Summary
이 문서에서는 전체 마운트 망막 제제및 증식 및 비증식 망막병에서 자주 변경되는 혈관 매개 변수의 정량적 측정에 필요한 프로토콜에 대해 잘 확립되고 재현 가능한 렉틴 얼룩 분석법에 대해 설명합니다.
Abstract
망막병증은 눈의 신경 감각 조직에 영향을 미치는 질병의 이질적인 그룹입니다. 그(것)들은 신경 변성, 글리오오스 및 혈관 기능 및 구조물에 있는 진보적인 변경에 의해 특징입니다. 망막증의 발병은 시각적 지각에 있는 미묘한 교란에 있는 특징이더라도, 혈관 신경병의 수정은 임상의에 의해 검출된 첫번째 표시입니다. 신생 혈관화의 부재 또는 존재는 망막병증이 비 증식 (NPDR) 또는 증식 (PDR)으로 분류되는지 여부를 결정합니다. 이러한 의미에서, 몇몇 동물 모형은 각 단계의 특정 혈관 특징을 모방하기 위하여 망막에서 일어나는 내피성 변경, 신경 죽음 및 그밖 사건에 관련되었던 근본적인 기계장치를 결정하기 위하여 시도했습니다. 본 기사에서는 산후일(P)17시에 성인 및 조기 출생 마우스의 망막 혈관 파라미터 측정에 필요한 절차에 대한 완전한 설명을 제공할 것입니다. 우리는 나중에 현미경 시각화를위한 전체 마운트에 이솔록틴 GSA-IB4와 망막 혈관 염색을 수행하는 프로토콜을 자세히 설명합니다. Image J Fiji 소프트웨어로 이미지 처리를 위한 주요 단계도 제공되므로 독자는 혈관 밀도, 직경 및 불법성, 혈관 분기뿐만 아니라 혈관 및 외반 영역을 측정할 수 있습니다. 이러한 도구는 비증식 및 증식 성 망막병모두에서 혈관 변화를 평가하고 정량화하는 데 매우 유용합니다.
Introduction
눈은 두 개의 arterio 정맥 시스템에 의해 양육된다: choroidal 혈관 분과, 망막 색소 상피 및 광수용체를 관성 외부 혈관 네트워크; 및 신경망막 혈관분과 는 신경절 세포 층과 망막1의 내부 핵 층을 관개합니다. 망막 혈관은 망막 세포에 영양분과 산소를 전달하고 적절한 시각적 신호 전달을 보장하기 위해 폐기물을 수확하는 혈관의 조직된 네트워크입니다. 이 혈관분피는 자율적 인 내적 눈부기의 부족, 본질적인 망막 메커니즘에 의한 혈관 톤의 조절 및 복잡한 망막 혈액 장벽2의 소유를 포함하여 몇 가지 뚜렷한 특징을 가지고 있습니다. 따라서 망막 혈관증은 발달 중 혈관 발생뿐만 아니라 이러한 혈관이 질병에서 겪는 변화 및 병리학 적 혈관 신생을 광범위하게 연구한 많은 연구자의 초점이었습니다3. 망막병증에서 관찰되는 가장 흔한 혈관 변화는 혈관 팽창, 난혈관화, 혈관 절단 손실 및 망막 주요 혈관의 변형으로 인해 더 지그게4,5,6입니다. 설명된 변경의 하나 이상은 임상의에 의해 검출될 초기 표시입니다. 혈관 시각화는 신속하고 비침습적이며 저렴한 스크리닝 방법을 제공합니다7. 혈관 나무에서 관찰 된 변경의 광범위한 연구는 망막증이 비 증식 또는 증식 및 추가 치료인지 여부를 결정합니다. 비 증식 망막병증은 비정상적인 혈관 형태, 감소 된 혈관 밀도, 세포 세포 모세 혈관, 백혈구 죽음, 황반 부종, 다른 사람의 사이에서 자신을 나타낼 수 있습니다. 또한, 증식성 망막병증은 또한 혈관 투과성, 세포외 리모델링 및 혈관 터프트의 형성을 쉽게 분해하거나 망막 분리를 유도하는 유리체 구멍을 향한 형성을 개발한다8.
일단 검출되면, 망막병증은 혈관 변경을 통해 감시될 수 있습니다9,10. 병리학의 진행은 질병의 단계를 명확하게 정의하는 혈관의 구조적 변화를 통해 따를 수 있습니다11. 이 모형에 있는 혈관 변경의 정량화는 혈관 변경 및 신경 죽음을 상관연관하고 질병의 다른 단계에서 환자를 위한 약리학 치료를 시험하는 것을 허용했습니다.
위의 진술에 비추어 볼 때, 우리는 혈관 변경의 인식과 정량화가 망막 병증 연구에서 근본적이라고 생각한다. 이 작품에서는 다양한 혈관 매개 변수를 측정하는 방법을 보여줍니다. 이를 위해 두 가지 동물 모델을 사용할 것입니다. 그 중 하나는 미숙아의 망막병증과 증식 당뇨병 성 망막증의 일부 측면을 모방 산소 유발 망막병마우스 model12입니다13,14. 이 모델에서는 혈관 영역, 난바혈관 지역 및 주요 선박의 팽창 및 불법성을 측정합니다. 우리의 실험실에서, 신진 대사 증후군 (MetS) 마우스 모델이 개발되었습니다, 이는 비 증식 성 망막증을 유도15. 여기에서 혈관 밀도와 분기를 평가합니다.
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Protocol
C57BL/6J 마우스는 안과 및 시력 연구에서 동물의 사용을 위한 ARVO 성명서의 지침에 따라 처리되었다. 실험 절차는 코르도바 국립 화학 과학 학부의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (CICUAL)에 의해 설계 및 승인되었습니다 (Res. HCD 1216/18).
