Summary
Denne artikel beskriver en veletableret og reproducerbar lectin plet assay for hele mount retinal præparater og de protokoller, der kræves for den kvantitative måling af vaskulære parametre ofte ændret i proliferative og ikke-proliferative retinopatier.
Abstract
Retinopatier er en heterogen gruppe af sygdomme, der påvirker det neurosensoriske væv i øjet. De er karakteriseret ved neurodegeneration, glioose og en progressiv ændring i vaskulær funktion og struktur. Selvom retinopatiernes begyndelse er karakteriseret ved subtile forstyrrelser i visuel opfattelse, er ændringerne i vaskulær plexus de første tegn, der opdages af klinikere. Fraværet eller tilstedeværelsen af neovascularization bestemmer, om retinopatien er klassificeret som enten ikke-proliferativ (NPDR) eller proliferativ (PDR). I denne forstand forsøgte flere dyremodeller at efterligne specifikke vaskulære træk ved hvert trin for at bestemme de underliggende mekanismer, der er involveret i endotelændringer, neuronal død og andre begivenheder, der finder sted i nethinden. I denne artikel vil vi give en komplet beskrivelse af de procedurer, der kræves til måling af retinale vaskulære parametre hos voksne og tidlige fødselsmus på postnatal dag (P)17. Vi vil detaljer protokollerne til at udføre retinal vaskulær farvning med Isolectin GSA-IB4 i hele mounts til senere mikroskopisk visualisering. Vigtige trin til billedbehandling med Image J Fiji-software leveres også, derfor vil læserne være i stand til at måle fartøjstæthed, diameter og tortuositet, vaskulær forgrening samt avaskulære og neovaskulære områder. Disse værktøjer er meget nyttige til at evaluere og kvantificere vaskulære ændringer i både ikke-proliferative og proliferative retinopatier.
Introduction
Øjnene næres af to arterio-venøse system: choroidal vaskulatur, et eksternt vaskulært netværk, der vander retinal pigmenteret epitel og fotoreceptorer; og neuro-retinal vaskulatur, der vander ganglion celler lag og det indre nukleare lag af nethinden1. Den retinale vaskulatur er et organiseret netværk af fartøjer, der leverer næringsstoffer og ilt til retinale celler og høste affaldsprodukter for at sikre korrekt visuel signalering transduktion. Denne vaskulatur har nogle forskellige funktioner, herunder: manglen på autonome innervation, regulering af vaskulær tone ved iboende retinale mekanismer og besiddelse af en kompleks retinal-blod barriere2. Derfor har retinal vaskulatur været i fokus for mange forskere, der i vid udstrækning har studeret ikke kun vasculogenese under udviklingen, men også de ændringer og den patologiske angiogenese, som disse fartøjer gennemgår i sygdomme3. De mest almindelige vaskulære ændringer observeret i retinopatier er fartøjsudvidelse, neovascularization, tab af vaskulær arborisering og deformation af de retinale hovedbeholdere, hvilket gør dem mere ziggaggy4,5,6. En eller flere af de beskrevne ændringer er de tidligste tegn, der skal opdages af klinikere. Vaskulær visualisering giver en hurtig, ikke-invasiv og billig screeningsmetode7. Den omfattende undersøgelse af de ændringer, der observeres i det vaskulære træ, vil afgøre, om retinopatien er ikke-proliferativ eller proliferativ og den videre behandling. De ikke-proliferative retinopatier kan manifestere sig med afvigende vaskulær morfologi, nedsat vaskulær tæthed, acellulære kapillærer, pericytter død, makulaødem, blandt andre. Hertil kommer, proliferative retinopatier også udvikle øget vaskulær permeabilitet, ekstracellulære remodeling, og dannelsen af vaskulære totter mod glaslegeme hulrum, der let nedbryde eller fremkalde nethinde løsrivelse8.
Når det er opdaget, retinopati kan overvåges gennem sine vaskulære ændringer9,10. Patologiens progression kan følges gennem de strukturelle ændringer af fartøjerne, som klart definerer stadier af sygdommen11. Kvantificeringen af vaskulære ændringer i disse modeller gjorde det muligt at korrelere fartøjsændringer og neuronal død og teste farmakologiske behandlinger for patienter i forskellige faser af sygdommen.
I lyset af ovenstående udsagn mener vi, at anerkendelse og kvantificering af vaskulære ændringer er grundlæggende i retinopatier undersøgelser. I dette arbejde vil vi vise, hvordan man måler forskellige vaskulære parametre. For at gøre det vil vi anvende to dyremodeller. En af dem er oxygen-induceret retinopati mus model12, som efterligner Retinopati af Præmaturitet og nogle aspekter af proliferative diabetisk Retinopati13,14. I denne model vil vi måle avaskulære områder, neovaskulære områder og udvidelse og tortuositet af hovedfartøjer. I vores laboratorium er der udviklet en metabolisk syndrom (MetS) musemodel, som fremkalder en ikke-proliferativ retinopati15. Her vil vi evaluere vaskulær tæthed og forgrening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
C57BL/6J mus blev håndteret i henhold til retningslinjerne i ARVO erklæring om brug af dyr i oftalmiske og Vision Research. Forsøgsprocedurerne blev udformet og godkendt af Det Institutionelle Udvalg for Dyrepleje og Anvendelse (CICUAL) ved Det Kemiske Fakultet, Córdobas nationale universitet (Res. HCD 1216/18).
1. Udarbejdelse af bufferløsninger og reagenser
- Fremstilling af 1x fosfatbuffer saltvand (PBS): Tilsæt 8 g natriumchlorid (NaCl), 0,2 g kaliumchlorid (KCl), 14,4 g disodium-hydrogen-fosfatdihydrat (Na2HPO4 2H2O) og 0,24 g kalium-dihydrogenphosphat (KH2PO4) til 800 mL destilleret vand. Rør opløsningen, indtil saltene er opløst fuldstændigt. pH-værdien justeres til 7,4 med chloridsyre (HCl) og volumen justeres til 1 L med yderligere destilleret vand. Filtrer opløsningen, og opbevar den ved 4 °C.
