Summary
Questo articolo descrive un saggio di colorazione lectina ben consolidato e riproducibile per l'intero monte di preparati retinici e i protocolli necessari per la misurazione quantitativa di parametri vascolari frequentemente alterati nelle retinopatie proliferative e non proliferative.
Abstract
Le retinopatie sono un gruppo eterogeneo di malattie che colpiscono il tessuto neurosensoriale dell'occhio. Sono caratterizzati da neurodegenerazione, gliosi e un progressivo cambiamento della funzione e della struttura vascolare. Sebbene l'insorgenza delle retinopatie sia caratterizzata da sottili disturbi nella percezione visiva, le modifiche nel plesso vascolare sono i primi segni rilevati dai medici. L'assenza o la presenza di neovascolarizzazione determina se la retinopatia è classificata come non proliferativa (NPDR) o proliferativa (PDR). In questo senso, diversi modelli animali hanno cercato di imitare specifiche caratteristiche vascolari di ogni stadio per determinare i meccanismi sottostanti coinvolti nelle alterazioni dell'endotelio, nella morte neuronale e in altri eventi che si verificano nella retina. In questo articolo, forniremo una descrizione completa delle procedure necessarie per la misurazione dei parametri vascolari retinici negli adulti e nei topi di parto precoce al giorno postnatale (P)17. Descriveremo in dettaglio i protocolli per eseguire la colorazione vascolare retinica con Isolectina GSA-IB4 in supporti interi per una successiva visualizzazione microscopica. Vengono inoltre forniti passaggi chiave per l'elaborazione delle immagini con il software Image J Fiji, pertanto i lettori saranno in grado di misurare la densità del vaso, il diametro e la tortuosità, la ramificazione vascolare e le aree avascolari e neovascolari. Questi strumenti sono molto utili per valutare e quantificare le alterazioni vascolari sia nelle retinopatie non proliferative che in quelle proliferative.
Introduction
Gli occhi sono nutriti da due sistemi arterio-venosi: la vascolarizzazione coroidale, una rete vascolare esterna che irriga l'epitelio pigmentato retinico e i fotorecettori; e la vascolarizzazione neuro-retinica che irriga lo strato di cellule gangliari e lo strato nucleare interno della retina1. La vascolarizzazione retinica è una rete organizzata di vasi che forniscono nutrienti e ossigeno alle cellule retiniche e raccolgono prodotti di scarto per garantire una corretta trasduzione della segnalazione visiva. Questa vascolarizzazione ha alcune caratteristiche distinte, tra cui: la mancanza di innervazione autonoma, la regolazione del tono vascolare da meccanismi retinici intrinseci e il possesso di una complessa barriera retinico-ematica2. Pertanto, la vascolarizzazione retinica è stata al centro di molti ricercatori che hanno ampiamente studiato non solo la vasculogenesi durante lo sviluppo, ma anche le alterazioni e l'angiogenesi patologica che questi vasi subiscono nelle malattie3. I cambiamenti vascolari più comuni osservati nelle retinopatie sono la dilatazione dei vasi, la neovascolarizzazione, la perdita di arborizzazione vascolare e la deformazione dei vasi principali della retina, che li rende più ziggaggy4,5,6. Una o più delle alterazioni descritte sono i primi segni che devono essere rilevati dai medici. La visualizzazione vascolare fornisce un metodo di screening rapido, non invasivo ed economico7. Lo studio approfondito delle alterazioni osservate nell'albero vascolare determinerà se la retinopatia non è proliferativa o proliferativa e l'ulteriore trattamento. Le retinopatie non proliferative possono manifestarsi con morfologia vascolare aberrante, diminuzione della densità vascolare, capillari acellulari, morte dei periciti, edema maculare, tra gli altri. Inoltre, le retinopatie proliferative sviluppano anche una maggiore permeabilità vascolare, rimodellamento extracellulare e formazione di ciuffi vascolari verso la cavità vitrea che facilmente si rompono o inducono il distacco della retina8.
Una volta rilevata, la retinopatia può essere monitorata attraverso i suoi cambiamenti vascolari9,10. La progressione della patologia può essere seguita attraverso i cambiamenti strutturali dei vasi, che definiscono chiaramente le fasi della malattia11. La quantificazione delle alterazioni vascolari in questi modelli ha permesso di correlare i cambiamenti vascolari e la morte neuronale e di testare terapie farmacologiche per pazienti in diverse fasi della malattia.
Alla luce delle affermazioni di cui sopra, riteniamo che il riconoscimento e la quantificazione delle alterazioni vascolari siano fondamentali negli studi sulle retinopatie. In questo lavoro, mostreremo come misurare diversi parametri vascolari. Per fare ciò, impiegheremo due modelli animali. Uno di questi è il modello murino di retinopatia indotta da ossigeno12, che imita la retinopatia della prematurità e alcuni aspetti della retinopatia diabetica proliferativa13,14. In questo modello, misureremo le aree avascolare, le aree neovascolari e la dilatazione e la tortuosità dei vasi principali. Nel nostro laboratorio è stato sviluppato un modello murino di Sindrome Metabolica (MetS), che induce una retinopatia non proliferativa15. Qui, valuteremo la densità vascolare e la ramificazione.
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Protocol
I topi C57BL / 6J sono stati gestiti secondo le linee guida della dichiarazione ARVO per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e visiva. Le procedure sperimentali sono state progettate e approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (CICUAL) della Facoltà di Scienze Chimiche, Università Nazionale di Córdoba (Res. HCD 1216/18).
