोवेसल के चयन को स्वचालित करने के लिए विशिष्ट प्लगइन्स बनाए हैं। ये तरीके तेज़ और कम श्रमसाध्य हैं, हालांकि यह जांचने की सिफारिश की जाती है कि छोटे कम-चमकदार नियोवेसल्स को परिमाणीकरण 31 से पहले चुना गया है। Neovessels के क्षेत्रों के आसपास के सामान्य जहाजों की तुलना में अधिक तीव्रता से fluoresce होगा। मैजिक वैंड टूल उन क्षेत्रों का चयन करता है जो समान रूप से रंगीन होते हैं और सहिष्णुता निर्धारित करती है कि रंग में कितने समान पिक्सेल चुने गए हैं। यदि एक neovessel सामान्य जहाजों के लिए समान तीव्रता का है, तो सहिष्णुता को सूक्ष्म तीव्रता अंतर के प्रति संवेदनशीलता बढ़ाने के लिए नीचे की ओर समायोजित किया जा सकता है। हालांकि हर नमूने में neovessel चयन एक समान दहलीज के साथ किया जाएगा, कुछ neovessels एक मामूली प्रतिदीप्ति तीव्रता की विशेषता है। इस मामले में, उचित चयन के लिए कम सहिष्णुता की आवश्यकता होगी।

Tortuosity और फैलाव दूरी के माप हैं। संवहनी पेड़ का एक व्यापक अध्ययन समान प्रकार (धमनियों या नसों) और कैलिबर के जहाजों का चयन करने में सहायक है। हम तीन ऊंचाइयों पर जहाजों में फैलाव को मापते हैं जैसा कि चित्र 4 में दिखाया गया है। पोत की दीवार के संबंध में सीधे चयन का कोण एक और प्रासंगिक बिंदु है जिसे ध्यान में रखा जाना चाहिए। यह संभव त्रुटियों से बचने के लिए 90 डिग्री के जितना संभव हो उतना करीब होना चाहिए। सीधी रेखा खींचते समय, उपयोगकर्ता ब्याज के पोत से संपर्क करने के लिए ज़ूम टूल का उपयोग कर सकते हैं।

संवहनी शाखाओं को विभिन्न ऊंचाइयों के दो या दो से अधिक परिमाणीकरण क्षेत्रों में भी मापा जा सकता है, यदि वांछित हो। इस मामले में, शोधकर्ताओं को विश्लेषण किए गए रेटिना के क्षेत्र का संरक्षण करना चाहिए (ऑप्टिक तंत्रिका के केंद्रीय, मध्यम, या परिधीय पक्ष)। यद्यपि रेटिनोपैथी के कई पशु मॉडलों में ब्रांचिंग को बदल दिया जाता है, लेकिन यहां प्रस्तुत मेट्स से जुड़े रेटिनोपैथी के शुरुआती चरण अभी भी इस तरह के परिवर्तन नहीं दिखाते हैं। मध्यवर्ती और गहरे जाल और पोत स्प्राउटिंग के रेटिना केशिकाओं में व्यापक अध्ययन के लिए, 3 डी कम्प्यूटेशनल तरीके संवहनी आकृति विज्ञान और नेटवर्क 32 में सूक्ष्म विविधताओं के मूल्यवान डेटा प्रदान करते हैं। अंत में, संवहनी घनत्व चयनित ROI के कुल क्षेत्र के संबंध में जहाजों द्वारा कब्जा किए गए क्षेत्र द्वारा निर्धारित किया जाता है। इस पैरामीटर के माप के लिए एक प्लगइन और ImageJ FIJI के एक वास्तविक संस्करण के उपयोग की आवश्यकता होती है, जहां ऑटो थ्रेशोल्ड और ज्यामिति से दूरी मानचित्र उपकरण उपलब्ध होना चाहिए। इन अतिरिक्त चरणों के बावजूद, प्लगइन का उपयोग करना आसान है, पुन: प्रस्तुत करने योग्य और विश्वसनीय है। संवहनी घनत्व के माप के लिए, रेटिना के विभिन्न क्षेत्रों में प्रतिदीप्ति तीव्रता के दस माप करने के लिए 0.015 मिमी 2 का एक आरओआई चुना गया था। इस आकार ने हमें पूरी तस्वीर को कवर करने की अनुमति दी, इस प्रकार प्रत्येक रेटिना में अधिक प्रतिनिधि औसत मूल्य और इसके विचलन को प्राप्त किया।