- Fremstilling af 4% paraformaldehyd (PFA): Tilsæt 40 g fast PFA til 800 mL frisklavet PBS. Rør opløsningen i en varmeplade ved en konstant temperatur på 60 °C. Der tilsættes 1 M natriumhydroxid (NaOH), indtil PFA er helt opløst, og kontroller, at pH-virksomheden opretholdes i et interval på 7,2-7,4. Fyld lydstyrken op til 1.000 mL med PBS og mix. Sluk for varmepladen, og filtrer opløsningen, når temperaturen er under 35 °C. Opløsningen opbevares ved 4 °C i op til 3 dage.
FORSIGTIG: PFA er skadelig, hvis den sluges, eller hvis den indåndes, og er sandsynligvis en mutageen forbindelse. Brug handsker og ansigtsmaske under hele processen, og arbejd i en sikkerhedskabine. - Fremstilling af 1x tris-buffered saltvand (TBS): Tilsæt 6,1 g tris og 9 g NaCl til 800 mL destilleret vand. Rør opløsningen, indtil saltene er opløst fuldstændigt. Juster pH til 7,4 med HCl, og opjuster lydstyrken til 1 L med yderligere destilleret vand. Filtrer opløsningen, og opbevar den ved 4 °C.
- Forberedelse af TBS- 0,1% Triton X-100: Tilsæt 0,1 mL TritonX-100 til 100 mL TBS. Bland forsigtigt og opbevar det ved 4 °C i op til 1 uge.
BEMÆRK: Da Triton er et meget tæt vaskemiddel, skæres spidsens terminal lidt for bedre pipettering. - Forberedelse af TBS-5%-Kvæg Serum Albumin (BSA) -0,1% Triton-X-100: Vejer 5 g BSA og tilsæt TBS- 0,1% triton X-100 opløsning op til et endeligt volumen på 100 mL. Rør forsigtigt. Aliquot og opbevares ved -20 °C i op til 2 måneder.
- Isolectin GSA-IB4 Alexa fluor-488 konjugat (Isolectin GSA-IB4): Vægt 36,75 mg calciumchlorid dihydrat (CaCl2·2H2O) og tilsæt det til 500 mL frisklavet PBS. Rør opløsningen med en omrørbar. Pipette 500 μL af opløsningen af CaCl2/PBS og tilsæt den til hætteglaset, der indeholder 500 μg lyophilized Isolectin GSA-IB4 pulver. Bland forsigtigt og aliquot opløsningen i 0,5 ML rør. Opbevar dem ved -20 °C beskyttet mod lys.
- Poly(vinylalkohol) i glycerol/tris: Vejer 2,4 g poly(vinylalkohol), tilsæt 6 g glycerol og rør forsigtigt. Tilsæt derefter 6 mL vand og fortsæt omrøring i flere timer ved stuetemperatur. Der tilsættes 12 mL forvarmet 0,2 M Tris opløsning (pH: 8,5) og opvarmes ved en konstant temperatur på 50 °C i 10 min. Endelig centrifugere opløsningen på 5.000 x g i 15 min for afklaring.
BEMÆRK: Lad opløsningen køle af ved stuetemperatur, aliquot den og opbevar den ved -20 °C.
2. Fluorescerende lectin farvning
- Ved mus offer ved kuldioxid (CO2) indånding, enucleate øjnene med en saks16. Fastgør de medinducerede øjne med frisklavede 4% PFA i 1 time ved stuetemperatur (RT).
BEMÆRK: Fiksering kan også udføres ved at inkubere øjnene i 4% PFA natten over (ON) ved 4 °C. Mus blev ofret i henhold til retningslinjerne i ARVO-erklæringen om brug af dyr i oftalmisk og visionsforskning og udvalget for institutionel dyrepleje og -anvendelse (CICUAL) fra Det Kemiske Fakultet, Córdobas nationale universitet (Res. HCD 1216/18). - Under dissekeremikroskopet fjernes hornhinder med en saks ved at skære langs limbus og dissekere hele nethinden. Kassér det forreste segment af øjet, og adskil derefter nethinden fra RPE-Choroid.
BEMÆRK: Sørg for at fjerne de resterende snavs og hyaloidkar ud af nethinden med sammentak. - Placer nethinden i 200 μL rør. Derefter blokere og permeabilize nethinden i 100 μL tris-buffered saltvand (TBS) opløsning, der indeholder 5% Kvæg Serum Albumin (BSA) og 0,1% Triton-X-100 i løbet af 6 timer ved 4 °C med blid agitation i shaker.
BEMÆRK: Dette trin kan udføres i 2 timer på RT. - Vend derefter røret for at placere nethinden i hætten og fjern blokeringsopløsningen med en pipette.
- Opløsningen tilsættes 100 μL, der indeholder 0,01 μg/μL isolectin GSA-IB4 (GSA-IB4). Pak rørene med aluminiumsfolie for at beskytte prøverne mod lys. Inkuber nethinden med lectinopløsningen ON ved 4 °C eller i 2 timer ved RT med blid omrøring i shakeren.
- Vask nethinden med 100 μL TBS indeholdende 0,1% Triton-X-100 i 20 min med blid omrøring i shakeren. For korrekt vask skal du placere nethinden i rørets hætte ved at vende den. Sæt røret tilbage til dets stående position, og fjern det medium, der er tilbage i beholderen. Gentag dette trin tre gange.
- Placer nethinden i et dias og tilføje en dråbe PBS. Under dissekering mikroskop, udføre fire lige så fjerne nedskæringer fra kanterne af nethinden mod synsnerven.
- For at udfolde kronbladene på nethinden skal du bruge sammentak eller små stykker filterpapir. Sørg for, at fotoreceptorsiden vender nedad.
- Fjern den resterende PBS af diaset med filterpapir. Derefter tilsættes et monteringsmedium (Poly(vinylalkohol) i glycerol / Tris) og coverslip. Lad det tørre i 1 time på RT.
- Opbevar dias ved 4 °C beskyttet mod lys.
BEMÆRK: Nethinden kan også opbevares i PBS ved 4 °C indtil konfokal mikroskopivisualisering.
3. Confocal mikroskopi visualisering og mikrofotos erhvervelse
- Før visualisering inkuberes diasene i 10 minutter på RT dækket af lys.
