Summary
この記事では、実装網膜製剤全体に対する確立された再現性のあるレクチン染色アッセイと、増殖性および不拡散性網膜症において頻繁に変化する血管パラメータの定量的測定に必要なプロトコルについて説明する。
Abstract
網膜症は、眼の神経感覚組織に影響を与える疾患の不均一なグループである。それらは神経変性、神経膠症および血管機能および構造の進行性の変化によって特徴付けられる。網膜症の発症は視覚の微妙な障害によって特徴付けられるが、血管叢の修飾は臨床医によって検出される最初の徴候である。新血管新生の不在または存在は、網膜症が不拡散(NPDR)または増殖(PDR)のいずれかに分類されるかどうかを決定する。この意味で、いくつかの動物モデルは、内皮変化、神経死および他の事象が、その他の事象に関与する根本的なメカニズムを決定するために、各段階の特定の血管特徴を模倣しようとした。本稿では、出生後(P)17日の成人および早期出産マウスにおけるレチナル血管パラメータの測定に必要な手順の完全な説明を行う。後の顕微鏡可視化のための全体の台紙のイソレチンGSA-IB4とのレチナル血管染色を行うためのプロトコルを詳述する。イメージJフィジーソフトウェアで画像処理のための重要なステップも提供されているので、読者は血管密度、直径およびトース性、血管分岐、ならびに血管および新血管領域を測定することができる。これらのツールは、不拡散性および増殖性網膜症の両方における血管変化を評価し、定量化するのに非常に有用である。
Introduction
目は2つの動脈静脈系によって栄養を与えられます:脈絡膜血管系、網膜色素上皮および光受容体を灌漑する外部血管ネットワーク。神経節細胞層とretina1の内部核層を灌漑する神経残性血管系。レチナル血管系は、栄養と酸素をレチナル細胞に供給し、廃棄物を収穫して適切な視覚シグナル伝達を確実にする血管の組織的ネットワークです。この血管系には、自律的な内インベーションの欠如、固有の筋機構による血管緊張の調節、複雑な筋血バリアの所持など、いくつかの特徴的な特徴があります2。したがって、血管系の血管系の研究は、開発中の血管形成だけでなく、これらの血管が疾患で受ける変化や病的血管新生も広く研究してきた多くの研究者の焦点となっています3。網膜症で観察される最も一般的な血管変化は、血管拡張、新血管新生、血管の樹状化および網膜主血管の変形の喪失であり、これらはよりジガギー4,5,6となる。記載された変更の1つ以上は、臨床医によって検出される最も初期の徴候である。血管の可視化は、迅速で、非侵襲的で、かつ安価なスクリーニング方法7を提供する。血管樹で観察される変化の広範な研究は、網膜症が不拡散または増殖性であるかどうかを決定し、さらなる治療を行う。不増殖性網膜症は、異常な血管形態、血管密度の低下、無細胞毛細血管、骨膜死、黄斑浮腫などで現れる。さらに、増殖性網膜症はまた、血管透過性の増加、細胞外リモデリング、および網膜剥離を容易に破壊または誘導する虚膜腔に向かう血管房の形成を発症する8。
一度検出されると、網膜症は、その血管変化を介して監視することができます9,10。病理の進行は、疾患の段階を明確に定義する血管の構造変化を通して追跡することができる11。これらのモデルにおける血管変化の定量化は、血管の変化と神経死を相関させ、疾患の異なる段階の患者に対する薬理学的療法を試験することを可能にした。
上記の記述に照らして、網膜症研究において血管変化の認識と定量化が基本であると考える。本研究では、異なる血管パラメータの測定方法を紹介する。そのために、2つの動物モデルを採用します。そのうちの一つは、未熟児網膜症および増殖性糖尿病網膜症13,14のいくつかの側面を模倣する酸素誘発網膜症マウスmodel12である。このモデルでは、血管領域、新血管領域、および主血管の拡張と拷問を測定します。当研究室では、メタボリックシンドローム(MetS)マウスモデルが開発されており、不拡散性網膜症15を誘導します。ここでは、血管密度と分岐を評価する。
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Protocol
C57BL/6Jマウスは、眼科および視覚研究における動物の使用に関するARVO声明のガイドラインに従って取り扱われた。実験手順は、コルドバ国立大学化学科学部の施設動物のケアと使用委員会(CICUAL)によって設計され、承認されました(Res. HCD 1216/18)。
1. 緩衝液および試薬の調製
- 1xリン酸緩衝液生理食塩水(PBS)の調製:8gの塩化ナトリウム(NaCl)、0.2gの塩化カリウム(KCl)、14.4gの二ナトリウム-リン酸二水和物(Na2HPO4 2H2O)および0.24gのリン酸カリウム二水素(KH2PO4)を800mLの蒸留水に加える。溶液を塩の完全溶解まで撹拌する。pHを塩化物酸(HCl)で7.4に調整し、追加の蒸留水で体積を1 Lに調整します。溶液をろ過し、4°Cで保存してください。
- 4%パラホルムアルデヒド(PFA):固形PFAを40g加えて、800mLの新たに調製したPBSを添加します。加熱プレートで溶液を60°Cの一定温度で攪拌します。 PFAが完全に溶解するまで1M水酸化ナトリウム(NaOH)を加え、pHが7.2-7.4の範囲で維持されていることを確認します。PBSで音量を1,000 mLに上げて混ぜます。加熱プレートをオフにし、温度が35°C未満のときに溶液をろ過します。 溶液を4°Cで3日間保存します。
注意:PFAは、飲み込まれた場合、または吸入した場合に有害であり、おそらく変異原性化合物である。全体のプロセスの間に手袋とフェイスマスクを使用し、安全キャビンで動作します。 - 1xトリスバッファー済み生理液(TBS)の調製:蒸留水の800 mLにトリスの6.1 gとNaClの9 gを加える。溶液を塩の完全溶解まで撹拌する。HClでpHを7.4に調整し、追加の蒸留水で1 Lに音量を調整します。溶液をろ過し、4°Cで保存してください。
- TBS- 0.1% トリトンX-100の調製:トリトンX-100〜100mLのTBSを0.1 mL加え、4°Cで1週間まで静かに混ぜます。