1. Preparazione di soluzioni tampone e reagenti
- Preparazione di 1x soluzione salina tampone fosfato (PBS): Aggiungere 8 g di cloruro di sodio (NaCl), 0,2 g di cloruro di potassio (KCl), 14,4 g di disodio-idrogeno-fosfato diidrato (Na2HPO4 2H2O) e 0,24 g di potassio-diidrogeno fosfato (KH2PO4) a 800 ml di acqua distillata. Mescolare la soluzione fino alla completa dissoluzione dei sali. Regolare il pH a 7,4 con acido clorurato (HCl) e regolare il volume a 1 L con acqua distillata aggiuntiva. Filtrare la soluzione e conservarla a 4 °C.
- Preparazione di paraformaldeide al 4% (PFA): aggiungere 40 g di PFA solido a 800 ml di PBS appena preparato. Mescolare la soluzione in una piastra riscaldante ad una temperatura costante di 60 °C. Aggiungere 1 M di idrossido di sodio (NaOH) fino a completa dissoluzione del PFA, controllando che il pH sia mantenuto in un intervallo di 7,2-7,4. Ricaricare il volume a 1.000 ml con PBS e mixare. Spegnere la piastra riscaldante e filtrare la soluzione quando la sua temperatura è inferiore a 35 °C. Conservare la soluzione a 4 °C per un massimo di 3 giorni.
ATTENZIONE: Il PFA è dannoso se ingerito o se inalato ed è probabilmente un composto mutageno. Utilizzare guanti e mascherina durante l'intero processo e lavorare in una cabina di sicurezza. - Preparazione di 1x soluzione salina tamponata con Tris (TBS): aggiungere 6,1 g di Tris e 9 g di NaCl a 800 ml di acqua distillata. Mescolare la soluzione fino alla completa dissoluzione dei sali. Regolare il pH a 7,4 con HCl e regolare il volume a 1 L con acqua distillata aggiuntiva. Filtrare la soluzione e conservarla a 4 °C.
- Preparazione di TBS- 0,1% Triton X-100: Aggiungere 0,1 mL di TritonX-100 a 100 mL di TBS. Mescolare delicatamente e conservare a 4 °C per un massimo di 1 settimana.
NOTA: Poiché Triton è un detergente molto denso, tagliare leggermente il terminale della punta per un migliore pipettaggio. - Preparazione di TBS-5%-Albumina sierica bovina (BSA) -0,1% Triton-X-100: Pesare 5 g di BSA e aggiungere la soluzione tbs-0,1% di tritone X-100 fino a un volume finale di 100 ml. Mescolare delicatamente. Aliquota e conservare a -20 °C per un massimo di 2 mesi.
- Isolectina GSA-IB4 Alexa fluor-488 coniugato (Isolectina GSA-IB4): Peso 36,75 mg di cloruro di calcio diidrato (CaCl2·2H2O) e aggiungerlo a 500 ml di PBS appena preparato. Mescolare la soluzione con una barra di agitazione. Pipettare 500 μL della soluzione di CaCl2/PBS e aggiungerlo al flaconcino contenente 500 μg di Isolectina GSA-IB4 liofilizzata in polvere. Mescolare delicatamente e aliquotare la soluzione in tubi da 0,5 ml. Conservarli a -20 °C al riparo dalla luce.
- Poli(alcool vinilico) in glicerolo/Tris: Pesare 2,4 g di Poly(alcool vinilico), aggiungere 6 g di glicerolo e mescolare delicatamente. Quindi, aggiungere 6 ml di acqua e continuare a mescolare per diverse ore a temperatura ambiente. Aggiungere 12 mL di soluzione Tris preriscaldata da 0,2 M (pH: 8,5) e riscaldare a una temperatura costante di 50 °C per 10 minuti e mescolare di tanto in tanto. Infine, centrifugare la soluzione a 5.000 x g per 15 minuti per la chiarificazione.
NOTA: Lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente, aliquotarla e conservarla a -20 °C.
2. Colorazione fluorescente della lectina
- Dopo il sacrificio dei topi per inalazione di anidride carbonica (CO2), enucleare gli occhi con le forbici16. Fissare gli occhi enucleati con PFA al 4% appena preparato per 1 ora a temperatura ambiente (RT).
NOTA: La fissazione può essere eseguita anche incubando gli occhi in PFA al 4% durante la notte (ON) a 4 °C. I topi sono stati sacrificati secondo le linee guida della Dichiarazione ARVO per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e visiva e del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (CICUAL) della Facoltà di Scienze Chimiche, Università Nazionale di Córdoba (Res. HCD 1216/18). - Sotto il microscopio sezionante, rimuovere le cornee con le forbici tagliando lungo il limbus e sezionare l'intera retina. Scartare il segmento anteriore dell'occhio e quindi separare la retina dalla coroide RPE.
NOTA: Assicurarsi di rimuovere i detriti rimanenti e i vasi ialoidi dalla retina con una pinza. - Posizionare le retine in tubi da 200 μL. Quindi, bloccare e permeabilizzare le retine in 100 μL di soluzione salina tamponata con Tris (TBS) contenente il 5% di albumina sierica bovina (BSA) e lo 0,1% di Triton-X-100 durante 6 ore a 4 °C con una leggera agitazione nello shaker.
NOTA: questo passaggio può essere eseguito per 2 ore a RT. - Quindi, invertire il tubo per posizionare la retina nel cappuccio e rimuovere la soluzione di blocco con una pipetta.
- Aggiungere 100 μL della soluzione contenente 0,01 μg/μL di Isolectina GSA-IB4 (GSA-IB4). Avvolgere i tubi con un foglio di alluminio per proteggere i campioni dalla luce. Incubare le retine con la soluzione di lectina ON a 4 °C o per 2 ore a RT con una delicata agitazione nello shaker.