- Ved det konfokale mikroskop skal du placere diaset i pladen med forsiden nedad.
- Fokuser den overlegne plexus af retinal vaskulatur og vælg et område for at starte billedet erhvervelse.
- Indstil generelle laserparametre i softwaren: Bølgelængde: 488 nm; Laserintensitet; HV; Forskydning; Vinde.
BEMÆRK: Laserintensitet, PMT, Offset og gain kan variere afhængigt af forholdene og brugen af lampen. De optimale indstillinger giver et klart billede af de fartøjer, der undgår mætningen i følsomheden af fotomultiplierrøret for at have et lineært forhold til fluorescenssignalet. - Angiv andre anskaffelsesparametre: Tilstand; Størrelse; Formål, uden zoom; Ingen Kalman; Trinstørrelse.
BEMÆRK: Der skal anvendes identiske anskaffelsesbetingelser til billeddannelse af kontrol- og forsøgsprøverne. - Indstil koordinaterne i x- og y-aksen: Scan nethinden i fokus 2x. Hvis området viser fartøjer, skal du markere det ved at klikke på det dobbelte af området for at markere det til senere billedopsamling.
BEMÆRK: Det anbefales stærkt at vælge nethindeområde ved at følge den overlegne vaskulære plexus, da fluorescensen af større fartøjer er højere. - Flyt i gitteret til en nabo firkant, fokusere nethinden, og vælg det område, hvis det svarer. Gentag dette trin, indtil det valgte område omfatter hele nethinden.
- Marker et område, og angiv koordinaterne i z-aksen for at definere tykkelsesudvidelsen, der skal scannes. For at gøre dette skal du visualisere nethinden i fokus 2x; med mikrometeret, gå til toppen af nethinden og klik på Indstil på startpositionen. Flyt derefter til bunden af nethinden og klik på Indstil i slutpositionen.
- Gentag trin 3.8 i hvert område, der er markeret i gitteret.
BEMÆRK: Tryk på Gå på startpositionen for at kontrollere det scannede område i dybden. Hvis fartøjer stadig visualiseres, skal du justere positionen ved at flytte mikrometeret og derefter klikke på Indstil. Gentag processen på slutpositionen. - Initialiser automatiseret scanning.
- Når scanningsprocessen er færdig, skal du åbne billedet.
- Vælg serieformatet for at optage billedet som en mosaik og gemme det med den foretrukne udvidelse. Endelig vises det syede billede på skærmen.
4. Billedbehandling
- Gå til menulinjen i ImageJ FIJI-softwaren, og klik på > Åbn. Vælg det billede, der skal behandles. Vælg ome-XML-metadataene Vis OME-XML-metadata i vinduet Indstillinger for import af bioformater, og klik på OK.
BEMÆRK: Billeder med lignende navn skal gemmes i separate mapper. - Søg efter oplysninger om pixelstørrelse i vinduet OME-metadata , der kaldes PhysicalSizeX, PhysicalSizeY og PhysicalSizeZ. Kopier disse data.
- I forbindelse med billedkalibrering skal du gå til menulinjen og vælge Egenskaber for billede >. Kopier oplysningerne om billedet i trin 4.2, og klik på OK. Billedet åbnes som et vindue med flere fotos, hvor hver repræsenterer de mikrofotografi, der er erhvervet på en z-akse.
- Tildel et foretrukket lut til billedet for at sende en farve til fluorescerende etiketten. Det gør du ved at gå til menulinjen og klikke på LUT-ikonet .
- Hvis du vil visualisere alle stakke i et enkelt billede, skal du gå til menulinjen og vælge Billede > stakke > Z Project.
- Vælg alle de stakke, hvor fartøjer visualiseres, i det viste Z-projektionvindue. Vælg Gennemsnitlig intensitet i projektionstype, og klik på OK.
BEMÆRK: Resultatet af summen af stakkene vises i et nyt billede med navnet AVG (billednavn). - Juster lysstyrken og kontrasten i det resulterende billede for at reducere baggrunden og fremhæve fartøjerne. Gå til menulinjen , og klik på Billede> Juster> Lysstyrke/Kontrast. I B- og C-vinduerne flyttes stængerne, indtil der observeres en bedre intensitet. Klik på Anvend og gem ændringerne.
- Kopier de parametre, der er valgt for Lysstyrke/Kontrast. disse skal være identiske for alle billeder.
- Før billedkvantificering skal du definere de parametre, der skal måles. Gå til Analyser > Indstil målinger på menulinjen. I de procedurer, der er beskrevet her, vil det være nødvendigt at opnå område og perimeter (dette er i sidste ende også nødvendigt for at måle afstande). Klik på OK.
- Download plugin, der kræves til kvantificering af kartæthed17 og følg installationsvejledningen fra pluginet.
- Fortsæt med kvantificeringen af en bestemt vaskulær parameter.
5. Kvantificering af avaskulære områder
- Vælg wandværktøjet på menulinjen. Vælg det retinale område, der mangler fartøjer.
BEMÆRK: Større eller mindre områder kan vælges afhængigt af tolerancen. Hvis du vil justere tolerancen, skal du klikke to gange på ikonet for tryllestavsværktøjet. Anvendt tilstand: Ældre. - Tryk på T-bogstavet på tastaturet for at optage det markerede område i ROI Manager. Gentag trin 5.1 og 5.2 med alle de avaskulære områder af nethinden.
- Klik på Mål i ROI manager for at få de avaskulære områdeoplysninger. Der vises et nyt vindue med de nødvendige oplysninger. Kopier dataene i et andet program, eller gem filen.
BEMÆRK: I nogle billeder foretrækker man måske at vælge de avaskulære områder manuelt. I dette tilfælde skal du vælge værktøjet PolygonValg, tegne korte afstande rundt om det avaskulære område og klikke på billedet, når en ny afstand er ved at starte. Luk det markerede område ved at klikke på det første punkt. - Gentag trin 5.1, 5.2 og 5.3 for at måle det samlede område af nethinden.
- Beregn det avaskulære område af nethinden som summen af alle de avaskulære områder målt divideret med det samlede areal af nethinden.
