Summary
מאמר זה מתאר בדיקת כתמי לציטין מבוססת וניתן לשחזור עבור כל ההכנות לרשתית ההר ואת הפרוטוקולים הנדרשים למדידה כמותית של פרמטרים וסקולריים משתנים לעתים קרובות ברטינופתיות שגשוג ולא מתרבות.
Abstract
רטינופתיות הן קבוצה הטרוגנית של מחלות המשפיעות על הרקמה הנוירו-חושית של העין. הם מאופיינים על ידי ניוון עצבי, גליוזיס ושינוי הדרגתי בתפקוד כלי הדם ובמבנה. למרות תחילת הרטינופתיות מאופיינת בהפרעות עדינות בתפיסה החזותית, השינויים בקליעת כלי הדם הם הסימנים הראשונים שזוהו על ידי קלינאים. היעדר או נוכחות של ניאווסקולריזציה קובע אם הרטינופתיה מסווגת כלא-התפשטות (NPDR) או להתרבות (PDR). במובן זה, מספר מודלים של בעלי חיים ניסו לחקות תכונות כלי דם ספציפיות של כל שלב כדי לקבוע את המנגנונים הבסיסיים המעורבים בשינויים אנדותל, מוות עצבי ואירועים אחרים המתרחשים ברשתית. במאמר זה, אנו נספק תיאור מלא של ההליכים הנדרשים למדידת הפרמטרים של כלי הדם ברשתית אצל מבוגרים ועכברי לידה מוקדמת ביום שלאחר הלידה (P)17. אנו נפרט את הפרוטוקולים לביצוע כתמי כלי דם ברשתית עם Isolectin GSA-IB4 בהרים שלמים להדמיה מיקרוסקופית מאוחרת יותר. צעדים מרכזיים לעיבוד תמונה עם תוכנת Image J Fiji מסופקים גם הם, ולכן, הקוראים יוכלו למדוד את צפיפות כלי הדם, הקוטר והטורטואוזיות, הסתעפות כלי הדם, כמו גם אזורים וסקולריים וניאווסקולריים. כלים אלה מועילים מאוד כדי להעריך ולכמת שינויים בכלי הדם הן רטינופתיות שאינן מתרבות והן התפשטות.
Introduction
העיניים ניזונות משני מערכת עורקים-ורידים: כלי הדם הכורואידיים, רשת כלי דם חיצונית המשקה אפיתל פיגמנטי ברשתית ופוטותרפטורים; ואת כלי הדם הנוירו-רשתיים המשקים את שכבת תאי הגנגליון ואת השכבה הגרעינית הפנימית של הרשתית1. כלי הדם ברשתית היא רשת מאורגנת של כלי שיט המספקים חומרים מזינים וחמצן לתאי הרשתית ומוצרי פסולת קציר כדי להבטיח העברת איתות חזותית נכונה. כלי דם זה יש כמה תכונות ברורות, כולל: חוסר innervation אוטונומי, הרגולציה של טון כלי הדם על ידי מנגנוני רשתית פנימית והחזקת מחסום דם רשתית מורכב2. לכן, כלי דם ברשתית היה המוקד של חוקרים רבים אשר חקרו בהרחבה לא רק vasculogenesis במהלך הפיתוח, אלא גם את השינויים ואת אנגיוגנזה פתולוגית כי כלי אלה עוברים במחלות3. השינויים הסקולריים הנפוצים ביותר שנצפו ברטינופתיות הם הרחבת כלי דם, ניאווסקולריזציה, אובדן ארבוריזציה וסקולרית ועיוות של כלי הדם הראשיים ברשתית, מה שהופך אותם יותר זיגאגי4,5,6. אחד או יותר מהשינויים המתוארים הם הסימנים המוקדמים ביותר שזוהו על ידי רופאים. הדמיה וסקולרית מספקת שיטת סינון מהירה, לא פולשנית וזולה7. המחקר הנרחב של השינויים שנצפו בעץ כלי הדם יקבע אם הרטינופתיה אינה מתרבה או מתרבה והטיפול הנוסף. רטינופתיות שאינן מתרבות יכולות להתבטא עם מורפולוגיה כלי דם חריגה, ירידה בצפיפות כלי הדם, נימים תאיים, מוות pericytes, בצקת מקולרית, בין היתר. בנוסף, רטינופתיות שגשוג גם לפתח חדירות כלי דם מוגברת, שיפוץ חוץ תאי, ואת היווצרות של tufts כלי דם לכיוון חלל הזגוגית כי בקלות התמוטטות או לגרום ניתוק רשתית8.
לאחר שזוהה, ניתן לעקוב אחר רטינופתיה באמצעות שינויי כלי הדם שלה9,10. התקדמות הפתולוגיה ניתן לעקוב אחר שינויים מבניים של כלי הדם, אשר מגדירים בבירור את שלבי המחלה11. הכימות של שינויים בכלי הדם במודלים אלה אפשר לתאם שינויים בכלי הדם ומוות עצבי ולבדוק טיפולים תרופתיים לחולים בשלבים שונים של המחלה.
לאור ההצהרות לעיל, אנו רואים כי ההכרה והכימות של שינויים בכלי הדם הם בסיסיים במחקרי רטינופתיה. בעבודה זו, נראה כיצד למדוד פרמטרים שונים של כלי הדם. כדי לעשות זאת, נשתמש בשני מודלים של בעלי חיים. אחד מהם הוא מודל העכבר רטינופתיה המושרה חמצן12, אשר מחקה רטינופתיה של פגות וכמה היבטים של רטינופתיה סוכרתית מתרבה13,14. במודל זה, נמדוד אזורים וסקולריים, אזורים ניאו-וסקולריים והרחבה וטורטואוזיות של כלי הדם העיקריים. במעבדה שלנו, פותח מודל עכבר תסמונת מטבולית (MetS), אשר גורם רטינופתיה לא שגשוג15. כאן, נעריך את צפיפות כלי הדם ואת ההסתעפות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
עכברי C57BL/6J טופלו על פי הנחיות של הצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וראייה. הליכי הניסוי תוכננו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (CICUAL) של הפקולטה למדעי הכימיה, האוניברסיטה הלאומית של קורדובה (מיל' HCD 1216/18).
1. הכנת פתרונות חוצצים ורגנטים
- הכנת תמיסת מלח חוצצת פוספט 1x (PBS): הוסף 8 גרם של נתרן כלורי (NaCl), 0.2 גרם של אשלגן כלורי (KCl), 14.4 גרם של דיהידראט דיסודיום-מימן-פוספט (Na2HPO4 2H2O) ו 0.24 גרם של אשלגן-דיהידרוגן פוספט (KH2PO4) עד 800 מ"ל של מים מזוקקים. מערבבים את התמיסה עד לפירוק מלא של המלחים. כווננו את ה-pH ל-7.4 עם חומצת כלוריד (HCl) והתאמו את עוצמת הקול ל-1 ליטר עם מים מזוקקים נוספים. סנן את הפתרון ואחסן אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
- הכנה של 4% paraformaldehyde (PFA): להוסיף 40 גרם של PFA מוצק ל 800 מ"ל של PBS מוכן טרי. מערבבים את התמיסה בצלחת חימום בטמפרטורה קבועה של 60 °C (60 °F). הוסף 1 M נתרן הידרוקסיד (NaOH) עד PFA מומס לחלוטין, בדיקה כי ה- pH נשמר בטווח של 7.2-7.4. מלאו את עוצמת הקול ל-1,000 מ"ל עם PBS וערבבו. כבה את צלחת החימום וסנן את הפתרון כאשר הטמפרטורה שלו היא מתחת ל -35 מעלות צלזיוס. יש לאחסן את הפתרון בטמפרטורה של 4 °C °C (4 °F) למשך עד 3 ימים.
