Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

القياس الكمي للمعلمات الوعائية في شبكية العين الكاملة للفئران ذات اعتلال الشبكية غير التكاثري والتكاثري

Published: March 12, 2022 doi: 10.3791/63126
Automatic Translation
1,2, 1,2,4, 1,2, 3, 1,2, 1,2
1Departamento de Bioquímica Clínica, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Nacional de Córdoba, 2Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología (CIBICI), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), 3Vitreo-retinal Department, Centro Privado de Ojos Romagosa-Fundación VER, 4Unidad de Investigación y Desarrollo en Tecnología Farmacéutica (UNITEFA), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET)

Summary

تصف هذه المقالة فحص بقع اللكتين الراسخ والقابل للتكرار لمستحضرات الشبكية الكاملة والبروتوكولات المطلوبة للقياس الكمي لمعلمات الأوعية الدموية التي يتم تغييرها بشكل متكرر في اعتلال الشبكية التكاثري وغير التكاثري.

Abstract

اعتلال الشبكية هي مجموعة غير متجانسة من الأمراض التي تؤثر على الأنسجة العصبية الحسية للعين. وهي تتميز بالتنكس العصبي والدبقية والتغيير التدريجي في وظيفة الأوعية الدموية وبنيتها. على الرغم من أن بداية اعتلال الشبكية تتميز باضطرابات طفيفة في الإدراك البصري ، إلا أن التعديلات في الضفيرة الوعائية هي العلامات الأولى التي يكتشفها الأطباء. يحدد غياب أو وجود الأوعية الدموية الجديدة ما إذا كان اعتلال الشبكية يصنف على أنه إما غير تكاثري (NPDR) أو تكاثري (PDR). وبهذا المعنى ، حاولت العديد من النماذج الحيوانية محاكاة ميزات الأوعية الدموية المحددة لكل مرحلة لتحديد الآليات الأساسية التي تنطوي عليها تغيرات البطانة ، والموت العصبي وغيرها من الأحداث التي تحدث في شبكية العين. في هذه المقالة ، سنقدم وصفا كاملا للإجراءات المطلوبة لقياس معلمات الأوعية الدموية في شبكية العين لدى البالغين والفئران المبكرة الولادة في يوم ما بعد الولادة (P)17. سنقوم بتفصيل البروتوكولات اللازمة لتنفيذ تلطيخ الأوعية الدموية في الشبكية باستخدام Isolectin GSA-IB4 في حوامل كاملة للتصور المجهري اللاحق. كما يتم توفير الخطوات الرئيسية لمعالجة الصور باستخدام برنامج Image J Fiji ، وبالتالي ، سيتمكن القراء من قياس كثافة الأوعية الدموية وقطرها وتعرجها ، وتفرع الأوعية الدموية ، وكذلك المناطق الوعائية والأوعية الدموية الجديدة. هذه الأدوات مفيدة للغاية لتقييم وقياس التغيرات الوعائية في كل من اعتلال الشبكية غير التكاثري والتكاثري.

Introduction

تتغذى العينان على نظامين شريانيين وريديين: الأوعية الدموية المشيمية ، وهي شبكة أوعية دموية خارجية تروي الظهارة المصطبغة للشبكية والمستقبلات الضوئية. والأوعية الدموية العصبية الشبكية التي تروي طبقة الخلايا العقدية والطبقة النووية الداخلية للشبكية1. الأوعية الدموية الشبكية هي شبكة منظمة من الأوعية التي توصل العناصر الغذائية والأكسجين إلى خلايا الشبكية وتحصد النفايات لضمان نقل الإشارات البصرية المناسبة. هذا الأوعية الدموية له بعض السمات المميزة، بما في ذلك: عدم وجود تعصيب مستقل، وتنظيم لهجة الأوعية الدموية من خلال آليات الشبكية الجوهرية وامتلاك حاجز معقد بين الشبكية والدم2. لذلك ، كانت الأوعية الدموية في شبكية العين محور تركيز العديد من الباحثين الذين درسوا على نطاق واسع ليس فقط تكوين الأوعية الدموية أثناء التطور ، ولكن أيضا التغيرات وتكوين الأوعية المرضية التي تخضع لها هذه الأوعية في الأمراض3. التغيرات الوعائية الأكثر شيوعا التي لوحظت في اعتلال الشبكية هي توسع الأوعية الدموية ، والأوعية الدموية الجديدة ، وفقدان تشجير الأوعية الدموية وتشوه الأوعية الرئيسية في شبكية العين ، مما يجعلها أكثر تعرجا4،5،6. واحد أو أكثر من التعديلات الموصوفة هي أقدم العلامات التي يتم اكتشافها من قبل الأطباء. يوفر التصور الوعائي طريقة فحص سريعة وغير جراحية وغير مكلفة7. ستحدد الدراسة المكثفة للتغيرات التي لوحظت في شجرة الأوعية الدموية ما إذا كان اعتلال الشبكية غير تكاثري أو تكاثري والعلاج الإضافي. يمكن أن تظهر اعتلالات الشبكية غير التكاثرية نفسها مع مورفولوجيا الأوعية الدموية الشاذة ، وانخفاض كثافة الأوعية الدموية ، والشعيرات الدموية اللاخلوية ، وموت الخلايا المحيطة ، والوذمة البقعية ، من بين أمور أخرى. بالإضافة إلى ذلك، تؤدي اعتلالات الشبكية التكاثرية أيضا إلى زيادة نفاذية الأوعية الدموية، وإعادة التشكيل خارج الخلية، وتشكيل خصلات الأوعية الدموية نحو التجويف الزجاجي الذي ينهار بسهولة أو يحفز انفصال الشبكية8.

بمجرد اكتشافه ، يمكن مراقبة اعتلال الشبكية من خلال تغييراته الوعائية9,10. يمكن متابعة تطور علم الأمراض من خلال التغييرات الهيكلية للأوعية ، والتي تحدد بوضوح مراحل المرض11. سمح القياس الكمي للتغيرات الوعائية في هذه النماذج بالربط بين تغيرات الأوعية الدموية والموت العصبي واختبار العلاجات الدوائية للمرضى في مراحل مختلفة من المرض.

في ضوء العبارات المذكورة أعلاه ، نعتبر أن التعرف على التغيرات الوعائية وتحديدها كميا أمر أساسي في دراسات اعتلال الشبكية. في هذا العمل ، سنوضح كيفية قياس معلمات الأوعية الدموية المختلفة. للقيام بذلك ، سنستخدم نموذجين حيوانيين. واحد منهم هو نموذج فأر اعتلال الشبكية الناجم عن الأكسجين12 ، الذي يحاكي اعتلال الشبكية الخداجي وبعض جوانب اعتلال الشبكية السكري التكاثري13,14. في هذا النموذج ، سنقيس المناطق اللاوعائية ومناطق الأوعية الدموية الجديدة وتوسع الأوعية الرئيسية وتعرجها. في مختبرنا ، تم تطوير نموذج فأر متلازمة التمثيل الغذائي (MetS) ، والذي يحفز اعتلال الشبكية غير التكاثري15. هنا ، سنقوم بتقييم كثافة الأوعية الدموية والتفرع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم التعامل مع الفئران C57BL/6J وفقا للمبادئ التوجيهية لبيان ARVO لاستخدام الحيوانات في أبحاث العيون والرؤية. تم تصميم الإجراءات التجريبية والموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (CICUAL) التابعة لكلية العلوم الكيميائية بجامعة قرطبة الوطنية (القرار HCD 1216/18).