- Lavare la retina con 100 μL di TBS contenente lo 0,1% di Triton-X-100 per 20 minuti con una leggera agitazione nello shaker. Per un corretto lavaggio, posizionare la retina nel cappuccio del tubo invertendolo. Riportare il tubo nella sua posizione eretta e rimuovere il mezzo rimasto nel contenitore. Ripetere questo passaggio tre volte.
- Posizionare la retina in un vetrino e aggiungere una goccia di PBS. Sotto il microscopio di dissezione, eseguire quattro tagli ugualmente distanti dai bordi della retina verso il nervo ottico.
- Per aprire i petali della retina, utilizzare una pinza o piccoli pezzi di carta da filtro. Assicurarsi che il lato del fotorecettore sia rivolto verso il basso.
- Rimuovere il PBS rimanente della diapositiva con carta da filtro. Quindi, aggiungere un mezzo di montaggio (Poly (alcool vinilico) in glicerolo / Tris) e coverslip. Lasciare asciugare per 1 ora a RT.
- Conservare i vetrini a 4 °C al riparo dalla luce.
NOTA: le retine possono anche essere conservate in PBS a 4 °C fino alla visualizzazione al microscopio confocale.
3. Visualizzazione al microscopio confocale e acquisizione microfotografica
- Prima della visualizzazione, incubare le diapositive per 10 minuti a RT coperto dalla luce.
- Al microscopio confocale, posizionare il vetrino nella piastra a faccia in giù.
- Focalizzare il plesso superiore della vascolarizzazione retinica e selezionare un'area per avviare l'acquisizione dell'immagine.
- Impostare i parametri laser generali nel software: Lunghezza d'onda: 488 nm; Intensità laser; HV; Offset; Guadagnare.
NOTA: l'intensità del laser, il PMT, l'offset e il guadagno possono variare a seconda delle condizioni e dell'utilizzo della lampada. Le impostazioni ottimali forniscono un'immagine chiara dei vasi evitando la saturazione nella sensibilità del tubo fotomoltiplicatore per avere una relazione lineare con il segnale di fluorescenza. - Impostare altri parametri di acquisizione: Modalità; Dimensioni; Obiettivo, senza zoom; No Kalman; Dimensione del passo.
NOTA: per l'imaging dei campioni di controllo e sperimentali devono essere utilizzate condizioni di acquisizione identiche. - Imposta le coordinate sull'asse x e y: scansiona la retina a fuoco 2x. Se l'area mostra vasi, selezionarla facendo clic due volte sull'area per contrassegnarla per l'acquisizione successiva dell'immagine.
NOTA: Si consiglia vivamente di selezionare l'area retinica seguendo il plesso vascolare superiore poiché la fluorescenza dei vasi più grandi è più alta. - Spostati nella griglia in un quadrato vicino, focalizza la retina e seleziona l'area se corrisponde. Ripetere questo passaggio fino a quando l'area selezionata comprende l'intera retina.
- Selezionate un'area e impostate le coordinate nell'asse z per definire l'estensione dello spessore da scansionare. Per fare questo, visualizzare la retina a fuoco 2x; con il micrometro, vai nella parte superiore della retina e fai clic su Imposta in posizione Start. Quindi, spostati nella parte inferiore della retina e fai clic su Imposta in posizione finale.
- Ripetere il passaggio 3.8 in ogni area selezionata nella griglia.
NOTA: per verificare in profondità l'area scansionata, premere Vai nella posizione Iniziale. Se le navi sono ancora visualizzate, regola nuovamente la posizione spostando il micrometro, quindi fai clic su Imposta. Ripetete il processo nella posizione Fine. - Inizializzare la scansione automatica.
- Una volta terminato il processo di scansione, apri l'immagine.
- Seleziona il formato Serie per registrare l'immagine come Mosaico e salvarla con l'estensione preferita. Infine, l'immagine cucita verrà mostrata sullo schermo.
4. Elaborazione delle immagini
- Nel software ImageJ FIJI, vai alla barra dei menu e fai clic su File > Apri. Selezionare l'immagine da elaborare. Nella finestra Opzioni di importazione bioformati , selezionare Visualizza metadati OME-XML e fare clic su OK.
NOTA: le immagini con nome simile devono essere salvate in cartelle separate. - Nella finestra Metadati OME , cercare le informazioni sulla dimensione dei pixel, denominate PhysicalSizeX, PhysicalSizeY e PhysicalSizeZ. Copiare questi dati.
- Per la calibrazione dell'immagine, vai alla barra dei menu e seleziona Proprietà > immagine. Copiare le informazioni dell'immagine nel passaggio 4.2 e fare clic su OK. L'immagine si apre come una finestra con diverse foto, dove ognuna rappresenta le microfotografie acquisite su un asse z.
- Assegna una lut preferita all'immagine per consegnare un colore all'etichetta fluorescente. Per fare ciò, vai alla barra dei menu e fai clic sull'icona LUT .
- Per visualizzare tutte le pile in una singola immagine, vai alla barra dei menu e seleziona Immagine > Stack > progetto Z.
- Nella finestra Proiezione Z visualizzata, selezionare tutte le pile in cui vengono visualizzate le navi. In Tipo di proiezione, selezionate Intensità media (Average Intensity ) e fate clic su OK.
NOTA: il risultato della somma degli stack verrà visualizzato in una nuova immagine denominata AVG (nome immagine). - Regola la luminosità e il contrasto nell'immagine risultante per ridurre lo sfondo e mettere in evidenza i vasi. Vai alla barra dei menu e fai clic su Immagine> Regola> Luminosità / Contrasto. Nelle finestre B e C spostare le barre fino a quando non si osserva una migliore intensità. Fare clic su Applica e salvare le modifiche.