1. 완충 솔루션 및 시약 준비
- 1x 인산염 완충식식염(PBS): 염화나트륨 8g(NaCl), 염화칼륨 0.2g(KCl), 디나트륨-수소포 14.4g 추가 증류수(Na2HPO4 2H2O) 및 0.24g의 칼륨-이수소 인산염(KH2PO4)에서 증류수 800mL에. 소금이 완전히 용해될 때까지 용액을 저어줍니다. 염화물산(HCl)으로 pH를 7.4로 조정하고 부피를 추가 증류수로 1L로 조정합니다. 용액을 걸게 하고 4°C에 보관하십시오.
- 4% 파라포름알데히드(PFA): 40g의 고체 PFA를 800mL에 추가하여 갓 준비된 PBS를 준비합니다. 60°C의 일정한 온도에서 가열 판에 용액을 저어줍니다. PFA가 완전히 용해될 때까지 수산화 나트륨(NaOH)을 추가하여 pH가 7.2-7.4 범위에서 유지되는지 확인합니다. PBS와 함께 1,000mL까지 볼륨을 위로 올려 혼합합니다. 가열 판을 끄고 온도가 35 °C 미만일 때 용액을 필터링하십시오. 최대 3일 동안 용액을 4°C로 저장합니다.
주의: PFA는 삼키거나 흡입한 경우 유해하며 아마도 돌연변이 화합물일 것입니다. 전체 공정 중에 장갑과 얼굴 마스크를 사용하고 안전 실에서 작업하십시오. - 1x Tris 버퍼식 식염수(TBS): 6.1g의 트리스와 800mL의 증류수에 NaCl 9g을 추가합니다. 소금이 완전히 용해될 때까지 용액을 저어줍니다. HCl을 사용하여 pH를 7.4로 조정하고 추가 증류수로 부피를 1L로 조정합니다. 용액을 걸게 하고 4°C에 보관하십시오.
- TBS- 0.1% 트리톤 X-100의 준비: TS의 TritonX-100 ~ 100mL의 0.1 mL을 추가합니다.
참고 : 트리톤은 매우 조밀 한 세제이기 때문에 팁의 단자를 약간 잘라 더 나은 파이펫팅을하십시오. - TBS-5%-소양 세럼 알부민(BSA) -0.1% 트리톤-X-100: BSA 의 무게 5g과 TBS-0.1% 트리톤 X-100 용액을 100mL의 최종 부피까지 추가한다. 부드럽게 저어줍니다. 알리쿼트와 -20°C에서 최대 2개월 간 보관하십시오.
- 이솔록신 GSA-IB4 알렉사 플루오-488 컨쥬게이트(이솔렉틴 GSA-IB4): 체중 36.75 mg의 염화칼슘 이수제(CaCl2·2H2O)를 추가하여 500mL의 갓 준비된 PBS에 추가합니다. 저어주세요. 파이펫 500 μL 의 CaCl2/PBS용액을 함유하고 있으며, 이를 500 μg의 림프성 이솔렉틴 GSA-IB4 분말을 함유한 바이알에 첨가한다. 부드럽게 섞고 0.5mL 튜브에 용액을 알리쿼트합니다. 빛으로부터 보호 -20 °C에 저장합니다.
- 폴리(비닐 알코올) 글리세롤/트리스: 폴리(비닐 알코올)의 무게 2.4g, 글리세롤 6g을 넣고 부드럽게 저어줍니다. 그런 다음 6mL의 물을 추가하고 실온에서 몇 시간 동안 계속 저어줍니다. 12mL의 사전 따뜻하게 된 0.2 M Tris 용액 (pH : 8.5)을 추가하고 10 분 동안 50 °C의 일정한 온도에서 열을 추가하고 가끔 섞습니다. 마지막으로, 원심 분리는 설명을 위해 15 분 동안 5,000 x g 의 솔루션을 원심 분리합니다.
참고 : 실온에서 용액을 식히고 알리 쿼트하고 -20 ° C에 보관하십시오.
2. 형광 렉틴 염색
- 이산화탄소(CO2) 흡입에 의한 마우스 희생시면 가위로 눈을 방출한다16. 실온(RT)에서 1시간 동안 갓 준비된 4% PFA로 에큐클레아드 눈을 고정합니다.
참고: 4°C에서 하룻밤 사이에 4%의 PFA(ON)로 눈을 배양하여 고정을 수행할 수도 있다. 마우스는 안과 및 시력 연구에서 동물의 사용에 대한 ARVO 성명서의 지침과 화학 과학 학부의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (CICUAL)의 지침에 따라 희생되었다, 코르도바 국립 대학 (Res. HCD 1216/18). - 해부 현미경에서, 림부를 따라 절단하여 가위로 각막을 제거하고 전체 망막을 해부. 눈의 전방 세그먼트를 버리고 망막을 RPE-Choroid에서 분리합니다.
참고: 남은 파편과 히알로이드 용기는 집게로 망막에서 제거해야 합니다. - 망막을 200 μL 튜브에 놓습니다. 이어서, 5% 소세럼 알부민(BSA)을 함유한 트리스 버퍼식 식염수(TBS) 용액의 100μL에서 망막을 차단및 투과화하여 쉐이커에 부드러운 동요를 가미한 4°C에서 6시간 동안 트리톤-X-100을 함유한다.
참고: 이 단계는 RT에서 2시간 동안 수행할 수 있습니다. - 그런 다음 튜브를 뒤집어 망막을 캡에 넣고 파이펫으로 차단 용액을 제거합니다.
- 이솔렉틴 GSA-IB4(GSA-IB4)의 0.01 μg/μL을 포함하는 용액의 100 μL을 추가합니다. 알루미늄 호일로 튜브를 감싸서 샘플이 빛으로부터 보호합니다. 레티나를 4°C에서 또는 RT에서 2시간 동안 레티닌을 셰이커에 부드럽게 교반합니다.
- 0.1% 트리톤-X-100을 함유한 100μL의 TS로 망막을 20분 동안 세척하여 셰이커에 부드럽게 교반합니다. 적절한 세척을 위해 망막을 튜브 의 뚜껑에 뒤집어 놓습니다. 튜브를 서 있는 위치로 되돌리고 용기에 남아 있는 매체를 제거합니다. 이 단계를 세 번 반복합니다.