1. إعداد المحاليل العازلة والكواشف

  1. تحضير 1x محلول ملحي عازل للفوسفات (PBS): أضف 8 جم من كلوريد الصوديوم (NaCl) ، و 0.2 جم من كلوريد البوتاسيوم (KCl) ، و 14.4 جم من ثنائي هيدرات ثنائي الصوديوم والهيدروجين والفوسفات (Na2HPO4 2H2O) و 0.24 جم من فوسفات البوتاسيوم ثنائي الهيدروجين (KH2PO4) إلى 800 مل من الماء المقطر. حرك المحلول حتى يذوب الأملاح بالكامل. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 مع حمض الكلوريد (HCl) واضبط الحجم على 1 لتر بالماء المقطر الإضافي. قم بتصفية المحلول وتخزينه عند 4 درجات مئوية.
  2. تحضير 4٪ بارافورمالدهيد (PFA): أضف 40 جم من PFA الصلب إلى 800 مل من PBS الطازج. حرك المحلول في لوحة تسخين عند درجة حرارة ثابتة تبلغ 60 درجة مئوية. أضف 1 مليون هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) حتى يذوب PFA تماما ، مع التحقق من الحفاظ على الرقم الهيدروجيني في نطاق 7.2-7.4. قم بزيادة مستوى الصوت إلى 1000 مل باستخدام PBS واخلطه. أطفئ لوحة التسخين وقم بتصفية المحلول عندما تكون درجة حرارته أقل من 35 درجة مئوية. تخزين الحل في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أيام.
    تحذير: PFA ضار إذا تم ابتلاعه أو إذا تم استنشاقه وربما يكون مركبا مطفرا. استخدم القفازات وقناع الوجه أثناء العملية برمتها واعمل في كابينة أمان.
  3. تحضير 1x محلول ملحي مخزن مؤقتا (TBS): أضف 6.1 جم من Tris و 9 جم من كلوريد الصوديوم إلى 800 مل من الماء المقطر. حرك المحلول حتى يذوب الأملاح بالكامل. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 باستخدام HCl واضبط الحجم على 1 لتر باستخدام ماء مقطر إضافي. قم بتصفية المحلول وتخزينه عند 4 درجات مئوية.
  4. تحضير TBS - 0.1٪ Triton X-100: أضف 0.1 مل من TritonX-100 إلى 100 مل من TBS. اخلط بلطف وخزنه على درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
    ملاحظة: نظرا لأن Triton منظف كثيف للغاية ، فقم بقطع طرف الطرف قليلا لتحسين السحب.
  5. تحضير TBS-5٪ - ألبومين مصل البقر (BSA) -0.1٪ Triton-X-100: وزن 5 جم من BSA وإضافة TBS - 0.1٪ محلول triton X-100 حتى الحجم النهائي 100 مل. يحرك بلطف. Aliquot وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهرين.
  6. Isolectin GSA-IB4 Alexa fluor-488 مترافق (Isolectin GSA-IB4): الوزن 36.75 ملغ من ثنائي هيدرات كلوريد الكالسيوم (CaCl2 · 2H2O) وإضافته إلى 500 مل من PBS الطازجة. حرك المحلول بقضيب تحريك. ماصة 500 ميكرولتر من محلول CaCl2 / PBS وإضافته إلى القارورة التي تحتوي على 500 ميكروغرام من مسحوق Isolectin GSA-IB4 المجمد بالتجميد. اخلط بلطف وأليكوت المحلول في أنابيب 0.5 مل. قم بتخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية محمية من الضوء.
  7. بولي (كحول الفينيل) في الجلسرين / تريس: وزن 2.4 غرام من بولي (كحول الفينيل) ، إضافة 6 غرام من الجلسرين ويحرك بلطف. ثم أضف 6 مل من الماء واستمر في التحريك لعدة ساعات في درجة حرارة الغرفة. أضف 12 مل من محلول تريس 0.2 M المسخن مسبقا (الرقم الهيدروجيني: 8.5) وسخن عند درجة حرارة ثابتة تبلغ 50 درجة مئوية لمدة 10 دقائق واخلطه من حين لآخر. أخيرا ، قم بطرد المحلول عند 5000 × جم لمدة 15 دقيقة للتوضيح.
    ملاحظة: دع المحلول يبرد في درجة حرارة الغرفة ، وقم بتحريكه وتخزينه عند -20 درجة مئوية.

2. تلطيخ الليكتين الفلورسنت

  1. عند تضحية الفئران باستنشاق ثاني أكسيد الكربون (CO2) ، قم باستئصال العينين بالمقص16. قم بإصلاح العيون المشقوقة باستخدام PFA 4٪ طازج لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT).
    ملاحظة: يمكن أيضا إجراء التثبيت عن طريق احتضان العينين في 4٪ PFA بين عشية وضحاها (ON) عند 4 درجات مئوية. تم التضحية بالفئران وفقا للمبادئ التوجيهية لبيان ARVO لاستخدام الحيوانات في أبحاث العيون والرؤية واللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (CICUAL) التابعة لكلية العلوم الكيميائية بجامعة قرطبة الوطنية (Res. HCD 1216/18).
  2. تحت المجهر التشريحي ، قم بإزالة القرنيات بالمقص عن طريق قطع على طول الحافة وتشريح الشبكية بأكملها. تخلص من الجزء الأمامي من العين، ثم افصل الشبكية عن RPE-Choroid.
    ملاحظة: تأكد من إزالة الحطام المتبقي والأوعية الهيالويد من شبكية العين باستخدام الملقط.
  3. ضع الشبكية في أنابيب 200 ميكرولتر. بعد ذلك ، قم بحظر ونفاذية شبكية العين في 100 ميكرولتر من محلول محلول ملحي مخزن مؤقتا من تريس (TBS) يحتوي على 5٪ من ألبومين مصل البقر (BSA) و 0.1٪ Triton-X-100 خلال 6 ساعات عند 4 درجات مئوية مع إثارة لطيفة في الخلاط.
    ملاحظة: يمكن تنفيذ هذه الخطوة لمدة 2 ساعة في RT.
  4. ثم ، عكس الأنبوب لوضع شبكية العين في الغطاء وإزالة محلول الحجب باستخدام ماصة.
  5. أضف 100 ميكرولتر من المحلول الذي يحتوي على 0.01 ميكروغرام/ميكرولتر من إيزوليكتين GSA-IB4 (GSA-IB4). لف الأنابيب بورق الألومنيوم لحماية العينات من الضوء. احتضن الشبكية بمحلول اللكتين ON عند 4 درجات مئوية أو لمدة 2 ساعة في RT مع إثارة لطيفة في الخلاط.
  6. اغسل شبكية العين ب 100 ميكرولتر من TBS التي تحتوي على 0.1٪ Triton-X-100 لمدة 20 دقيقة مع إثارة لطيفة في الخلاط. للغسيل السليم ، ضع شبكية العين في غطاء الأنبوب عن طريق عكسها. أعد الأنبوب إلى وضع الوقوف وقم بإزالة الوسط المتبقي في الحاوية. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
  7. ضع شبكية العين في شريحة وأضف قطرة من PBS. تحت المجهر التشريحي ، قم بإجراء أربعة جروح بعيدة بالتساوي من حواف الشبكية نحو العصب البصري.
  8. لكشف بتلات الشبكية، استخدم ملقط أو قطع صغيرة من ورق الترشيح. تأكد من أن جانب المستقبلات الضوئية متجه لأسفل.
  9. قم بإزالة PBS المتبقي من الشريحة باستخدام ورق التصفية. ثم ، أضف وسيط تركيب (بولي (كحول الفينيل) في الجلسرين / تريس) وغطاء الغطاء. اتركه يجف لمدة 1 ساعة في RT.
  10. قم بتخزين الشرائح عند 4 درجات مئوية محمية من الضوء.
    ملاحظة: يمكن أيضا تخزين شبكية العين في PBS عند 4 درجات مئوية حتى التصور المجهري البؤري.