- Copiare i parametri selezionati per Luminosità/Contrasto; questi devono essere identici per tutte le immagini.
- Prima della quantificazione dell'immagine, definire i parametri che verranno misurati. Nella barra dei menu, vai ad Analizza > imposta misurazioni. Nelle procedure qui descritte, sarà necessario ottenere Area e Perimetro (questo è in definitiva necessario anche per misurare le distanze). Fare clic su OK.
- Scarica il plugin necessario per la quantificazione della densità del vaso17 e segui le istruzioni di installazione fornite dal plugin.
- Continuare con la quantificazione di uno specifico parametro vascolare.
5. Quantificazione delle aree avascolare
- Nella barra dei menu, scegliere lo strumento bacchetta. Seleziona l'area retinica che manca di vasi.
NOTA: è possibile selezionare aree più grandi o più piccole a seconda della tolleranza. Per regolare la tolleranza, fate clic due volte sull'icona dello strumento bacchetta. Modalità impiegata: Legacy. - Premere la lettera T sulla tastiera per registrare l'area selezionata in ROI Manager. Ripetere i passaggi 5.1 e 5.2 con tutte le aree avascolari della retina.
- Fare clic su Misura nel ROI manager per ottenere le informazioni sull'area avascolare. Il programma visualizzerà una nuova finestra con le informazioni richieste. Copiare i dati in un altro programma o salvare il file.
NOTA: In alcune immagini, si potrebbe preferire selezionare manualmente le aree avascolare. In questo caso, scegliete lo strumento Selezione poligono, disegnate brevi distanze attorno all'area avascolare e fate clic sull'immagine quando sta per iniziare una nuova distanza. Chiudete l'area selezionata facendo clic sul primo punto. - Ripetere i passaggi 5.1, 5.2 e 5.3 per misurare l'area totale della retina.
- Calcola l'area avascolare della retina come somma di tutte le aree avascolari misurate divise per l'area totale della retina.
6. Quantificazione delle aree neovascolari
- Nella barra dei menu scegliere lo strumento bacchetta.
- Ingrandisci l'immagine per visualizzare meglio i neovasi. Seleziona i neovasi uno per uno con lo strumento bacchetta.
NOTA: Regolare la tolleranza non superiore a 20 per garantire la selezione di un singolo neovaso. Questo livello di tolleranza deve rimanere costante durante tutte le quantificazioni dell'immagine. - Premere la lettera T sulla tastiera per registrare l'area selezionata in ROI Manager. Ripetere i passaggi 6.1 e 6.2 con tutte le aree neovascolari della retina.
- Fare clic su Misura nel ROI manager per ottenere i dati dell'area. Il programma visualizzerà una nuova finestra con le informazioni richieste. Copiare i dati in un altro programma o salvare il file.
- Ripetere i passaggi 6.1, 6.2 e 6.3 per quantificare l'area totale della retina.
- Calcola l'area neovascolare della retina come somma di tutte le aree dei neovasi misurate divise per l'area totale della retina.
7. Quantificazione del diametro del recipiente
- Nella barra dei menu, selezionate lo strumento linea retta.
- Ingrandisci l'immagine per visualizzare meglio la parete della nave. Eseguire tre linee trasversali alla nave principale prima del primo ramo. Questo deve essere fatto disegnando una linea dal confine di una parete della nave al contrario.
NOTA: La linea deve essere perfettamente perpendicolare al recipiente a parete per evitare errori di quantificazione. - Premere la lettera T sulla tastiera per registrare l'area selezionata in ROI Manager. Ripetere i passaggi 7.1 e 7.2 in tutti i recipienti che devono essere quantificati.
- Fare clic su Misura nel roi manager per ottenere i dati sulla distanza. Il programma visualizzerà una nuova finestra con le informazioni richieste. Copiare i dati in un altro programma o salvare il file.
8. Quantificazione della tortuosità della nave
- Nella barra dei menu, fare clic sull'icona Strumento linea diritta con il tasto destro del mouse e selezionare Linea segmentata o Linea a mano libera. Tracciare una linea all'interno del vaso dal nervo ottico fino alla prima ramificazione del vaso che segue la forma vascolare.
NOTA: La linea deve seguire la forma vascolare per evitare errori di quantificazione. - Premere la lettera T sulla tastiera per registrare l'area selezionata in ROI Manager.
- Nella barra dei menu, selezionate lo strumento linea retta. Disegna una linea dal nervo ottico fino alla prima ramificazione del vaso.
- Premere la lettera T sulla tastiera per registrare l'area selezionata in ROI Manager.
- Clicca su Misura nel ROI Manager per ottenere i dati sulle distanze. Il programma visualizzerà una nuova finestra con le informazioni richieste. Copiare i dati in un altro programma o salvare il file.
- Calcola l'indice di tortuosità come segue: distanza ottenuta con linea segmentata divisa per la distanza ottenuta con linea retta.
9. Quantificazione delle ramificazioni vascolari
- Con lo strumento ovale della barra dei menu, definire un'area applicata equamente a tutte le condizioni sperimentali. L'area selezionata deve essere un cerchio concentrico disegnato attorno al nervo ottico.
- Premere la lettera T sulla tastiera per registrare l'area selezionata in ROI Manager.
NOTA: in questo caso, si consiglia di salvare il ROI poiché la quantificazione è lenta e il ROI identico deve essere utilizzato in tutte le immagini. Per fare ciò, nel ROI Manager clicca su ALTRO > Salva. - Contare manualmente il numero di rami primari derivanti dalle navi principali all'interno dell'area di selezione.
