Summary
Denne artikkelen beskriver en veletablert og reproduserbar lectin flekkanalyse for hele fjellet retinal preparater og protokollene som kreves for kvantitativ måling av vaskulære parametere ofte endret i proliferative og ikke-proliferative retinopatier.
Abstract
Retinopatier er en heterogen gruppe sykdommer som påvirker øyets nevrosensoriske vev. De er preget av nevrodegenerasjon, gliose og en progressiv endring i vaskulær funksjon og struktur. Selv om utbruddet av retinopatiene er preget av subtile forstyrrelser i visuell oppfatning, er modifikasjonene i vaskulær plexus de første tegnene som oppdages av klinikere. Fraværet eller tilstedeværelsen av neovascularization bestemmer om retinopatien er klassifisert som enten ikke-proliferativ (NPDR) eller proliferativ (PDR). I denne forstand prøvde flere dyremodeller å etterligne spesifikke vaskulære egenskaper i hvert trinn for å bestemme de underliggende mekanismene som er involvert i endotelendringer, nevronal død og andre hendelser som finner sted i netthinnen. I denne artikkelen vil vi gi en fullstendig beskrivelse av prosedyrene som kreves for måling av retinal vaskulære parametere hos voksne og tidlige fødselsmus på barseldag (P)17. Vi vil detaljere protokollene for å utføre retinal vaskulær farging med Isolectin GSA-IB4 i hele mounts for senere mikroskopisk visualisering. Viktige trinn for bildebehandling med Image J Fiji-programvare er også gitt, derfor vil leserne kunne måle kartetthet, diameter og tortuositet, vaskulær forgrening, samt avaskulære og neovascular områder. Disse verktøyene er svært nyttige for å evaluere og kvantifisere vaskulære endringer i både ikke-proliferative og proliferative retinopatier.
Introduction
Øynene er næret av to arterio-venøse system: choroidal vaskulatur, et eksternt vaskulært nettverk som irrigerer retinal pigmentert epitel og fotoreseptorer; og nevroretinal vaskulatur som irrigerer ganglioncellelaget og det indre kjernefysiske laget av netthinnen1. Retinal vaskulaturen er et organisert nettverk av kar som leverer næringsstoffer og oksygen til netthinnecellene og høster avfallsprodukter for å sikre riktig visuell signaltransduksjon. Denne vaskulaturen har noen forskjellige egenskaper, inkludert: mangelen på autonom innervering, regulering av vaskulær tone ved iboende retinalmekanismer og besittelse av en kompleks retinal-blodbarriere2. Derfor har retinal vaskulatur vært fokus for mange forskere som i stor grad har studert ikke bare vaskulogenese under utviklingen, men også endringene og den patologiske angiogenesen som disse karene gjennomgår i sykdommer3. De vanligste vaskulære endringene som observeres i retinopatier er kardilatasjon, neovascularization, tap av vaskulær arborisering og deformasjon av retinal hovedkarene, noe som gjør dem mer ziggaggy4,5,6. En eller flere av de beskrevne endringene er de tidligste tegnene som skal oppdages av klinikere. Vaskulær visualisering gir en rask, ikke-invasiv og billig screeningmetode7. Den omfattende studien av endringene som observeres i det vaskulære treet, vil avgjøre om retinopatien er ikke-proliferativ eller proliferativ og den videre behandlingen. De ikke-proliferative retinopatiene kan manifestere seg med avvikende vaskulær morfologi, redusert vaskulær tetthet, acellulære kapillærer, pericytter død, makulaødem, blant andre. I tillegg utvikler proliferative retinopatier også økt vaskulær permeabilitet, ekstracellulær ombygging og dannelsen av vaskulære tufts mot glasslegemet som lett bryter ned eller induserer retinal løsrivelse8.
Når retinopatien er oppdaget, kan den overvåkes gjennom sine vaskulære endringer9,10. Progresjonen av patologien kan følges gjennom de strukturelle endringene i karene, som klart definerer stadier av sykdommen11. Kvantifiseringen av vaskulære endringer i disse modellene tillot å korrelere karendringer og nevronal død og å teste farmakologiske terapier for pasienter i ulike faser av sykdommen.
I lys av de ovennevnte uttalelsene anser vi at anerkjennelse og kvantifisering av vaskulære endringer er grunnleggende i retinopatistudier. I dette arbeidet vil vi vise hvordan du måler forskjellige vaskulære parametere. For å gjøre det, vil vi ansette to dyremodeller. En av dem er den oksygeninduserte retinopatimusemodellen12, som etterligner Retinopati av prematuritet og noen aspekter av proliferativ diabetisk retinopati13,14. I denne modellen vil vi måle avaskulære områder, neovascular områder og dilatasjon og tortuositet av hovedfartøy. I vårt laboratorium er det utviklet en metabolsk syndrom (MetS) musemodell, som induserer en ikke-proliferativ retinopati15. Her vil vi evaluere vaskulær tetthet og forgrening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
C57BL/6J-mus ble håndtert i henhold til retningslinjene i ARVO-erklæringen for bruk av dyr i oftalmisk og visjonsforskning. Eksperimentelle prosedyrer ble utformet og godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (CICUAL) ved Fakultet for kjemisk vitenskap, National University of Córdoba (Res. HCD 1216/18).
1. Utarbeidelse av bufferløsninger og reagenser
- Tilberedning av 1x fosfatbuffer saltvann (PBS): Tilsett 8 g natriumklorid (NaCl), 0,2 g kaliumklorid (KCl), 14,4 g disodium-hydrogen-fosfatdihydrat (Na2HPO4 2H2O) og 0,24 g kalium-dihydrogenfosfat (KH2PO4) til 800 ml destillert vann. Rør løsningen til fullstendig oppløsning av saltene. Juster pH til 7,4 med kloridsyre (HCl) og juster volumet til 1 L med ekstra destillert vann. Filtrer oppløsningen og oppbevar den ved 4 °C.