6. Kvantificering af neovaskulære områder
- Vælg værktøjet Wand i menulinjen.
- Zoom ind på billedet for bedre at visualisere neovessels. Vælg neovessels en efter en med staven værktøj.
BEMÆRK: Juster tolerancen ikke højere end 20 for at sikre valget af en enkelt neovessel. Dette toleranceniveau skal forblive konstant under alle billedkvantifikationer. - Tryk på T-bogstavet på tastaturet for at optage det markerede område i ROI Manager. Gentag trin 6.1 og 6.2 med alle neovaskulære områder af nethinden.
- Klik på Mål i ROI-lederen for at hente områdedataene. Der vises et nyt vindue med de nødvendige oplysninger. Kopier dataene i et andet program, eller gem filen.
- Gentag trin 6.1, 6.2 og 6.3 for at kvantificere det samlede område af nethinden.
- Beregn det neovaskulære område af nethinden som summen af alle neovessels områder målt divideret med det samlede område af nethinden.
7. Kvantificering af fartøjets diameter
- Vælg lige linjeværktøjet på menulinjen.
- Zoom ind på billedet for bedre at visualisere karvæggen. Udfør tre tværgående linjer til hovedfartøjet før den første gren. Dette skal gøres ved at tegne en streg fra grænsen af en væg af fartøjet til det modsatte.
BEMÆRK: Linjen skal være helt vinkelret på vægbeholderen for at undgå kvantificeringsfejl. - Tryk på T-bogstavet på tastaturet for at optage det markerede område i ROI Manager. Gentag trin 7.1 og 7.2 i alle de fartøjer, der skal kvantificeres.
- Klik på Mål i ROI-lederen for at få fjerndataene. Der vises et nyt vindue med de nødvendige oplysninger. Kopier dataene i et andet program, eller gem filen.
8. Kvantificering af fartøj tortuositet
- Klik på ikonet Lige linjeværktøj med musens højre knap på menulinjen, og vælg Segmenteret linje eller Frihåndslinje. Tegn en linje inde i fartøjet fra synsnerven, indtil det første fartøj forgreer efter vaskulær form.
BEMÆRK: Linjen skal følge den vaskulære form for at undgå kvantificeringsfejl. - Tryk på T-bogstavet på tastaturet for at optage det markerede område i ROI Manager.
- Vælg lige linjeværktøjet på menulinjen. Tegn en linje fra synsnerven, indtil det første fartøj forgrer.
- Tryk på T-bogstavet på tastaturet for at optage det markerede område i ROI Manager.
- Klik på Mål i ROI Manager for at få fjerndata. Der vises et nyt vindue med de nødvendige oplysninger. Kopier dataene i et andet program, eller gem filen.
- Beregn tortuositetsindekset på følgende måde: afstand opnået med segmenteret linje divideret med den afstand, der opnås med lige linje.
9. Kvantificering af vaskulær forgrening
- Med menulinjens ovale værktøj defineres et område, der anvendes ligeligt på alle eksperimentelle forhold. Det valgte område skal være en koncentrisk cirkel tegnet rundt om synsnerven.
- Tryk på T-bogstavet på tastaturet for at optage det markerede område i ROI Manager.
BEMÆRK: I dette tilfælde anbefales det at gemme investeringsafkast, da kvantificeringen er langsom, og det identiske investeringsafkast skal bruges i alle billeder. Det kan du gøre ved at klikke på MERE > Gem i ROI Manager. - Optællingen af antallet af primære grene, der stammer fra hovedfartøjer inden for udvælgelsesområdet.
- Gentag trin 9.2 og 9.3 i naboområder, og bevar kriterierne for synsnerve-periferi.
10. Kvantificering af vaskulær tæthed
- Transformer billedet til 8-bit tilstand.
- Gå til Plugins i menulinjen, vælg Vessel Analysis > Vascular Density.
- Definer et område med menulinjens firkantede værktøj, hvor beholdertætheden skal måles. Klik på OK.
- Der vises et nyt vindue med de nødvendige oplysninger. Kopier dataene i et andet program, eller gem filen.
- Gentag trin 10.2, 10.3 og 10.4 i de omkringliggende områder, vedligeholdelse af investeringsafkast, men placerer det ni gange, der omfatter periferien og midten af hele nethinden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som beskrevet i protokolafsnittet, fra en enkelt fluorescerende farvning assay kan du få vaskulær morfologi og evaluere flere parametre af interesse kvantitativt. Søgningen af en specifik ændring vil afhænge af den type retinopati undersøgt. I denne artikel blev avaskulære og neovaskulære områder, tortuositet og dilatation evalueret i en musemodel af proliferativ retinopati, mens vaskulær forgrening og tæthed blev analyseret i en MetS-musemodel, hvilket fremkalder en ikke-proliferativ retinopati.
I det første eksperimentelle eksempel blev den iltinducerede retinopati (OIR) musemodel ansat, som ligner retinopatien af præmaturitet og nogle funktioner i den proliferative fase af diabetisk retinopati. I denne model vedligeholdes kuld med deres ammende mor i et hyperoxisk kammer fra postnatal dag (P)7 til P1218. Intravitreale injektioner blev udført på P12 for at bestemme effektiviteten af et lægemiddel som en antiangiogen (tilstand navngivet som behandling). Mus blev ofret på P17, tidspunktet for den maksimale neovessels formation19. Mus injiceret med køretøjet blev anvendt som kontrol. Begge prøver blev rettet og farves med Isolectin GSA-IB4 sammen. Efter confocal erhvervelse, blev billeder analyseret med ImageJ FIJI software som angivet ovenfor. Med syningsmodulet integreret i konfokalt mikroskop blev hele holderen observeret som et unikt billede (figur 1). På P17 er det muligt at observere hyaloid vasculaturen, et forbigående vaskulært system, der er afgørende i intrauterinlivet (figur 1, hvide pile)20.
Som følge af overdreven iltforsyning i det hyperoxiske kammer arresterer OIR-mus den fysiologiske vaskulære udvikling og genererer avaskulære områder i nethinden. Derefter defineres de avaskulære områder som de zoner, der mangler retinale blodkar (figur 2). Fra de erhvervede billeder kan avaskulære områder kvantificeres som summen af regionerne uden fartøjer divideret med det samlede areal af nethinden. Områder med mekaniske skader viser også fravær af fartøjer. For at identificere beskadigede områder skal du analysere integriteten af neuronale lag med Hoechst-plet.