注:トリトンは非常に密な洗剤であるため、チップの端子を少しカットしてピペットを良くします。 - TBS-5%-牛血清アルブミン(BSA)の調製-0.1%トリトンX-100:BSAの5gを量り、TBS- 0.1%トリトンX-100溶液を100 mLの最終容積まで加える。やさしくかき混ぜます。アリコートと-20°Cで2ヶ月間保管してください。
- イソレクチンGSA-IB4アレクサフルオール-488コンジュゲート(イソレクチンGSA-IB4):加えて、36.75mgの塩化カルシウム二水和物(CaCl2·2H2O)を500mLに加えて、新たに調製したPBSを添加した。攪拌バーで溶液をかき混ぜます。CaCl2/PBSの溶液のピペット500 μLを、500 μgの凍結乾燥アイソレクチンGSA-IB4粉末を含むバイアルに加えます。0.5 mLチューブにそっと混ぜて溶液をアリクォートします。光から保護された-20°Cに保管してください。
- グリセロール/トリスのポリ(ビニルアルコール):ポリ(ビニルアルコール)の2.4gを量り、グリセロールの6gを加え、穏やかにかき混ぜます。その後、6mLの水を加え、室温で数時間撹拌を続けます。12 mLのプリウォームド0.2 Mトリス溶液(pH:8.5)を加え、50°Cの一定温度で10分間加熱し、時折混ぜます。最後に、溶液を5,000 x g で15分間遠心して、明確化します。
注:溶液を室温で冷却し、アリクォートし、-20°Cで保存してください。
2. 蛍光レクチン染色
- マウスが二酸化炭素(CO2)吸入によって犠牲にされると、はさみ16で目を引き出す。室温(RT)で1時間、作りたての4%PFAで、有核眼を固定します。
注:固定は、4°Cで一晩(ON)の4%PFAで目をインキュベートすることによっても行うことができます。 マウスは、眼科および視覚研究における動物の使用に関するARVO声明と、コルドバ国立大学化学科学部の施設動物ケアおよび使用委員会(CICUAL)のガイドラインに従って屠殺された(Res. HCD 1216/18)。 - 解剖顕微鏡の下で、手足に沿って切断してはさみで角膜を取り除き、全体のレティナを解剖します。眼の前部を捨て、次に、RPE-チョロイドからレチナを分離します。
注:残りの破片やヒヤロイド血管を鉗子でレチナから取り除くようにしてください。 - 200 μL チューブにレティナを入れる。次に、5%の牛血清アルブミン(BSA)と0.1%トリトンX-100を含むトリス緩衝生理(TBS)溶液の100 μLのレチナを4°Cで4°Cで遮断し、揺れ動かして透過させます。
注: このステップは RT で 2 時間実行できます。 - 次いで、チューブを反転して、キャップにレチナを入れ、ピペットでブロッキング溶液を除去する。
- イソレクチン GSA-IB4 (GSA-IB4) の 0.01 μg/μL を含む溶液を 100 μL加えます。サンプルを光から保護するために、チューブをアルミホイルで包みます。4 °Cでレクチン溶液をオンにして、または2時間のRTで、シェーカーで穏やかな攪拌でレチナをインキュベートします。
- 0.1%トリトンX-100を含む100 μLのTBSで、シェイカーに穏やかな攪拌で20分間洗浄します。適切な洗浄のために、それを反転させることによってチューブのキャップにレティナを置きます。チューブを立った位置に戻し、容器に残っている媒体を取り外します。この手順を 3 回繰り返します。
- スライドにレティナを配置し、PBSを追加します。解剖顕微鏡の下で、眼神経に向かって、眼の縁から4つの等しく離れた切り傷を行う。
- 花びらを広げるには、鉗子や小さなフィルターペーパーを使用します。感光体側が下向きであることを確認します。
- スライドの残りのPBSをフィルタペーパーで取り外します。次に、取り付け媒体(ポリ(ビニルアルコール)をグリセロール/トリスに入れ、カバースリップを加えます。RTで1時間乾燥させます。
- 光から保護された4°Cでスライドを保管してください。
注意:レチナスは、共焦点顕微鏡観察の可視化まで4°CでPBSに保存することもできます。
3. 共焦点顕微鏡可視化とマイクロフォト撮影
- 可視化する前に、光から覆われたRTで10分間スライドをインキュベートします。
- 共焦点顕微鏡で、スライドをプレートの下に置きます。
- 家臣の優れた神経叢に焦点を当て、画像取得を開始する領域を選択します。
- ソフトウェアの一般的なレーザーパラメータを設定します: 波長: 488 nm;レーザー強度;HV;オフセット。得。
注: レーザー強度、PMT、オフセット、およびゲインは、ランプの条件と使用法によって異なる場合があります。最適な設定は、蛍光信号との線形関係を有する光増倍管の感度の飽和を回避する血管の鮮明な画像を提供する。 - 他の取得パラメータを設定: モード;サイズ;目的、ズームなし。カルマンなし。ステップサイズ。
注意: 同一の取得条件は、コントロールと実験サンプルをイメージングするために使用する必要があります。 - x 軸と y 軸で座標を設定する:フォーカス 2x で、retina をスキャンします。エリアに血管が表示されている場合は、後で画像を取得するためにマークするために、領域を2回クリックして選択します。
注:大きな血管の蛍光が高くなるほど、優れた血管叢に従うことで、レチン領域を選択することが強く推奨されます。 - グリッド内を隣接する正方形に移動し、その領域にフォーカスを合わせ、対応する領域を選択します。選択した領域が全レティナを含むまで、この手順を繰り返します。
- 1 つの領域を選択し、z 軸の座標を設定して、スキャンする厚さの範囲を定義します。これを行うには、フォーカス2xでretinaを視覚化します。マイクロメーターで、retinaの上部に移動し、開始位置で 設定 をクリックします。次に、レティナの一番下に移動し、終了位置で [設定 ]をクリックします。
- グリッドで選択したすべての領域で、ステップ 3.8 を繰り返します。