- Tilberedning av 4% paraformaldehyd (PFA): Tilsett 40 g solid PFA til 800 ml nylaget PBS. Rør oppløsningen i en varmeplate ved en konstant temperatur på 60 °C. Tilsett 1 M natriumhydroksid (NaOH) til PFA er helt oppløst, og kontroller at pH opprettholdes i et område på 7,2-7,4. Fyll opp volumet til 1000 ml med PBS og bland. Slå av varmeplaten og filtrer oppløsningen når temperaturen er under 35 °C. Oppbevar oppløsningen ved 4 °C i opptil 3 dager.
FORSIKTIG: PFA er skadelig ved svelging eller ved innånding og er sannsynligvis en mutagene forbindelse. Bruk hansker og munnbind under hele prosessen og arbeid i en sikkerhetskabin. - Tilberedning av 1x Tris-bufret saltvann (TBS): Tilsett 6,1 g Tris og 9 g NaCl til 800 ml destillert vann. Rør løsningen til fullstendig oppløsning av saltene. Juster pH til 7,4 med HCl og juster volumet til 1 L med ekstra destillert vann. Filtrer oppløsningen og oppbevar den ved 4 °C.
- Tilberedning av TBS- 0,1% Triton X-100: Tilsett 0,1 ml TritonX-100 til 100 ml TBS. Bland forsiktig og oppbevar den ved 4 °C i opptil 1 uke.
MERK: Siden Triton er et veldig tett vaskemiddel, kutter du lett spissens klemme for bedre pipettering. - Tilberedning av TBS-5%-Bovine Serum Albumin (BSA) -0,1% Triton-X-100: Vei 5 g BSA og tilsett TBS- 0,1% triton X-100-løsning opp til et endelig volum på 100 ml. Rør forsiktig. Aliquot og oppbevar ved -20 °C i opptil 2 måneder.
- Isolectin GSA-IB4 Alexa fluor-488 konjugat (Isolectin GSA-IB4): Vekt 36,75 mg kalsiumkloriddihydrat (CaCl2·2H2O) og tilsett den til 500 ml nylaget PBS. Rør løsningen med en rørestang. Pipette 500 μL av løsningen av CaCl2 / PBS og legg den til hetteglasset som inneholder 500 μg lyofilisert Isolectin GSA-IB4 pulver. Bland forsiktig og aliquot løsningen i 0,5 ml rør. Oppbevar dem ved -20 °C beskyttet mot lys.
- Poly (vinylalkohol) i glyserol/Tris: Vei 2,4 g Poly (vinylalkohol), tilsett 6 g glyserol og rør forsiktig. Tilsett deretter 6 ml vann og fortsett å røre i flere timer ved romtemperatur. Tilsett 12 ml forvarmet 0,2 M Tris-oppløsning (pH: 8,5) og varm ved en konstant temperatur på 50 °C i 10 minutter og bland av og til. Til slutt sentrifugerer løsningen på 5000 x g i 15 minutter for avklaring.
MERK: La oppløsningen avkjøles ved romtemperatur, aliquot den og oppbevar den ved -20 °C.
2. Fluorescerende lectin farging
- Ved mus offer av karbondioksid (CO2) innånding, enukle øynene med saks16. Fest de enucleated øynene med nylagde 4% PFA i 1 time ved romtemperatur (RT).
MERK: Fiksering kan også utføres ved å inkubere øynene i 4% PFA over natten (ON) ved 4 °C. Mus ble ofret i henhold til retningslinjene i ARVO-erklæringen for bruk av dyr i oftalmisk og visjonsforskning og institusjonell dyrepleie- og brukskomité (CICUAL) ved Fakultet for kjemisk vitenskap, Nasjonalt universitet i Córdoba (Res. HCD 1216/18). - Under dissekering mikroskopet, fjern hornhinnene med saks ved å kutte langs limbus og dissekere hele netthinnene. Kast det fremre segmentet av øyet, og skill deretter netthinnen fra RPE-Choroid.
MERK: Sørg for å fjerne de resterende ruskene og hyaloidbeholderne ut av netthinnen med tang. - Plasser netthinnene i 200 μL rør. Blokker og permeabiliser deretter netthinnene i 100 μL tris-bufret saltvannsoppløsning (TBS) som inneholder 5% Bovine Serum Albumin (BSA) og 0,1% Triton-X-100 i løpet av 6 timer ved 4 °C med skånsom agitasjon i shakeren.
MERK: Dette trinnet kan utføres i 2 timer ved RT. - Snu deretter røret for å plassere netthinnen i hetten og fjern blokkeringsløsningen med en pipette.
- Tilsett 100 μL av oppløsningen som inneholder 0,01 μg/μL isolektin GSA-IB4 (GSA-IB4). Pakk rørene med aluminiumsfolie for å beskytte prøvene mot lys. Inkuber netthinnene med lectin-oppløsningen PÅ ved 4 °C eller i 2 timer ved RT med skånsom agitasjon i shakeren.
- Vask netthinnen med 100 μL TBS som inneholder 0,1% Triton-X-100 i 20 minutter med mild agitasjon i shakeren. For riktig vask, plasser netthinnen i hetten på røret ved å invertere den. Sett røret tilbake i stående stilling og fjern mediet som er igjen i beholderen. Gjenta dette trinnet tre ganger.
- Plasser netthinnen i et lysbilde og legg til en dråpe PBS. Under dissekering mikroskopet, utføre fire like fjerne kutt fra kantene av netthinnen mot synsnerven.
- For å utfolde kronbladene i netthinnen, bruk tang eller små biter av filterpapir. Pass på at fotoreseptorsiden vender ned.
- Fjern den gjenværende PBS-en på lysbildet med filterpapir. Tilsett deretter et monteringsmedium (Poly (vinylalkohol) i glyserol/Tris) og coverlip. La det tørke i 1 time ved RT.
- Oppbevar sklier ved 4 °C beskyttet mot lys.
MERK: Netthinner kan også oppbevares i PBS ved 4 °C til konfikal mikroskopivisualisering.
3. Konfomisk mikroskopivisualisering og mikrofotografanskaffelse
- Før visualisering, inkuber lysbildene i 10 min på RT dekket av lys.
- Plasser glidebryteren i platen med forsiden ned ved det konfiske mikroskopet.