אזהרה: PFA מזיק אם נבלע או אם בשאיפה והוא כנראה תרכובת מוטגנית. השתמשו בכפפות ומסכת פנים לאורך כל התהליך ועבדו בתא בטיחות. - הכנת תמיסת מלח 1x טריס-חוצץ (TBS): להוסיף 6.1 גרם של טריס ו 9 גרם של NaCl ל 800 מ"ל של מים מזוקקים. מערבבים את התמיסה עד לפירוק מלא של המלחים. כווננו את רמת החומציות ל-7.4 עם HCl והתאמו את עוצמת הקול ל-1 ליטר עם מים מזוקקים נוספים. סנן את הפתרון ואחסן אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
- הכנת TBS- 0.1% טריטון X-100: הוסף 0.1 מ"ל של TritonX-100 עד 100 מ"ל של TBS. יש לערבב בעדינות ולאחסן אותו בטמפרטורה של 4 °C (60 °F) למשך עד שבוע אחד.
הערה: כמו טריטון הוא חומר ניקוי צפוף מאוד, לחתוך מעט את המסוף של הקצה עבור צינורות טובים יותר. - הכנה של TBS-5%-Bovine סרום אלבומין (BSA) -0.1% טריטון-X-100: לשקול 5 גרם של BSA ולהוסיף TBS- 0.1% טריטון X-100 פתרון עד נפח סופי של 100 מ"ל. מערבבים בעדינות. Aliquot ולאחסן ב -20 °C (50 °F) עד 2 חודשים.
- איזולקטין GSA-IB4 Alexa fluor-488 מצומד (Isolectin GSA-IB4): משקל 36.75 מ"ג סידן כלוריד דיהידרט (CaCl2·2H2O) והוסף אותו ל-500 מ"ל של PBS טרי. מערבבים את התמיסה עם מוט ערבוב. Pipette 500 μL של הפתרון של CaCl2/PBS ולהוסיף אותו בקבוקון המכיל 500 מיקרוגרם של אבקת איזולקטין GSA-IB4 ליופיליזציה. מערבבים בעדינות ומערבבים את התמיסה בצינורות של 0.5 מ"ל. יש לאחסן אותם בטמפרטורה של 20 °C (60 °F) מוגנים מפני אור.
- פולי(ויניל אלכוהול) בגליצרול/טריס: שקול 2.4 גרם פולי (אלכוהול ויניל), להוסיף 6 גרם של גליצרול ומערבבים בעדינות. לאחר מכן, מוסיפים 6 מ"ל של מים וממשיכים לערבב במשך כמה שעות בטמפרטורת החדר. יש להוסיף 12 מ"ל של תמיסת 0.2 מ' טריס שחוממה מראש (pH: 8.5) ולחמם בטמפרטורה קבועה של 50 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולערבב מדי פעם. לבסוף, צנטריפוגה הפתרון ב 5,000 x g במשך 15 דקות להבהרה.
הערה: תן את הפתרון להתקרר בטמפרטורת החדר, aliquot אותו ולאחסן אותו ב -20 °C (60 °F).
2. כתמי לציטין פלואורסצנטיים
- על עגלים להקריב על ידי פחמן דו חמצני (CO2) שאיפה, לפתות את העיניים עם מספריים16. תקן את העיניים המובחרות עם 4% PFA טרי מוכן למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר (RT).
הערה: קיבעון יכול להתבצע גם על ידי דגירה של העיניים ב 4% PFA לילה (ON) ב 4 °C (60 °F). עכברים הוקרבו על פי הנחיות הצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וחזון והוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (CICUAL) של הפקולטה למדעי הכימיה, האוניברסיטה הלאומית של קורדובה (מיל' HCD 1216/18). - תחת המיקרוסקופ המנתח, להסיר את הקרניות עם מספריים על ידי חיתוך לאורך הלימבוס ולנתח את הרשתיות כולה. השלך את המקטע הקדמי של העין ולאחר מכן הפרד את הרשתית מה- RPE-Choroid.
הערה: הקפד להסיר את שאר הפסולת וכלי היאלויד מהרשתית עם מלקחיים. - מניחים את הרשתיות ב 200 צינורות μL. לאחר מכן, לחסום ולחלחל את הרשתיות ב 100 μL של תמיסת מלח חוצץ Tris (TBS) פתרון המכיל 5% בקר סרום אלבומין (BSA) ו 0.1% טריטון-X-100 במהלך 6 שעות ב 4 °C עם תסיסה עדינה בשייקר.
הערה: ניתן לבצע שלב זה במשך 2 שעות ב- RT. - לאחר מכן, הפוך את הצינור כדי למקם את הרשתית בכובע ולהסיר את פתרון החסימה עם פיפטה.
- הוסף 100 μL של הפתרון המכיל 0.01 מיקרוגרם / μL של Isolectin GSA-IB4 (GSA-IB4). לעטוף את הצינורות עם רדיד אלומיניום כדי להגן על הדגימות מפני אור. לדגור את הרשתיות עם פתרון לציטין על ב 4 °C (50 °F) או עבור 2 שעות ב RT עם תסיסה עדינה בשייקר.
- לשטוף את הרשתית עם 100 μL של TBS המכיל 0.1% טריטון-X-100 במשך 20 דקות עם תסיסה עדינה בשייקר. לכביסה נכונה, מניחים את הרשתית בכובע הצינור על ידי היפוךו. להחזיר את הצינור למצב העמידה שלה ולהסיר את המדיום שנותר במיכל. חזור על שלב זה שלוש פעמים.
- מניחים את הרשתית בשקופית ומוסיפים טיפה של PBS. תחת המיקרוסקופ המנתח, בצע ארבעה חתכים רחוקים באותה מידה משולי הרשתית לכיוון עצב הראייה.
- כדי לפתוח את עלי הכותרת של הרשתית, השתמש מלקחיים או חתיכות קטנות של נייר מסנן. ודא שצד קולטן האור פונה כלפי מטה.
- הסר את ה- PBS הנותר של השקופית עם נייר סינון. לאחר מכן, מוסיפים מדיום הרכבה (פולי (אלכוהול ויניל) בגליצרול / טריס) וכיסוי. תן לו להתייבש במשך 1 שעות ב RT.
- אחסן שקופיות בטמפרטורה של 4 °C °C (60 °F) מוגנות מפני אור.
הערה: ניתן לאחסן את הרשתיות גם ב- PBS בטמפרטורה של 4 °C (4 °F) עד הדמיה מיקרוסקופית קונפוקלית.