メモ:スキャンした領域の深さを確認するには、開始位置で [Go ]を押します。船舶がまだ視覚化されている場合は、マイクロメーターを移動して位置を再調整し、[ Set]をクリックします。終了位置でプロセスを繰り返します。 - 自動スキャンを初期化します。
- スキャンプロセスが完了したら、画像を開きます。
- 画像をモザイクとして記録し、希望する拡張子で保存するには、 シリーズ 形式を選択します。最後に、ステッチされた画像が画面に表示されます。
4. 画像処理
- ImageJ FIJI ソフトウェアで、 メニューバー に移動し、 ファイル>を開く]をクリックします。処理するイメージを選択します。[ バイオフォーマットのインポートオプション]ウィンドウで 、[ OME-XMLを表示]メタデータ を選択し、[OK]をクリック します。
注: 類似した名前の画像は、別のフォルダに保存する必要があります。 - OME メタデータ ウィンドウで、物理サイズ、物理サイズ、および物理サイズ Z という名前のピクセル サイズ情報を検索します。このデータをコピーします。
- 画像キャリブレーションの場合は、 メニューバー に移動し、[ イメージ>プロパティ]を選択します。手順 4.2 でイメージの情報をコピーし、[OK] をクリック します。画像は、複数の写真を含むウィンドウとして開き、各写真はz軸で取得したマイクロフォトを表します。
- 蛍光標識に色を付けるために、画像に好ましいlutを割り当てます。これを行うには、 メニューバー に移動し、 LUT アイコンをクリックします。
- 1 つのイメージ内のすべてのスタックを視覚化するには、 メニュー バー に移動し、 Z プロジェクト>イメージ > スタックを選択します。
- 表示された Z 投影ウィンドウで、船舶が視覚化されているすべてのスタックを選択します。[投影タイプ] で 、[ 平均強度 ] を選択し、[OK] をクリック します。
注: スタックの合計の結果は、AVG(イメージ名)という名前の新しい画像に表示されます。 - 結果の画像の明るさとコントラストを調整して、背景を減らし、血管をハイライトします。 メニューバー に移動し、 画像>調整>明るさ/コントラストをクリックします。BとCのウィンドウでは、より良い強度が観察されるまでバーを移動します。[ 適用 ]をクリックして、変更を保存します。
- 明るさ/コントラストに選択したパラメータをコピーします。これらはすべての画像で同一である必要があります。
- 画像の定量化の前に、測定するパラメータを定義します。 メニューバーで、「 計測値を分析>設定する」に進んでください。ここで説明する手順では、面積と周囲長を取得する必要があります(これは最終的には距離を測定するためにも必要です)。 [OK] をクリックします。
- 容器密度定量化17に必要なプラグインをダウンロードし、プラグインが提供するインストール手順に従います。
- 特定の血管パラメータの定量化を続行します。
5. 血管領域の定量化
- メニュー バーで、[杖ツール] を選択します。船が足りない残りの領域を選択します。
注: 許容値に応じて、大きい領域または小さい領域を選択できます。許容値を調整するには、杖ツールアイコンを 2 回クリックします。採用されているモード: レガシー。 - キーボードの T 文字を押して、選択した領域を ROI マネージャに記録します。残りのすべての血管領域でステップ 5.1 と 5.2 を繰り返します。
- ROI マネージャの [メジャー] をクリックして、血管領域情報を取得します。プログラムは、必要な情報を含む新しいウィンドウを表示します。データを別のプログラムにコピーするか、ファイルを保存します。
注:一部の画像では、血管領域を手動で選択することを好むかもしれません。この場合は、ポリゴン選択ツールを選択し、血管領域の周囲に短い距離を描画し、新しい距離が始まるときに画像をクリックします。最初の点をクリックして、選択した領域を閉じます。 - ステップ 5.1、5.2、および 5.3 を繰り返して、レティナの総面積を測定します。
- 測定されたすべての血管領域を、その全ての領域で除算した、その全ての血管領域の合計として、その残管領域を算出する。
新血管領域の定量化
- メニューバーで、[ 杖] ツールを選択します。
- 画像を拡大して、ネオ船をより良く視覚化します。杖ツールでネオ容器を1つずつ選択します。
注: 1 つのネオ船の選択を確実にするために 20 より高く許容値を調整します。この許容値レベルは、すべての画像の定量中に一定の値を維持する必要があります。 - キーボードの T 文字を押して、選択した領域を ROI マネージャに記録します。6.1と6.2を、すべての新血管領域で繰り返します。
- ROI マネージャの [メジャー] をクリックして、エリア データを取得します。プログラムは、必要な情報を含む新しいウィンドウを表示します。データを別のプログラムにコピーするか、ファイルを保存します。
- ステップ 6.1、6.2、および 6.3 を繰り返して、残りの部分の総面積を数値化します。
- すべての新血管領域を、その全領域で除算した全ての新船領域の合計として、その新血管領域を計算する。
7. 容器の直径の定量化
- メニュー バーで、直線ツールを選択します。
- 画像を拡大表示して、船舶の壁をよりよく視覚化します。最初の分岐の前に、主船に3本の横線を行います。これは、容器の壁の境界から反対側に線を引くことによって行う必要があります。
注: ラインは、定量化エラーを避けるために壁面容器に完全に垂直でなければなりません。 - キーボードの T 文字を押して、選択した領域を ROI マネージャに記録します。定量化が必要なすべての船舶でステップ7.1と7.2を繰り返します。
- ROI マネージャで [測定] をクリックして距離データを取得します。プログラムは、必要な情報を含む新しいウィンドウを表示します。データを別のプログラムにコピーするか、ファイルを保存します。
8. 船舶の不法行為の定量化