De avaskulære områder af nethinden undgår iltlevering, og derfor er et stærkt pro-angiogent respons indstillet, hvilket fremkalder neovascularization16. Neovessels er små kaliber fartøjer, der stammer fra et allerede eksisterende fartøj af den overlegne vaskulære plexus. Deres struktur er uorganiseret, derfor neovessels vokse som totter mod glaslegeme hulrum21. Vi beregnede det areal, der er besat af neovessels 'totter ved at kvantificere det neovaskulære område af nethinden divideret med det samlede areal af nethinden (Figur 3). Da neovessels 'form og størrelse er variabel, lejlighedsvis de kan ligne vragrester og artefakter. For at skelne neovessels skal du kontrollere, at tuft vokser fra et modent fartøj.
Vaskulær dilatation og tortuositet er to andre hyppige ændringer, som har negative virkninger på vaskulær biologi, da de producerer turbulent blodcirkulation. Til analyse af dilatationen målte vi hovedbeholdernes diameter i tre højder før den første gren22,23 (figur 4). Forskere skal definere en forudbestemt afstand til at måle fartøjets diameter for at reducere variationen blandt resultaterne. Ideelt set bør det fjerneste punkt fra synsnerven være omkring 300 μm. Vi foreslår at udføre analysen og senere tage et gennemsnit på mindst seks mus pr. Tilstand.
Med hensyn til tortuositet måler vi den afstand, der er omfattet af de vigtigste fartøjer, der følger dens form med hensyn til den lige afstand mellem synsnerven og det første forgreningspunkt24 (figur 5). Som vi kan se på billedet, er der heterogenitet i de vigtigste fartøjers sinuositet. For at opnå et repræsentativt resultat skal mindst seks mus pr. tilstand kvantificeres.
De seneste parametre, vaskulær forgrening og tæthed, blev analyseret i MetS-modellen, der udviser ikke-proliferativ retinopati. I MetS, både lipider og kulhydrater derangements er forbundet med retinale pericytter og endotelceller dysfunktion og død, hvilket fører til dannelsen af acellulære kapillærer eller en nedsat vaskulær forgrening25. I vores model blev ApoE-KO mus fodret med fructose tilsat drikkevandet i en koncentration på 10% w / v. Kontroldyr har lige modtaget postevand. Efter 4 måneders kost blev mus ofret, og nethinden blev behandlet som angivet før. Til måling af vaskulær forgrening definerede vi kvantificeringsområdet ved at tegne en koncentrisk cirkel, og så talte vi en efter en de primære grene, der stammer fra et hovedcentralfartøj (figur 6).
Ud fra de erhvervede billeder blev den vaskulære tæthed kvantificeret som det areal, der var besat af fartøjer divideret med ROI-området (en kvadrat på 0,015 mm2, se flade i figur 7), som var placeret forskellige steder i hvert mikrofotograf, som det blev forklaret i protokolafsnittet. Undgå at kvantificere områder med mekanisk skade (Figur 7, hvide pile). Hvis der er mere end to områder med punkteringer, skal nethinden kasseres.
Figur 1: Vaskulær farvning af nethinden hele mount mærket med Isolectin GSA-IB4: Repræsentative confocal billeder af P17 OIR mus nethinder injiceres med køretøj eller behandling på P12. Fluorescerende farvning blev udført i hele mount nethinder med Isolectin GSA-IB4 Alexa 488 i henhold til protokollen. Avaskulære områder (AV) og neovaskulære områder (NV) er angivet. Skalastang: 500 μm. Hvide pile viser resten hyaloid vaskulatur. Gule pile viser ufuldstændige scanningsområder under indsamling af confocal-billeder. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Kvantificering af avaskulære områder: (A) Repræsentative billeder af hele mount nethinder på P17, der viser GSA-IB4 vaskulær farvning i OIR-køretøj og OIR-behandling mus. Områder med vaso-udslettelse er angivet med gult. Skalastang: 500 μm. (B) AV-området (%) blev kvantificeret som forholdet mellem det centrale avaskulære område og hele nethinden. Tohalede uparrede t-test blev brugt til statistisk sammenligning. Data præsenteret som middel ± SEM. *** p < 0,001. Mindst seks dyr blev anvendt for hver tilstand i den undersøgte overlevelsestid. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Kvantificering af neovaskulære områder: (A) Repræsentative billeder af hele mount nethinder på P17, der viser GSA-IB4 vaskulær farvning i OIR-køretøj og OIR-behandling mus. Områder med neovascularization er angivet i hvidt. Skalastang: 500 μm. (B) NV-området (%) blev kvantificeret som forholdet mellem det areal, der er besat af neovessels, og hele nethinden. Tohalede uparrede t-test blev brugt til statistisk sammenligning. Data præsenteret som middel ± SEM. *** p < 0,001. Mindst seks dyr blev anvendt for hver tilstand i den undersøgte overlevelsestid. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Kvantificering af vaskulær dilatation: (A) Repræsentative billeder af hele mount nethinder på P17, der viser GSA-IB4 vaskulær farvning i OIR-køretøj og OIR-behandling mus. Venstre paneler: ROI udvalgt til kvantificering. Højre paneler: zoom af ROI'erne, der viser lige linjer udført i et hovedfartøj for at måle fartøjets diameter. Tre linjer blev sporet på transversalt til fartøjet og i gennemsnit. Vægtstang: 100 μm. (B) Fartøjets diameter (%) blev kvantificeret som den gennemsnitlige diameter målt i større kar på nethinden. Tohalede uparrede t-test blev brugt til statistisk sammenligning. Data præsenteret som gennemsnitlige ± SEM. * p < 0,05. Mindst seks dyr blev anvendt for hver tilstand i den undersøgte overlevelsestid. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Bestemmelse af tortuositetsindeks: (A) Repræsentative billeder af hele mount nethinden på P17, der viser GSA-IB4 vaskulær farvning i OIR-køretøjs- og OIR-behandlingsmus. Venstre paneler: ROI udvalgt til kvantificering. Centerpaneler: zoom af roi'erne, der viser segmenterede linjer spores i et hovedfartøj fra synsnerven til det første forgreningspunkt. Højre paneler: zoom af ROI' erne, der viser lige linjer spores i et hovedfartøj fra synsnerven til det første forgreningspunkt. Skalalinje: 100 μm. (B) Tortuositetsindekset blev opnået ved at dividere afstanden mellem den segmenterede linje til afstanden mellem den lige linje. Tohalede uparrede t-test blev brugt til statistisk sammenligning. Data præsenteret som gennemsnitlige ± SEM. ns, ikke-signifikante. Mindst seks dyr blev anvendt for hver tilstand i den undersøgte overlevelsestid. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Kvantificering af vaskulær forgrening: (A) Repræsentative billeder af hele mount nethinder, der viser Isolectin GSA-IB4 vaskulær farvning i ApoE-KO og ApoE-KO + fructose fodret mus. Cirkulære kvantificeringsområder blev defineret i gult. Skalastang: 100 μm, 100x forstørrelse. B) Antallet af grene blev kvantificeret som antallet af primære grene fra et hovedfartøj, da synsnerven til periferien. Tohalede uparrede t-test blev brugt til statistisk sammenligning. Data præsenteret som gennemsnitlige ± SEM. ns, ikke-signifikante. Mindst seks dyr blev anvendt for hver tilstand. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Kvantificering af vaskulær tæthed: (A) Repræsentative billeder af hele mount nethinder, der viser Isolectin GSA-IB4 vaskulær farvning i ApoE-KO og ApoE-KO + fructose fodret mus. Kvadratet på 0,015 mm2 kvantificeringsområde blev defineret med gult. Skalastang: 100 μm, 100x forstørrelse. (B) Vaskulær densitet blev kvantificeret som forholdet mellem vaskulært areal og det samlede INVESTERINGSAFKAST-område, som blev placeret ni gange forskellige steder i hvert mikrofotograf. Hvide pile viser områder med mekanisk skade. Tohalede uparrede t-test blev brugt til statistisk sammenligning. Data præsenteret som gennemsnitlige ± SEM. ns, ikke-signifikante. Mindst seks dyr blev anvendt for hver tilstand. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dyremodeller af retinopatier er kraftfulde værktøjer til at studere vaskulær udvikling, ombygning eller patologisk angiogenese. Succesen af disse undersøgelser på området afhænger af den nemme adgang til vævet, der gør det muligt at udføre en bred vifte af teknikker, der giver data fra in vivo og postmortem mice26,27. Desuden er der fundet stor korrelation mellem in vivo-undersøgelser og klinisk analyse, hvilket giver solid sporbarhed og pålidelighed til disse modeller28. I denne artikel præsenterer vi en enkel og robust beskrivelse af trinene til at karakterisere det vaskulære netværk i musemodeller af retinale vaskulære sygdomme. I litteraturen finder læserne andre mulige parametre til måling og parallelle tilgange til at kvantificere dem, der er valgt her. De kompilerede protokoller har mange fordele i forhold til andre, fordi de er reproducerbare, og de kræver bare en gratis software til at udføre analysen (Image J Fiji).
Desuden er disse protokoller nemme at udføre af studerende, der ikke har omfattende viden om programmet, og de fleste målinger behøver ikke yderligere plugins (undtagen fra vaskulær tæthed).
Prøveudvinding og fluorescens farvning teknik er enkle og korte29. Det er meget vigtigt at arbejde med friske nethinder, selv om de kan opbevares ved 4 °C i PBS med hæmmere af bakterievækst. Da vævet er tyndt og blødt, nedbrydes gamle prøver ofte under inkubationen, eller når prøven foldes ud før montering. Desuden, overdreven fiksering med 4% PFA vender nethinden overdreven stiv og skør, men dette påvirker ikke lectin farvning. Isolectin GSA-IB4 farvning gør det muligt at visualisere det komplette vaskulære netværk på hvert lag, herunder neovessels og formerende endotelceller. Andre markører, som CD 31, kræver inkubation af prøven med koncentrerede antistoffer, og de har mere baggrund. På den anden side har fluorescerende farvestof i angiografi tendens til at sprede sig ud af karrene, hvilket øger variabiliteten i beholderens kaliber og tortuositet kvantificering. En ulempe ved Isolectin GSA-IB4 er, at det også kan mærke mikrogliale celler30. Der skal udvises forsigtighed ved udførelse af intravitreale injektioner eller andre forsøgsprocedurer, der fremkalder overdreven infiltration, fordi mikrogliale celler kan danne agglomerater.
Billedopsamling kan udføres med ethvert konfokalt mikroskop. Brugen af en motoriseret plade par til en software, der omfatter syning modul vil give fuldstændig visualisering af hele monteret nethinden i et enkelt billede. Når du vælger nethinden område, skal du sørge for alle ekstremer af prøven er inkluderet, ellers billedet vil være ufuldstændig (Figur 1, gule pile). Dette er ikke særlig relevant i musen model af OIR, som et eksempel, fordi vaskulære ændringer er i nærheden af synsnerven. Mens der i rottemodellen af OIR kan denne fejl føre til unøjagtig kvantificering, da de avaskulære og neovaskulære områder er ved siden af limbus. En anden mulighed er at tage individuelle retinale mikrofotografi. Brugeren kan senere organisere dem som et puslespil med en ordentlig software. Det anbefales ikke at bruge epifluorescence mikroskop, især når man analyserer forgrening, fordi fartøjer spirer gennem hele tykkelsen af nethinden, og nogle fartøjer vil ikke blive opdaget i en udelukkende z stack.