3. التصور المجهري البؤري واكتساب التصوير المجهري

  1. قبل التصور، قم باحتضان الشرائح لمدة 10 دقائق في RT مغطاة من الضوء.
  2. عند المجهر البؤري ، ضع الشريحة في اللوحة وجها لأسفل.
  3. ركز الضفيرة الفائقة للأوعية الدموية في الشبكية وحدد منطقة لبدء الحصول على الصورة.
  4. تعيين معلمات الليزر العامة في البرنامج: الطول الموجي: 488 نانومتر. كثافة الليزر; فيروس التهاب الكبد الوبائي. الإزاحة. كسب.
    ملاحظة: قد تختلف شدة الليزر وPMT والإزاحة والكسب حسب الظروف واستخدام المصباح. توفر الإعدادات المثلى صورة واضحة للأوعية التي تتجنب التشبع في حساسية أنبوب المضاعف الضوئي ليكون لها علاقة خطية مع إشارة التألق.
  5. تعيين معلمات الاستحواذ الأخرى: الوضع; الحجم; الهدف ، دون التكبير / التصغير ؛ لا كالمان. حجم الخطوة.
    ملاحظة: يجب استخدام شروط اكتساب متطابقة لتصوير العينات الضابطة والتجريبية.
  6. تعيين الإحداثيات في المحور x و y: امسح الشبكية ضوئيا في التركيز البؤري 2x. إذا كانت المنطقة تعرض السفن، فحددها بالنقر فوق ضعف المساحة من أجل وضع علامة عليها للحصول على صورة لاحقا.
    ملاحظة: يوصى بشدة بتحديد منطقة الشبكية باتباع الضفيرة الوعائية العليا لأن تألق الأوعية الأكبر أعلى.
  7. انتقل في الشبكة إلى مربع مجاور، وركز شبكية العين، وحدد المنطقة إذا كانت متوافقة. كرر هذه الخطوة حتى تضم المنطقة المحددة شبكية العين بأكملها.
  8. حدد منطقة واحدة واضبط الإحداثيات في المحور z لتحديد مدى سمك المسح الضوئي. للقيام بذلك ، تصور شبكية العين في التركيز البؤري 2x ؛ باستخدام الميكرومتر ، انتقل إلى أعلى شبكية العين وانقر فوق تعيين في موضع البدء. ثم انتقل إلى أسفل شبكية العين وانقر على تعيين في موضع النهاية.
  9. كرر الخطوة 3.8 في كل منطقة محددة في الشبكة.
    ملاحظة: للتحقق من عمق المنطقة الممسوحة ضوئيا، اضغط على انتقال في موضع البدء. إذا كانت الأوعية لا تزال مرئية ، فأعد ضبط الموضع عن طريق تحريك الميكرومتر ، ثم انقر فوق تعيين. كرر العملية في موضع النهاية.
  10. تهيئة المسح الضوئي التلقائي.
  11. بمجرد انتهاء عملية المسح الضوئي، افتح الصورة.
  12. حدد تنسيق السلسلة لتسجيل الصورة كفسيفساء وحفظها بالامتداد المفضل. أخيرا ، سيتم عرض الصورة المخيطة على الشاشة.

4. معالجة الصور

  1. في برنامج ImageJ FIJI ، انتقل إلى شريط القوائم وانقر فوق ملف > فتح. حدد الصورة المراد معالجتها. في نافذة خيارات استيراد التنسيقات الحيوية ، حدد عرض البيانات الوصفية OME-XML وانقر فوق موافق.
    ملاحظة: يجب حفظ الصور التي تحمل اسما مشابها في مجلدات منفصلة.
  2. في نافذة بيانات تعريف OME ، ابحث عن معلومات حجم البكسل، المسماة PhysicalSizeX و PhysicalSizeY و PhysicalSizeZ. انسخ هذه البيانات.
  3. لمعايرة الصور، انتقل إلى شريط القوائم وحدد خصائص > الصورة. انسخ معلومات الصورة في الخطوة 4.2 وانقر فوق موافق. تفتح الصورة كنافذة تحتوي على عدة صور ، حيث تمثل كل صورة الصور المصغرة التي تم الحصول عليها في محور z.
  4. قم بتعيين لوت مفضل للصورة من أجل إرسال لون إلى ملصق الفلورسنت. للقيام بذلك ، انتقل إلى شريط القوائم وانقر فوق رمز LUT .
  5. لتصور كل المكدسات في صورة واحدة، انتقل إلى شريط القوائم وحدد صورة > مكدسات > Z Project.
  6. في نافذة العرض Z، حدد جميع المكدسات حيث يتم تصور الأوعية. في نوع الإسقاط، اختر متوسط الكثافة وانقر على موافق.
    ملاحظة: سيتم عرض نتيجة مجموع المكدسات في صورة جديدة تسمى AVG (اسم الصورة).
  7. اضبط السطوع والتباين في الصورة الناتجة لتقليل الخلفية وتمييز الأوعية. انتقل إلى شريط القوائم وانقر على صورة> ضبط > السطوع / التباين. في النوافذ B و C ، حرك القضبان حتى يتم ملاحظة كثافة أفضل. انقر فوق تطبيق واحفظ التغييرات.
  8. نسخ المعلمات المحددة للسطوع / التباين ؛ يجب أن تكون هذه متطابقة لجميع الصور.
  9. قبل القياس الكمي للصورة، حدد المعلمات التي سيتم قياسها. في شريط القوائم، انتقل إلى تحليل > تعيين القياسات. في الإجراءات الموضحة هنا ، سيكون من الضروري الحصول على المساحة والمحيط (وهذا ضروري أيضا في النهاية لقياس المسافات). انقر فوق موافق.
  10. قم بتنزيل المكون الإضافي المطلوب لقياس كثافة الوعاء17 واتبع إرشادات التثبيت التي يوفرها المكون الإضافي.
  11. استمر في القياس الكمي لمعلمة وعائية محددة.

5. القياس الكمي للمناطق اللاوعائية

  1. في شريط القوائم، اختر أداة العصا. حدد منطقة الشبكية التي تفتقر إلى الأوعية.
    ملاحظة: يمكن تحديد مساحات أكبر أو أصغر اعتمادا على التفاوت. لضبط التسامح ، انقر فوق رمز أداة العصا مرتين. الوضع المستخدم: الإرث.
  2. اضغط على الحرف T على لوحة المفاتيح لتسجيل المنطقة المحددة في إدارة عائد الاستثمار. كرر الخطوتين 5.1 و5.2 مع جميع المناطق اللاوعائية في شبكية العين.
  3. انقر فوق قياس في مدير عائد الاستثمار للحصول على معلومات منطقة الأوعية الدموية. سيعرض البرنامج نافذة جديدة تحتوي على المعلومات المطلوبة. انسخ البيانات في برنامج آخر أو احفظ الملف.
    ملاحظة: في بعض الصور، قد يفضل المرء تحديد المناطق اللاوعائية يدويا. في هذه الحالة ، اختر أداة تحديد المضلع ، وارسم مسافات قصيرة حول المنطقة الوعائية ، وانقر فوق الصورة عندما تكون مسافة جديدة على وشك البدء. أغلق المنطقة المحددة بالنقر فوق النقطة الأولى.
  4. كرر الخطوات 5.1 و5.2 و5.3 لقياس المساحة الكلية لشبكية العين.
  5. احسب المساحة اللاوعائية للشبكية كمجموع جميع المناطق اللاوعائية المقاسة مقسوما على المساحة الكلية للشبكية.