- 망막을 슬라이드에 넣고 PBS 한 방울을 추가합니다. 해부 현미경에서, 시신경을 향해 망막의 가장자리에서 4 개의 동등하게 먼 상처를 수행.
- 망막의 꽃잎을 펼치려면 집게 또는 작은 필터 용지를 사용하십시오. 광수용체 측이 아래로 향하고 있는지 확인합니다.
- 필터 용지로 슬라이드의 나머지 PBS를 제거합니다. 그런 다음 글리세롤/트리에 마운팅 매체(폴리(폴리(폴리 알코올)를 추가하고 커버슬립을 넣습니다. RT에서 1 시간 동안 건조시키십시오.
- 빛으로부터 보호된 4°C의 슬라이드를 저장합니다.
참고: 망막은 공초점 현미경 시각화까지 4°C에서 PBS에 저장할 수도 있습니다.
3. 공초점 현미경 시각화 및 마이크로 사진 획득
- 시각화하기 전에 빛에서 덮인 RT에서 슬라이드를 10분 동안 배양합니다.
- 공초점 현미경에서 슬라이드를 아래로 향하게 놓습니다.
- 망막 혈관의 우수한 신경총에 초점을 맞추고 이미지 수집을 시작하는 영역을 선택합니다.
- 소프트웨어에서 일반 레이저 매개 변수 설정 : 파장 : 488 nm; 레이저 강도; HV; 오프셋; 이득.
참고: 레이저 강도, PMT, 오프셋 및 게인은 램프의 조건 및 사용에 따라 달라질 수 있습니다. 최적의 설정은 광증 관의 감도에서 포화를 피하는 선박의 선명한 이미지를 제공하여 형광 신호와 선형적인 관계를 갖습니다. - 다른 획득 매개 변수 설정: 모드; 크기; 확대/축소 없이 목표; 칼만 없음; 단계 크기.
참고: 동일한 획득 조건은 제어 및 실험 샘플을 이미징하는 데 사용해야 합니다. - 좌표를 x 및 y 축으로 설정: 망막을 초점 2x로 스캔합니다. 영역이 선박을 표시하는 경우 나중에 이미지 수집을 위해 표시하려면 영역의 두 배를 클릭하여 선택합니다.
참고: 더 큰 혈관의 형광이 높기 때문에 우수한 혈관 신경총에 따라 망막 영역을 선택하는 것이 좋습니다. - 그리드에서 이웃 사각형으로 이동하여 망막에 초점을 맞추고 해당되는 경우 영역을 선택합니다. 선택한 영역이 전체 망막을 구성할 때까지 이 단계를 반복합니다.
- 한 영역을 선택하고 좌표를 z 축으로 설정하여 스캔할 두께 범위를 정의합니다. 이렇게하려면, 초점 2x에 망막을 시각화; 마이크로미터를 사용하여 망막 의 상단으로 이동하여 시작 위치에서 설정을 클릭합니다. 그런 다음 망막 의 바닥으로 이동하여 끝 위치에서 집합 을 클릭합니다.
- 그리드에서 선택한 모든 영역에서 3.8 단계를 반복합니다.
참고: 스캔한 영역을 심층으로 확인하려면 시작 위치에서 이동 을 누릅니다. 선박이 여전히 시각화된 경우 마이크로미터를 이동하여 위치를 재조정한 다음 세트를 클릭합니다. 끝 위치에서 프로세스를 반복합니다. - 자동 스캐닝을 초기화합니다.
- 스캔 프로세스가 완료되면 이미지를 엽니다.
- 시리즈 형식을 선택하여 이미지를 모자이크로 기록하고 기본 확장으로 저장합니다. 마지막으로 스티치 된 이미지가 화면에 표시됩니다.
4. 이미지 처리
- ImageJ FIJI 소프트웨어에서 메뉴 모음 으로 이동하여 파일 > 열기를 클릭합니다. 처리할 이미지를 선택합니다. 바이오 포맷 가져오기 옵션 창에서 디스플레이 OME-XML 메타데이터를 선택하고 확인을 클릭 합니다.
참고: 비슷한 이름의 이미지를 별도의 폴더에 저장해야 합니다. - OME 메타데이터 창에서 물리적 SizeX, PhysicalSizeY 및 PhysicalSizeZ라는 픽셀 크기 정보를 검색합니다. 이 데이터를 복사합니다.
- 이미지 보정을 위해 메뉴 모음 으로 이동하여 이미지 > 속성을 선택합니다. 4.2 단계에서 이미지 정보를 복사하고 확인을 클릭 합니다. 이미지는 여러 장의 사진이 있는 창으로 열리며, 각 사진은 z 축에서 획득한 마이크로사진을 나타냅니다.
- 형광 레이블에 색상을 위탁하기 위해 이미지에 선호하는 루트를 할당합니다. 이렇게 하려면 메뉴 모음 으로 이동하여 LUT 아이콘을 클릭합니다.
- 단일 이미지의 모든 스택을 시각화하려면 메뉴 표시줄 로 이동하여 Z 프로젝트 > 이미지 > 스택을 선택합니다.
- 표시된 Z 프로젝션 창에서 용기가 시각화되는 모든 스택을 선택합니다. 프로젝션 유형에서 평균 강도를 선택하고 확인을 클릭 합니다.
참고: 스택 합계의 결과는 AVG(이미지 이름)라는 새 이미지에 표시됩니다. - 결과 이미지의 밝기와 대비를 조정하여 배경을 줄이고 혈관을 강조 표시합니다. 메뉴 표시줄 로 이동하여 이미지를 클릭 > 밝기/대비> 조정합니다. B 및 C 창에서 더 나은 강도가 관찰될 때까지 막대를 이동합니다. 적용 을 클릭하고 변경 내용을 저장합니다.
- 밝기/대비에 대해 선택한 매개 변수를 복사합니다. 모든 이미지에 대해 동일해야 합니다.