- Ripetere i passaggi 9.2 e 9.3 nelle aree vicine, mantenendo i criteri nervo ottico-periferia.
10. Quantificazione della densità vascolare
- Trasforma l'immagine in modalità a 8 bit.
- Vai a Plugin nella barra dei menu, seleziona Analisi dei vasi > densità vascolare.
- Definite un'area con lo strumento quadrato della barra dei menu, in cui è necessario misurare la densità del recipiente. Fare clic su OK.
- Il programma visualizzerà una nuova finestra con le informazioni richieste. Copiare i dati in un altro programma o salvare il file.
- Ripeti i passaggi 10.2, 10.3 e 10.4 nelle aree vicine, mantenendo il ROI ma posizionandolo nove volte comprendendo la periferia e il centro dell'intera retina.
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Representative Results
Come descritto nella sezione protocollo, da un singolo test di colorazione fluorescente è possibile ottenere la morfologia vascolare e valutare quantitativamente diversi parametri di interesse. La ricerca di un'alterazione specifica dipenderà dal tipo di retinopatia studiata. In questo articolo, le aree avascolare e neovascolare, la tortuosità e la dilatazione sono state valutate in un modello murino di retinopatia proliferativa, mentre la ramificazione e la densità vascolare sono state analizzate in un modello murino MetS, che induce una retinopatia non proliferativa.
Nel primo esempio sperimentale, è stato utilizzato il modello murino di retinopatia indotta da ossigeno (OIR), che assomiglia alla retinopatia della prematurità e ad alcune caratteristiche dello stadio proliferativo della retinopatia diabetica. In questo modello, le cucciolate vengono mantenute con la madre che allatta in una camera iperossica dal giorno postnatale (P) 7 a P1218. Le iniezioni intravitreali sono state eseguite a P12 per determinare l'efficacia di un farmaco come antiangiogenico (condizione denominata trattamento). I topi sono stati sacrificati a P17, il punto temporale della massima formazione di neovasi19. I topi iniettati con il veicolo sono stati impiegati come controllo. Entrambi i campioni sono stati fissati e colorati con Isolectina GSA-IB4 insieme. Dopo l'acquisizione confocale, le immagini sono state analizzate con il software ImageJ FIJI come indicato sopra. Con il modulo Stitching integrato al microscopio confocale, l'intero supporto completo è stato osservato come un'immagine unica (Figura 1). A P17 è possibile osservare la vascolarizzazione ialoide, un sistema vascolare transitorio essenziale durante la vita intrauterina (Figura 1, frecce bianche)20.
Come conseguenza dell'eccessiva fornitura di ossigeno nella camera iperossica, i topi OIR arrestano lo sviluppo vascolare fisiologico e generano aree avascolari nella retina. Quindi, le aree avascolari sono definite come le zone che mancano di vasi sanguigni retinici (Figura 2). Dalle immagini acquisite, le aree avascolari possono essere quantificate come la somma delle regioni senza vasi divise per l'area totale della retina. Le aree con danni meccanici mostrano anche l'assenza di navi. Per identificare le aree danneggiate, analizzare l'integrità degli strati neuronali con la macchia di Hoechst.
Le aree avascolari della retina evitano l'apporto di ossigeno e, quindi, si imposta una forte risposta pro-angiogenica, inducendo la neovascolarizzazione16. I neovasi sono vasi di piccolo calibro che provengono da un vaso preesistente del plesso vascolare superiore. La loro struttura è disorganizzata, quindi i neovasi crescono come ciuffi verso la cavità vitrea21. Abbiamo calcolato l'area occupata dai ciuffi dei neovasi quantificando l'area neovascolare della retina divisa per l'area totale della retina (Figura 3). Poiché la forma e le dimensioni dei neovasi sono variabili, occasionalmente possono sembrare simili a detriti e artefatti. Per distinguere i neovasi, verificare che il ciuffo cresca da una nave matura.
La dilatazione vascolare e la tortuosità sono altre due alterazioni frequenti, che hanno effetti negativi sulla biologia vascolare, in quanto producono una circolazione sanguigna turbolenta. Per l'analisi della dilatazione, abbiamo misurato il diametro dei vasi principali a tre altezze prima del primo ramo22,23 (Figura 4). I ricercatori devono definire una distanza predeterminata per misurare il diametro del vaso al fine di ridurre la variabilità tra i risultati. Idealmente, il punto più lontano dal nervo ottico dovrebbe essere di circa 300 μm. Suggeriamo di eseguire l'analisi e successivamente di prendere una media di almeno sei topi per condizione.
Per quanto riguarda la tortuosità, misuriamo la distanza percorsa dai vasi principali seguendo la sua forma rispetto alla distanza diritta tra il nervo ottico e il primo punto di ramificazione24 (Figura 5). Come possiamo vedere nell'immagine, c'è eterogeneità nella sinuosità dei vasi principali. Per ottenere un risultato rappresentativo, devono essere quantificati non meno di sei topi per condizione.
Gli ultimi parametri, ramificazione vascolare e densità, sono stati analizzati nel modello MetS che presenta retinopatia non proliferativa. In MetS, sia i lipidi che i carboidrati sono associati a disfunzioni e morte dei periciti retinici e delle cellule endoteliali, portando alla formazione di capillari acellulari o a una diminuzione della ramificazione vascolare25. Nel nostro modello, i topi ApoE-KO sono stati alimentati con fruttosio aggiunto all'acqua potabile, ad una concentrazione del 10% p / v. Gli animali di controllo hanno appena ricevuto l'acqua del rubinetto. Dopo 4 mesi di dieta, i topi sono stati sacrificati e le retine elaborate come indicato prima. Per la misura della ramificazione vascolare, abbiamo definito l'area di quantificazione disegnando un cerchio concentrico, e poi abbiamo contato, uno per uno, i rami primari derivanti da un vaso centrale principale (Figura 6).