6. القياس الكمي للمناطق الوعائية الجديدة

  1. في شريط القوائم، اختر أداة العصا.
  2. قم بتكبير الصورة لتصور الأوعية الجديدة بشكل أفضل. حدد الأوعية الجديدة واحدة تلو الأخرى باستخدام أداة العصا.
    ملاحظة: اضبط التسامح الذي لا يزيد عن 20 لضمان اختيار سفينة جديدة واحدة. يجب أن يظل مستوى التسامح هذا ثابتا أثناء جميع عمليات القياس الكمي للصورة.
  3. اضغط على الحرف T على لوحة المفاتيح لتسجيل المنطقة المحددة في إدارة عائد الاستثمار. كرر الخطوتين 6.1 و6.2 مع جميع مناطق الأوعية الدموية الجديدة في شبكية العين.
  4. انقر فوق قياس في مدير عائد الاستثمار للحصول على بيانات المنطقة. سيعرض البرنامج نافذة جديدة تحتوي على المعلومات المطلوبة. انسخ البيانات في برنامج آخر أو احفظ الملف.
  5. كرر الخطوات 6.1 و6.2 و6.3 لتحديد المساحة الكلية لشبكية العين.
  6. احسب المساحة الوعائية الجديدة للشبكية كمجموع جميع مناطق الأوعية الدموية الجديدة المقاسة مقسوما على المساحة الكلية للشبكية.

7. القياس الكمي لقطر السفينة

  1. في شريط القوائم، حدد أداة الخط المستقيم.
  2. قم بتكبير الصورة لتصور جدار الوعاء بشكل أفضل. قم بإجراء ثلاثة خطوط عرضية إلى الوعاء الرئيسي قبل الفرع الأول. يجب أن يتم ذلك عن طريق رسم خط من حدود جدار واحد من السفينة إلى العكس.
    ملاحظة: يجب أن يكون الخط عموديا تماما على وعاء الحائط لتجنب أخطاء القياس الكمي.
  3. اضغط على الحرف T على لوحة المفاتيح لتسجيل المنطقة المحددة في إدارة عائد الاستثمار. كرر الخطوتين 7.1 و 7.2 في كافة السفن التي تحتاج إلى تحديد كمي.
  4. انقر فوق قياس في مدير عائد الاستثمار للحصول على بيانات المسافة. سيعرض البرنامج نافذة جديدة تحتوي على المعلومات المطلوبة. انسخ البيانات في برنامج آخر أو احفظ الملف.

8. القياس الكمي للالتواء السفينة

  1. في شريط القوائم ، انقر فوق أيقونة أداة الخط المستقيم بالزر الأيمن من الماوس وحدد خطا مجزأ أو خطا حرا. ارسم خطا داخل الوعاء من العصب البصري حتى يتشعب الوعاء الأول بعد شكل الأوعية الدموية.
    ملاحظة: يجب أن يتبع الخط شكل الأوعية الدموية لتجنب أخطاء القياس الكمي.
  2. اضغط على الحرف T على لوحة المفاتيح لتسجيل المنطقة المحددة في إدارة عائد الاستثمار.
  3. في شريط القوائم، حدد أداة الخط المستقيم. ارسم خطا من العصب البصري حتى تشعب الوعاء الأول.
  4. اضغط على الحرف T على لوحة المفاتيح لتسجيل المنطقة المحددة في إدارة عائد الاستثمار.
  5. انقر فوق قياس في مدير عائد الاستثمار للحصول على بيانات المسافات. سيعرض البرنامج نافذة جديدة تحتوي على المعلومات المطلوبة. انسخ البيانات في برنامج آخر أو احفظ الملف.
  6. احسب مؤشر الالتواء على النحو التالي: المسافة التي تم الحصول عليها باستخدام الخط المجزأ مقسوما على المسافة التي تم الحصول عليها باستخدام الخط المستقيم.

9. القياس الكمي لتفرع الأوعية الدموية

  1. باستخدام الأداة البيضاوية لشريط القوائم، حدد مساحة مطبقة بالتساوي على جميع الظروف التجريبية. يجب أن تكون المنطقة المحددة دائرة متحدة المركز مرسومة حول العصب البصري.
  2. اضغط على الحرف T على لوحة المفاتيح لتسجيل المنطقة المحددة في إدارة عائد الاستثمار.
    ملاحظة: في هذه الحالة، يوصى بحفظ عائد الاستثمار لأن القياس الكمي بطيء ويجب استخدام عائد الاستثمار المطابق في جميع الصور. للقيام بذلك ، في مدير عائد الاستثمار ، انقر فوق MORE > حفظ.
  3. يدويا ، عد عدد الفروع الأولية الناشئة عن الأوعية الرئيسية داخل منطقة الاختيار.
  4. كرر الخطوتين 9.2 و9.3 في المناطق المجاورة، مع الحفاظ على معايير محيط العصب البصري.

10. القياس الكمي لكثافة الأوعية الدموية

  1. قم بتحويل الصورة إلى وضع 8 بت.
  2. انتقل إلى المكونات الإضافية في شريط القوائم ، وحدد تحليل الوعاء > كثافة الأوعية الدموية.
  3. حدد مساحة باستخدام الأداة المربعة لشريط القوائم، حيث يلزم قياس كثافة الوعاء. انقر فوق موافق.
  4. سيعرض البرنامج نافذة جديدة تحتوي على المعلومات المطلوبة. انسخ البيانات في برنامج آخر أو احفظ الملف.
  5. كرر الخطوات 10.2 و 10.3 و 10.4 في المناطق المجاورة ، مع الحفاظ على عائد الاستثمار ولكن وضعه تسع مرات يشمل محيط ومركز شبكية العين بأكملها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

كما هو موضح في قسم البروتوكول ، من فحص تلطيخ الفلورسنت واحد ، يمكنك الحصول على مورفولوجيا الأوعية الدموية وتقييم العديد من المعلمات ذات الأهمية كميا. يعتمد البحث عن تغيير معين على نوع اعتلال الشبكية الذي تمت دراسته. في هذه المقالة ، تم تقييم المناطق الوعائية والأوعية الدموية الجديدة ، والالتواء ، والتوسع في نموذج الفأر لاعتلال الشبكية التكاثري ، في حين تم تحليل تفرع الأوعية الدموية وكثافتها في نموذج فأر MetS ، مما يؤدي إلى اعتلال الشبكية غير التكاثري.

في المثال التجريبي الأول ، تم استخدام نموذج فأر اعتلال الشبكية الناجم عن الأكسجين (OIR) ، والذي يشبه اعتلال الشبكية الخداجي وبعض ميزات المرحلة التكاثرية من اعتلال الشبكية السكري. في هذا النموذج ، يتم الحفاظ على الفضلات مع أمهم المرضعة في غرفة مفرطة الأكسدة من يوم ما بعد الولادة (P) 7 إلى P1218. تم إجراء الحقن داخل الجسم الزجاجي في P12 لتحديد فعالية الدواء كمضاد لتولد الأوعية الدموية (حالة تسمى العلاج). تم التضحية بالفئران في P17 ، وهي النقطة الزمنية لأقصى تكوين للذئاب الجديدة19. تم استخدام الفئران التي تم حقنها بالسيارة كعنصر تحكم. تم إصلاح كلتا العينتين وتلطيخهما ب Isolectin GSA-IB4 معا. بعد الحصول على البؤرية ، تم تحليل الصور باستخدام برنامج ImageJ FIJI كما هو موضح أعلاه. مع دمج وحدة الخياطة في المجهر البؤري ، لوحظت الحامل الكامل كصورة فريدة من نوعها (الشكل 1). في P17 ، من الممكن مراقبة الأوعية الدموية الهيالويد ، وهو نظام وعائي عابر ضروري خلال الحياة داخل الرحم (الشكل 1 ، الأسهم البيضاء)20.

نتيجة لتوفير الأكسجين المفرط في الغرفة مفرطة الأكسدة ، تقوم فئران OIR بإيقاف تطور الأوعية الدموية الفسيولوجية وتوليد مناطق لا وعائية في شبكية العين. ثم ، يتم تعريف المناطق اللاوعائية على أنها المناطق التي تفتقر إلى الأوعية الدموية في شبكية العين (الشكل 2). من الصور التي تم الحصول عليها ، يمكن تحديد المناطق اللاوعائية كميا على أنها مجموع المناطق التي لا تحتوي على أوعية مقسومة على المساحة الكلية للشبكية. المناطق ذات الأضرار الميكانيكية تظهر أيضا عدم وجود سفن. لتحديد المناطق المتضررة ، قم بتحليل سلامة الطبقات العصبية مع بقعة Hoechst.