3. הדמיה מיקרוסקופית קונפוקלית ורכישת מיקרופוטוגרפיה
- לפני הדמיה, לדגור על השקופיות במשך 10 דקות ב RT מכוסה מאור.
- במיקרוסקופ הקונפוקלי, מקם את השקופית בצלחת עם הפנים כלפי מטה.
- למקד את מקלעת מעולה של כלי הרשתית ולבחור אזור כדי להתחיל את רכישת התמונה.
- הגדר פרמטרי לייזר כלליים בתוכנה: אורך גל: 488 ננומטר; עוצמת לייזר; ח"ו; היסט; לקבל.
הערה: עוצמת הלייזר, PMT, היסט ורווח עשויים להשתנות בהתאם לתנאים ולשימוש במנורה. ההגדרות האופטימליות מספקות תמונה ברורה של כלי הדם הימנעות הרוויה ברגישות של צינור photomultiplier יש קשר ליניארי עם אות פלואורסצנטיות. - הגדר פרמטרי רכישה אחרים: מצב; גודל; אובייקטיבי, ללא זום; אין קלמן; גודל צעד.
הערה: יש להשתמש בתנאי רכישה זהים להדמיית השליטה ודגימות ניסיוניות. - הגדרת הקואורדינטות בציר x ו- y: סרוק את הרשתית במוקד 2x. אם האזור מציג כלי שיט, בחר אותו על-ידי לחיצה כפולה על השטח כדי לסמן אותו לרכישת תמונה מאוחרת יותר.
הערה: מומלץ מאוד לבחור אזור רשתית על ידי ביצוע מקלעת כלי הדם מעולה כמו פלואורסצנטיות של כלי גדול יותר הוא גבוה יותר. - מעבר ברשת לריבוע שכן, מיקוד הרשתית ובחר את האזור אם הוא מתאים. חזור על שלב זה עד שהאזור שנבחר יכלול את הרשתית כולה.
- בחר אזור אחד והגדר את הקואורדינטות בציר z כדי להגדיר את מידת העובי לסריקה. לשם כך, דמיין את הרשתית במוקד 2x; עם המיקרומטר, עבור לראש הרשתית ולחץ על הגדר במיקום התחל. לאחר מכן, עבור לתחתית הרשתית ולחץ על הגדר במיקום הקצה.
- חזור על שלב 3.8 בכל אזור שנבחר ברשת.
הערה: כדי לאמת את האזור הסרוק לעומק, הקש Go במיקום התחל. אם כלי הדם עדיין דמיינו, התאם מחדש את המיקום על-ידי הזזת המיקרומטר ולאחר מכן לחץ על Set. חזור על התהליך במיקום הקצה. - אתחל סריקה אוטומטית.
- לאחר סיום תהליך הסריקה, פתח את התמונה.
- בחר בתבנית סידרה כדי להקליט את התמונה כפסיפס ולשמור אותה עם ההרחבה המועדפת. לבסוף, התמונה התפורה תוצג על המסך.
4. עיבוד תמונה
- בתוכנת ImageJ FIJI, עבור לשורת התפריטים ולחץ על קובץ > פתח. בחר את התמונה לעיבוד. בחלון 'אפשרויות ייבוא של תבניות ביולוגיות' , בחרו במטה-נתונים של Display OME-XML ולחצו על הלחצן 'אשר'.
הערה: יש לשמור תמונות עם שם דומה בתיקיות נפרדות. - בחלון המטה-נתונים של OME , חפשו את מידע גודל הפיקסלים, הנקרא PhysicalSizeX, PhysicalSizeY ו-PhysicalSizeZ. העתק נתונים אלה.
- לכיול תמונה, עברו לשורת התפריטים ובחרו 'מאפייני > תמונה'. העתק את פרטי התמונה בשלב 4.2 ולחץ על אישור. התמונה נפתחת כחלון עם מספר תמונות, כאשר כל אחת מהן מייצגת את המיקרופוטוגרפיות שנרכשו בציר z.
- הקצו לוץ מועדף לתמונה כדי להעביר צבע לתווית הפלואורסצנט. לשם כך, עבור אל שורת התפריטים ולחץ על סמל LUT .
- להצגה חזותית של כל הערימות בתמונה אחת, עבור/י לשורת התפריטים ובחר /י ״תמונה > ערימות > Z Project״.
- בחלון הקרנת Z המוצג, בחר את כל הערימות שבהן מוצגים כלי שיט. בסוג הקרנה, בחרו ' עוצמה ממוצעת' ולחצו על הלחצן 'אשר'.
הערה: התוצאה של סכום הערימות תוצג בתמונה חדשה בשם AVG (שם תמונה). - התאם את הבהירות והניגודיות בתמונה המתקבלת כדי להפחית את כלי הרקע וההדגשה. עבור לשורת התפריטים ולחץ על תמונה> התאמה> בהירות/ניגודיות. בחלונות B ו- C להזיז את הסורגים עד עוצמה טובה יותר הוא ציין. לחץ על החל ושמור את השינויים.
- העתק את הפרמטרים שנבחרו עבור בהירות/חדות; אלה חייבים להיות זהים עבור כל התמונות.
- לפני כימות התמונה, הגדר את הפרמטרים שעומדים להימדד. בשורת התפריטים, עבור אל ניתוח > הגדרת מידות. בהליכים המתוארים כאן, יהיה צורך להשיג שטח והיקף (זה בסופו של דבר גם נדרש כדי למדוד מרחקים). לחץ על אישור.
- הורד את התוסף הדרוש לכימות צפיפות כלי השיט17 ובצע את הוראות ההתקנות המסופקות על ידי התוסף.
- המשך בכימות של פרמטר כלי דם ספציפי.
5. כימות של אזורי כלי דם
- בשורת התפריטים, בחרו בכלי השרביט. בחר את אזור הרשתית שחסרים לו כלי שיט.
הערה: ניתן לבחור אזורים גדולים או קטנים יותר בהתאם לסובלנות. כדי להתאים את הסבילות, לחץ פעמיים על סמל כלי השרביט. מצב מועסק: מורשת. - הקש על אות T בלוח המקשים כדי להקליט את האזור הנבחר במנהל ההחזר על ההשקעה. חזור על שלבים 5.1 ו 5.2 עם כל אזורי כלי הדם של הרשתית.
- לחץ על מדידה במנהל החזר ההשקעה כדי לקבל את המידע על אזור כלי הדם. התוכנית תציג חלון חדש עם המידע הנדרש. העתק את הנתונים בתוכנית אחרת או שמור את הקובץ.
הערה: בתמונות מסוימות, ייתכן שתעדיף לבחור את אזורי כלי הדם באופן ידני. במקרה זה, בחרו בכלי בחירת מצולע, ציירו מרחקים קצרים סביב אזור כלי הדם ולחצו על התמונה כשמרחק חדש עומד להתחיל. סגור את האזור הנבחר על-ידי לחיצה על הנקודה הראשונה. - חזור על שלבים 5.1, 5.2 ו- 5.3 כדי למדוד את השטח הכולל של הרשתית.