कुल मिलाकर, इस तथ्य के बावजूद कि विधियों के ये संग्रह स्वचालित नहीं हैं और मापदंडों के मैन्युअल चयन की आवश्यकता होती है, वे रेटिना के मात्रात्मक और कठोर डेटा प्रदान करने में सक्षम हैं। संवहनी माप के लिए उपरोक्त प्रस्तुत प्रोटोकॉल के बारे में मुख्य सीमा एक ही छवि का विश्लेषण करते समय अंतर-परीक्षक परिवर्तनशीलता पर निर्भर करती है। इस पूर्वाग्रह को कम करने के लिए, पोत की दीवार की सीमाओं के रूप में सामान्य सेटिंग को पूर्व-स्थापित करना महत्वपूर्ण है, एवैस्कुलर क्षेत्रों और नियोवेसल्स की पहचान, और क्षतिग्रस्त ऊतकों के लिए बहिष्करण मानदंड भी। पोत tortuosity के बारे में, ऑप्टिक तंत्रिका के बगल में एक सहमत प्रारंभिक बिंदु की आवश्यकता होती है। शुरुआती उपयोगकर्ताओं के लिए, दो या दो से अधिक परीक्षकों द्वारा एकत्र किए गए डेटा को औसत करने की अत्यधिक सिफारिश की जाती है। प्रशिक्षित उपयोगकर्ताओं में, विभिन्न मापदंडों के मापन में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया गया है, जब तक कि परिमाणीकरण मानदंड में समझौता स्थिर रहता है। इसी तरह, रेटिनोपैथी में पाए गए संवहनी परिवर्तनों के आधार पर सूचीबद्ध प्रोटोकॉल में अतिरिक्त मापदंडों को जोड़ा जा सकता है। गैर-प्रोलिफेरेटिव रेटिनोपैथी में, एसेल्युलर केशिका संख्या का माप, पेरिसाइट्स को माइग्रेट करना, पेरिसाइट / एंडोथेलियल कोशिकाओं की संख्या और रक्त रेटिना बाधा पारगम्यता का अनुपात रेटिना वास्कुलचर 33,34,35 में परिवर्तित शुरुआती पैरामीटर हैं। क्रोनिक मॉडल और हल्के रेटिनोपैथी के लिए, इन अतिरिक्त मापों को शामिल करने की सलाह दी जाती है। मापा मापदंडों की एक बड़ी संख्या vasculature में होने वाली घटनाओं का एक और अधिक वफादार परिदृश्य प्रदान करेगा। संक्षेप में, इस लेख में, हमने नैदानिक अभ्यास में ध्यान में रखे गए कुछ सबसे प्रासंगिक मापदंडों को मापने के लिए शास्त्रीय, अच्छी तरह से स्थापित और पुन: प्रस्तुत करने योग्य तकनीकों को दिखाया है।

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की है कि अनुसंधान किसी भी वाणिज्यिक या वित्तीय संबंधों की अनुपस्थिति में आयोजित किया गया था जिसे हितों के संभावित संघर्ष के रूप में माना जा सकता है।

Acknowledgments

हम कार्लोस मास, मारिया पिलर क्रेस्पो, और CEMINCO के सेसिलिया Sampedro (Centro de Micro y Nanoscopía Córdoba, CONICET-UNC, Córdoba, Argentina) को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी में सहायता के लिए धन्यवाद देते हैं, समर्पित पशु देखभाल के लिए सोलेडाद मिरो और विक्टोरिया ब्लैंको और हिस्टोलॉजिकल सहायता के लिए लौरा गाटिका को। हम वीडियो उत्पादन और संस्करण के लिए विक्टर डियाज़ (एफसीक्यू के संस्थागत संचार के प्रो-सेक्रेटरी) और पांडुलिपि के अपने महत्वपूर्ण पढ़ने और भाषा संशोधन के लिए पॉल हॉब्सन को भी धन्यवाद देते हैं।

इस लेख को Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT), Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (सभी M.C.S. के लिए) से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aluminuim foil
Bovine Serum Albumin Merck A4503 quality
Calcium chloride dihydrate Merck C3306
Hydrochloric acid Biopack 9632.08
Confocal Microscope FV1200 Olympus FV1200 with motorized plate
Covers Paul Marienfeld GmnH & Co. 111520
Dissecting Microscope NIKON SMZ645
Disodium-hydrogen-phosphate dihydrate Merck 119753
200 µL  tube Merck Z316121
Filter paper Merck WHA5201090
Incubator shaker GyroMini LabNet International S0500
Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate Invitrogen I21411
Poly(vinyl alcohol) (Mowiol 4-88) Merck 475904
Paraformaldehyde Merck 158127
pHmeter SANXIN PHS-3D-03
Potassium chloride Merck P9541
Potassium-dihydrogen phosphate Merck 1,04,873
Slides Fisher Scientific 12-550-15
Sodium chloride Merck S3014
Sodium hydroxide Merck S5881
Tris Merck GE17-1321-01
Triton X-100 Merck X100-1GA
Vessel Analysis Fiji software Mai Elfarnawany https://imagej.net/Vessel_Analysis

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 181
गैर-प्रोलिफेरेटिव और प्रोलिफेरेटिव रेटिनोपैथी के साथ चूहों के पूरे माउंट रेटिना में संवहनी मापदंडों का परिमाणीकरण
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Subirada, P. V., Paz, M. C.,… More

Subirada, P. V., Paz, M. C., Vaglienti, M. V., Luna, J. D., Barcelona, P. F., Sánchez, M. C. Quantification of Vascular Parameters in Whole Mount Retinas of Mice with Non-Proliferative and Proliferative Retinopathies. J. Vis. Exp. (181), e63126, doi:10.3791/63126 (2022).

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