تتجنب المناطق اللاوعائية في شبكية العين توصيل الأكسجين ، وبالتالي ، يتم تعيين استجابة قوية مؤيدة للأوعية الدموية ، مما يؤدي إلى الأوعية الدموية الجديدة16. Neovessels هي أوعية صغيرة العيار تنشأ من وعاء موجود مسبقا من الضفيرة الوعائية العليا. هيكلها غير منظم ، وبالتالي ، تنمو الأوعية الجديدة كخصلات نحو التجويف الزجاجي21. قمنا بحساب المساحة التي تشغلها خصلات الأوعية الدموية الجديدة عن طريق تحديد مساحة الأوعية الدموية الجديدة في شبكية العين مقسوما على المساحة الكلية للشبكية (الشكل 3). نظرا لأن شكل وحجم الأوعية الجديدة متغيران ، فقد تبدو أحيانا مشابهة للحطام والتحف. للتمييز بين الأوعية الجديدة ، تحقق من أن الخصلة تنمو من وعاء ناضج.

التوسع الوعائي والالتواء هما تغييران متكرران آخران ، لهما آثار سلبية على بيولوجيا الأوعية الدموية ، لأنها تنتج الدورة الدموية المضطربة. لتحليل التمدد ، قمنا بقياس قطر الأوعية الرئيسية على ثلاثة ارتفاعات قبل الفرع الأول22,23 (الشكل 4). يجب على الباحثين تحديد مسافة محددة مسبقا لقياس قطر الوعاء من أجل تقليل التباين بين النتائج. من الناحية المثالية ، يجب أن تكون أبعد نقطة عن العصب البصري حوالي 300 ميكرومتر. نقترح إجراء التحليل وبعد ذلك نأخذ ما معدله ستة فئران على الأقل لكل حالة.

فيما يتعلق بالالتواء، نقيس المسافة التي تغطيها الأوعية الرئيسية بعد شكلها فيما يتعلق بالمسافة المستقيمة بين العصب البصري ونقطة التفرع الأولى24 (الشكل 5). كما نرى في الصورة ، هناك عدم تجانس في سرعة الأوعية الرئيسية. للحصول على نتيجة تمثيلية ، يجب تحديد كمية لا تقل عن ستة فئران لكل حالة.

تم تحليل أحدث المعلمات ، تفرع الأوعية الدموية وكثافتها ، في نموذج MetS الذي يظهر اعتلال الشبكية غير التكاثري. في MetS، ترتبط كل من اختلالات الدهون والكربوهيدرات بالخلايا المحيطة بالشبكية واختلال وظائف الخلايا البطانية وموتها، مما يؤدي إلى تكوين الشعيرات الدموية اللاخلوية أو انخفاض تفرع الأوعية الدموية25. في نموذجنا ، تم تغذية الفئران ApoE-KO بالفركتوز المضاف إلى مياه الشرب ، بتركيز 10٪ w / v. الحيوانات السيطرة تلقت للتو مياه الصنبور. بعد 4 أشهر من النظام الغذائي ، تم التضحية بالفئران ، ومعالجة شبكية العين كما هو موضح من قبل. لقياس تفرع الأوعية الدموية ، حددنا منطقة القياس الكمي عن طريق رسم دائرة متحدة المركز ، ثم قمنا بحساب ، واحدة تلو الأخرى ، الفروع الأولية الناشئة عن وعاء مركزي رئيسي (الشكل 6).

من الصور التي تم الحصول عليها ، تم تحديد كثافة الأوعية الدموية كميا على أنها المساحة التي تشغلها الأوعية مقسومة على مساحة عائد الاستثمار (مربع 0.015 مم 2 ، انظر التسطيح في الشكل 7) ، والذي تم وضعه في أماكن مختلفة في كل صورة ميكروفوتوغرافية ، كما تم شرحه في قسم البروتوكول. تجنب تحديد المناطق ذات الأضرار الميكانيكية (الشكل 7 ، الأسهم البيضاء). إذا كان هناك أكثر من منطقتين مع ثقوب ، فيجب التخلص من شبكية العين.