- 이미지 정량화 전에 측정될 매개 변수를 정의합니다. 메뉴 표시줄에서 측정 > 분석합니다. 여기에 설명된 절차에서는 영역 및 둘레를 얻어야 합니다(궁극적으로 거리를 측정하는 데도 필요합니다). 확인을 클릭 합니다.
- 선박 밀도 정량화17에 필요한 플러그인을 다운로드하고 플러그인에서 제공하는 설치 지침을 따르십시오.
- 특정 혈관 매개 변수의 정량화를 계속합니다.
5. 혈관 영역의 정량화
- 메뉴 모음에서 지팡이 도구를 선택합니다. 혈관이 부족한 망막 영역을 선택합니다.
참고: 허용 오차에 따라 더 크거나 작은 영역을 선택할 수 있습니다. 허용 오차를 조정하려면 지팡이 도구 아이콘을 두 번 클릭합니다. 사용 모드: 레거시. - 키보드의 T 문자를 눌러 ROI 관리자에서 선택한 영역을 기록합니다. 망막의 모든 변반 부위와 함께 5.1 및 5.2 단계를 반복합니다.
- ROI 관리자의 측정 값을 클릭하여 변위 영역 정보를 얻습니다. 프로그램에 필요한 정보가 있는 새 창이 표시됩니다. 다른 프로그램에서 데이터를 복사하거나 파일을 저장합니다.
참고: 일부 이미지에서는 변속 영역을 수동으로 선택하는 것을 선호할 수 있습니다. 이 경우 다각형 선택 도구를 선택하고, 바변 영역 주위의 짧은 거리를 그리며, 새 거리가 시작될 때 이미지를 클릭합니다. 첫 번째 점을 클릭하여 선택한 영역을 닫습니다. - 5.1, 5.2 및 5.3 단계를 반복하여 망막의 총 면적을 측정합니다.
- 망막의 총 면적으로 나눈 모든 변안 영역의 합으로 망막의 변반 부위를 계산한다.
6. 중혈관 지역의 정량화
- 메뉴 모음에서 지팡이 도구를 선택합니다.
- 이미지를 확대하여 네오카를 더 잘 시각화합니다. 지팡이 도구를 사용하여 네오카를 하나씩 선택합니다.
참고: 공차성을 20이하로 조정하여 단일 신선박의 선택을 보장합니다. 이 허용 오차 수준은 모든 이미지 정량화 중에 일정하게 유지되어야 합니다. - 키보드의 T 문자를 눌러 ROI 관리자에서 선택한 영역을 기록합니다. 망막의 모든 신생 혈관 부위와 함께 6.1 및 6.2 단계를 반복하십시오.
- ROI 관리자의 측정값을 클릭하여 영역 데이터를 가져옵니다. 프로그램에 필요한 정보가 있는 새 창이 표시됩니다. 다른 프로그램에서 데이터를 복사하거나 파일을 저장합니다.
- 6.1, 6.2 및 6.3단계를 반복하여 망막의 총 면적을 정량화한다.
- 망막의 전체 영역으로 나누어 측정된 모든 신혈관 영역의 합으로 망막의 신생 영역을 계산합니다.
7. 선박 직경의 정량화
- 메뉴 표시줄에서 직선 도구를 선택합니다.
- 이미지를 확대하여 용기 벽을 더 잘 시각화합니다. 첫 번째 분기 전에 주 선박에 세 개의 횡단 선을 수행합니다. 이는 선박의 한 벽의 경계에서 반대로 선을 그려서 수행해야 합니다.
참고: 정량화 오류를 피하기 위해 선은 벽 용기에 완벽하게 수직이어야 합니다. - 키보드의 T 문자를 눌러 ROI 관리자에서 선택한 영역을 기록합니다. 정량화해야 하는 모든 선박에서 7.1 및 7.2 단계를 반복합니다.
- 거리 데이터를 얻으려면 ROI 관리자의 측정값을 클릭합니다. 프로그램에 필요한 정보가 있는 새 창이 표시됩니다. 다른 프로그램에서 데이터를 복사하거나 파일을 저장합니다.
8. 선박 의 불법화
- 메뉴 표시줄에서 마우스의 오른쪽 버튼이 있는 직선 도구 아이콘을 클릭하고 분할된 선 또는 프리핸드 라인을 선택합니다. 혈관 모양다음첫 용기파충까지 시신경에서 용기 내부에 선을 그립니다.
참고: 정량화 오류를 방지하기 위해 선은 혈관 모양을 따라야 합니다. - 키보드의 T 문자를 눌러 ROI 관리자에서 선택한 영역을 기록합니다.
- 메뉴 표시줄에서 직선 도구를 선택합니다. 시신경에서 첫 번째 용기파급효과까지 선을 그립니다.
- 키보드의 T 문자를 눌러 ROI 관리자에서 선택한 영역을 기록합니다.
- ROI 관리자의 측정 값을 클릭하여 거리 데이터를 얻습니다. 프로그램에 필요한 정보가 있는 새 창이 표시됩니다. 다른 프로그램에서 데이터를 복사하거나 파일을 저장합니다.
- 다음과 같이 비틀기 인덱스를 계산합니다: 직선으로 얻은 거리로 분할된 선으로 얻은 거리.
9. 혈관 분지의 정량화
- 메뉴 모음의 타원형 도구를 사용하여 모든 실험 조건에 동일하게 적용된 영역을 정의합니다. 선택한 영역은 시신경 주위에 그려진 동심 원이어야 합니다.
- 키보드의 T 문자를 눌러 ROI 관리자에서 선택한 영역을 기록합니다.
참고: 이 경우 정량화가 느리고 동일한 ROI를 모든 이미지에 사용해야 하므로 ROI를 저장하는 것이 좋습니다. 이렇게 하려면 ROI 관리자에서 더 많은 > 저장을 클릭합니다. - 수동으로 선택 영역 내부의 주요 선박에서 발생하는 기본 분기 수를 계산합니다.
- 시신경 주변 기준을 유지하면서 이웃 지역에서 9.2 및 9.3 단계를 반복합니다.
10. 혈관 밀도의 정량화
- 이미지를 8비트 모드로 변환합니다.