Under billedbehandling med ImageJ FIJI anbefales det ikke at opdatere softwaren, før alle billederne er kvantificeret, for at holde identiske forhold i softwaren. Kalibreringen af billederne (tildeling af pixelstørrelse i mikron) er et kritisk skridt, da disse protokoller indebærer kvantificering af afstande og områder. Når brugeren er fortrolig med programmet, kan brugeren udforske andre værktøjer til at vælge det neovaskulære og det avaskulære område ud over stavværktøjet. Polygonvalgværktøjet er især nyttigt til at måle avaskulære områder, der er skåret i to dele ved monteringstrinnet. Andre forskere har skabt specifikke plugins til at automatisere udvælgelsen af neovessels baseret på fluorescens intensiteten af disse strukturer. Disse metoder er hurtigere og mindre besværlige, selv om det anbefales at kontrollere, at små mindre skinnende neovessels er blevet valgt før kvantificering31. Områderne neovessels vil fluorescere mere intenst end de omkringliggende normale fartøjer. Værktøjet Tryllestav vælger områder, der er farvet på samme måde, og tolerancen bestemmer, hvor ens i farven de valgte pixel. Hvis en neovessel er af samme intensitet som normale fartøjer, kan tolerancen justeres nedad for at øge følsomheden over for subtile intensitetsforskelle. Selvom neovesselvalg i hver prøve vil blive udført med en identisk tærskel, er nogle neovessels karakteriseret ved en mindre fluorescensintensitet. I dette tilfælde kræves en lavere tolerance for korrekt udvælgelse.
Tortuositet og dilatation er målinger af afstand. En omfattende undersøgelse af vaskulært træ er nyttigt at vælge fartøjer af samme type (arterier eller vener) og kaliber. Vi måler dilatationen i fartøjer i tre højder som vist i figur 4. Vinklen på den lige udvælgelse af karvæggen er et andet relevant punkt at tage hensyn til. Dette bør være så tæt som muligt på 90 ° for at undgå mulige fejl. Når du tegner den lige linje, kan brugerne bruge zoomværktøjet til at nærme sig det kar af interesse.
Vaskulær forgrening kan også måles i to eller flere kvantificeringsområder i forskellige højder, hvis det ønskes. I dette tilfælde bør forskerne bevare området af nethinden analyseret (central, medium eller perifer side af synsnerven). Selvom forgrening ændres i flere dyremodeller af retinopati, viser tidlige stadier af retinopatien i forbindelse med MetS, der præsenteres her, stadig ikke sådanne ændringer15. Til omfattende undersøgelser af retinale kapillærer af den mellemliggende og dybe plexus og karspirering giver 3D-beregningsmetoder værdifulde data om subtile variationer i vaskulær morfologi og netværk32. Endelig bestemmes den vaskulære tæthed af det areal, der besættes af fartøjer med hensyn til det samlede areal af et udvalgt investeringsafkast. Målingen af denne parameter kræver brug af et plugin og en aktualiseret version af ImageJ FIJI, hvor Auto Threshold og Geometri til Distance Map værktøjer skal være tilgængelige. På trods af disse ekstra trin er pluginet let at bruge, reproducerbart og pålideligt. Til måling af vaskulær densitet blev der valgt et investeringsafkast på 0,015 mm2 for at foretage ti målinger af fluorescensintensiteten i forskellige områder af nethinden. Denne størrelse gjorde det muligt for os at dække hele billedet og dermed opnå en mere repræsentativ gennemsnitlig værdi og dens afvigelse i hver nethinde.
Samlet set, på trods af at disse samlinger af metoder ikke er automatiseret og kræver manuel udvælgelse af parametrene, de er i stand til at give kvantitative og strenge data af nethinden. Den vigtigste begrænsning med hensyn til ovenstående præsenterede protokoller for vaskulære målinger afhænger af inter-examiner variabilitet, når man analyserer det samme billede. For at minimere denne bias er det vigtigt at på forhånd etablere den generelle indstilling som karvæggrænser, identifikation af avaskulære områder og neovessels og også udelukkelseskriterier for beskadiget væv. Med hensyn til kar tortuositet, et aftalt udgangspunkt ved siden af synsnerven er påkrævet. For nybegyndere anbefales det stærkt at gennemsnit de data, der indsamles af to eller flere eksaminatorer. Hos uddannede brugere er der ikke konstateret væsentlige forskelle i målingen af forskellige parametre, så længe kvantificeringskriterierne forbliver konstante. På samme måde kan der føjes yderligere parametre til de angivne protokoller, afhængigt af de vaskulære ændringer, der registreres i retinopatien. I ikke-proliferative retinopatier er måling af acellulær kapillær nummer, migrerende pericytter, forholdet mellem pericytter / endotelceller nummer og blod retinal barriere permeabilitet de tidligste parametre ændret i retinal vaskulatur33,34,35. For kroniske modeller og milde retinopatier er det tilrådeligt at inkludere disse yderligere målinger. Et stort antal målte parametre vil give et mere trofast landskab af de begivenheder, der finder sted i vaskulaturen. Sammenfattende har vi i denne artikel vist klassiske, veletablerede og reproducerbare teknikker til at kvantificere nogle af de mest relevante parametre, der tages i betragtning i den kliniske praksis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at forskningen blev udført i mangel af kommercielle eller finansielle relationer, der kunne fortolkes som en potentiel interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi takker Carlos Mas, María Pilar Crespo og Cecilia Sampedro fra CEMINCO (Centro de Micro y Nanoscopía Córdoba, CONICET-UNC, Córdoba, Argentina) for hjælp til konfokal mikroskopi, til Soledad Miró og Victoria Blanco for dedikeret dyrepleje og Laura Gatica for histologisk bistand. Vi takker også Victor Diaz (Pro-Secretary of Institutional Communication of FCQ) for videoproduktion og udgave og Paul Hobson for hans kritiske læsning og sprog revision af manuskriptet.