- メニューバーで、マウスの右ボタンで直線ツールアイコンをクリックし、セグメント線またはフリーハンドラインを選択します。血管の内側に、血管の形状に続く最初の血管の影響まで、視神経から線を引きます。
注: 線は、定量化エラーを避けるために血管形状に従う必要があります。 - キーボードの T 文字を押して、選択した領域を ROI マネージャに記録します。
- メニュー バーで、直線ツールを選択します。視神経から最初の血管の影響まで線を引きます。
- キーボードの T 文字を押して、選択した領域を ROI マネージャに記録します。
- ROI マネージャで [測定] をクリックして距離データを取得します。プログラムは、必要な情報を含む新しいウィンドウを表示します。データを別のプログラムにコピーするか、ファイルを保存します。
- トルトオーティ指数を計算するには、線分を直線で得た距離で割った距離を分割します。
9. 血管枝の定量化
- メニューバーの楕円ツールを使用して、すべての実験条件に均等に適用される領域を定義します。選択した領域は視神経の周りに描かれた同心円でなければなりません。
- キーボードの T 文字を押して、選択した領域を ROI マネージャに記録します。
注: この場合、定量が遅く、同一の ROI をすべての画像で使用する必要があるため、ROI を保存することをお勧めします。これを行うには、ROIマネージャで[保存] >[詳細]をクリックします。 - 手動で、選択領域内の主な船舶から生じる一次分岐の数をカウントします。
- 視神経周辺条件を維持したまま、隣接領域でステップ 9.2 と 9.3 を繰り返します。
10. 血管密度の定量化
- イメージを 8 ビット モードに変換します。
- メニューバーのプラグインに移動し、血管分析>血管密度を選択します。
- メニューバーの正方形ツールで、容器の密度を測定する必要がある領域を定義します。[OK] をクリックします。
- プログラムは、必要な情報を含む新しいウィンドウを表示します。データを別のプログラムにコピーするか、ファイルを保存します。
- ステップ 10.2、10.3、および 10.4 を隣接する地域で繰り返し、ROI を維持しますが、周囲と全てのレティナの中心を 9 回配置します。
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Representative Results
プロトコルセクションに記載されているように、単一の蛍光染色アッセイから、血管形態を取得し、目的の複数のパラメータを定量的に評価することができる。特定の変化の探索は、研究された網膜症の種類によって異なります。この記事では、血管領域と新血管領域、トース性、および拡張を増殖性網膜症のマウスモデルで評価し、血管分岐および密度をMetSマウスモデルで分析し、不拡散性網膜症を誘発した。
最初の実験例では、酸素誘導網膜症(OIR)マウスモデルを採用し、これは未熟網膜症と糖尿病網膜症の増殖段階のいくつかの特徴に似ている。このモデルでは、出生後の日(P)7からP1218までの高酸素室で、老人の母親と一緒にごみが維持されます。P12で、抗血管新生(治療と名付けられた状態)としての薬剤の有効性を判定するために、細胞内注射を行った。マウスは、最大の新船形成の時点であるP17で屠殺した19。車両を注射したマウスを制御として採用した。両方のサンプルを固定し、イソレクチンGSA-IB4を一緒に染色した。共焦点取得後、上記のように画像をImageJ FIJIソフトウェアで分析した。ステッチングモジュールを共焦点顕微鏡に統合することで、完全なマウント全体をユニークな画像として観察しました(図1)。P17では、子宮内生命の間に不可欠な一過性血管系であるヒアルロイド血管系を観察することができる(図1、白矢印)。20。
高酸素性チャンバーでの過剰な酸素供給の結果として、OIRマウスは生理学的血管の発達を阻止し、その後、その内に血管領域を生成する。次に、血管領域は、血管の残りの領域と定義される(図2)。取得した画像から、血管のない領域の合計を、血管のない領域の合計を、残管の総面積で割った値として定量化することができる。機械的損傷を有する領域はまた、船舶の不在を示す。損傷した領域を特定するには、Hoechst染色でニューロン層の完全性を分析します。
この場合、このレチナの血管領域は酸素送達を避け、したがって、強力な血管形成反応が設定され、新血管新生を誘導する16。新血管は、優れた血管叢の既存の血管に由来する小口径の血管です。これらの構造は組織化されていないため、新血管は、房状が、大口空洞21に向かって房のように成長する。新血管の房が占める面積を、その新血管領域を、その全領域で割って除いて算出した(図3)。新船の形状と大きさは可変であるため、時には破片やアーティファクトに似ている場合があります。新船を区別するために、房が成熟した容器から成長することを確認する。
血管拡張とトースオシティは、他の2つの頻繁な変化であり、それらは乱流血液循環を生じるので、血管生物学に悪影響を及ぼす。拡張の分析では、第1分岐22,23の前に3つの高さで主血管径を測定しました(図4)。研究者は、結果間の変動性を減らすために、血管径を測定するための所定の距離を定義する必要があります。理想的には、視神経からの最も遠い点は約300μmであるべきである。我々は、分析を行い、後で条件ごとに少なくとも6匹のマウスの平均を取ることを提案する。
トースに関しては、視神経と第1分岐点24 との間の直線距離に対して、その形状に続く主血管のカバー距離を測定する(図5)。画像で見ることができるように、主な血管のしなに異質があります。代表的な結果を得るには、1つの条件につき6匹以下のマウスを定量化しなければならない。