- 메뉴 표시줄의 플러그인으로 이동하여 혈관 밀도> 선박 분석을 선택합니다.
- 선박 밀도를 측정해야 하는 Menu Bar의 사각형 도구를 사용하여 영역을 정의합니다. 확인을 클릭합니다.
- 프로그램에 필요한 정보가 있는 새 창이 표시됩니다. 다른 프로그램에서 데이터를 복사하거나 파일을 저장합니다.
- 주변 지역에서 10.2, 10.3 및 10.4 단계를 반복하여 ROI를 유지하지만 전체 망막의 주변과 중심을 포괄하는 9 번 배치합니다.
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Representative Results
프로토콜 섹션에 설명된 바와 같이, 단일 형광 염색 분석에서 혈관 형태를 얻고 여러 파라미터의 이자파라미터를 정량적으로 평가할 수 있다. 특정 변경의 검색은 연구 된 망막병증의 유형에 따라 달라집니다. 본 기사에서는 혈관 및 중혈관 부위, 대망막 및 팽창이 증식 망막증의 마우스 모델에서 평가된 반면, 혈관 분진 및 밀도는 비증식 망막증을 유도하는 MetS 마우스 모델에서 분석되었다.
첫 번째 실험 예에서, 산소 유도 망막병증 (OIR) 마우스 모델은, 미숙아의 망막병증과 당뇨병 망막증의 증식 단계의 일부 특징을 닮은 채택되었다. 이 모델에서는 산후일(P)7부터 P1218까지 과옥한 방에서 간호어머니와 함께 쓰레기를 유지한다. 인트라비트 주사는 항 혈관 신생 (치료로 명명 된 조건)으로 약물의 효과를 결정하기 위해 P12에서 수행되었다. 마우스는 P17, 최대 신혈관 형성의 시점이다19에서 희생하였다. 차량에 주입된 마우스는 제어로 사용되었습니다. 두 샘플 모두 이솔렉틴 GSA-IB4로 고정되고 염색되었습니다. 공초점 획득 후, 이미지는 위의 표시된 대로 ImageJ FIJI 소프트웨어로 분석되었다. 공초점 현미경에 통합된 스티치 모듈을 통해 전체 탈것은 고유한 이미지로 관찰되었습니다(그림 1). P17에서는 자궁 내 수명 중에 필수적인 과도 혈관 시스템인 히알로이드 혈관을 관찰할 수 있다(도 1, 흰색 화살표)20.
아옥시성 챔버에서 과도한 산소 공급의 결과로, OIR 마우스는 생리 혈관 발달을 체포하고 망막에 있는 혈관 영역을 생성합니다. 이어서, 변반 부위는 망막 혈관이 결여된 영역으로 정의된다(도 2). 획득된 이미지로부터, 혈관이 없는 영역의 합으로 혈관을 정량화할 수 있다. 기계적 손상이 있는 영역도 선박의 부재를 보여줍니다. 손상된 부위를 식별하려면 Hoechst 얼룩으로 신경 층의 무결성을 분석하십시오.
망막의 혈관 영역은 산소 전달을 피하고, 따라서, 강한 친 혈관 신생 반응이 설정되어 신생 혈관화를 유도합니다16. 네오선박은 우수한 혈관 신경발의 기존 용기에서 유래하는 작은 구경 혈관입니다. 그들의 구조는 무질서, 따라서, 신혈관은 유리충을 향해 터프로 성장21. 망막의 전체 면적으로 나눈 망막의 중혈관 면적을 정량화하여 신혈관의 터프트가 점유하는 영역을 계산하였다(도 3). 네오선박의 모양과 크기가 가변적이기 때문에 때때로 파편과 유물과 비슷하게 보일 수 있습니다. 네오선박을 구별하려면, 터프트가 성숙한 용기에서 자라는지 확인한다.
혈관 팽창과 불법성은 난류 혈액 순환을 생성하기 때문에 혈관 생물학에 부정적인 영향을 미치는 다른 두 가지 빈번한 변화입니다. 팽창의 분석을 위해, 우리는 제 1 분기 22,23 (도 4)전에 3 높이에서 주요 혈관 직경을 측정했다. 연구원은 결과 중 가변성을 감소시키기 위하여 선박 직경을 측정하기 위하여 미리 정해진 거리를 정의해야 합니다. 이상적으로, 시신경에서 가장 먼 지점은 약 300 μm이어야한다. 우리는 분석을 수행하고 나중에 조건 당 적어도 6 마우스의 평균을 하는 것이 좋습니다.
고문에 관해서는, 시신경과 제1 분기 점24 사이의 직선 거리와 관련하여 형상에 따라 주요 선박에 의해 덮여 있는 거리를 측정합니다(그림 5). 우리가 이미지에서 볼 수 있듯이, 주요 선박의 부비도에 이질성이있다. 대표적인 결과를 얻으려면 조건당 6개 미만의 마우스를 정량화해야 합니다.
최신 파라미터, 혈관 분기 및 밀도는, 비증식 망막증을 나타내는 MetS 모델에서 분석되었다. MetS에서, 지질과 탄수화물 혼란은 망막 백혈구 및 내피 세포 기능 장애 및 죽음에 연관되어, 세포 모세 혈관 의 형성 또는 감소된 혈관 분지25의 형성으로 이끌어 냅니다25. 우리의 모형에서, ApoE-KO 마우스는 10%w/v의 농도에서 식수에 추가된 과당을 공급했습니다. 제어 동물은 수돗물을 받았습니다. 4개월의 식단 끝에 마우스를 희생했고, 망막은 전에 나타난 대로 처리되었다. 혈관 분지의 측정을 위해 동심원을 그려 정량화 영역을 정의한 다음, 주 중앙 용기에서 발생하는 1차 가지를 하나씩 계산하였다(도 6).