Dalle immagini acquisite, la densità vascolare è stata quantificata come l'area occupata dai vasi divisa per l'area del ROI (un quadrato di 0,015 mm2, vedi appiattimento in Figura 7), che è stata posizionata in punti diversi in ciascuna microfotografia, come è stato spiegato nella sezione protocollo. Evitare di quantificare le aree con danni meccanici (Figura 7, frecce bianche). Se ci sono più di due aree con punture, la retina deve essere scartata.
Figura 1: Colorazione vascolare di retine a pieno supporto marcata con Isolectina GSA-IB4: Immagini confocali rappresentative di retine di topi OIR P17 iniettate con veicolo o trattamento a P12. La colorazione fluorescente è stata eseguita su retine a montaggio intero con Isolectina GSA-IB4 Alexa 488 secondo il protocollo. Sono indicate le aree avascolari (AV) e le aree neovascolari (NV). Barra di scala: 500 μm. Le frecce bianche mostrano la vascolarizzazione ialoide rimanente. Le frecce gialle mostrano aree di scansione incomplete durante l'acquisizione di immagini confocali. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Quantificazione delle aree avascolare: (A) Immagini rappresentative di retine a monte intero a P17 che mostrano la colorazione vascolare GSA-IB4 nei topi OIR-veicolo e OIR-trattamento. Le aree con vaso-obliterazione sono indicate in giallo. Barra della scala: 500 μm. (B) L'area AV (%) è stata quantificata come il rapporto tra l'area avascolare centrale e l'intera area retinica. Il t-test a due code spaiato è stato utilizzato per il confronto statistico. Dati presentati come ± medi SEM. *** p < 0,001. Almeno sei animali sono stati impiegati per ogni condizione nel tempo di sopravvivenza esaminato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Quantificazione delle aree neovascolari: (A) Immagini rappresentative di retine a monte intero a P17 che mostrano la colorazione vascolare GSA-IB4 in topi OIR-veicolo e OIR-trattamento. Le aree con neovascolarizzazione sono indicate in bianco. Barra della scala: 500 μm. (B) L'area NV (%) è stata quantificata come il rapporto tra l'area occupata dai neovasi e l'intera area retinica. Il t-test a due code spaiato è stato utilizzato per il confronto statistico. Dati presentati come ± medi SEM. *** p < 0,001. Almeno sei animali sono stati impiegati per ogni condizione nel tempo di sopravvivenza esaminato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Quantificazione della dilatazione vascolare: (A) Immagini rappresentative di retine a monte intero a P17 che mostrano la colorazione vascolare GSA-IB4 in topi OIR-veicolo e OIR-trattamento. Pannelli di sinistra: ROI selezionati per la quantificazione. Pannelli di destra: zoom dei ROI, che mostra le linee rette eseguite in una nave principale per misurare il diametro della nave. Tre linee sono state tracciate trasversalmente alla nave e mediate. Barra della scala: 100 μm. (B) Il diametro del vaso (%) è stato quantificato come il diametro medio misurato nei principali vasi della retina. Il t-test a due code spaiato è stato utilizzato per il confronto statistico. Dati presentati come ± medi SEM. *p < 0,05. Almeno sei animali sono stati impiegati per ogni condizione nel tempo di sopravvivenza esaminato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Determinazione dell'indice di tortuosità: (A) Immagini rappresentative di retine a monte intero a P17 che mostrano la colorazione vascolare GSA-IB4 in topi con veicolo OIR e trattamento OIR. Pannelli di sinistra: ROI selezionati per la quantificazione. Pannelli centrali: zoom dei ROI, che mostra linee segmentate tracciate in un vaso principale dal nervo ottico al primo punto di ramificazione. Pannelli di destra: zoom dei ROI, che mostra linee rette tracciate in un vaso principale dal nervo ottico al primo punto di ramificazione. Barra della scala: 100 μm. (B) L'indice di tortuosità è stato ottenuto dividendo la distanza della linea segmentata alla distanza della linea retta. Il t-test a due code spaiato è stato utilizzato per il confronto statistico. Dati presentati come ± SEM. ns, non significativi. Almeno sei animali sono stati impiegati per ogni condizione nel tempo di sopravvivenza esaminato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Quantificazione della ramificazione vascolare: (A) Immagini rappresentative di retine a monte intero che mostrano la colorazione vascolare di Isolectina GSA-IB4 in topi alimentati con ApoE-KO e ApoE-KO + fruttosio. Le aree di quantificazione circolare sono state definite in giallo. Barra di scala: 100 μm, ingrandimento 100x. (B) Il numero di rami è stato quantificato come il numero di rami primari da un vaso principale, dal nervo ottico alla periferia. Il t-test a due code spaiato è stato utilizzato per il confronto statistico. Dati presentati come ± SEM. ns, non significativi. Almeno sei animali sono stati impiegati per ogni condizione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Quantificazione della densità vascolare: (A) Immagini rappresentative di retine intere che mostrano la colorazione vascolare di Isolectina GSA-IB4 in topi alimentati con ApoE-KO e ApoE-KO + fruttosio. Il quadrato di 0,015 mm2 di area di quantificazione è stato definito in giallo. Barra di scala: 100 μm, ingrandimento 100x. (B) La densità vascolare è stata quantificata come il rapporto tra area vascolare e area ROI totale, che è stata posizionata nove volte in punti diversi in ciascuna microfotografia. Le frecce bianche mostrano aree con danni meccanici. Il t-test a due code spaiato è stato utilizzato per il confronto statistico. Dati presentati come ± SEM. ns, non significativi. Almeno sei animali sono stati impiegati per ogni condizione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I modelli animali di retinopatie sono potenti strumenti per studiare lo sviluppo vascolare, il rimodellamento o l'angiogenesi patologica. Il successo di questi studi sul campo si basa sul facile accesso al tessuto che consente di eseguire un'ampia varietà di tecniche, fornendo dati da topi in vivo e post mortem26,27. Inoltre, è stata trovata una grande correlazione tra studi in vivo e analisi cliniche, fornendo una solida tracciabilità e affidabilità a questi modelli28. In questo articolo, presentiamo una descrizione semplice e robusta dei passaggi per caratterizzare la rete vascolare in modelli murini di malattie vascolari retiniche. In letteratura, i lettori troveranno altri possibili parametri da misurare e approcci paralleli per quantificare quelli selezionati qui. I protocolli compilati hanno molti vantaggi rispetto ad altri perché sono riproducibili e richiedono solo un software libero per eseguire l'analisi (Immagine J Fiji).