最新のパラメータは、血管分岐および密度を、不増殖性網膜症を示すMetSモデルで分析した。MetSでは、脂質と炭水化物の両方の変質が、機能不全および死死のレチナルペリサイトおよび内皮細胞に関連しており、細胞毛細血管の形成または血管枝の減少につながる25。我々のモデルでは、ApoE-KOマウスは、10%w/vの濃度で、飲料水に添加されたフルクトースを供給した。コントロール動物はちょうど水道水を受け取りました。4ヶ月の食事の後、マウスを屠殺し、前に示したようにレティナを処理した。血管分岐の測定では、同心円を描いて定量化領域を定義し、主中央血管から生じる一次枝を1つずつ数えました(図6)。
取得した画像から、血管密度をROIの面積で割った血管(0.015mm2の正方形、図7の平坦化を参照)として定量化し、各マイクロ写真の異なる場所に配置した。プロトコルセクションで説明した。機械的損傷のある領域の定量化は避けてください(図7、白い矢印)。穿刺のある領域が 3 つ以上ある場合は、その残りは破棄する必要があります。
図1:イソレクチンGSA-IB4で標識されたレティナス全体の血管染色: P12での車両または治療を注射したP17 OIRマウスの代表的な共焦点像。蛍光染色は、プロトコルに従ってイソレクチンGSA-IB4 Alexa 488を用いて全体のマウントレチナで行った。血管領域(AV)および新血管領域(NV)が示されている。スケールバー:500 μm。白い矢印は残ったヒヤロイド血管系を示す。黄色の矢印は、共焦点画像取得中の不完全なスキャン領域を示します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:血管領域の定量化: (A)OIR-vehicleおよびOIR処置マウスにおけるGSA-IB4血管染色を示すP17における全マウントレチナの代表的な画像。血管が傾斜している領域は黄色で示されます。スケールバー:500μm(B)AV領域(%)を、全健経領域に対する中央血管領域の比率として定量した。両側のペアなし t 検定は、統計的比較に使用されました。平均± SEM. *** p < 0.001 として表示されるデータ。少なくとも6匹の動物を、調査した生存時間の各条件に対して用いた。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:新血管領域の定量化: (A)OIR-vehicleおよびOIR処置マウスにおけるGSA-IB4血管染色を示すP17における全マウントレチナの代表的な画像。新血管新脈性領域は白色で示されている。スケールバー:500μm(B)NV領域(%)を、全レチナル領域に対する新船が占める面積の比率として定量化した。両側のペアなし t 検定は、統計的比較に使用されました。平均± SEM. *** p < 0.001 として表示されるデータ。少なくとも6匹の動物を、調査した生存時間の各条件に対して用いた。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:血管拡張の定量化: (A)OIR-vehicleおよびOIR処置マウスにおけるGSA-IB4血管染色を示すP17における全マウントレチナの代表的な画像。左側のパネル: 数量化のために選択された ROI。右パネル:ROIのズーム、容器の直径を測定するために主容器で行われる直線を示す。3本の線を船に横回しに追跡し、平均した。スケールバー:100μm(B)の血管径(%)を、レティナの主要血管で測定した平均直径として定量した。両側のペアなし t 検定は、統計的比較に使用されました。平均± SEM. *p < 0.05 として提示されるデータ。少なくとも6匹の動物を、調査した生存時間の各条件に対して用いた。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:トースオシティ指数の測定: (A)OIR-vehicleおよびOIR処置マウスにおけるGSA-IB4血管染色を示すP17における全マウントレチナの代表的な画像。左側のパネル: 数量化のために選択された ROI。中央パネル:ROIをズームし、視神経から最初の分岐点まで主な血管でトレースされたセグメント化された線を示します。右パネル:ROIのズーム、視神経から最初の分岐点まで主な血管でトレースされた直線を示す。スケールバー:100μm(B)トース指数は、セグメント化された線の距離を直線の距離に分割して取得した。両側のペアなし t 検定は、統計的比較に使用されました。平均で提示されるデータは、SEM. ns ±、非重要です。少なくとも6匹の動物を、調査した生存時間の各条件に対して用いた。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:血管枝の定量化: (A)アポエ-KO及びApoE-KO+フルクトース供給マウスにおけるイソレクチンGSA-IB4血管染色を示す全マウントレチナの代表的な画像。円形定量領域は黄色で定義した。スケールバー:100 μm、100倍の倍率。(B)視神経から周辺まで、主血管からの一次枝の数として枝数を定量した。両側のペアなし t 検定は、統計的比較に使用されました。平均で提示されるデータは、SEM. ns ±、非重要です。各条件に対して少なくとも6匹の動物が用いられた。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:血管密度の定量化: (A)アポエ-KO及びアポエ-KO+フルクトース供給マウスにおけるイソレチンGSA-IB4血管染色を示す全マウントレチナの代表的な画像。0.015 mm2 定量面積の二乗は黄色で定義した。スケールバー:100 μm、100倍の倍率。(B)血管密度を総ROI面積に対する血管面積の比として定量し、各マイクロ写真において異なる場所に9回配置した。白い矢印は、機械的損傷のある領域を示しています。両側のペアなし t 検定は、統計的比較に使用されました。平均で提示されるデータは、SEM. ns ±、非重要です。各条件に対して少なくとも6匹の動物が用いられた。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