획득된 이미지에서, 혈관 밀도는 프로토콜 섹션에서 설명된 바와 같이 각 마이크로사진의 상이한 장소에 위치하던 ROI(0.015 mm2의 사각형, 도 7에서 평탄화)의 영역으로 나뉘어진 혈관에 의해 점유된 영역으로 정량화되었다. 기계적 손상영역을 정량화하지 마십시오(그림 7, 흰색 화살표). 펑크가 있는 두 개 이상의 영역이 있는 경우 망막은 폐기해야 합니다.
도 1: 이솔렉틴 GSA-IB4로 표지된 망막 전체 마운트의 혈관 염색: P17 OIR 마우스 망막의 대표적인 공초점 이미지P12에서 차량 또는 치료로 주입. 형광 염색은 프로토콜에 따라 이솔록틴 GSA-IB4 알렉사 488로 전체 산 망막에서 수행되었다. 혈관 영역(AV) 및 신생 지역(NV)이 표시됩니다. 스케일 바: 500 μm. 흰색 화살표는 잔류 히알로이드 혈관을 보여줍니다. 노란색 화살표는 공초점 이미지 수집 중에 불완전한 스캐닝 영역을 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 혈관 영역의 정량화: (A) 전체 산 망막의 대표적인 이미지는 OIR-차량 및 OIR-처리 마우스에서 GSA-IB4 혈관 염색을 보여주는 P17에서 의 대표적인 이미지. 혈관 말살이 있는 영역은 노란색으로 표시됩니다. 스케일 바: 500 μm. (B) AV 영역(%)은 중앙 배반영역의 비율로 전체 망막 부위에 정량화되었다. 두 꼬리 페어링되지 않은 t-테스트는 통계 비교에 사용되었습니다. SEM을 ± 의미로 제시된 데이터 *** p < 0.001. 적어도 6마리의 동물은 생존 시간에 각 조건에 대해 조사되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 중혈관 영역의 정량화: (A) 전체 산망막의 대표적인 이미지는 OIR-차량 및 OIR-처리 마우스에서 GSA-IB4 혈관 염색을 나타낸다. 신생 혈관화 영역은 흰색으로 표시됩니다. 스케일 바: 500 μm. (B) NV 영역(%)은 네오용기가 점유하는 면적의 비율로 전체 망막 부위에 정량화되었다. 두 꼬리 페어링되지 않은 t-테스트는 통계 비교에 사용되었습니다. SEM을 ± 의미로 제시된 데이터 *** p < 0.001. 적어도 6마리의 동물은 생존 시간에 각 조건에 대해 조사되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 혈관 팽창의 정량화: (A) 전체 산망막의 대표적인 이미지는 OIR-차량 및 OIR-처리 마우스에서 GSA-IB4 혈관 염색을 나타낸다. 왼쪽 패널: 정량화를 위해 선택된 ROI입니다. 오른쪽 패널: 선박 직경을 측정하기 위해 주 선박에서 수행된 직선을 보여주는 ROI의 확대/ 축소. 3선은 선박에 반으로 추적되었고 평균이었다. 스케일 바: 100 μm. (B) 혈관 직경(%)은 망막의 주요 혈관에서 측정된 평균 직경으로 정량화되었다. 두 꼬리 페어링되지 않은 t-테스트는 통계 비교에 사용되었습니다. 평균 ± SEM으로 제시된 데이터* p < 0.05. 적어도 6마리의 동물은 생존 시간에 각 조건에 대해 조사되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 단통지수 의 결정: (A) 전체 산망막의 대표적인 이미지는 OIR-차량 및 OIR 처리 마우스에서 GSA-IB4 혈관 염색을 보여주는 P17에서 망막전체를 나타낸다. 왼쪽 패널: 정량화를 위해 선택된 ROI입니다. 중앙 패널: ROI의 확대/ 축소, 시신경에서 첫 번째 분기점에 주요 용기에서 추적된 세그먼트 라인을 보여. 오른쪽 패널: 시신경에서 첫 번째 분기점에 주요 용기에서 추적된 직선을 보여주는 ROI의 확대/ 축소. 스케일 바: 100 μm. (B) 비틀거리는 선의 거리를 직선의 거리로 나누어 서 서 비틀거린 인덱스를 얻었다. 두 꼬리 페어링되지 않은 t-테스트는 통계 비교에 사용되었습니다. 의미로 제시 된 데이터는 sEM. ns에 ±, 중요하지 않습니다. 적어도 6마리의 동물은 생존 시간에 각 조건에 대해 조사되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: 혈관 분지의 정량화: (A) 아포에-KO 및 아포에-KO + 과당 공급 마우스에서 이솔렉틴 GSA-IB4 혈관 염색을 보여주는 전체 산 망막의 대표적인 이미지. 원형 정량 영역은 노란색으로 정의되었다. 스케일 바: 100 μm, 100배배율. (B) 시신경이 주변으로 이동하기 때문에, 주요 혈관에서 1차 가지의 수로 정량화되었다. 두 꼬리 페어링되지 않은 t-테스트는 통계 비교에 사용되었습니다. 의미로 제시 된 데이터는 sEM. ns에 ±, 중요하지 않습니다. 각 조건에 대해 적어도 6마리의 동물이 고용되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 혈관 밀도의 정량화: (A) 아포에-KO 및 ApoE-KO + 과당 공급 마우스에서 이솔렉틴 GSA-IB4 혈관 염색을 보여주는 전체 산 망막의 대표적인 이미지. 정사각형 0.015 mm2 정량화 영역은 노란색으로 정의되었다. 스케일 바: 100 μm, 100배배율. (B) 혈관 밀도는 각 마이크로사진에서 서로 다른 장소에서 9번 위치된 총 ROI 영역에 대한 혈관 영역의 비율로 정량화되었다. 흰색 화살표는 기계적 손상이 있는 영역을 표시합니다. 두 꼬리 페어링되지 않은 t-테스트는 통계 비교에 사용되었습니다. 의미로 제시 된 데이터는 sEM. ns에 ±, 중요하지 않습니다. 각 조건에 대해 적어도 6마리의 동물이 고용되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
망막병증의 동물 모델은 혈관 발달, 리모델링 또는 병리학 적 혈관 신생을 연구하기위한 강력한 도구입니다. 현장에서 이러한 연구의 성공은 생체 내 및 사후 마우스26,27에서 데이터를 제공하는 다양한 기술을 수행 할 수있는 조직에 쉽게 접근할 수 있습니다. 더욱이, 생체 내 연구와 임상 분석 사이에 큰 상관관계가 발견되어 이러한 모델에 대한 견고한 추적성과 신뢰성을 제공한다28. 이 기사에서는 망막 혈관 질환의 마우스 모델에서 혈관 네트워크를 특성화하는 단계에 대한 간단하고 강력한 설명을 제시합니다. 문헌에서 독자는 여기에서 선택한 매개 변수를 정량화하기 위해 측정하고 병렬 접근 방식을 찾을 수 있습니다. 컴파일 된 프로토콜은 재현 할 수 있기 때문에 다른 프로토콜에 비해 많은 이점을 가지고 있으며 분석을 수행하기 위해 무료 소프트웨어가 필요합니다 (이미지 J 피지).