- חשב את אזור כלי הדם של הרשתית כסכום של כל אזורי כלי הדם הנמדדים חלקי השטח הכולל של הרשתית.
6. כימות של אזורים ניאו-וסקולריים
- בשורת התפריטים, בחרו בכלי שרביט.
- הגדל את התצוגה של התמונה כדי לדמיין טוב יותר את neovessels. בחר את neovesselsels אחד אחד עם הכלי שרביט.
הערה: התאם את הסבילות לא יותר מ- 20 כדי להבטיח את הבחירה של neovessel יחיד. רמת סובלנות זו חייבת להישאר קבועה במהלך כל כימות התמונה. - הקש על אות T בלוח המקשים כדי להקליט את האזור הנבחר במנהל ההחזר על ההשקעה. חזור על שלבים 6.1 ו 6.2 עם כל האזורים הניאו-וסקולריים של הרשתית.
- לחץ על מדידה במנהל ההחזר על ההשקעה כדי לקבל את נתוני האזור. התוכנית תציג חלון חדש עם המידע הנדרש. העתק את הנתונים בתוכנית אחרת או שמור את הקובץ.
- חזור על שלבים 6.1, 6.2 ו- 6.3 כדי לכמת את השטח הכולל של הרשתית.
- חשב את האזור הניאו-וסקולרי של הרשתית כסכום של כל האזורים של neovessels נמדד חלקי השטח הכולל של הרשתית.
7. כימות קוטר כלי השיט
- בשורת התפריטים, בחרו בכלי קו ישר.
- הגדל את התצוגה של התמונה כדי לדמיין טוב יותר את קיר כלי השיט. בצע שלושה קווים חוצים לכלי הראשי לפני הענף הראשון. זה חייב להיעשות על ידי ציור קו מגבול של קיר אחד של הכלי להפך.
הערה: הקו חייב להיות מאונך באופן מושלם לכלי הקיר כדי למנוע שגיאות כימות. - הקש על אות T בלוח המקשים כדי להקליט את האזור הנבחר במנהל ההחזר על ההשקעה. חזור על שלבים 7.1 ו 7.2 בכל כלי השיט שיש לכמת.
- לחץ על מדידה במנהל ההחזר על ההשקעה כדי לקבל את נתוני המרחק. התוכנית תציג חלון חדש עם המידע הנדרש. העתק את הנתונים בתוכנית אחרת או שמור את הקובץ.
8. כימות של טורטואוזיות כלי שיט
- בשורת התפריטים, לחץ על סמל הכלי קו ישר עם הכפתור הימני של העכבר ובחר קו מקוטע או קו חופשי. צייר קו בתוך הכלי מעצב הראייה עד להשלכות הכלי הראשון בעקבות צורת כלי הדם.
הערה: הקו חייב לעקוב אחר צורת כלי הדם כדי למנוע שגיאות כימות. - הקש על אות T בלוח המקשים כדי להקליט את האזור הנבחר במנהל ההחזר על ההשקעה.
- בשורת התפריטים, בחרו בכלי קו ישר. צייר קו מעצב הראייה עד השלכות כלי השיט הראשון.
- הקש על אות T בלוח המקשים כדי להקליט את האזור הנבחר במנהל ההחזר על ההשקעה.
- לחץ על מדוד במנהל החזר ההשקעה כדי לקבל את נתוני המרחקים. התוכנית תציג חלון חדש עם המידע הנדרש. העתק את הנתונים בתוכנית אחרת או שמור את הקובץ.
- חשב את מדד הטורטואוזיות כדלקמן: מרחק המתקבל עם קו מקוטע חלקי המרחק המתקבל בקו ישר.
9. כימות הסתעפות כלי הדם
- בעזרת הכלי הסגלגל של שורת התפריטים, הגדר אזור המוחל באופן שווה על כל תנאי הניסוי. האזור שנבחר חייב להיות עיגול קונצנטרי שצויר סביב עצב הראייה.
- הקש על אות T בלוח המקשים כדי להקליט את האזור הנבחר במנהל ההחזר על ההשקעה.
הערה: במקרה זה, מומלץ לשמור את ההחזר על ההשקעה מכיוון שהכימות איטי ויש להשתמש בהחזר ההשקעה הזהה בכל התמונות. לשם כך, במנהל החזר ההשקעות לחץ על עוד > שמור. - באופן ידני, ספור את מספר הענפים הראשיים הנובעים מכלי שיט עיקריים בתוך אזור הבחירה.
- חזור על שלבים 9.2 ו-9.3 באזורים הסמוכים, תוך שמירה על הקריטריונים של עצב הראייה בפריפריה.
10. כימות צפיפות כלי הדם
- הפכו את התמונה למצב של 8 סיביות.
- עבור אל תוספים בשורת התפריטים, בחר ניתוח כלי > צפיפות כלי הדם.
- הגדר אזור באמצעות הכלי ריבועי של שורת התפריטים, שבו יש למדוד את צפיפות כלי השיט. לחץ על אישור.
- התוכנית תציג חלון חדש עם המידע הנדרש. העתק את הנתונים בתוכנית אחרת או שמור את הקובץ.
- חזור על שלבים 10.2, 10.3 ו- 10.4 באזורים הסמוכים, תוך שמירה על ההחזר על ההשקעה אך הצבתו תשע פעמים המקיפה את הפריפריה ומרכז הרשתית כולה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כפי שמתואר בסעיף הפרוטוקול, מתוך בדיקת כתמים פלואורסצנטית אחת אתה יכול להשיג את המורפולוגיה של כלי הדם ולהעריך כמה פרמטרים של עניין כמותי. החיפוש אחר שינוי מסוים יהיה תלוי בסוג הרטינופתיה שנחקרה. במאמר זה, אזורים וסקולריים וניאו-וסקולריים, טורטואוזיות והרחבה הוערכו במודל עכבר של רטינופתיה מתרבה, ואילו הסתעפות כלי הדם והצפיפות נותחו במודל עכבר MetS, מה שגורם לרטינופתיה לא מתרבות.
בדוגמה הניסיונית הראשונה, מודל העכבר רטינופתיה המושרה בחמצן (OIR), הועסק, הדומה לרטינופתיה של פגות וכמה תכונות של השלב ההתפשטותי של רטינופתיה סוכרתית. במודל זה, המלטה נשמרת עם אמם הסיעודית בתא היפראוקסי מיום הלידה (P)7 עד P1218. זריקות Intravitreal בוצעו ב P12 כדי לקבוע את האפקטיביות של תרופה כמו אנטינגיוגני (מצב בשם טיפול). עכברים הוקרבו ב P17, נקודת הזמן של היווצרות neovessels המקסימלי19. עכברים שהוזרקו עם רכב הועסקו כבקרה. שתי הדגימות היו קבועות ומוכתמות באיסולקטין GSA-IB4 יחד. לאחר רכישת קונפוקל, תמונות נותחו עם תוכנת ImageJ FIJI כפי שצוין לעיל. עם מודול התפירה המשולב במיקרוסקופ קונפוקלי, הרכבה שלמה נצפתה כתמונה ייחודית (איור 1). ב-P17 ניתן לצפות בכלי הדם ההיאאלואידיים, מערכת כלי דם ארעית החיונית במהלך החיים התוך רחמיים (איור 1, חצים לבנים)20.