網膜症の動物モデルは、血管の発達、リモデリング、または病理学的血管新生を研究するための強力なツールです。この分野でのこれらの研究の成功は、生体内および死後マウス26,27からのデータを提供し、多種多様な技術を実行することを可能にする組織への容易なアクセスに依存している。さらに、インビボ研究と臨床分析との間に大きな相関関係が見られ、これらのmodel28に確かなトレーサビリティと信頼性を提供しています。本稿では、レスチン管疾患のマウスモデルにおける血管ネットワークを特徴付ける手順の簡単かつ堅牢な説明を提示する。文献では、読者はここで選択されたものを定量化するための他の可能なパラメータを測定し、並列アプローチを見つけるでしょう。コンパイルされたプロトコルは、再現性があるため他のプロトコルよりも多くの利点があり、分析を実行するためにフリーソフトウェアが必要です(Image J Fiji)。
さらに、これらのプロトコルは、プログラムに関する広範な知識を持っていない学生によって簡単に実行され、測定のほとんどは、(血管密度を除く)追加のプラグインを必要としません。
サンプル抽出および蛍光染色技術は簡単で簡潔な29です。新鮮なレチナで作業することは非常に重要ですが、細菌増殖の阻害剤とPBSで4°Cで保存することができます。組織が薄く柔らかいため、インキュベーション中や、取り付ける前にサンプルを展開する際に、古いサンプルが頻繁に分解されます。また、4%PFAによる過度の固定は、レティナを過度に硬く脆くしますが、これはレクチン染色に影響を与えません。イソレクチンGSA-IB4染色は、新血管および増殖内皮細胞を含むあらゆる層における完全な血管ネットワークを可視化することを可能にする。CD31として他のマーカーは、濃縮抗体でサンプルのインキュベーションを必要とし、それらはより多くの背景を有する。一方、血管造影では、蛍光色素が血管から拡散する傾向があり、血管の口径やトートの定量性のばらつきが大きくなる。イソレクチンGSA-IB4の欠点の1つは、ミクログリア細胞30にも標識できることである。微小グリア細胞が凝集体を形成する可能性があるため、硝子体内注射や過剰な浸潤を誘発する他の実験的処置を行う場合には注意が必要です。
画像取得は任意の共焦点顕微鏡で行うことができる。スティッチングモジュールを含むソフトウェアに電動プレートのカップルを使用すると、単一の画像にマウントされた全てのレティナの完全な視覚化を提供します。レティナ領域を選択する場合は、サンプルのすべての極端な部分が含まれていることを確認してください。これは、血管の変化が視神経の近くにあるため、一例としてOIRのマウスモデルにおいてはあまり関係ない。OIRのラットモデルでは、血管領域と新血管領域が四肢の隣にあるため、この間違いは不正確な定量化につながる可能性があります。もう一つの可能性は、個々のレチンのマイクロ写真を撮る。ユーザーは、後で適切なソフトウェアを使用してパズルとしてそれらを整理することができます。特に分岐を分析する場合、血管は全厚のレティナ全体に芽を出し、一部の血管はzスタックのみで検出されないため、蛍光顕微鏡を使用することはお勧めできません。
ImageJ FIJI での画像処理では、ソフトウェアで同じ条件を保つために、すべてのイメージが定量化されるまでソフトウェアを更新しないことをお勧めします。これらのプロトコルは距離と領域の定量化を意味するので、画像のキャリブレーション(ミクロン単位でのピクセルサイズの割り当て)は重要なステップです。プログラムに慣れると、ユーザーは杖ツールに加えて血管の新血管領域および血管領域を選択する他のツールを探索することができる。ポリゴン選択ツールは、取り付けステップで2つの部分に切断された血管領域を測定するのに特に便利です。他の研究者は、これらの構造の蛍光強度に基づいて新血管の選択を自動化するための特定のプラグインを作成しました。これらの方法は、定量化31の前に小さな光沢のないネオ容器が選択されていることを確認することが推奨されますが、より速く、より労力の少ないです。新船の領域は、周囲の正常な血管よりも激しく蛍光を発します。マジックワンドツールは、同じ色の領域を選択し、許容値によって選択したピクセルの色がどの程度類似しているかを決定します。ネオ容器が通常の血管と同様の強度である場合、許容範囲は微妙な強度の違いに対する感度を高めるために下方に調整することができます。すべてのサンプルでの新血管選択は同じ閾値で行われますが、いくつかの新血管は、マイナーな蛍光強度によって特徴付けられる。この場合、適切な選択のためには、許容値が低く抑えられる必要があります。
トルトオシティと拡張は距離の測定です。血管の木の包括的な研究は、同一のタイプ(動脈または静脈)と口径の血管を選択するのに役立ちます。 図4に示すように、3つの高さで血管の膨張を測定します。船壁に対する直線選択の角度は、考慮するもう一つの関連点である。これは、エラーの可能性を避けるために、できるだけ90°に近いはずです。直線を描画する場合、ユーザーはズームツールを使用して目的の容器に近づくことができます。
血管分岐はまた、必要に応じて、異なる高さの2つ以上の定量領域で測定することができる。この場合、研究者は分析されたレティナの領域(視神経の中央、中、または末梢側)を保存する必要があります。分岐は網膜症のいくつかの動物モデルで変化するが、ここで提示されたMetSに関連する網膜症の初期段階はまだそのような変化を示さない15。中および深部神経叢および血管発芽のレチナル毛細血管の広範な研究のために、3D計算法は、血管形態およびnetwork32の微妙な変動の貴重なデータを提供する。最後に、血管密度は、選択されたROIの総面積に対して血管が占める面積によって決定される。このパラメータの測定では、プラグインと、自動しきい値と距離マップへのジオメトリを使用できる必要がある ImageJ FIJI の実際のバージョンを使用する必要があります。これらの追加の手順にもかかわらず、プラグインは、再現性と信頼性の高い、使いやすいです。血管密度の測定のために、0.015 mm2 のROIを選び、その結果、異なる領域の異なる領域で蛍光強度を10回測定した。このサイズは、写真全体をカバーすることができ、したがって、各レチナでより代表的な平均値とその偏差を得ました。