또한, 이러한 프로토콜은 프로그램에 대한 광범위한 지식이없는 학생들에 의해 수행되기 쉽고 측정의 대부분은 추가 플러그인이 필요하지 않습니다 (혈관 밀도 제외).
샘플 추출 및 형광 염색 기술은 간단하고 간략한29입니다. 그들은 세균 성장의 억제제와 PBS에서 4 °C에서 저장할 수 있지만, 신선한 망막과 함께 작동하는 것이 매우 중요합니다. 조직이 얇고 부드러기 때문에, 오래된 견본은 수시로 잠복 도중 또는 장착하기 전에 견본을 펼칠 때 분해합니다. 게다가, 4% PFA와 과도한 고정은 망막을 지나치게 단단하고 취성 돌지만, 이것은 렉틴 염색에 영향을 미치지 않습니다. Isolectin GSA-IB4 염색은 신혈관및 증식내세포를 포함하여 모든 층에서 완전한 혈관 네트워크를 시각화할 수 있게 합니다. CD 31과 같은 다른 마커는 농축 된 항체를 가진 샘플의 배큐베이션을 필요로하며 더 많은 배경을 가지고 있습니다. 한편, 혈관조영술에서 형광염은 혈관에서 확산되는 경향이 있어 혈관 구경 및 불법 화의 가변성을 증가시킵니다. 이솔렉틴 GSA-IB4의 한 가지 단점은 마이크로글리아세포30에 라벨을 붙일 수 있다는 것입니다. 마이크로글리아 세포가 응집체를 형성할 수 있기 때문에 과도한 침투를 유도하는 인트라비테리얼 주사 또는 기타 실험 적 절차를 수행 할 때주의를 기울여야합니다.
이미지 수집은 공초점 현미경으로 수행 될 수있다. 스티치 모듈을 포함하는 소프트웨어에 전동 플레이트 커플을 사용하면 단일 이미지에서 장착된 전체 망막의 완전한 시각화를 제공합니다. 망막 영역을 선택할 때 샘플의 모든 극단이 포함되어 있는지 확인하면 사진이 불완전합니다 (그림 1, 노란색 화살표). 이것은 혈관 변경이 시신경 근처에 있기 때문에, 예를 들면, OIR의 마우스 모형에서 아주 관련되지 않습니다. OIR의 쥐 모델에 있는 동안, 이 실수는 바변 및 신생아 지역이 림푸스 옆에 있기 때문에 부정확한 정량화로 이끌어 낼 수 있습니다. 또 다른 가능성은 개별 망막 마이크로 사진을 찍는 것입니다. 사용자는 나중에 적절한 소프트웨어와 퍼즐로 구성 할 수 있습니다. 특히 분기를 분석할 때, 망막의 전체 두께에 걸쳐 배의 싹이 나고 일부 혈관이 전적으로 z 스택에서 검출되지 않기 때문에, 특히 분기를 분석할 때, 부피 현미경을 사용하는 것이 좋습니다.
ImageJ FIJI와 이미지 처리 하는 동안, 모든 이미지가 정량화 될 때까지 소프트웨어를 업데이트 하지 않는 것이 좋습니다., 소프트웨어에서 동일한 조건을 유지 하기 위해. 이러한 프로토콜은 거리와 영역의 정량화를 의미하기 때문에 이미지 의 보정(미크론에서 픽셀 크기 할당)은 중요한 단계입니다. 프로그램에 익숙해지면 사용자는 다른 도구를 탐색하여 지팡이 도구 외에도 신생 혈관 및 변반 영역을 선택할 수 있습니다. 다각형 선택 도구는 장착 단계에서 두 부분으로 절단된 변속 영역을 측정하는 데 특히 유용합니다. 다른 연구자들은 이러한 구조의 형광 강도에 따라 신혈관의 선택을 자동화하기 위해 특정 플러그인을 만들었습니다. 이러한 방법은 더 빠르고 덜 힘들지만, 작은 덜 빛나는 신혈관이 정량화31 이전에 선택되었는지 확인하는 것이 좋습니다. 네오선박의 영역은 주변 의 정상 혈관보다 더 강렬하게 형광할 것입니다. 매직 지팡이 도구는 유사하게 착색된 영역을 선택하고 공차는 색상이 선택한 픽셀이 얼마나 유사한지 결정합니다. 네오용기가 정상 선박과 유사한 강도인 경우, 공차는 미묘한 강도 차이에 대한 민감도를 높이기 위해 하향 조정될 수 있다. 모든 샘플에서 신혈관 선택은 동일한 임계값으로 수행되지만, 일부 신혈관은 경미한 형광 강도가 특징입니다. 이 경우 적절한 선택을 위해서는 허용 오차가 낮습니다.
불법및 팽창은 거리의 측정입니다. 혈관 나무의 포괄적 인 연구는 동일한 유형의 혈관 (동맥 또는 정맥) 및 구경을 선택하는 데 도움이됩니다. 도 4에 도시된 바와 같이 선박의 팽창을 3개의 높이로 측정합니다. 선박 벽에 대한 직선 선택각도는 고려해야 할 또 다른 관련 지점입니다. 가능한 오류를 피하기 위해 가능한 한 90°에 가까워야 합니다. 직선을 그릴 때 사용자는 줌 도구를 사용하여 관심 있는 용기에 접근할 수 있습니다.