כתוצאה מאספקת חמצן מופרזת בתא ההיפראוקסי, עכברי OIR עוצרים את התפתחות כלי הדם הפיזיולוגיים ומייצרים אזורי כלי דם ברשתית. לאחר מכן, אזורי כלי הדם מוגדרים כאזורים חסרי כלי דם ברשתית (איור 2). מן התמונות שנרכשו, אזורים וסקולריים ניתן לכמת כסכום של האזורים ללא כלי מחולק על ידי השטח הכולל של הרשתית. אזורים עם נזק מכני מראים גם היעדר כלי שיט. כדי לזהות אזורים פגומים, לנתח את השלמות של שכבות עצביות עם כתם Hoechst.
אזורי כלי הדם של הרשתית להימנע אספקת חמצן, ולכן, תגובה פרו-אנגיוגנית חזקה מוגדרת, גרימת neovascularization16. Neovessels הם כלי קליבר קטן שמקורם בכלי קיים של מקלעת כלי דם מעולה. המבנה שלהם הוא לא מאורגן, ולכן, neovessels לגדול כמו tufts לכיוון חלל הזגוגית21. חישבנו את האזור הכבוש על ידי טאפטים של neovessels על ידי כימות האזור הניאו-וסקולרי של הרשתית חלקי השטח הכולל של הרשתית (איור 3). מכיוון שצורתם וגודלם של הניאו-אווסלים משתנים, לעיתים הם יכולים להיראות דומים לפסולת ולממצאים. כדי להבחין בין neovessels, ודא כי tuft גדל מכלי בוגר.
הרחבת כלי הדם וטורטואוזיות הם שני שינויים תכופים אחרים, אשר יש השפעות שליליות על ביולוגיה של כלי הדם, כפי שהם מייצרים זרימת דם סוערת. לצורך ניתוח ההרחבה, מדדנו את קוטר כלי השיט העיקריים בשלושה גבהים לפני הסניף הראשון 22,23 (איור 4). החוקרים חייבים להגדיר מרחק קבוע מראש כדי למדוד את קוטר הכלי על מנת להפחית את השונות בין התוצאות. באופן אידיאלי, הנקודה הרחוקה ביותר מעצב הראייה צריכה להיות סביב 300 מיקרומטר. אנו מציעים לבצע את הניתוח ולאחר מכן לקחת בממוצע לפחות שישה עכברים לכל מצב.
באשר לטורטואוזיות, אנו מודדים את המרחק המכוסה על ידי כלי הדם העיקריים העוקבים אחר צורתו ביחס למרחק הישר בין עצב הראייה לנקודת ההסתעפות הראשונה24 (איור 5). כפי שאנו יכולים לראות בתמונה, יש הטרוגניות בסינוסיות של הכלים העיקריים. כדי להשיג תוצאה מייצגת, יש לכמת לא פחות משישה עכברים לכל תנאי.
הפרמטרים האחרונים, הסתעפות כלי דם וצפיפות, נותחו במודל MetS המציג רטינופתיה לא מתרבות. ב- MetS, הן שומנים והן פחמימות מופרעים קשורים pericytes רשתית ותאי אנדותל תפקוד ומוות, מה שמוביל להיווצרות של נימים תאוצה או הסתעפות כלי דם ירד25. במודל שלנו, עכברי ApoE-KO קיבלו פרוקטוז שנוספו למי השתייה, בריכוז של 10% w /v. חיות בקרה קיבלו מי ברז. לאחר 4 חודשים של דיאטה, עכברים הוקרבו, ואת הרשתיות מעובדות כפי שצוין קודם לכן. לצורך מדידת הסתעפות כלי הדם, הגדרנו את אזור הכימות על ידי ציור עיגול קונצנטרי, ואז ספרנו, בזה אחר זה, את הענפים העיקריים הנובעים מכלי מרכזי ראשי (איור 6).
מהתמונות שנרכשו, צפיפות כלי הדם כונתה כשטח הכבוש על ידי כלי שיט המחולק על ידי שטח ההחזר על ההשקעה (ריבוע של 0.015 מ"מ2, ראה שיטוח באיור 7), אשר הוצב במקומות שונים בכל מיקרופוטוגרפיה, כפי שהוסבר בסעיף הפרוטוקול. הימנע מכמת אזורים עם נזק מכני (איור 7, חצים לבנים). אם יש יותר משני אזורים עם נקבים, יש להשליך את הרשתית.
איור 1: כתמי כלי דם של רשתיות שלמות של הרכבה מלאה המסומנת עם Isolectin GSA-IB4: תמונות קונפוקליות מייצגות של רשתות עכברי P17 OIR המוזרקות לרכב או לטיפול ב- P12. כתמים פלואורסצנטיים בוצעו ברשתיות הר שלמות עם Isolectin GSA-IB4 Alexa 488 על פי הפרוטוקול. אזורי כלי דם (AV) ואזורים ניאו-וסקולריים (NV) מסומנים. סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר. החצים הלבנים מראים את שאריות כלי הדם ההיאאלואידיים. חצים צהובים מציגים אזורי סריקה לא שלמים במהלך רכישת תמונה קונפוקלית. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: כימות של אזורי כלי דם: (A) תמונות מייצגות של רשתות הר שלמות ב-P17 המציגות כתמי כלי דם GSA-IB4 בעכברים עם רכב OIR וטיפול OIR. אזורים עם השמדת כלי דם מסומנים בצהוב. סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר. (B) אזור AV (%) היה כימות כמו היחס של אזור כלי דם מרכזי לאזור רשתית שלמה. בדיקת t דו-זנבית לא מזווגת שימשה להשוואה סטטיסטית. נתונים המוצגים כממוצע ± SEM. *** p < 0.001. לפחות שישה בעלי חיים הועסקו עבור כל תנאי בזמן ההישרדות שנבדק. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: כימות של אזורים ניאו-וסקולריים: (A) תמונות מייצגות של רשתות הר שלמות ב-P17 המציגות כתמי כלי דם GSA-IB4 בעכברים מסוג OIR-vehicle ו-OIR-Treatment. אזורים עם ניאווסקולריזציה מסומנים בלבן. סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר. (ב) שטח ה- NV (%) כונתה כיחס בין השטח שנכבש על ידי neovesselsels לאזור רשתית שלם. בדיקת t דו-זנבית לא מזווגת שימשה להשוואה סטטיסטית. נתונים המוצגים כממוצע ± SEM. *** p < 0.001. לפחות שישה בעלי חיים הועסקו עבור כל תנאי בזמן ההישרדות שנבדק. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: כימות הרחבת כלי הדם: (A) תמונות מייצגות של רשתות הר שלמות ב-P17 המציגות כתמי כלי דם GSA-IB4 בעכברים עם רכב OIR ו-OIR-Treatment. חלוניות שמאליות: החזרי השקעה שנבחרו לכימות. לוחות ימניים: זום של ROIs, מראה קווים ישרים המבוצעים בכלי הראשי כדי למדוד את קוטר הכלי. שלושה קווים אותרו באופן חוצה לכלי השיט וממוצע. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. (B) קוטר הכלי (%) היה כימות כמו הקוטר הממוצע נמדד בכלי הראשי של הרשתית. בדיקת t דו-זנבית לא מזווגת שימשה להשוואה סטטיסטית. נתונים המוצגים כממוצע ± SEM. *p < 0.05. לפחות שישה בעלי חיים הועסקו עבור כל תנאי בזמן ההישרדות שנבדק. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: קביעת מדד טורטואוזיות: (A) תמונות מייצגות של רשתות הר שלמות ב-P17 המציגות כתמי כלי דם GSA-IB4 בעכברים לטיפול ברכב OIR וב-OIR.T. חלוניות שמאליות: החזרי השקעה שנבחרו לכימות. לוחות מרכזיים: זום של החזר ההשקעה, המציג קווים מקוטעים במעקב בכלי הראשי מעצב הראייה לנקודת ההסתעפות הראשונה. לוחות ימניים: זום של החזר ההשקעה, המציג קווים ישרים במעקב בכלי הראשי מעצב הראייה לנקודת ההסתעפות הראשונה. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. (B) מדד הטורטואוזיות הושג על ידי חלוקת המרחק של הקו המפולח למרחק הקו הישר. בדיקת t דו-זנבית לא מזווגת שימשה להשוואה סטטיסטית. נתונים המוצגים כממוצע ± SEM. ns, לא משמעותיים. לפחות שישה בעלי חיים הועסקו עבור כל תנאי בזמן ההישרדות שנבדק. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: כימות של הסתעפות כלי דם: (A) תמונות מייצגות של רשתות הר שלמות המציגות כתמי כלי דם של Isolectin GSA-IB4 בעכברים המוזנים ApoE-KO ו- ApoE-KO + פרוקטוז. אזורי כימות מעגליים הוגדרו בצהוב. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר, הגדלה של פי 100. (ב) מספר הענפים כונת כמספר הענפים העיקריים מכלי מרכזי, שכן עצב הראייה לפריפריה. בדיקת t דו-זנבית לא מזווגת שימשה להשוואה סטטיסטית. נתונים המוצגים כממוצע ± SEM. ns, לא משמעותיים. לפחות שש חיות הועסקו בכל תנאי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: כימות צפיפות כלי הדם: (A) תמונות מייצגות של רשתות הר שלמות המציגות כתמי כלי דם של Isolectin GSA-IB4 בעכברים המוזנים ב- ApoE-KO ו- ApoE-KO + פרוקטוז האכיל עכברים. ריבוע של 0.015 מ"מ2 אזור כימות הוגדר בצהוב. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר, הגדלה של פי 100. (B) צפיפות כלי הדם כונתה כיחס בין אזור כלי הדם לאזור ההחזר הכולל על ההשקעה, אשר הוצב תשע פעמים במקומות שונים בכל מיקרופוטוגרפיה. חצים לבנים מראים אזורים עם נזק מכני. בדיקת t דו-זנבית לא מזווגת שימשה להשוואה סטטיסטית. נתונים המוצגים כממוצע ± SEM. ns, לא משמעותיים. לפחות שש חיות הועסקו בכל תנאי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מודלים מן החי של רטינופתיות הם כלים רבי עוצמה לחקר התפתחות כלי הדם, שיפוץ או אנגיוגנזה פתולוגית. ההצלחה של מחקרים אלה בתחום מסתמכת על הגישה הקלה לרקמה המאפשרת לבצע מגוון רחב של טכניקות, ומספקת נתונים מ- in vivo ועכברים לאחר המוות26,27. יתר על כן, נמצא מתאם רב בין מחקרי vivo וניתוח קליני, מתן עקיבות מוצקה ואמינות למודלים אלה28. במאמר זה, אנו מציגים תיאור פשוט וחזק של השלבים לאפיון רשת כלי הדם במודלים של עכבר של מחלות כלי דם ברשתית. בספרות, הקוראים ימצאו פרמטרים אפשריים אחרים למדוד וגישות מקבילות כדי לכמת את אלה שנבחרו כאן. לפרוטוקולים המהודרים יש יתרונות רבים על פני אחרים מכיוון שהם ניתנים לשחזור, והם פשוט דורשים תוכנה חופשית כדי לבצע את הניתוח (Image J Fiji).
יתר על כן, פרוטוקולים אלה קלים לביצוע על ידי תלמידים שאין להם ידע נרחב על התוכנית ורוב המדידות אינן זקוקות לתוספים נוספים (למעט צפיפות כלי דם).
מיצוי מדגם וטכניקת כתמי פלואורסצנטיות הם פשוטים וקצרים29. חשוב מאוד לעבוד עם רשתיות טריות, אם כי הם יכולים להיות מאוחסנים ב 4 °C (50 °F) ב PBS עם מעכבי צמיחה חיידקית. כמו הרקמה היא דקה ורכה, אז דגימות ישנות לעתים קרובות לשבור במהלך הדגירה או בעת פתיחת המדגם לפני הרכבה. חוץ מזה, קיבעון מוגזם עם 4% PFA הופך את הרשתית נוקשה ופריכה יתר על המידה, אבל זה לא משפיע על כתמי lectin. כתמי Isolectin GSA-IB4 מאפשרים לדמיין את רשת כלי הדם המלאה בכל שכבה, כולל neovessels ותאי אנדותל מתרבים. סמנים אחרים, כמו CD 31, דורש דגירה של המדגם עם נוגדנים מרוכזים ויש להם יותר רקע. מצד שני, באנגיוגרפיה, הצבע הפלואורסצנטי נוטה לפזר מתוך כלי הדם, מה שמגביר את השונות בקליבר כלי השיט וכימות הטורטואוזיות. חיסרון אחד של Isolectin GSA-IB4 הוא שזה יכול גם לתייג תאים microglial30. יש לנקוט בזהירות בעת ביצוע זריקות intravitreal או הליכים ניסיוניים אחרים הגורמים חדירה מוגזמת כי התאים microglial יכול ליצור agglomerates.
רכישת תמונה יכולה להתבצע עם כל מיקרוסקופ קונפוקלי. השימוש בזוג לוחות ממונעים לתוכנה הכוללת את מודול התפירה יספק הדמיה מלאה של הרשתית המותקנת כולה בתמונה אחת. בעת בחירת אזור הרשתית, ודאו שכל הקצוות של המדגם כלולים, אחרת התמונה לא תהיה שלמה (איור 1, חצים צהובים). זה לא מאוד רלוונטי במודל העכבר של OIR, כדוגמה, כי שינויים בכלי הדם נמצאים ליד עצב הראייה. בעוד במודל החולדה של OIR, טעות זו יכולה להוביל לכימות לא מדויק, כמו אזורי כלי דם ניאווסקולריים נמצאים ליד הלימבוס. אפשרות נוספת היא לקחת מיקרופוטוגרפיות רשתית בודדות. מאוחר יותר המשתמש יכול לארגן אותם כחידה עם תוכנה מתאימה. זה לא מומלץ להשתמש מיקרוסקופ epifluorescence, במיוחד בעת ניתוח הסתעפות, כי כלי נבטים לאורך כל העובי של הרשתית וכמה כלי לא יזוהו בערימה z בלבד.