Denne artikel er finansieret af tilskud fra Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT), Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (alt til M.C.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminuim foil | |||
| Bovine Serum Albumin | Merck | A4503 | quality |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | C3306 | |
| Hydrochloric acid | Biopack | 9632.08 | |
| Confocal Microscope FV1200 | Olympus | FV1200 | with motorized plate |
| Covers | Paul Marienfeld GmnH & Co. | 111520 | |
| Dissecting Microscope | NIKON | SMZ645 | |
| Disodium-hydrogen-phosphate dihydrate | Merck | 119753 | |
| 200 µL tube | Merck | Z316121 | |
| Filter paper | Merck | WHA5201090 | |
| Incubator shaker GyroMini | LabNet International | S0500 | |
| Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | I21411 | |
| Poly(vinyl alcohol) (Mowiol 4-88) | Merck | 475904 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 158127 | |
| pHmeter | SANXIN | PHS-3D-03 | |
| Potassium chloride | Merck | P9541 | |
| Potassium-dihydrogen phosphate | Merck | 1,04,873 | |
| Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Sodium chloride | Merck | S3014 | |
| Sodium hydroxide | Merck | S5881 | |
| Tris | Merck | GE17-1321-01 | |
| Triton X-100 | Merck | X100-1GA | |
| Vessel Analysis Fiji software | Mai Elfarnawany | https://imagej.net/Vessel_Analysis |
References
- Kur, J., Newman, E. A., Chan-Ling, T. Cellular and physiological mechanisms underlying blood flow regulation in the retina and choroid in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (5), 377-406 (2012).
- McDougal, D. H., Gamlin, P. D.
- Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. Retinal vasculature development in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (2018).
- Wei, Y., et al. Age-related alterations in the retinal microvasculature, microcirculation, and microstructure. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (9), 3804-3817 (2017).
- Lavia, C., et al. Reduced vessel density in the superficial and deep plexuses in diabetic retinopathy is associated with structural changes in corresponding retinal layers. PLoS One. 14 (7), 0219164 (2019).
- Rosenblatt, T. R., et al. Key factors in a rigorous longitudinal image-based assessment of retinopathy of prematurity. Scientific Reports. 11 (1), 5369 (2021).
- Edwards, A. L. Funduscopic examination of patients with diabetes who are admitted to hospital. Canadian Medical Association Journal. 134 (11), 1263-1265 (1986).
- Lechner, J., O'Leary, O. E., Stitt, A. W. The pathology associated with diabetic retinopathy. Vision Research. 139, 7-14 (2017).
- Sun, Z., et al. angiography metrics predict progression of diabetic retinopathy and development of diabetic macular edema: A prospective study. Ophthalmology. 126 (12), 1675-1684 (2019).
- Jia, Y., et al. Quantitative optical coherence tomography angiography of vascular abnormalities in the living human eye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 2395-2402 (2015).
- Pauleikhoff, D., Gunnemann, F., Book, M., Rothaus, K. Progression of vascular changes in macular telangiectasia type 2: comparison between SD-OCT and OCT angiography. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 257 (7), 1381-1392 (2019).
- Gammons, M. V., Bates, D. O. Models of oxygen induced retinopathy in rodents. Methods in Molecular Biology. 1430, 317-332 (2016).
- Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal models of choroidal and retinal neovascularization. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).
- Han, N., Xu, H., Yu, N., Wu, Y., Yu, L. MiR-203a-3p inhibits retinal angiogenesis and alleviates proliferative diabetic retinopathy in oxygen-induced retinopathy (OIR) rat model via targeting VEGFA and HIF-1α. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 47 (1), 85-94 (2020).
- Paz, M. C., et al. Metabolic syndrome triggered by fructose diet impairs neuronal function and vascular integrity in ApoE-KO mouse retinas: Implications of autophagy deficient activation. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 573987 (2020).
- Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).
- Zarb, Y., et al. Ossified blood vessels in primary familial brain calcification elicit a neurotoxic astrocyte response. Brain. 142 (4), 885-902 (2019).
- Smith, L. E., et al.
- Subirada, P. V., et al. Effect of autophagy modulators on vascular, glial, and neuronal alterations in the oxygen-induced retinopathy mouse model. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 279 (2019).
- Lutty, G. A., McLeod, D. S. Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).
- Kim, C. B., D'Amore, P. A., Connor, K. M. Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).
- Guaiquil, V. H., et al. A murine model for retinopathy of prematurity identifies endothelial cell proliferation as a potential mechanism for plus disease. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5294-5302 (2013).
- Mezu-Ndubuisi, O. J. In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery. Optometry and Vision Science: Official Publication of the American Academy of Optometry. 93 (10), 1268-1279 (2016).
- Scott, A., Powner, M. B., Fruttiger, M. Quantification of vascular tortuosity as an early outcome measure in oxygen induced retinopathy (OIR). Experimental Eye Research. 120, 55-60 (2014).
- Kim, A. Y., et al. Quantifying microvascular density and morphology in diabetic retinopathy using spectral-domain optical coherence tomography angiography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 362 (2016).
- Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
- Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal models of choroidal and retinal neovascularization. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).
- Kern, T. S., Antonetti, D. A., Smith, L. E. H. Pathophysiology of diabetic retinopathy: Contribution and limitations of laboratory research. Ophthalmic Research. 62 (4), 196-202 (2019).
- Lorenc, V. E., et al. IGF-1R regulates the extracellular level of active MMP-2, pathological neovascularization, and functionality in retinas of OIR mouse model. Molecular Neurobiology. 55 (2), 1123-1135 (2018).
- Ma, N., Streilein, J. W. Contribution of microglia as passenger leukocytes to the fate of intraocular neuronal retinal grafts. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (12), 2384-2393 (1998).
- Mazzaferri, J., Larrivée, B., Cakir, B., Sapieha, P., Costantino, S. A machine learning approach for automated assessment of retinal vasculature in the oxygen induced retinopathy model. Scientific Reports. 8 (1), 3916 (2018).
- Milde, F., Lauw, S., Koumoutsakos, P., Iruela-Arispe, M. L. The mouse retina in 3D: quantification of vascular growth and remodeling. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro (Camb). 5 (12), 1426-1438 (2013).
- Yang, T., et al. Pericytes of indirect contact coculture decrease integrity of inner blood-retina barrier model in vitro by upgrading MMP-2/9 activity. Disease Markers. 2021, 7124835 (2021).
- Huang, Q., Wang, S., Sorenson, C. M., Sheibani, N. PEDF-deficient mice exhibit an enhanced rate of retinal vascular expansion and are more sensitive to hyperoxia-mediated vessel obliteration. Experimental Eye Research. 87 (3), 226-241 (2008).
- Jiang, H., Zhang, H., Jiang, X., Wu, S. Overexpression of D-amino acid oxidase prevents retinal neurovascular pathologies in diabetic rats. Diabetologia. 64 (3), 693-706 (2021).