Inoltre, questi protocolli sono facili da eseguire da parte di studenti che non hanno una vasta conoscenza del programma e la maggior parte delle misurazioni non ha bisogno di plugin aggiuntivi (tranne che dalla densità vascolare).
L'estrazione del campione e la tecnica di colorazione a fluorescenza sono semplici e brevi29. È molto importante lavorare con retine fresche, anche se possono essere conservate a 4 °C in PBS con inibitori della crescita batterica. Poiché il tessuto è sottile e morbido, i vecchi campioni si rompono spesso durante l'incubazione o quando si apre il campione prima del montaggio. Inoltre, l'eccessiva fissazione con il 4% di PFA trasforma la retina eccessivamente rigida e fragile, ma ciò non influisce sulla colorazione delle lectine. La colorazione dell'isolectina GSA-IB4 consente di visualizzare l'intera rete vascolare ad ogni strato, compresi i neovasi e le cellule endoteliali proliferanti. Altri marcatori, come CD 31, richiedono l'incubazione del campione con anticorpi concentrati e hanno più background. D'altra parte, in angiografia, il colorante fluorescente tende a diffondersi fuori dai vasi, il che aumenta la variabilità nel calibro del vaso e la quantificazione della tortuosità. Uno svantaggio di Isolectin GSA-IB4 è che può anche etichettare le cellule microgliali30. Prestare attenzione quando si eseguono iniezioni intravitreali o altre procedure sperimentali che inducono un'eccessiva infiltrazione perché le cellule microgliali possono formare agglomerati.
L'acquisizione di immagini potrebbe essere eseguita con qualsiasi microscopio confocale. L'uso di una coppia di piastre motorizzate a un software che include il modulo Stitching fornirà una visualizzazione completa dell'intera retina montata in un'unica immagine. Quando si seleziona l'area retinica, assicurarsi che tutti gli estremi del campione siano inclusi, altrimenti la foto sarà incompleta (Figura 1, frecce gialle). Questo non è molto rilevante nel modello murino di OIR, ad esempio, perché le alterazioni vascolari sono vicine al nervo ottico. Mentre nel modello di ratto di OIR, questo errore può portare a una quantificazione imprecisa, poiché le aree avascolare e neovascolare sono accanto al limbus. Un'altra possibilità è quella di prendere singole microfotografie retiniche. L'utente può in seguito organizzarli come un puzzle con un software adeguato. Non è consigliabile utilizzare il microscopio a epifluorescenza, specialmente quando si analizza la ramificazione, perché i vasi germogliano in tutto lo spessore della retina e alcuni vasi non verranno rilevati in una pila di soli z.
Durante l'elaborazione delle immagini con ImageJ FIJI, si consiglia di non aggiornare il software fino a quando tutte le immagini non sono quantificate, al fine di mantenere condizioni identiche nel software. La calibrazione delle immagini (assegnazione della dimensione dei pixel in micron) è un passaggio critico in quanto questi protocolli implicano la quantificazione di distanze e aree. Una volta familiarizzato con il programma, l'utente può esplorare altri strumenti per selezionare l'area neovascolare e avascolare oltre allo strumento bacchetta. Lo strumento di selezione dei poligoni è particolarmente utile per misurare le aree avascolari che sono state tagliate in due parti nella fase di montaggio. Altri ricercatori hanno creato plugin specifici per automatizzare la selezione dei neovasi in base all'intensità di fluorescenza di queste strutture. Questi metodi sono più veloci e meno laboriosi, anche se si raccomanda di verificare che piccoli neovasi meno lucidi siano stati selezionati prima della quantificazione31. Le aree dei neovasi fluoresceranno più intensamente rispetto ai vasi normali circostanti. Lo strumento Bacchetta magica seleziona le aree di colore simile e la tolleranza determina la somiglianza di colore dei pixel selezionati. Se un neovaso è di intensità simile a quella dei vasi normali, la tolleranza può essere regolata verso il basso per aumentare la sensibilità alle sottili differenze di intensità. Sebbene la selezione dei neovasi in ogni campione venga eseguita con una soglia identica, alcuni neovasi sono caratterizzati da un'intensità di fluorescenza minore. In questo caso, sarà necessaria una tolleranza inferiore per una corretta selezione.