全体的に、これらのメソッドのコレクションは自動化されておらず、パラメータの手動選択が必要であるにもかかわらず、彼らはレティナの定量的かつ厳格なデータを提供することができます。上記の血管測定プロトコルに関する主な制限は、同じ画像を分析する際の検査者間変動性に依存する。このバイアスを最小限に抑えるためには、血管壁の境界として一般的な設定を事前に確立し、血管領域と新血管の同定、損傷組織の排除基準を事前に確立することが重要です。血管の拷問性に関しては、視神経の隣に合意された出発点が必要である。初心者の方には、2 人以上の審査官が収集したデータを平均化することを強くお勧めします。訓練を受けたユーザーでは、定量基準の一定の合意が保たれ、様々なパラメータの測定に有意な差は見つかっていない。同様に、網膜症で検出された血管変化に応じて、リストされたプロトコルに追加のパラメータを追加することができます。不増殖性網膜症において、細胞毛細血管数の測定は、回遊細胞、回縁細胞の割合/内皮細胞数および血液網膜バリア透過性の最も初期のパラメータであり、網膜脈管構造33、34、35において変化する。慢性モデルおよび軽度の網膜症の場合、これらの追加の測定値を含めるのが賢明である。測定されたパラメータの主要な数は、血管系で起こっているイベントのより忠実な風景を提供します。要約すると、この記事では、臨床現場で考慮される最も関連性の高いパラメータのいくつかを定量化するための古典的で確立された再現性の高い技術を示しました。
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Disclosures
著者らは、研究は、潜在的な利益相反と解釈される可能性のある商業的または財政的関係がない場合に行われたと宣言している。
Acknowledgments
カルロス・マス、マリア・ピラール・クレスポ、CEMINCOのセシリア・サンペドロ(セントロ・デ・ミクロ・イ・ナノスコピア・コルドバ、コニセトUNC、コルドバ、アルゼンチン)に対する共焦点顕微鏡の支援、ソレダッド・ミロとビクトリア・ブランコの専任動物ケア、ローラ・ガティカの神学的支援に感謝します。また、ビクター・ディアス(FCQの制度コミュニケーションのプロ秘書)に、ビデオ制作と版、ポール・ホブソンが原稿の批判的な読書と言語改訂に感謝します。
この記事は、セクレタリア・デ・シエンシア・イ・テクノロジアからの助成金によって資金提供されました。 ナシオナル・デ・コルドバ大学(SECyT-UNC)コソリサー2018-2021、フォンド・パラ・ラ・インベスティガシオン・シエンティフィカ・イ・テクノロギカ(FONCyT)、プロエクト・デ・インベスティガシオン・エン・シエンシア・イ・テクノロジア(PICT.C)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminuim foil | |||
| Bovine Serum Albumin | Merck | A4503 | quality |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | C3306 | |
| Hydrochloric acid | Biopack | 9632.08 | |
| Confocal Microscope FV1200 | Olympus | FV1200 | with motorized plate |
| Covers | Paul Marienfeld GmnH & Co. | 111520 | |
| Dissecting Microscope | NIKON | SMZ645 | |
| Disodium-hydrogen-phosphate dihydrate | Merck | 119753 | |
| 200 µL tube | Merck | Z316121 | |
| Filter paper | Merck | WHA5201090 | |
| Incubator shaker GyroMini | LabNet International | S0500 | |
| Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | I21411 | |
| Poly(vinyl alcohol) (Mowiol 4-88) | Merck | 475904 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 158127 | |
| pHmeter | SANXIN | PHS-3D-03 | |
| Potassium chloride | Merck | P9541 | |
| Potassium-dihydrogen phosphate | Merck | 1,04,873 | |
| Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Sodium chloride | Merck | S3014 | |
| Sodium hydroxide | Merck | S5881 | |
| Tris | Merck | GE17-1321-01 | |
| Triton X-100 | Merck | X100-1GA | |
| Vessel Analysis Fiji software | Mai Elfarnawany | https://imagej.net/Vessel_Analysis |
References
- Kur, J., Newman, E. A., Chan-Ling, T. Cellular and physiological mechanisms underlying blood flow regulation in the retina and choroid in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (5), 377-406 (2012).