Figure 1
الشكل 1: تلطيخ الأوعية الدموية للشبكية بالكامل المسمى Isolectin GSA-IB4: صور متحدة البؤرة تمثيلية لشبكية العين الفئران P17 OIR المحقونة بالسيارة أو العلاج في P12. تم إجراء تلطيخ الفلورسنت في شبكية العين الكاملة باستخدام Isolectin GSA-IB4 Alexa 488 وفقا للبروتوكول. يشار إلى المناطق الوعائية (AV) والمناطق الوعائية الجديدة (NV). شريط المقياس: 500 ميكرومتر. تظهر الأسهم البيضاء بقايا الأوعية الدموية اللامية. تظهر الأسهم الصفراء مناطق مسح ضوئي غير مكتملة أثناء الحصول على صورة متحدة البؤرة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: التحديد الكمي للمناطق اللاوعائية: (أ) صور تمثيلية لشبكية العين الكاملة في P17 تظهر تلطيخ الأوعية الدموية GSA-IB4 في الفئران المعالجة بالموجات فوق الصوتية وفئران معالجة الترددات العميقة. يشار إلى المناطق ذات الطمس الوعائي باللون الأصفر. شريط المقياس: 500 ميكرومتر (B) تم تحديد مساحة AV (٪) كميا كنسبة من المنطقة اللاوعائية المركزية إلى منطقة الشبكية بأكملها. تم استخدام اختبار t-test غير المقترن ثنائي الذيل للمقارنة الإحصائية. البيانات المقدمة كمتوسط ± SEM. *** p < 0.001. تم توظيف ما لا يقل عن ستة لكل حالة في وقت البقاء على قيد الحياة الذي تم فحصه. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: التحديد الكمي للمناطق الوعائية الجديدة: (أ) صور تمثيلية لشبكية العين الكاملة في P17 تظهر تلطيخ الأوعية الدموية GSA-IB4 في الفئران المعالجة بالذئبة الداخلية وفئران معالجة الترددات العميقة. يشار إلى المناطق ذات الأوعية الدموية الجديدة باللون الأبيض. شريط المقياس: 500 ميكرومتر (B) تم تحديد مساحة NV (٪) كميا كنسبة المساحة التي تشغلها الأوعية الجديدة إلى منطقة الشبكية بأكملها. تم استخدام اختبار t-test غير المقترن ثنائي الذيل للمقارنة الإحصائية. البيانات المقدمة كمتوسط ± SEM. *** p < 0.001. تم توظيف ما لا يقل عن ستة لكل حالة في وقت البقاء على قيد الحياة الذي تم فحصه. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: القياس الكمي لتوسع الأوعية الدموية: (أ) صور تمثيلية لشبكية العين الكاملة في P17 تظهر تلطيخ الأوعية الدموية GSA-IB4 في الفئران OIR-vehicle و OIR المعالجة. اللوحات اليسرى: عائد الاستثمار المحدد للقياس الكمي. اللوحات اليمنى: تكبير عائد الاستثمار، وإظهار الخطوط المستقيمة التي يتم تنفيذها في وعاء رئيسي لقياس قطر السفينة. تم تتبع ثلاثة خطوط بشكل عرضي إلى السفينة ومتوسطها. شريط المقياس: 100 ميكرومتر (B) تم تحديد قطر الوعاء (٪) كميا كمتوسط القطر المقاس في الأوعية الرئيسية في شبكية العين. تم استخدام اختبار t-test غير المقترن ثنائي الذيل للمقارنة الإحصائية. البيانات المقدمة كمتوسط ± SEM. * p < 0.05. تم توظيف ما لا يقل عن ستة لكل حالة في وقت البقاء على قيد الحياة الذي تم فحصه. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 5
الشكل 5: تحديد مؤشر الالتواء: (أ) صور تمثيلية لشبكية العين الكاملة في P17 تظهر تلطيخ الأوعية الدموية GSA-IB4 في الفئران المعالجة بالذئبة الداخلية وفئران معالجة التواء التواء الذئبة الداخلية. اللوحات اليسرى: عائد الاستثمار المحدد للقياس الكمي. اللوحات المركزية: تكبير/تصغير عائد الاستثمار، وإظهار خطوط مجزأة تم تتبعها في وعاء رئيسي من العصب البصري إلى نقطة التفرع الأولى. اللوحات اليمنى: تكبير عائد الاستثمار ، وإظهار الخطوط المستقيمة التي تم تتبعها في وعاء رئيسي من العصب البصري إلى نقطة التفرع الأولى. شريط المقياس: 100 ميكرومتر (B) تم الحصول على مؤشر الالتواء عن طريق قسمة مسافة الخط المجزأ إلى مسافة الخط المستقيم. تم استخدام اختبار t-test غير المقترن ثنائي الذيل للمقارنة الإحصائية. البيانات المقدمة كمتوسط ± SEM. ns ، غير مهمة. تم توظيف ما لا يقل عن ستة لكل حالة في وقت البقاء على قيد الحياة الذي تم فحصه. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 6
الشكل 6: التحديد الكمي لتفرع الأوعية الدموية: (أ) صور تمثيلية لشبكية العين الكاملة التي تظهر تلطيخ الأوعية الدموية Isolectin GSA-IB4 في الفئران التي تتغذى على ApoE-KO و ApoE-KO + الفركتوز. تم تعريف مناطق القياس الكمي الدائري باللون الأصفر. شريط المقياس: 100 ميكرومتر ، تكبير 100x. (ب) تم تحديد عدد الفروع كميا على أنه عدد الفروع الأولية من وعاء رئيسي ، لأن العصب البصري إلى المحيط. تم استخدام اختبار t-test غير المقترن ثنائي الذيل للمقارنة الإحصائية. البيانات المقدمة كمتوسط ± SEM. ns ، غير مهمة. تم توظيف ما لا يقل عن ستة لكل حالة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 7
الشكل 7: القياس الكمي لكثافة الأوعية الدموية: (أ) صور تمثيلية لشبكية العين الكاملة التي تظهر تلطيخ الأوعية الدموية Isolectin GSA-IB4 في الفئران التي تتغذى على ApoE-KO و ApoE-KO + الفركتوز. تم تعريف مساحة قياس مربع 0.015 مم 2 باللون الأصفر. شريط المقياس: 100 ميكرومتر ، تكبير 100x. (ب) تم تحديد كثافة الأوعية الدموية كميا كنسبة مساحة الأوعية الدموية إلى إجمالي مساحة عائد الاستثمار، والتي تم وضعها تسع مرات في أماكن مختلفة في كل صورة ميكروفوتوغرافية. تظهر الأسهم البيضاء المناطق ذات الأضرار الميكانيكية. تم استخدام اختبار t-test غير المقترن ثنائي الذيل للمقارنة الإحصائية. البيانات المقدمة كمتوسط ± SEM. ns ، غير مهمة. تم توظيف ما لا يقل عن ستة لكل حالة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

النماذج الحيوانية لاعتلال الشبكية هي أدوات قوية لدراسة تطور الأوعية الدموية أو إعادة تشكيلها أو تكوين الأوعية الدموية المرضية. يعتمد نجاح هذه الدراسات في هذا المجال على سهولة الوصول إلى الأنسجة التي تسمح بإجراء مجموعة واسعة من التقنيات ، مما يوفر بيانات من الفئران في الجسم الحي وبعد الوفاة26,27. علاوة على ذلك، تم العثور على علاقة كبيرة بين الدراسات في الجسم الحي والتحليل السريري، مما يوفر إمكانية تتبع وموثوقية قوية لهذه النماذج28. في هذه المقالة ، نقدم وصفا بسيطا وقويا لخطوات توصيف شبكة الأوعية الدموية في نماذج الفئران لأمراض الأوعية الدموية في شبكية العين. في الأدبيات ، سيجد القراء معلمات أخرى ممكنة للقياس ومناهج موازية لتحديد تلك المختارة هنا. للبروتوكولات المجمعة فوائد عديدة على غيرها لأنها قابلة للتكرار، وتتطلب فقط برنامجا مجانيا لإجراء التحليل (Image J Fiji).

علاوة على ذلك ، من السهل تنفيذ هذه البروتوكولات من قبل الطلاب الذين ليس لديهم معرفة واسعة بالبرنامج ومعظم القياسات لا تحتاج إلى مكونات إضافية (باستثناء كثافة الأوعية الدموية).

استخراج العينات وتقنية تلطيخ التألق بسيطة وموجزة29. من المهم جدا العمل مع شبكية العين الطازجة ، على الرغم من أنه يمكن تخزينها عند 4 درجات مئوية في PBS مع مثبطات نمو البكتيريا. نظرا لأن الأنسجة رقيقة وناعمة ، فإن العينات القديمة تنهار بشكل متكرر أثناء الحضانة أو عند فتح العينة قبل التركيب. إلى جانب ذلك ، فإن التثبيت المفرط بنسبة 4٪ PFA يحول شبكية العين إلى جامدة وهشة بشكل مفرط ، ولكن هذا لا يؤثر على تلطيخ الليكتين. يسمح تلطيخ Isolectin GSA-IB4 بتصور شبكة الأوعية الدموية الكاملة في كل طبقة ، بما في ذلك الأوعية الدموية الجديدة والخلايا البطانية المتكاثرة. تتطلب العلامات الأخرى ، مثل CD 31 ، حضانة العينة بأجسام مضادة مركزة ولها خلفية أكبر. من ناحية أخرى ، في تصوير الأوعية الدموية ، تميل صبغة الفلورسنت إلى الانتشار خارج الأوعية ، مما يزيد من التباين في عيار الوعاء وقياس كمية الالتواء. أحد عيوب Isolectin GSA-IB4 هو أنه يمكنه أيضا تسمية الخلايا الدبقية الصغيرة30. يجب توخي الحذر عند إجراء الحقن داخل الجسم الزجاجي أو غيرها من الإجراءات التجريبية التي تحفز التسلل المفرط لأن الخلايا الدبقية الصغيرة يمكن أن تشكل تكتلات.

يمكن إجراء الحصول على الصور باستخدام أي مجهر متحد البؤرة. سيوفر استخدام زوج من اللوحات الآلية لبرنامج يتضمن وحدة الخياطة تصورا كاملا لشبكية العين المثبتة بالكامل في صورة واحدة. عند تحديد منطقة الشبكية ، تأكد من تضمين جميع أطراف العينة ، وإلا فإن الصورة ستكون غير مكتملة (الشكل 1 ، الأسهم الصفراء). هذا ليس ذا صلة كبيرة في نموذج الماوس من OIR ، على سبيل المثال ، لأن تغيرات الأوعية الدموية بالقرب من العصب البصري. بينما في نموذج الفئران من OIR ، يمكن أن يؤدي هذا الخطأ إلى تحديد كمي غير دقيق ، حيث أن المناطق الوعائية والأوعية الدموية الجديدة بجوار limbus. هناك احتمال آخر هو أخذ الصور الدقيقة الفردية للشبكية. يمكن للمستخدم لاحقا تنظيمها كلغز باستخدام برنامج مناسب. لا ينصح باستخدام مجهر epifluorescence ، خاصة عند تحليل التفرع ، لأن الأوعية تنبت في جميع أنحاء سمك الشبكية بالكامل ولن يتم اكتشاف بعض الأوعية في مكدس z فقط.