- Fokuser den overlegne plexusen til retinal vaskulaturen, og velg et område for å starte bildeanskaffelsen.
- Angi generelle laserparametere i programvaren: Bølgelengde: 488 nm; Laserintensitet; HV; Forskyvning; Vinne.
MERK: Laserintensitet, PMT, offset og forsterkning kan variere avhengig av forholdene og bruken av lampen. De optimale innstillingene gir et klart bilde av karene som unngår metning i følsomheten til fotomultiplierrøret for å ha et lineært forhold til fluorescenssignalet. - Angi andre anskaffelsesparametere: Modus; Størrelse; Målsetting, uten zoom; Ingen Kalman; Trinnstørrelse.
MERK: Identiske anskaffelsesbetingelser må brukes til å avbilde kontroll- og eksperimentelle prøver. - Angi koordinatene i x- og y-aksen: Skann netthinnen i fokus 2x. Hvis området viser fartøy, velger du det ved å klikke to ganger i området for å merke det for senere bildeinnhenting.
MERK: Det anbefales på det sterkeste å velge netthinneområde ved å følge den overlegne vaskulære plexusen, da fluorescensen til større kar er høyere. - Flytt i rutenettet til en nabo firkant, fokuser netthinnen, og velg området hvis det tilsvarer. Gjenta dette trinnet til det valgte området består av hele netthinnen.
- Velg ett område, og angi koordinatene i z-aksen for å definere tykkelsessonen som skal skannes. For å gjøre dette, visualiser netthinnen i fokus 2x; med mikrometeret, gå til toppen av netthinnen og klikk på Sett i startposisjon. Deretter flytter du til bunnen av netthinnen og klikker på Sett i endeposisjon.
- Gjenta trinn 3.8 på hvert område som er valgt i rutenettet.
MERK: For å kontrollere det skannede området i dybden, trykk på Gå i startposisjon. Hvis fartøy fortsatt er visualisert, juster posisjonen ved å flytte mikrometeret, og klikk deretter på Set. Gjenta prosessen i endeposisjonen. - Initialiser automatisk skanning.
- Når skanneprosessen er ferdig, åpner du bildet.
- Velg serieformatet for å spille inn bildet som en mosaikk og lagre det med den foretrukne utvidelsen. Til slutt vises det sydde bildet på skjermen.
4. Bildebehandling
- I ImageJ FIJI-programvaren går du til menylinjen og klikker på Fil > Åpne. Velg bildet som skal behandles. I vinduet Importalternativer for bioformater velger du Vis OME-XML-metadata og klikker på OK.
MERK: Bilder med lignende navn bør lagres i separate mapper. - I vinduet OME-metadata søker du etter pikselstørrelsesinformasjonen, kalt PhysicalSizeX, PhysicalSizeY og PhysicalSizeZ. Kopier disse dataene.
- For bildekalibrering går du til menylinjen og velger Egenskaper for bilde >. Kopier informasjonen i bildet i trinn 4.2 og klikk på OK. Bildet åpnes som et vindu med flere bilder, hvor hver og en representerer mikrofotografiene som er anskaffet ved en z-akse.
- Tilordne en foretrukket lut til bildet for å sende en farge til fluorescerende etikett. For å gjøre det, gå til menylinjen og klikk på LUT-ikonet .
- Hvis du vil visualisere alle stakkene i ett enkelt bilde, går du til menylinjen og velger Bilde > stakker > Z-prosjekt.
- I Z-projeksjonsvinduet som vises, velger du alle bunkene der fartøyene visualiseres. Velg Gjennomsnittlig intensitet i Projeksjonstype, og klikk ok.
MERK: Resultatet av summen av stakkene vises i et nytt bilde med navnet AVG (bildenavn). - Juster lysstyrken og kontrasten i det resulterende bildet for å redusere bakgrunnen og høylyskarene. Gå til menylinjen og klikk på Bilde> Juster> Lysstyrke/kontrast. I B- og C-vinduene flytter du stolpene til en bedre intensitet overholdes. Klikk på Bruk og lagre endringene.
- Kopier parameterne som er valgt under Lysstyrke/kontrast. Disse må være identiske for alle bilder.
- Før bilde kvantifisering definerer du parameterne som skal måles. Gå til Analyser > Angi målinger på menylinjen. I prosedyrene som er beskrevet her, vil det være nødvendig å skaffe areal og perimeter (dette er til syvende og sist også nødvendig for å måle avstander). Klikk på OK.
- Last ned plugin-modulen som kreves for kartetthet kvantifisering17 og følg installasjonsinstruksjonene fra plugin-modulen.
- Fortsett med kvantifiseringen av en bestemt vaskulær parameter.
5. Kvantifisering av avaskulære områder
- Velg tryllestavverktøyet på menylinjen. Velg retinalområdet som mangler fartøy.
MERK: Større eller mindre områder kan velges avhengig av toleransen. For å justere toleransen, klikk på tryllestavverktøyikonet to ganger. Modus ansatt: Eldre. - Trykk på T-bokstaven på tastaturet for å spille inn det valgte området i ROI Manager. Gjenta trinn 5.1 og 5.2 med alle de avaskulære områdene i netthinnen.
- Klikk på Mål i ROI-lederen for å få informasjon om det avaskulære området. Programmet viser et nytt vindu med nødvendig informasjon. Kopier dataene i et annet program, eller lagre filen.
MERK: I noen bilder kan man foretrekke å velge de avaskulære områdene manuelt. I dette tilfellet velger du markeringsverktøyet mangekant, tegner korte avstander rundt det avaskulære området og klikker på bildet når en ny avstand er i ferd med å starte. Lukk det merkede området ved å klikke det første punktet. - Gjenta trinn 5.1, 5.2 og 5.3 for å måle det totale arealet av netthinnen.
- Beregn det avaskulære området av netthinnen som summen av alle de avaskulære områdene målt delt på det totale arealet av netthinnen.
6. Kvantifisering av nevaskulære områder
- Velg tryllestavverktøyet på menylinjen.
- Zoom inn bildet for å visualisere neovessels bedre. Velg neovessels en etter en med stavverktøyet.
MERK: Juster toleransen ikke høyere enn 20 for å sikre valg av en enkelt neovessel. Dette toleransenivået må være konstant under alle bilde kvantifiseringer. - Trykk på T-bokstaven på tastaturet for å spille inn det valgte området i ROI Manager. Gjenta trinn 6.1 og 6.2 med alle neovascular områder av netthinnen.
- Klikk på Mål i ROI-lederen for å få tak i områdedataene. Programmet viser et nytt vindu med nødvendig informasjon. Kopier dataene i et annet program, eller lagre filen.
- Gjenta trinn 6.1, 6.2 og 6.3 for å kvantifisere det totale arealet av netthinnen.
- Beregn det neovaskulære området av netthinnen som summen av alle neovessels områder målt delt på det totale arealet av netthinnen.
7. Kvantifisering av kardiameter
- Velg rettlinjeverktøyet på menylinjen.
- Zoom inn bildet for å visualisere karveggen bedre. Utfør tre tverrgående linjer til hovedfartøyet før den første grenen. Dette må gjøres ved å tegne en linje fra grensen til en vegg av fartøyet til det motsatte.
MERK: Linjen må være helt vinkelrett på veggbeholderen for å unngå kvantifiseringsfeil. - Trykk på T-bokstaven på tastaturet for å spille inn det valgte området i ROI Manager. Gjenta trinn 7.1 og 7.2 i alle fartøyene som må kvantifiseres.
- Klikk på Mål i ROI-lederen for å få avstandsdataene. Programmet viser et nytt vindu med nødvendig informasjon. Kopier dataene i et annet program, eller lagre filen.
8. Kvantifisering av fartøyets tortuositet
- På menylinjen klikker du på straight-line verktøyikonet med høyre museknapp og velger Segmentert linje eller Frihåndslinje. Tegn en linje inne i fartøyet fra synsnerven til det første fartøyets konsekvenser etter den vaskulære formen.
MERK: Linjen må følge den vaskulære formen for å unngå kvantifiseringsfeil. - Trykk på T-bokstaven på tastaturet for å spille inn det valgte området i ROI Manager.
- Velg rettlinjeverktøyet på menylinjen. Tegn en linje fra synsnerven til det første fartøyets konsekvenser.
- Trykk på T-bokstaven på tastaturet for å spille inn det valgte området i ROI Manager.
- Klikk på Mål i ROI Manager for å få avstandsdataene. Programmet viser et nytt vindu med nødvendig informasjon. Kopier dataene i et annet program, eller lagre filen.
- Beregn tortuositetsindeksen på følgende måte: Avstand oppnådd med Segmentert linje delt på avstanden oppnådd med Rett linje.
9. Kvantifisering av vaskulær forgrening
- Med det ovale verktøyet på menylinjen definerer du et område som brukes likt på alle eksperimentelle forhold. Det valgte området må være en konsentrisk sirkel trukket rundt synsnerven.
- Trykk på T-bokstaven på tastaturet for å spille inn det valgte området i ROI Manager.
MERK: I dette tilfellet anbefales det å lagre avkastningen da kvantifiseringen er langsom og den identiske avkastningen må brukes i alle bilder. For å gjøre dette, klikk på MER > Lagre i ROI Manager. - Tell manuelt antall primærgrener som oppstår fra hovedfartøy inne i valgområdet.
- Gjenta trinn 9.2 og 9.3 i naboområder, og vedlikehold synsnerven-periferikriteriene.
10. Kvantifisering av vaskulær tetthet
- Transformer bildet til 8-biters modus.
- Gå til Plugins i menylinjen, velg Fartøyanalyse > Vaskulær tetthet.
- Definer et område med firkantet verktøy på menylinjen, der fartøyets tetthet må måles. Klikk på OK.
- Programmet viser et nytt vindu med nødvendig informasjon. Kopier dataene i et annet program, eller lagre filen.
- Gjenta trinn 10.2, 10.3 og 10.4 i naboområdene, opprettholde avkastningen, men plassere den ni ganger som omfatter periferien og midten av hele netthinnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som beskrevet i protokolldelen, fra en enkelt fluorescerende fargeanalyse, kan du få den vaskulære morfologien og evaluere flere parametere av interesse kvantitativt. Søket av en bestemt endring vil avhenge av hvilken type retinopati som studeres. I denne artikkelen ble avascular og neovascular områder, tortuositet og dilatasjon evaluert i en musemodell av proliferativ retinopati, mens vaskulær forgrening og tetthet ble analysert i en MetS-musemodell, som induserer en ikke-proliferativ retinopati.
I det første eksperimentelle eksemplet ble den oksygeninduserte Retinopati (OIR) musemodellen, brukt, som ligner Prematuris retinopati og noen funksjoner i den proliferative fasen av Diabetic Retinopathy. I denne modellen opprettholdes kull med sin ammende mor i et hyperoksisk kammer fra barseldag (P) 7 til P1218. Intravitreale injeksjoner ble utført ved P12 for å bestemme effektiviteten av et stoff som en antiangiogene (tilstand kalt behandling). Mus ble ofret ved P17, tidspunktet for maksimal neovesselsformasjon19. Mus injisert med kjøretøy ble ansatt som kontroll. Begge prøvene ble fikset og farget med Isolectin GSA-IB4 sammen. Etter konfiskert oppkjøp ble bilder analysert med ImageJ FIJI-programvare som angitt ovenfor. Med Stitching-modulen integrert i konfokalt mikroskop ble hele braketten observert som et unikt bilde (figur 1). Ved P17 er det mulig å observere hyaloidvaskulaturen, et forbigående vaskulært system som er viktig i løpet av intrauterinlivet (figur 1, hvite piler)20.
Som en konsekvens av overdreven oksygentilførsel i hyperoksisk kammer, arresterer OIR-mus den fysiologiske vaskulære utviklingen og genererer avaskulære områder i netthinnen. Deretter er de avaskulære områdene definert som sonene som mangler retinal blodårer (figur 2). Fra bildene som er anskaffet, kan avaskulære områder kvantifiseres som summen av regionene uten fartøy delt på det totale arealet av netthinnen. Områder med mekanisk skade viser også fravær av fartøy. For å identifisere skadede områder, analyser integriteten til nevronale lag med Hoechst-flekk.
De avaskulære områdene i netthinnen unngår oksygentilførsel, og derfor er det satt en sterk pro-angiogen respons, som induserer neovascularization16. Neovessels er små kaliber fartøy som stammer fra et eksisterende fartøy av den overlegne vaskulære plexus. Deres struktur er uorganisert, derfor vokser neovessels som tufts mot glasslegemet hulrom21. Vi beregnet området okkupert av neovessels tufts ved å kvantifisere det neovaskulære området av netthinnen delt på det totale arealet av netthinnen (figur 3). Siden neovessels form og størrelse er variabel, kan de av og til se ut som rusk og gjenstander. For å skille neovessels, kontroller at tuft vokser fra et modent fartøy.
Vaskulær dilatasjon og tortuositet er andre to hyppige endringer, som har negative effekter på vaskulær biologi, da de produserer turbulent blodsirkulasjon. For analyse av dilatasjonen målte vi hovedbeholderdiameteren i tre høyder før den første grenen22,23 (figur 4). Forskeren må definere en forhåndsbestemt avstand for å måle fartøyets diameter for å redusere variasjonen blant resultatene. Ideelt sett bør det lengste punktet fra synsnerven være rundt 300 μm. Vi foreslår at du utfører analysen og senere tar i gjennomsnitt minst seks mus per tilstand.
Når det gjelder tortuositet, måler vi avstanden som dekkes av hovedfartøyene etter formen med hensyn til den rette avstanden mellom synsnerven og det første forgreningspunktet24 (figur 5). Som vi kan se på bildet, er det heterogenitet i sinuositeten til hovedfartøyene. For å oppnå et representativt resultat må ikke mindre enn seks mus per tilstand kvantifiseres.
De nyeste parametrene, vaskulær forgrening og tetthet, ble analysert i MetS-modellen som viser ikke-proliferativ retinopati. I MetS er både lipider og karbohydrater derangements forbundet med retinal pericytter og endotelceller dysfunksjon og død, noe som fører til dannelse av acellulære kapillærer eller en redusert vaskulær forgrening25. I vår modell ble ApoE-KO-mus matet med fruktose tilsatt drikkevannet, i en konsentrasjon på 10% m / v. Kontroller dyr som nettopp har fått vann fra springen. Etter 4 måneder med diett ble mus ofret, og netthinnene behandlet som indikert før. For måling av vaskulær forgrening definerte vi kvantifiseringsområdet ved å tegne en konsentrisk sirkel, og så telte vi, en etter en, de primære grenene som følge av et hovedsentralfartøy (figur 6).
Fra bildene som er anskaffet, ble den vaskulære tettheten kvantifisert som området okkupert av fartøy delt av ROI-området (en firkant på 0,015 mm2, se flate i figur 7), som ble plassert på forskjellige steder i hver mikrofotografi, som det ble forklart i protokolldelen. Unngå kvantifisering av områder med mekanisk skade (figur 7, hvite piler). Hvis det er mer enn to områder med punkteringer, må netthinnen kastes.
Figur 1: Vaskulær farging av netthinner hele braketten merket med Isolectin GSA-IB4: Representative konfiskeringsbilder av P17 OIR-mus netthinner injisert med kjøretøy eller behandling ved P12. Fluorescerende farging ble utført i hele mount netthinner med Isolectin GSA-IB4 Alexa 488 i henhold til protokollen. Avascular områder (AV) og neovascular områder (NV) er indikert. Skala bar: 500 μm. Hvite piler viser resten hyaloid vaskulatur. Gule piler viser ufullstendige skanneområder under konfikal bildeanskaffelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Kvantifisering av avaskulære områder: (A) Representative bilder av hele mount netthinner på P17 som viser GSA-IB4 vaskulær farging i OIR-kjøretøy og OIR-behandling mus. Områder med vaso-utslettelse er indikert i gult. Skalastang: 500 μm. (B) AV-området (%) ble kvantifisert som forholdet mellom sentralt avascular område og hele netthinneområdet. To-tailed unpaired t-test ble brukt til statistisk sammenligning. Data presentert som gjennomsnittlig ± SEM. *** p < 0,001. Minst seks dyr ble ansatt for hver tilstand i overlevelsestiden som ble undersøkt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Kvantifisering av neovascular områder: (A) Representative bilder av hele mount netthinner på P17 viser GSA-IB4 vaskulær farging i OIR-kjøretøy og OIR-behandling mus. Områder med neovascularization er indikert i hvitt. Skalastang: 500 μm. (B) NV-området (%) ble kvantifisert som forholdet mellom området okkupert av neovessels til hele netthinneområdet. To-tailed unpaired t-test ble brukt til statistisk sammenligning. Data presentert som gjennomsnittlig ± SEM. *** p < 0,001. Minst seks dyr ble ansatt for hver tilstand i overlevelsestiden som ble undersøkt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Kvantifisering av vaskulær dilatasjon: (A) Representative bilder av hele mount netthinner på P17 som viser GSA-IB4 vaskulær farging i OIR-kjøretøy og OIR-behandling mus. Venstre paneler: ROIer valgt for kvantifisering. Høyre paneler: zoom av ROIene, som viser rette linjer utført i et hovedfartøy for å måle kardiameteren. Tre linjer ble sporet tverrgående til fartøyet og i gjennomsnitt. Skalastang: 100 μm. (B) Kardiameteren (%) ble kvantifisert som gjennomsnittlig diameter målt i store beholdere i netthinnen. To-tailed unpaired t-test ble brukt til statistisk sammenligning. Data presentert som gjennomsnittlig ± SEM. *p < 0,05. Minst seks dyr ble ansatt for hver tilstand i overlevelsestiden som ble undersøkt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Bestemmelse av tortuositetsindeks: (A) Representative bilder av hele mount netthinner på P17 som viser GSA-IB4 vaskulær farging i OIR-kjøretøy og OIR-behandling mus. Venstre paneler: ROIer valgt for kvantifisering. Senterpaneler: zoom av ROIene, som viser segmenterte linjer sporet i et hovedfartøy fra synsnerven til det første forgreningspunktet. Høyre paneler: zoom av ROIene, som viser rette linjer sporet i et hovedfartøy fra synsnerven til det første forgreningspunktet. Skalastang: 100 μm. (B) Tortuositetsindeksen ble oppnådd ved å dele avstanden til den segmenterte linjen til avstanden til den rette linjen. To-tailed unpaired t-test ble brukt til statistisk sammenligning. Data presentert som gjennomsnittlig ± SEM. ns, ikke-signifikante. Minst seks dyr ble ansatt for hver tilstand i overlevelsestiden som ble undersøkt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Kvantifisering av vaskulær forgrening: (A) Representative bilder av hele mount netthinner som viser Isolectin GSA-IB4 vaskulær farging i ApoE-KO og ApoE-KO + fruktose matet mus. Sirkulære kvantifiseringsområder ble definert i gult. Skalastang: 100 μm, 100x forstørrelse. (B) Antall grener ble kvantifisert som antall primærgrener fra et hovedfartøy, siden synsnerven til periferien. To-tailed unpaired t-test ble brukt til statistisk sammenligning. Data presentert som gjennomsnittlig ± SEM. ns, ikke-signifikante. Minst seks dyr ble ansatt for hver tilstand. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Kvantifisering av vaskulær tetthet: (A) Representative bilder av hele mount netthinner som viser Isolectin GSA-IB4 vaskulær farging i ApoE-KO og ApoE-KO + fruktosefôrede mus. Kvadratet på 0,015 mm2 kvantifiseringsområde ble definert i gult. Skalastang: 100 μm, 100x forstørrelse. (B) Vaskulær tetthet ble kvantifisert som forholdet mellom vaskulært område og totalt avkastningsområde, som ble plassert ni ganger på forskjellige steder i hver mikrofotografi. Hvite piler viser områder med mekanisk skade. To-tailed unpaired t-test ble brukt til statistisk sammenligning. Data presentert som gjennomsnittlig ± SEM. ns, ikke-signifikante. Minst seks dyr ble ansatt for hver tilstand. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dyremodeller av retinopatier er kraftige verktøy for å studere vaskulær utvikling, ombygging eller patologisk angiogenese. Suksessen til disse studiene i feltet er avhengig av enkel tilgang til vevet som gjør det mulig å utføre et bredt spekter av teknikker, og gir data fra in vivo og postmortem mus26,27. Videre er det funnet stor sammenheng mellom in vivo-studier og klinisk analyse, noe som gir solid sporbarhet og pålitelighet til disse modellene28. I denne artikkelen presenterer vi en enkel og robust beskrivelse av trinnene for å karakterisere det vaskulære nettverket i musemodeller av retinal vaskulære sykdommer. I litteraturen vil leserne finne andre mulige parametere for å måle og parallelle tilnærminger for å kvantifisere de som er valgt her. De kompilerte protokollene har mange fordeler i forhold til andre fordi de er reproduserbare, og de krever bare en gratis programvare for å utføre analysen (Image J Fiji).
Videre er disse protokollene enkle å utføre av studenter som ikke har omfattende kunnskap om programmet, og de fleste målingene trenger ikke ekstra plugins (unntatt vaskulær tetthet).
Prøveekstraksjon og fluorescensfargingsteknikk er enkel og kort29. Det er svært viktig å jobbe med friske netthinner, selv om de kan lagres ved 4 °C i PBS med hemmere av bakterievekst. Ettersom vevet er tynt og mykt, bryter gamle prøver ofte ned under inkubasjonen eller når du bretter ut prøven før montering. Dessuten gjør overdreven fiksering med 4% PFA netthinnen for stiv og sprø, men dette påvirker ikke lectinfargingen. Isolectin GSA-IB4 farging gjør det mulig å visualisere hele vaskulære nettverket på hvert lag, inkludert neovessels og proliferating endotelceller. Andre markører, som CD 31, krever inkubasjon av prøven med konsentrerte antistoffer, og de har mer bakgrunn. På den annen side, i angiografi, har fluorescerende fargestoff en tendens til å spre seg ut av karene, noe som øker variasjonen i karkaliberet og tortuositetskvartifiseringen. En ulempe med Isolectin GSA-IB4 er at den også kan merke mikrogliale celler30. Forsiktighet bør utvises ved gjennomføring av intravitreale injeksjoner eller andre eksperimentelle prosedyrer som induserer overdreven infiltrasjon fordi mikrogliale celler kan danne agglomerater.
Bildeanskaffelse kan utføres med et hvilket som helst konfikalt mikroskop. Bruken av et motorisert platepar til en programvare som inkluderer Stitching-modulen, vil gi fullstendig visualisering av hele den monterte netthinnen i et enkelt bilde. Når du velger netthinneområdet, må du sørge for at alle ytterpunktene i prøven er inkludert, ellers vil bildet være ufullstendig (figur 1, gule piler). Dette er ikke veldig relevant i musemodellen til OIR, som et eksempel, fordi vaskulære endringer er nær synsnerven. Mens du er i rottemodellen til OIR, kan denne feilen føre til unøyaktig kvantifisering, da de avaskulære og neovascular områdene ligger ved siden av limbusen. En annen mulighet er å ta individuelle retinal mikrofotografer. Brukeren kan senere organisere dem som et puslespill med riktig programvare. Det anbefales ikke å bruke epifluorescence mikroskop, spesielt når du analyserer forgrening, fordi fartøy spirer gjennom hele tykkelsen av netthinnen, og noen fartøy vil ikke bli oppdaget i en utelukkende z-stabel.
Under bildebehandling med ImageJ FIJI anbefales det ikke å oppdatere programvaren før alle bildene er kvantifisert, for å holde identiske forhold i programvaren. Kalibreringen av bildene (tildeling av pikselstørrelse i mikron) er et kritisk skritt, da disse protokollene innebærer kvantifisering av avstander og områder. Når brukeren er kjent med programmet, kan han utforske andre verktøy for å velge det neovascular og avascular området i tillegg til stavverktøyet. Markeringsverktøyet for polygon er spesielt nyttig for å måle tilgjengelige områder som er kuttet i to deler ved monteringstrinnet. Andre forskere har laget spesifikke plugins for å automatisere utvalget av neovessels basert på fluorescensintensiteten til disse strukturene. Disse metodene er raskere og mindre arbeidskrevende, selv om det anbefales å sjekke at små mindre skinnende neovessels er valgt før kvantifisering31. Områdene av neovessels vil fluoresce mer intenst enn de omkringliggende normale fartøyene. Tryllestavverktøyet markerer områder som er farget på samme måte, og toleransen bestemmer hvor like fargen er bildepunktene som er markert. Hvis en neovessel har lignende intensitet som normale kar, kan toleransen justeres nedover for å øke følsomheten for subtile intensitetsforskjeller. Selv om neovesselvalg i hver prøve vil bli utført med en identisk terskel, er noen neovessels preget av en mindre fluorescensintensitet. I dette tilfellet kreves det en lavere toleranse for riktig valg.
Tortuositet og dilatasjon er målinger av avstand. En omfattende studie av det vaskulære treet er nyttig for å velge kar av identisk type (arterier eller årer) og kaliber. Vi måler dilatasjonen i fartøy i tre høyder som vist i figur 4. Vinkelen på det rette utvalget i forhold til karveggen er et annet relevant punkt å ta hensyn til. Dette bør være så nært som mulig til 90° for å unngå mulige feil. Når du tegner den rette linjen, kan brukerne bruke zoomverktøyet til å nærme seg det aderente fartøyet.
Vaskulær forgrening kan også måles i to eller flere kvantifiseringsområder av forskjellige høyder, om ønskelig. I dette tilfellet bør forskere bevare regionen av netthinnen analysert (sentral, middels eller perifer side av synsnerven). Selv om forgrening er endret i flere dyremodeller av retinopati, viser tidlige stadier av retinopatien knyttet til MetS presentert her fortsatt ikke slike endringer15. For omfattende studier i retinal kapillærer av mellomliggende og dyp plexus og karspiring, gir 3D-beregningsmetoder verdifulle data om subtile variasjoner i vaskulær morfologi og nettverk32. Til slutt bestemmes den vaskulære tettheten av området okkupert av fartøy med hensyn til det totale arealet av en ROI valgt. Målingen av denne parameteren krever bruk av en plugin og en aktualisert versjon av ImageJ FIJI, der autoterskel og geometri til avstandskartverktøy må være tilgjengelige. Til tross for disse ekstra trinnene er plugin-modulen enkel å bruke, reproduserbar og pålitelig. For måling av vaskulær tetthet ble det valgt en avkastning på 0,015 mm2 for å gjøre ti målinger av fluorescensintensiteten i forskjellige områder av netthinnen. Denne størrelsen tillot oss å dekke hele bildet, og dermed oppnå en mer representativ gjennomsnittsverdi og avvik i hver netthinne.
Totalt sett, til tross for at disse samlingene av metoder ikke er automatisert og krever manuell valg av parametrene, er de i stand til å gi kvantitative og strenge data fra netthinnene. Hovedbegrensningen for ovennevnte protokoller for vaskulære målinger er avhengig av variasjonen mellom sensorene ved analyse av det samme bildet. For å minimere denne skjevheten er det viktig å forhåndsetablere den generelle innstillingen som fartøyvegggrenser, identifisering av avaskulære områder og neovessels, og også utelukkelseskriterier for skadet vev. Når det gjelder fartøyets tortuositet, er det nødvendig med et avtalt utgangspunkt ved siden av synsnerven. For nybegynnere anbefales det på det sterkeste å beregne gjennomsnittet av dataene som samles inn av to eller flere sensorer. Hos opplærte brukere er det ikke funnet noen signifikante forskjeller i måling av ulike parametere, så lenge enigheten i kvantifiseringskriteriene forblir konstant. På samme måte kan ytterligere parametere legges til de oppførte protokollene, avhengig av de vaskulære endringene som oppdages i retinopatien. I ikke-proliferative retinopatier er målingen av acellulært kapillærtall, migrerende pericytter, forholdet mellom pericytter / endotelceller og blodretinal barrieregjennomtrengelighet de tidligste parametrene som er endret i retinal vaskulatur33,34,35. For kroniske modeller og milde retinopatier er det tilrådelig å inkludere disse tilleggsmålingene. Et stort antall målte parametere vil gi et mer trofast landskap av hendelsene som finner sted i vaskulaturen. Oppsummert har vi i denne artikkelen vist klassiske, veletablerte og reproduserbare teknikker for å kvantifisere noen av de mest relevante parametrene som er tatt i betraktning i den kliniske praksisen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at forskningen ble utført i fravær av kommersielle eller økonomiske forhold som kunne tolkes som en potensiell interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi takker Carlos Mas, María Pilar Crespo og Cecilia Sampedro fra CEMINCO (Centro de Micro y Nanoscopía Córdoba, CONICET-UNC, Córdoba, Argentina) for hjelp i konfikal mikroskopi, til Soledad Miró og Victoria Blanco for dedikert dyrepleie og Laura Gatica for histologisk hjelp. Vi takker også Victor Diaz (pro-sekretær for institusjonell kommunikasjon av FCQ) for videoproduksjonen og utgaven og Paul Hobson for hans kritiske lesning og språkrevisjon av manuskriptet.
Denne artikkelen ble finansiert av tilskudd fra Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT), Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (alle til M.C.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminuim foil | |||
| Bovine Serum Albumin | Merck | A4503 | quality |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | C3306 | |
| Hydrochloric acid | Biopack | 9632.08 | |
| Confocal Microscope FV1200 | Olympus | FV1200 | with motorized plate |
| Covers | Paul Marienfeld GmnH & Co. | 111520 | |
| Dissecting Microscope | NIKON | SMZ645 | |
| Disodium-hydrogen-phosphate dihydrate | Merck | 119753 | |
| 200 µL tube | Merck | Z316121 | |
| Filter paper | Merck | WHA5201090 | |
| Incubator shaker GyroMini | LabNet International | S0500 | |
| Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | I21411 | |
| Poly(vinyl alcohol) (Mowiol 4-88) | Merck | 475904 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 158127 | |
| pHmeter | SANXIN | PHS-3D-03 | |
| Potassium chloride | Merck | P9541 | |
| Potassium-dihydrogen phosphate | Merck | 1,04,873 | |
| Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Sodium chloride | Merck | S3014 | |
| Sodium hydroxide | Merck | S5881 | |
| Tris | Merck | GE17-1321-01 | |
| Triton X-100 | Merck | X100-1GA | |
| Vessel Analysis Fiji software | Mai Elfarnawany | https://imagej.net/Vessel_Analysis |
References
- Kur, J., Newman, E. A., Chan-Ling, T. Cellular and physiological mechanisms underlying blood flow regulation in the retina and choroid in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (5), 377-406 (2012).
- McDougal, D. H., Gamlin, P. D.
- Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. Retinal vasculature development in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (2018).
- Wei, Y., et al. Age-related alterations in the retinal microvasculature, microcirculation, and microstructure. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (9), 3804-3817 (2017).
- Lavia, C., et al. Reduced vessel density in the superficial and deep plexuses in diabetic retinopathy is associated with structural changes in corresponding retinal layers. PLoS One. 14 (7), 0219164 (2019).
- Rosenblatt, T. R., et al. Key factors in a rigorous longitudinal image-based assessment of retinopathy of prematurity. Scientific Reports. 11 (1), 5369 (2021).
- Edwards, A. L. Funduscopic examination of patients with diabetes who are admitted to hospital. Canadian Medical Association Journal. 134 (11), 1263-1265 (1986).
- Lechner, J., O'Leary, O. E., Stitt, A. W. The pathology associated with diabetic retinopathy. Vision Research. 139, 7-14 (2017).
- Sun, Z., et al. angiography metrics predict progression of diabetic retinopathy and development of diabetic macular edema: A prospective study. Ophthalmology. 126 (12), 1675-1684 (2019).
- Jia, Y., et al. Quantitative optical coherence tomography angiography of vascular abnormalities in the living human eye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 2395-2402 (2015).
- Pauleikhoff, D., Gunnemann, F., Book, M., Rothaus, K. Progression of vascular changes in macular telangiectasia type 2: comparison between SD-OCT and OCT angiography. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 257 (7), 1381-1392 (2019).
- Gammons, M. V., Bates, D. O. Models of oxygen induced retinopathy in rodents. Methods in Molecular Biology. 1430, 317-332 (2016).
- Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal models of choroidal and retinal neovascularization. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).
- Han, N., Xu, H., Yu, N., Wu, Y., Yu, L. MiR-203a-3p inhibits retinal angiogenesis and alleviates proliferative diabetic retinopathy in oxygen-induced retinopathy (OIR) rat model via targeting VEGFA and HIF-1α. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 47 (1), 85-94 (2020).
- Paz, M. C., et al. Metabolic syndrome triggered by fructose diet impairs neuronal function and vascular integrity in ApoE-KO mouse retinas: Implications of autophagy deficient activation. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 573987 (2020).
- Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).
- Zarb, Y., et al. Ossified blood vessels in primary familial brain calcification elicit a neurotoxic astrocyte response. Brain. 142 (4), 885-902 (2019).
- Smith, L. E., et al.
- Subirada, P. V., et al. Effect of autophagy modulators on vascular, glial, and neuronal alterations in the oxygen-induced retinopathy mouse model. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 279 (2019).
- Lutty, G. A., McLeod, D. S. Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).
- Kim, C. B., D'Amore, P. A., Connor, K. M. Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).
- Guaiquil, V. H., et al. A murine model for retinopathy of prematurity identifies endothelial cell proliferation as a potential mechanism for plus disease. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5294-5302 (2013).
- Mezu-Ndubuisi, O. J. In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery. Optometry and Vision Science: Official Publication of the American Academy of Optometry. 93 (10), 1268-1279 (2016).
- Scott, A., Powner, M. B., Fruttiger, M. Quantification of vascular tortuosity as an early outcome measure in oxygen induced retinopathy (OIR). Experimental Eye Research. 120, 55-60 (2014).
- Kim, A. Y., et al. Quantifying microvascular density and morphology in diabetic retinopathy using spectral-domain optical coherence tomography angiography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 362 (2016).
- Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
- Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal models of choroidal and retinal neovascularization. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).
- Kern, T. S., Antonetti, D. A., Smith, L. E. H. Pathophysiology of diabetic retinopathy: Contribution and limitations of laboratory research. Ophthalmic Research. 62 (4), 196-202 (2019).
- Lorenc, V. E., et al. IGF-1R regulates the extracellular level of active MMP-2, pathological neovascularization, and functionality in retinas of OIR mouse model. Molecular Neurobiology. 55 (2), 1123-1135 (2018).
- Ma, N., Streilein, J. W. Contribution of microglia as passenger leukocytes to the fate of intraocular neuronal retinal grafts. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (12), 2384-2393 (1998).
- Mazzaferri, J., Larrivée, B., Cakir, B., Sapieha, P., Costantino, S. A machine learning approach for automated assessment of retinal vasculature in the oxygen induced retinopathy model. Scientific Reports. 8 (1), 3916 (2018).
- Milde, F., Lauw, S., Koumoutsakos, P., Iruela-Arispe, M. L. The mouse retina in 3D: quantification of vascular growth and remodeling. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro (Camb). 5 (12), 1426-1438 (2013).
- Yang, T., et al. Pericytes of indirect contact coculture decrease integrity of inner blood-retina barrier model in vitro by upgrading MMP-2/9 activity. Disease Markers. 2021, 7124835 (2021).
- Huang, Q., Wang, S., Sorenson, C. M., Sheibani, N. PEDF-deficient mice exhibit an enhanced rate of retinal vascular expansion and are more sensitive to hyperoxia-mediated vessel obliteration. Experimental Eye Research. 87 (3), 226-241 (2008).
- Jiang, H., Zhang, H., Jiang, X., Wu, S. Overexpression of D-amino acid oxidase prevents retinal neurovascular pathologies in diabetic rats. Diabetologia. 64 (3), 693-706 (2021).