במהלך עיבוד תמונה עם ImageJ FIJI, מומלץ לא לעדכן את התוכנה עד שכל התמונות יכומתו, על מנת לשמור על תנאים זהים בתוכנה. הכיול של התמונות (הקצאה של גודל פיקסל במיקרונים) הוא צעד קריטי שכן פרוטוקולים אלה מרמזים על כימות של מרחקים ואזורים. כאשר מכירים את התוכנית, המשתמש יכול לחקור כלים אחרים כדי לבחור את הניאווסקולרי ואת אזור כלי הדם בנוסף לכלי השרביט. כלי בחירת המצולעים שימושי במיוחד למדידת אזורי כלי דם שנחתכו בשני חלקים בשלב ההרכבה. חוקרים אחרים יצרו תוספים ספציפיים כדי להפוך את הבחירה של neovessels מבוסס על עוצמת פלואורסצנטיות של מבנים אלה. שיטות אלה מהירות יותר ופחות מייגעות, אם כי מומלץ לבדוק כי neovesselsels קטן פחות מבריק נבחרו לפני כימות31. האזורים של neovesselsels יהיה fluoresce בעוצמה רבה יותר מאשר כלי הדם הרגילים שמסביב. הכלי מטה הקסם בוחר אזורים בצבע דומה והסובלנות קובעת עד כמה דומים בצבע הפיקסלים שנבחרו. אם neovessel הוא בעוצמה דומה לכלים נורמליים, הסובלנות עשויה להיות מותאמת כלפי מטה כדי להגביר את הרגישות להבדלי עוצמה עדינים. למרות בחירת neovessel בכל מדגם יבוצע עם סף זהה, כמה neovesselsels מאופיינים על ידי עוצמת פלואורסצנטיות קלה. במקרה זה, סובלנות נמוכה יותר תידרש לבחירה נכונה.
טורטואוזיות והרחבה הן מדידות של מרחק. מחקר מקיף של עץ כלי הדם מועיל לבחור כלי מסוג זהה (עורקים או ורידים) וקליבר. אנו מודדים את ההרחבה בכלי השיט בשלושה גבהים כפי שמוצג באיור 4. הזווית של הבחירה הישרה ביחס לקיר כלי השיט היא נקודה רלוונטית נוספת שיש לקחת בחשבון. זה צריך להיות קרוב ככל האפשר ל 90 ° כדי למנוע שגיאות אפשריות. בעת ציור הקו הישר, משתמשים יכולים להשתמש בכלי זום כדי להתקרב לכלי העניין.
הסתעפות כלי דם ניתן למדוד גם בשני אזורי כימות או יותר בגבהים שונים, אם תרצה. במקרה זה, החוקרים צריכים לשמר את האזור של הרשתית מנותח (מרכזי, בינוני, או צד היקפי של עצב הראייה). למרות שהסתעפות משתנה במספר מודלים בעלי חיים של רטינופתיה, שלבים מוקדמים של הרטינופתיה הקשורה למטס המוצגים כאן עדיין אינם מראים שינויים כאלה15. למחקרים מקיפים בנימים ברשתית של מקלעת הביניים והעמוקה ונבטת כלי הדם, שיטות חישוביות תלת-ממדיות מספקות נתונים בעלי ערך של וריאציות עדינות במורפולוגיה של כלי הדם וברשת32. לבסוף, צפיפות כלי הדם נקבעת על ידי האזור הכבוש על ידי כלי ביחס לשטח הכולל של החזר ההשקעה שנבחר. המידה של פרמטר זה דורשת שימוש בתוסף ובגירסה ממומשת של ImageJ FIJI, שבה כלי מפת סף אוטומטי וגיאומטריה למרחק חייבים להיות זמינים. למרות שלבים נוספים אלה, התוסף קל לשימוש, ניתן לשחזור ואמין. למדידת צפיפות כלי הדם, נבחר החזר השקעה של 0.015 מ"מ2 , על מנת לבצע עשר מדידות של עוצמת הפלואורסצנטיות באזורים שונים של הרשתית. גודל זה אפשר לנו לכסות את התמונה כולה, ובכך להשיג ערך ממוצע מייצג יותר ואת הסטייה שלה בכל רשתית.
בסך הכל, למרות העובדה כי אוספים אלה של שיטות אינם אוטומטיים ודורשים בחירה ידנית של הפרמטרים, הם מסוגלים לספק נתונים כמותיים וקפדניים של הרשתיות. המגבלה העיקרית לגבי הפרוטוקולים שהוצגו לעיל למדידות כלי דם מסתמכת על השונות הבין-בוחנת בעת ניתוח אותה תמונה. כדי למזער הטיה זו, חשוב לקבוע מראש את ההגדרה הכללית כגבולות קיר כלי שיט, זיהוי של אזורי כלי דם ו neovessels, וגם קריטריונים להחרגה עבור רקמות פגומות. לגבי טורטואוזיות כלי הדם, נדרשת נקודת התחלה מוסכמת ליד עצב הראייה. עבור משתמשים מתחילים, מומלץ מאוד ממוצע הנתונים שנאספו על ידי שני בוחנים או יותר. אצל משתמשים מיומנים לא נמצאו הבדלים משמעותיים במדידת הפרמטרים השונים, כל עוד ההסכמה בקריטריוני הכימות נותרה קבועה. באופן דומה, ניתן להוסיף פרמטרים נוספים לפרוטוקולים המפורטים, בהתאם לשינויים בכלי הדם שזוהו ברטינופתיה. ברטינופתיות שאינן מתרבות, המדידה של מספר נימים תאיים, פריקטים נודדים, יחס של pericytes / מספר תאי אנדותל וחדירות מחסום רשתית הדם הם הפרמטרים המוקדמים ביותר ששונו בכלי הרשתית33,34,35. עבור מודלים כרוניים ורטינופתיות קלות, מומלץ לכלול מדידות נוספות אלה. מספר גדול של פרמטרים שנמדדו יספקו נוף נאמן יותר של האירועים המתרחשים בכלי הדם. לסיכום, במאמר זה, הראינו טכניקות קלאסיות, מבוססות היטב וניתן לשחזור כדי לכמת כמה מהפרמטרים הרלוונטיים ביותר שנלקחו בחשבון בפרקטיקה הקלינית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי המחקר נערך בהיעדר קשרים מסחריים או פיננסיים שיכולים להתפרש כניגוד אינטרסים פוטנציאלי.
Acknowledgments
אנו מודים לקרלוס מאס, מריה פילאר קרספו וססיליה סמפדרו מ- CEMINCO (Centro de Micro y Nanoscopía Córdoba, CONICET-UNC, קורדובה, ארגנטינה) על הסיוע במיקרוסקופיה קונפוקלית, לסולדד מירו וויקטוריה בלנקו על טיפול מסור בבעלי חיים ולורה גטיקה על סיוע היסטולוגי. אנו מודים גם לויקטור דיאז (פרו-מזכיר התקשורת המוסדית של FCQ) על הפקת הווידאו והמהדורה ופול הובסון על הקריאה הביקורתית שלו ותיקון השפה של כתב היד.