أثناء معالجة الصور باستخدام ImageJ FIJI ، يوصى بعدم تحديث البرنامج حتى يتم تحديد جميع الصور كميا ، من أجل الحفاظ على ظروف متطابقة في البرنامج. تعد معايرة الصور (تعيين حجم البكسل بالميكرونات) خطوة حاسمة لأن هذه البروتوكولات تعني التحديد الكمي للمسافات والمساحات. عند التعرف على البرنامج ، يمكن للمستخدم استكشاف أدوات أخرى لتحديد الأوعية الدموية الجديدة والمنطقة اللاوعائية بالإضافة إلى أداة العصا. تعد أداة اختيار المضلع مفيدة بشكل خاص لقياس المناطق اللاوعائية التي تم قطعها إلى قسمين عند خطوة التركيب. ابتكر باحثون آخرون مكونات إضافية محددة لأتمتة اختيار الأوعية الجديدة بناء على شدة التألق لهذه الهياكل. هذه الطرق أسرع وأقل شاقة ، على الرغم من أنه يوصى بالتحقق من اختيار الأوعية الجديدة الصغيرة الأقل لمعانا قبل القياس الكمي31. سوف تتألق مناطق الأوعية الجديدة بشكل مكثف أكثر من الأوعية العادية المحيطة. تحدد أداة العصا السحرية المساحات الملونة بشكل مشابه ويحدد التسامح مدى تشابه البيكسلات المحددة في اللون. إذا كانت الأوعية الجديدة ذات كثافة مماثلة للأوعية العادية ، فقد يتم ضبط التسامح لأسفل لزيادة الحساسية لاختلافات الكثافة الدقيقة. على الرغم من أن اختيار الأوعية الجديدة في كل عينة سيتم إجراؤه بعتبة متطابقة ، إلا أن بعض الأوعية الجديدة تتميز بكثافة تألق طفيفة. في هذه الحالة ، ستكون هناك حاجة إلى تسامح أقل للاختيار الصحيح.

الالتواء والتوسع هي قياسات المسافة. دراسة شاملة لشجرة الأوعية الدموية مفيدة لاختيار الأوعية من نفس النوع (الشرايين أو الأوردة) والعيار. نقيس التمدد في الأوعية على ثلاثة ارتفاعات كما هو موضح في الشكل 4. زاوية الاختيار المستقيم فيما يتعلق بجدار الوعاء هي نقطة أخرى ذات صلة يجب مراعاتها. يجب أن يكون هذا أقرب ما يمكن إلى 90 درجة لتجنب الأخطاء المحتملة. عند رسم الخط المستقيم ، يمكن للمستخدمين استخدام أداة التكبير / التصغير للاقتراب من وعاء الاهتمام.

يمكن أيضا قياس تفرع الأوعية الدموية في منطقتين أو أكثر من مناطق القياس الكمي ذات الارتفاعات المختلفة ، إذا رغبت في ذلك. في هذه الحالة ، يجب على الباحثين الحفاظ على منطقة الشبكية التي تم تحليلها (الجانب المركزي أو المتوسط أو المحيطي من العصب البصري). على الرغم من أن التفرع يتغير في العديد من النماذج الحيوانية لاعتلال الشبكية، إلا أن المراحل المبكرة من اعتلال الشبكية المرتبط ب MetS المعروضة هنا لا تزال لا تظهر مثل هذه التغييرات15. لإجراء دراسات مكثفة في الشعيرات الدموية الشبكية للضفيرة المتوسطة والعميقة ونمو الأوعية الدموية ، توفر الطرق الحسابية ثلاثية الأبعاد بيانات قيمة عن الاختلافات الدقيقة في مورفولوجيا الأوعية الدموية والشبكة32. أخيرا ، يتم تحديد كثافة الأوعية الدموية من خلال المساحة التي تشغلها الأوعية فيما يتعلق بالمساحة الإجمالية لعائد الاستثمار المحدد. يتطلب قياس هذه المعلمة استخدام مكون إضافي وإصدار فعلي من ImageJ FIJI ، حيث يجب أن تتوفر أدوات Auto Threshold و Geometry to Distance Map. على الرغم من هذه الخطوات الإضافية ، فإن المكون الإضافي سهل الاستخدام وقابل للتكرار وموثوق. لقياس كثافة الأوعية الدموية ، تم اختيار عائد استثمار قدره 0.015 مم 2 ، من أجل إجراء عشرة قياسات لشدة التألق في مناطق مختلفة من شبكية العين. سمح لنا هذا الحجم بتغطية الصورة بأكملها ، وبالتالي الحصول على متوسط قيمة أكثر تمثيلا وانحرافها في كل شبكية.

بشكل عام ، على الرغم من حقيقة أن هذه المجموعات من الأساليب ليست مؤتمتة وتتطلب اختيارا يدويا للمعلمات ، إلا أنها قادرة على توفير بيانات كمية وصارمة عن شبكية العين. يعتمد القيد الرئيسي فيما يتعلق بالبروتوكولات المقدمة أعلاه لقياسات الأوعية الدموية على التباين بين الفاحصين عند تحليل نفس الصورة. لتقليل هذا التحيز ، من المهم تحديد الإعداد العام مسبقا كحدود لجدار الأوعية الدموية ، وتحديد المناطق اللاوعائية والأوعية الدموية الجديدة ، وكذلك معايير الاستبعاد للأنسجة التالفة. فيما يتعلق بالتواء الوعاء ، يلزم وجود نقطة انطلاق متفق عليها بجوار العصب البصري. بالنسبة للمستخدمين المبتدئين ، يوصى بشدة بمتوسط البيانات التي يجمعها اثنان أو أكثر من الفاحصين. وفي المستعملين المدربين، لم يعثر على فروق ذات دلالة إحصائية في قياس مختلف البارامترات، ما دام الاتفاق على معايير القياس الكمي ثابتا. وبالمثل ، يمكن إضافة معلمات إضافية إلى البروتوكولات المدرجة ، اعتمادا على التغيرات الوعائية المكتشفة في اعتلال الشبكية. في اعتلال الشبكية غير التكاثري ، فإن قياس عدد الشعيرات الدموية اللاخلوية ، والخلايا المحيطية المهاجرة ، ونسبة عدد الخلايا المحيطية / البطانية ونفاذية حاجز الشبكية في الدم هي أقدم المعلمات التي تم تغييرها في الأوعية الدموية للشبكية33,34,35. بالنسبة للنماذج المزمنة واعتلال الشبكية الخفيف ، ينصح بتضمين هذه القياسات الإضافية. سيوفر عدد كبير من المعلمات التي تم قياسها مشهدا أكثر إخلاصا للأحداث التي تجري في الأوعية الدموية. باختصار ، في هذه المقالة ، أظهرنا تقنيات كلاسيكية وراسخة وقابلة للتكرار لتحديد بعض المعلمات الأكثر صلة التي تؤخذ في الاعتبار في الممارسة السريرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن المؤلفون أن البحث أجري في غياب أي علاقات تجارية أو مالية يمكن تفسيرها على أنها تضارب محتمل في المصالح.

Acknowledgments

ونشكر كارلوس ماس، وماريا بيلار كريسبو، وسيسيليا سامبيدرو من مركز ميكرو ونانوسكوبيا قرطبة، CONICET-UNC، قرطبة، الأرجنتين) على المساعدة في الفحص المجهري البؤري، وإلى سوليداد ميرو وفيكتوريا بلانكو على الرعاية المتفانية للحيوانات، وإلى لورا غاتيكا على المساعدة النسيجية. كما نشكر فيكتور دياز (السكرتير المؤيد للاتصال المؤسسي في FCQ) على إنتاج الفيديو وإصداره وبول هوبسون على قراءته النقدية ومراجعته اللغوية للمخطوطة.