혈관 분진은 또한 원하는 경우, 다른 높이의 두 개 이상의 정량화 영역으로 측정될 수 있다. 이 경우 연구자들은 분석된 망막 영역(시신경의 중앙, 중간 또는 말초 면)을 보존해야 합니다. 분기는 망막증의 몇몇 동물 모형에서 변경되지만, 여기에서 제시된 MetS에 관련되었던 망막병증의 초기 단계는 아직도 그러한 변경을 보여주지 않습니다15. 중간 및 깊은 신경총 및 혈관 발아의 망막 모세 혈관에 대한 광범위한 연구를 위해 3D 계산 방법은 혈관 형태 및 network32의 미묘한 변화에 대한 귀중한 데이터를 제공합니다. 마지막으로, 혈관 밀도는 선택된 ROI의 총 면적에 대하여 선박이 점유하는 영역에 의해 결정된다. 이 매개 변수의 측정은 플러그인과 ImageJ FIJI의 실제 버전을 사용해야하며, 자동 임계값 및 거리 맵 도구에 대한 지오메트리를 사용할 수 있어야 합니다. 이러한 추가 단계에도 불구 하 고, 플러그인사용 하기 쉽고, 재현 하 고 신뢰할 수 있습니다. 혈관 밀도의 측정을 위해, 망막의 다른 지역에서 형광 강도의 10개의 측정을 하기 위해 0.015 mm2 의 ROI를 선택되었다. 이 크기는 우리가 전체 사진을 커버 할 수 있게하여 각 망막에서 보다 대표적인 평균 값과 편차를 얻을 수 있었습니다.
전반적으로 이러한 메서드 컬렉션이 자동화되지 않고 매개 변수를 수동으로 선택해야 한다는 사실에도 불구하고 망막의 정량적이고 엄격한 데이터를 제공 할 수 있습니다. 혈관 측정을 위한 위의 제시된 프로토콜에 관한 주요 제한은 동일한 이미지를 분석할 때 심사관 간 가변성에 의존합니다. 이러한 편견을 최소화하기 위해 일반적인 설정을 선박 벽 경계, 혈관 영역 및 신혈관 식별, 손상된 조직에 대한 배제 기준으로 미리 설정하는 것이 중요합니다. 혈관 불법성에 관해서는 시신경 옆에 합의된 출발점이 필요합니다. 초보자 사용자의 경우 두 명 이상의 심사관이 수집한 데이터를 평균하는 것이 좋습니다. 숙련된 사용자에서는 정량화 기준의 합의가 일정하게 유지되는 한 다양한 매개 변수의 측정에서 중요한 차이가 발견되지 않았습니다. 마찬가지로, 망막병증에서 검출된 혈관 변경에 따라 나열된 프로토콜에 추가 매개변수를 추가할 수 있다. 비증식 망막증에서, 세포모세혈관 수, 이동 체세포, 백혈구/내피 세포 수 및 혈액 망막 장벽 투과성의 측정은 망막 혈관33,34,35에서 변경된 초기 매개변수이다. 만성 모델과 가벼운 망막증의 경우 이러한 추가 측정을 포함하는 것이 좋습니다. 측정 된 매개 변수의 주요 숫자는 혈관에서 일어나는 사건의 더 충실한 풍경을 제공 할 것입니다. 요약하자면, 이 문서에서는 임상 실습에서 고려된 가장 관련성이 있는 매개 변수중 일부를 정량화하기 위해 고전적으로 확립된 재현 가능한 기술을 보여주었습니다.
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Disclosures
저자는 연구가 잠재적 인 이해 충돌로 해석 될 수있는 상업적 또는 금융 관계의 부재에서 수행되었다고 선언합니다.
Acknowledgments
카를로스 마스, 마리아 필라르 크레스포, CEMINCO의 세실리아 삼페드로(센트로 드 마이크로 이 나노스코피아 코르도바, 코니스트-UNC, 코르도바, 아르헨티나)에게 공초점 현미경 검사법을 지원해 주셔서 감사합니다. 우리는 또한 빅터 디아즈 (FCQ의 기관 커뮤니케이션의 프로 장관)와 원고의 비판적 인 읽기 및 언어 개정에 대한 폴 홉슨에게 감사드립니다.
이 문서는 Secretaría de Ciencia y Tecnología의 보조금에 의해 지원되었으며, 유니버시다드 나시오날 드 코르도바 (SECyT-UNC) 콘솔더 2018-2021, 폰도 파라 라 Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT), 프로익토 데 Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015..C N4.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminuim foil | |||
| Bovine Serum Albumin | Merck | A4503 | quality |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | C3306 | |
| Hydrochloric acid | Biopack | 9632.08 | |
| Confocal Microscope FV1200 | Olympus | FV1200 | with motorized plate |
| Covers | Paul Marienfeld GmnH & Co. | 111520 | |
| Dissecting Microscope | NIKON | SMZ645 | |
| Disodium-hydrogen-phosphate dihydrate | Merck | 119753 | |
| 200 µL tube | Merck | Z316121 | |
| Filter paper | Merck | WHA5201090 | |
| Incubator shaker GyroMini | LabNet International | S0500 | |
| Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | I21411 | |
| Poly(vinyl alcohol) (Mowiol 4-88) | Merck | 475904 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 158127 | |
| pHmeter | SANXIN | PHS-3D-03 | |
| Potassium chloride | Merck | P9541 | |
| Potassium-dihydrogen phosphate | Merck | 1,04,873 | |
| Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Sodium chloride | Merck | S3014 | |
| Sodium hydroxide | Merck | S5881 | |
| Tris | Merck | GE17-1321-01 | |
| Triton X-100 | Merck | X100-1GA | |
| Vessel Analysis Fiji software | Mai Elfarnawany | https://imagej.net/Vessel_Analysis |
References
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