מאמר זה מומן על ידי מענקים מ Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT), Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (all to M.C.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminuim foil | |||
| Bovine Serum Albumin | Merck | A4503 | quality |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | C3306 | |
| Hydrochloric acid | Biopack | 9632.08 | |
| Confocal Microscope FV1200 | Olympus | FV1200 | with motorized plate |
| Covers | Paul Marienfeld GmnH & Co. | 111520 | |
| Dissecting Microscope | NIKON | SMZ645 | |
| Disodium-hydrogen-phosphate dihydrate | Merck | 119753 | |
| 200 µL tube | Merck | Z316121 | |
| Filter paper | Merck | WHA5201090 | |
| Incubator shaker GyroMini | LabNet International | S0500 | |
| Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | I21411 | |
| Poly(vinyl alcohol) (Mowiol 4-88) | Merck | 475904 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 158127 | |
| pHmeter | SANXIN | PHS-3D-03 | |
| Potassium chloride | Merck | P9541 | |
| Potassium-dihydrogen phosphate | Merck | 1,04,873 | |
| Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Sodium chloride | Merck | S3014 | |
| Sodium hydroxide | Merck | S5881 | |
| Tris | Merck | GE17-1321-01 | |
| Triton X-100 | Merck | X100-1GA | |
| Vessel Analysis Fiji software | Mai Elfarnawany | https://imagej.net/Vessel_Analysis |
References
- Kur, J., Newman, E. A., Chan-Ling, T. Cellular and physiological mechanisms underlying blood flow regulation in the retina and choroid in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (5), 377-406 (2012).
- McDougal, D. H., Gamlin, P. D.
- Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. Retinal vasculature development in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (2018).
- Wei, Y., et al. Age-related alterations in the retinal microvasculature, microcirculation, and microstructure. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (9), 3804-3817 (2017).
- Lavia, C., et al. Reduced vessel density in the superficial and deep plexuses in diabetic retinopathy is associated with structural changes in corresponding retinal layers. PLoS One. 14 (7), 0219164 (2019).
- Rosenblatt, T. R., et al. Key factors in a rigorous longitudinal image-based assessment of retinopathy of prematurity. Scientific Reports. 11 (1), 5369 (2021).
- Edwards, A. L. Funduscopic examination of patients with diabetes who are admitted to hospital. Canadian Medical Association Journal. 134 (11), 1263-1265 (1986).
- Lechner, J., O'Leary, O. E., Stitt, A. W. The pathology associated with diabetic retinopathy. Vision Research. 139, 7-14 (2017).
- Sun, Z., et al. angiography metrics predict progression of diabetic retinopathy and development of diabetic macular edema: A prospective study. Ophthalmology. 126 (12), 1675-1684 (2019).
- Jia, Y., et al. Quantitative optical coherence tomography angiography of vascular abnormalities in the living human eye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 2395-2402 (2015).
- Pauleikhoff, D., Gunnemann, F., Book, M., Rothaus, K. Progression of vascular changes in macular telangiectasia type 2: comparison between SD-OCT and OCT angiography. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 257 (7), 1381-1392 (2019).
- Gammons, M. V., Bates, D. O. Models of oxygen induced retinopathy in rodents. Methods in Molecular Biology. 1430, 317-332 (2016).
- Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal models of choroidal and retinal neovascularization. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).
- Han, N., Xu, H., Yu, N., Wu, Y., Yu, L. MiR-203a-3p inhibits retinal angiogenesis and alleviates proliferative diabetic retinopathy in oxygen-induced retinopathy (OIR) rat model via targeting VEGFA and HIF-1α. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 47 (1), 85-94 (2020).
- Paz, M. C., et al. Metabolic syndrome triggered by fructose diet impairs neuronal function and vascular integrity in ApoE-KO mouse retinas: Implications of autophagy deficient activation. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 573987 (2020).
- Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).
- Zarb, Y., et al. Ossified blood vessels in primary familial brain calcification elicit a neurotoxic astrocyte response. Brain. 142 (4), 885-902 (2019).
- Smith, L. E., et al.
- Subirada, P. V., et al. Effect of autophagy modulators on vascular, glial, and neuronal alterations in the oxygen-induced retinopathy mouse model. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 279 (2019).
- Lutty, G. A., McLeod, D. S. Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).
- Kim, C. B., D'Amore, P. A., Connor, K. M. Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).
- Guaiquil, V. H., et al. A murine model for retinopathy of prematurity identifies endothelial cell proliferation as a potential mechanism for plus disease. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5294-5302 (2013).
- Mezu-Ndubuisi, O. J. In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery. Optometry and Vision Science: Official Publication of the American Academy of Optometry. 93 (10), 1268-1279 (2016).
- Scott, A., Powner, M. B., Fruttiger, M. Quantification of vascular tortuosity as an early outcome measure in oxygen induced retinopathy (OIR). Experimental Eye Research. 120, 55-60 (2014).
- Kim, A. Y., et al. Quantifying microvascular density and morphology in diabetic retinopathy using spectral-domain optical coherence tomography angiography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 362 (2016).
- Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
- Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal models of choroidal and retinal neovascularization. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).
- Kern, T. S., Antonetti, D. A., Smith, L. E. H. Pathophysiology of diabetic retinopathy: Contribution and limitations of laboratory research. Ophthalmic Research. 62 (4), 196-202 (2019).
- Lorenc, V. E., et al. IGF-1R regulates the extracellular level of active MMP-2, pathological neovascularization, and functionality in retinas of OIR mouse model. Molecular Neurobiology. 55 (2), 1123-1135 (2018).
- Ma, N., Streilein, J. W. Contribution of microglia as passenger leukocytes to the fate of intraocular neuronal retinal grafts. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (12), 2384-2393 (1998).
- Mazzaferri, J., Larrivée, B., Cakir, B., Sapieha, P., Costantino, S. A machine learning approach for automated assessment of retinal vasculature in the oxygen induced retinopathy model. Scientific Reports. 8 (1), 3916 (2018).
- Milde, F., Lauw, S., Koumoutsakos, P., Iruela-Arispe, M. L. The mouse retina in 3D: quantification of vascular growth and remodeling. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro (Camb). 5 (12), 1426-1438 (2013).
- Yang, T., et al. Pericytes of indirect contact coculture decrease integrity of inner blood-retina barrier model in vitro by upgrading MMP-2/9 activity. Disease Markers. 2021, 7124835 (2021).
- Huang, Q., Wang, S., Sorenson, C. M., Sheibani, N. PEDF-deficient mice exhibit an enhanced rate of retinal vascular expansion and are more sensitive to hyperoxia-mediated vessel obliteration. Experimental Eye Research. 87 (3), 226-241 (2008).
- Jiang, H., Zhang, H., Jiang, X., Wu, S. Overexpression of D-amino acid oxidase prevents retinal neurovascular pathologies in diabetic rats. Diabetologia. 64 (3), 693-706 (2021).