La tortuosità e la dilatazione sono misure della distanza. Uno studio completo dell'albero vascolare è utile per selezionare vasi di tipo identico (arterie o vene) e calibro. Misuriamo la dilatazione nei vasi a tre altezze come mostrato nella Figura 4. L'angolo della selezione diritta rispetto alla parete della nave è un altro punto rilevante da tenere in considerazione. Questo dovrebbe essere il più vicino possibile a 90 ° per evitare possibili errori. Quando si disegna la linea retta, gli utenti possono utilizzare lo strumento zoom per avvicinarsi alla nave di interesse.
La ramificazione vascolare può anche essere misurata in due o più aree di quantificazione di diverse altezze, se lo si desidera. In questo caso, i ricercatori dovrebbero conservare la regione della retina analizzata (lato centrale, medio o periferico del nervo ottico). Sebbene la ramificazione sia alterata in diversi modelli animali di retinopatia, le prime fasi della retinopatia associata alla MetS qui presentata non mostrano ancora tali cambiamenti15. Per studi approfonditi sui capillari retinici del plesso intermedio e profondo e sulla germinazione dei vasi, i metodi computazionali 3D forniscono dati preziosi di sottili variazioni nella morfologia vascolare e nella rete32. Infine, la densità vascolare è determinata dall'area occupata dalle navi rispetto all'area totale di un ROI selezionato. La misurazione di questo parametro richiede l'uso di un plugin e di una versione attualizzata di ImageJ FIJI, dove devono essere disponibili gli strumenti Auto Threshold e Geometry to Distance Map. Nonostante questi passaggi aggiuntivi, il plugin è facile da usare, riproducibile e affidabile. Per la misurazione della densità vascolare è stato scelto un ROI di 0,015 mm2 , al fine di effettuare dieci misurazioni dell'intensità della fluorescenza in diverse regioni della retina. Questa dimensione ci ha permesso di coprire l'intera foto, ottenendo così un valore medio più rappresentativo e la sua deviazione in ogni retina.
Nel complesso, nonostante il fatto che queste raccolte di metodi non siano automatizzate e richiedano la selezione manuale dei parametri, sono in grado di fornire dati quantitativi e rigorosi delle retine. La principale limitazione relativa ai protocolli sopra presentati per le misurazioni vascolari si basa sulla variabilità inter-esaminatore quando si analizza la stessa immagine. Per ridurre al minimo questo pregiudizio, è importante pre-stabilire l'impostazione generale come confini della parete del vaso, l'identificazione delle aree avascolari e dei neovasori e anche i criteri di esclusione per i tessuti danneggiati. Per quanto riguarda la tortuosità della nave, è necessario un punto di partenza concordato accanto al nervo ottico. Per gli utenti principianti, si consiglia vivamente di fare la media dei dati raccolti da due o più esaminatori. Negli utenti addestrati, non sono state riscontrate differenze significative nella misurazione di vari parametri, purché l'accordo sui criteri di quantificazione rimanga costante. Allo stesso modo, è possibile aggiungere ulteriori parametri ai protocolli elencati, a seconda delle alterazioni vascolari rilevate nella retinopatia. Nelle retinopatie non proliferative, la misurazione del numero capillare acellulare, dei periciti migratori, del rapporto tra numero di periciti / cellule endoteliali e permeabilità della barriera retinica ematica sono i primi parametri alterati nella vascolarizzazione retinica33,34,35. Per i modelli cronici e le retinopatie lievi, è consigliabile includere queste misurazioni aggiuntive. Un numero importante di parametri misurati fornirà un panorama più fedele degli eventi che si svolgono nella vascolarizzazione. In sintesi, in questo articolo, abbiamo mostrato tecniche classiche, consolidate e riproducibili per quantificare alcuni dei parametri più rilevanti presi in considerazione nella pratica clinica.
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Disclosures
Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di relazioni commerciali o finanziarie che potrebbero essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.
Acknowledgments
Ringraziamo Carlos Mas, María Pilar Crespo e Cecilia Sampedro di CEMINCO (Centro de Micro y Nanoscopía Córdoba, CONICET-UNC, Córdoba, Argentina) per l'assistenza nella microscopia confocale, a Soledad Miró e Victoria Blanco per la cura dedicata degli animali e Laura Gatica per l'assistenza istologica. Ringraziamo anche Victor Diaz (Pro-Segretario della Comunicazione Istituzionale di FCQ) per la produzione e l'edizione video e Paul Hobson per la sua lettura critica e revisione linguistica del manoscritto.
Questo articolo è stato finanziato da sovvenzioni di Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT), Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (all to M.C.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminuim foil | |||
| Bovine Serum Albumin | Merck | A4503 | quality |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | C3306 | |
| Hydrochloric acid | Biopack | 9632.08 | |
| Confocal Microscope FV1200 | Olympus | FV1200 | with motorized plate |
| Covers | Paul Marienfeld GmnH & Co. | 111520 | |
| Dissecting Microscope | NIKON | SMZ645 | |
| Disodium-hydrogen-phosphate dihydrate | Merck | 119753 | |
| 200 µL tube | Merck | Z316121 | |
| Filter paper | Merck | WHA5201090 | |
| Incubator shaker GyroMini | LabNet International | S0500 | |
| Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | I21411 | |
| Poly(vinyl alcohol) (Mowiol 4-88) | Merck | 475904 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 158127 | |
| pHmeter | SANXIN | PHS-3D-03 | |
| Potassium chloride | Merck | P9541 | |
| Potassium-dihydrogen phosphate | Merck | 1,04,873 | |
| Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Sodium chloride | Merck | S3014 | |
| Sodium hydroxide | Merck | S5881 | |
| Tris | Merck | GE17-1321-01 | |
| Triton X-100 | Merck | X100-1GA | |
| Vessel Analysis Fiji software | Mai Elfarnawany | https://imagej.net/Vessel_Analysis |
References
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