- McDougal, D. H., Gamlin, P. D.
- Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. Retinal vasculature development in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (2018).
- Wei, Y., et al. Age-related alterations in the retinal microvasculature, microcirculation, and microstructure. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (9), 3804-3817 (2017).
- Lavia, C., et al. Reduced vessel density in the superficial and deep plexuses in diabetic retinopathy is associated with structural changes in corresponding retinal layers. PLoS One. 14 (7), 0219164 (2019).
- Rosenblatt, T. R., et al. Key factors in a rigorous longitudinal image-based assessment of retinopathy of prematurity. Scientific Reports. 11 (1), 5369 (2021).
- Edwards, A. L. Funduscopic examination of patients with diabetes who are admitted to hospital. Canadian Medical Association Journal. 134 (11), 1263-1265 (1986).
- Lechner, J., O'Leary, O. E., Stitt, A. W. The pathology associated with diabetic retinopathy. Vision Research. 139, 7-14 (2017).
- Sun, Z., et al. angiography metrics predict progression of diabetic retinopathy and development of diabetic macular edema: A prospective study. Ophthalmology. 126 (12), 1675-1684 (2019).
- Jia, Y., et al. Quantitative optical coherence tomography angiography of vascular abnormalities in the living human eye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 2395-2402 (2015).
- Pauleikhoff, D., Gunnemann, F., Book, M., Rothaus, K. Progression of vascular changes in macular telangiectasia type 2: comparison between SD-OCT and OCT angiography. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 257 (7), 1381-1392 (2019).
- Gammons, M. V., Bates, D. O. Models of oxygen induced retinopathy in rodents. Methods in Molecular Biology. 1430, 317-332 (2016).
- Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal models of choroidal and retinal neovascularization. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).
- Han, N., Xu, H., Yu, N., Wu, Y., Yu, L. MiR-203a-3p inhibits retinal angiogenesis and alleviates proliferative diabetic retinopathy in oxygen-induced retinopathy (OIR) rat model via targeting VEGFA and HIF-1α. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 47 (1), 85-94 (2020).
- Paz, M. C., et al. Metabolic syndrome triggered by fructose diet impairs neuronal function and vascular integrity in ApoE-KO mouse retinas: Implications of autophagy deficient activation. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 573987 (2020).
- Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).
- Zarb, Y., et al. Ossified blood vessels in primary familial brain calcification elicit a neurotoxic astrocyte response. Brain. 142 (4), 885-902 (2019).
- Smith, L. E., et al.
- Subirada, P. V., et al. Effect of autophagy modulators on vascular, glial, and neuronal alterations in the oxygen-induced retinopathy mouse model. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 279 (2019).
- Lutty, G. A., McLeod, D. S. Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).
- Kim, C. B., D'Amore, P. A., Connor, K. M. Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).
- Guaiquil, V. H., et al. A murine model for retinopathy of prematurity identifies endothelial cell proliferation as a potential mechanism for plus disease. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5294-5302 (2013).
- Mezu-Ndubuisi, O. J. In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery. Optometry and Vision Science: Official Publication of the American Academy of Optometry. 93 (10), 1268-1279 (2016).
- Scott, A., Powner, M. B., Fruttiger, M. Quantification of vascular tortuosity as an early outcome measure in oxygen induced retinopathy (OIR). Experimental Eye Research. 120, 55-60 (2014).
- Kim, A. Y., et al. Quantifying microvascular density and morphology in diabetic retinopathy using spectral-domain optical coherence tomography angiography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 362 (2016).
- Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
- Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal models of choroidal and retinal neovascularization. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).
- Kern, T. S., Antonetti, D. A., Smith, L. E. H. Pathophysiology of diabetic retinopathy: Contribution and limitations of laboratory research. Ophthalmic Research. 62 (4), 196-202 (2019).
- Lorenc, V. E., et al. IGF-1R regulates the extracellular level of active MMP-2, pathological neovascularization, and functionality in retinas of OIR mouse model. Molecular Neurobiology. 55 (2), 1123-1135 (2018).
- Ma, N., Streilein, J. W. Contribution of microglia as passenger leukocytes to the fate of intraocular neuronal retinal grafts. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (12), 2384-2393 (1998).
- Mazzaferri, J., Larrivée, B., Cakir, B., Sapieha, P., Costantino, S. A machine learning approach for automated assessment of retinal vasculature in the oxygen induced retinopathy model. Scientific Reports. 8 (1), 3916 (2018).
- Milde, F., Lauw, S., Koumoutsakos, P., Iruela-Arispe, M. L. The mouse retina in 3D: quantification of vascular growth and remodeling. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro (Camb). 5 (12), 1426-1438 (2013).
- Yang, T., et al. Pericytes of indirect contact coculture decrease integrity of inner blood-retina barrier model in vitro by upgrading MMP-2/9 activity. Disease Markers. 2021, 7124835 (2021).
- Huang, Q., Wang, S., Sorenson, C. M., Sheibani, N. PEDF-deficient mice exhibit an enhanced rate of retinal vascular expansion and are more sensitive to hyperoxia-mediated vessel obliteration. Experimental Eye Research. 87 (3), 226-241 (2008).
- Jiang, H., Zhang, H., Jiang, X., Wu, S. Overexpression of D-amino acid oxidase prevents retinal neurovascular pathologies in diabetic rats. Diabetologia. 64 (3), 693-706 (2021).