تم تمويل هذه المقالة من خلال منح من أمانة العلوم والتكنولوجيا ، والجامعة الوطنية في قرطبة (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021 ، Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT) ، Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (جميعها إلى M.C.S).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aluminuim foil
Bovine Serum Albumin Merck A4503 quality
Calcium chloride dihydrate Merck C3306
Hydrochloric acid Biopack 9632.08
Confocal Microscope FV1200 Olympus FV1200 with motorized plate
Covers Paul Marienfeld GmnH & Co. 111520
Dissecting Microscope NIKON SMZ645
Disodium-hydrogen-phosphate dihydrate Merck 119753
200 µL  tube Merck Z316121
Filter paper Merck WHA5201090
Incubator shaker GyroMini LabNet International S0500
Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate Invitrogen I21411
Poly(vinyl alcohol) (Mowiol 4-88) Merck 475904
Paraformaldehyde Merck 158127
pHmeter SANXIN PHS-3D-03
Potassium chloride Merck P9541
Potassium-dihydrogen phosphate Merck 1,04,873
Slides Fisher Scientific 12-550-15
Sodium chloride Merck S3014
Sodium hydroxide Merck S5881
Tris Merck GE17-1321-01
Triton X-100 Merck X100-1GA
Vessel Analysis Fiji software Mai Elfarnawany https://imagej.net/Vessel_Analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kur, J., Newman, E. A., Chan-Ling, T. Cellular and physiological mechanisms underlying blood flow regulation in the retina and choroid in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (5), 377-406 (2012).
  2. McDougal, D. H., Gamlin, P. D. Autonomic control of the eye. Comprehensive Physiology. 5 (1), 439-473 (2015).
  3. Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. Retinal vasculature development in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (2018).
  4. Wei, Y., et al. Age-related alterations in the retinal microvasculature, microcirculation, and microstructure. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (9), 3804-3817 (2017).
  5. Lavia, C., et al. Reduced vessel density in the superficial and deep plexuses in diabetic retinopathy is associated with structural changes in corresponding retinal layers. PLoS One. 14 (7), 0219164 (2019).
  6. Rosenblatt, T. R., et al. Key factors in a rigorous longitudinal image-based assessment of retinopathy of prematurity. Scientific Reports. 11 (1), 5369 (2021).
  7. Edwards, A. L. Funduscopic examination of patients with diabetes who are admitted to hospital. Canadian Medical Association Journal. 134 (11), 1263-1265 (1986).
  8. Lechner, J., O'Leary, O. E., Stitt, A. W. The pathology associated with diabetic retinopathy. Vision Research. 139, 7-14 (2017).
  9. Sun, Z., et al. angiography metrics predict progression of diabetic retinopathy and development of diabetic macular edema: A prospective study. Ophthalmology. 126 (12), 1675-1684 (2019).
  10. Jia, Y., et al. Quantitative optical coherence tomography angiography of vascular abnormalities in the living human eye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 2395-2402 (2015).
  11. Pauleikhoff, D., Gunnemann, F., Book, M., Rothaus, K. Progression of vascular changes in macular telangiectasia type 2: comparison between SD-OCT and OCT angiography. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 257 (7), 1381-1392 (2019).
  12. Gammons, M. V., Bates, D. O. Models of oxygen induced retinopathy in rodents. Methods in Molecular Biology. 1430, 317-332 (2016).
  13. Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal models of choroidal and retinal neovascularization. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).
  14. Han, N., Xu, H., Yu, N., Wu, Y., Yu, L. MiR-203a-3p inhibits retinal angiogenesis and alleviates proliferative diabetic retinopathy in oxygen-induced retinopathy (OIR) rat model via targeting VEGFA and HIF-1α. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 47 (1), 85-94 (2020).
  15. Paz, M. C., et al. Metabolic syndrome triggered by fructose diet impairs neuronal function and vascular integrity in ApoE-KO mouse retinas: Implications of autophagy deficient activation. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 573987 (2020).
  16. Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).
  17. Zarb, Y., et al. Ossified blood vessels in primary familial brain calcification elicit a neurotoxic astrocyte response. Brain. 142 (4), 885-902 (2019).
  18. Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).
  19. Subirada, P. V., et al. Effect of autophagy modulators on vascular, glial, and neuronal alterations in the oxygen-induced retinopathy mouse model. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 279 (2019).
  20. Lutty, G. A., McLeod, D. S. Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).
  21. Kim, C. B., D'Amore, P. A., Connor, K. M. Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).
  22. Guaiquil, V. H., et al. A murine model for retinopathy of prematurity identifies endothelial cell proliferation as a potential mechanism for plus disease. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5294-5302 (2013).
  23. Mezu-Ndubuisi, O. J. In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery. Optometry and Vision Science: Official Publication of the American Academy of Optometry. 93 (10), 1268-1279 (2016).
  24. Scott, A., Powner, M. B., Fruttiger, M. Quantification of vascular tortuosity as an early outcome measure in oxygen induced retinopathy (OIR). Experimental Eye Research. 120, 55-60 (2014).
  25. Kim, A. Y., et al. Quantifying microvascular density and morphology in diabetic retinopathy using spectral-domain optical coherence tomography angiography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 362 (2016).
  26. Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
  27. Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal models of choroidal and retinal neovascularization. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).
  28. Kern, T. S., Antonetti, D. A., Smith, L. E. H. Pathophysiology of diabetic retinopathy: Contribution and limitations of laboratory research. Ophthalmic Research. 62 (4), 196-202 (2019).
  29. Lorenc, V. E., et al. IGF-1R regulates the extracellular level of active MMP-2, pathological neovascularization, and functionality in retinas of OIR mouse model. Molecular Neurobiology. 55 (2), 1123-1135 (2018).
  30. Ma, N., Streilein, J. W. Contribution of microglia as passenger leukocytes to the fate of intraocular neuronal retinal grafts. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (12), 2384-2393 (1998).
  31. Mazzaferri, J., Larrivée, B., Cakir, B., Sapieha, P., Costantino, S. A machine learning approach for automated assessment of retinal vasculature in the oxygen induced retinopathy model. Scientific Reports. 8 (1), 3916 (2018).
  32. Milde, F., Lauw, S., Koumoutsakos, P., Iruela-Arispe, M. L. The mouse retina in 3D: quantification of vascular growth and remodeling. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro (Camb). 5 (12), 1426-1438 (2013).
  33. Yang, T., et al. Pericytes of indirect contact coculture decrease integrity of inner blood-retina barrier model in vitro by upgrading MMP-2/9 activity. Disease Markers. 2021, 7124835 (2021).
  34. Huang, Q., Wang, S., Sorenson, C. M., Sheibani, N. PEDF-deficient mice exhibit an enhanced rate of retinal vascular expansion and are more sensitive to hyperoxia-mediated vessel obliteration. Experimental Eye Research. 87 (3), 226-241 (2008).
  35. Jiang, H., Zhang, H., Jiang, X., Wu, S. Overexpression of D-amino acid oxidase prevents retinal neurovascular pathologies in diabetic rats. Diabetologia. 64 (3), 693-706 (2021).

Tags

علم الأعصاب، العدد 181،
القياس الكمي للمعلمات الوعائية في شبكية العين الكاملة للفئران ذات اعتلال الشبكية غير التكاثري والتكاثري
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Subirada, P. V., Paz, M. C.,… More

Subirada, P. V., Paz, M. C., Vaglienti, M. V., Luna, J. D., Barcelona, P. F., Sánchez, M. C. Quantification of Vascular Parameters in Whole Mount Retinas of Mice with Non-Proliferative and Proliferative Retinopathies. J. Vis. Exp. (181), e63126, doi:10.3791/63126 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter