Summary
Мы представляем метод инъекции клеток с помощью безигольчатой водоструйной технологии в сочетании с продолжением послеродовых исследований с точки зрения измерения клеточной жизнеспособности, пролиферации и эластичности.
Abstract
Недержание мочи (UI) является широко распространенным состоянием, характеризующимся дефицитом мышцы уретрального сфинктера. Отрасли регенеративной медицины, особенно клеточная терапия, являются новыми подходами к улучшению и восстановлению функции уретрального сфинктера. Несмотря на то, что инъекция активных функциональных клеток обычно выполняется в клинических условиях с помощью иглы и шприца, эти подходы имеют значительные недостатки и ограничения. В этом контексте технология безигольчатой гидроабразивной струи (WJ) является осуществимым и инновационным методом, который может вводить жизнеспособные клетки с помощью визуальной цистоскопии в уретральный сфинктер. В настоящем исследовании мы использовали WJ для доставки стромальных клеток (pADSC), полученных из жировой ткани свиней, в трупную уретральную ткань и впоследствии исследовали влияние доставки WJ на выход и жизнеспособность клеток. Мы также оценили биомеханические характеристики (т.е. эластичность) с помощью измерений атомно-силовой микроскопии (AFM). Мы показали, что pADSC, доставленные WJ, были значительно снижены в их клеточной эластичности. Жизнеспособность была значительно ниже по сравнению с контрольной группой, но все еще выше 80%.
Introduction
Недержание мочи (UI) является широко распространенным расстройством с распространенностью 1,8 - 30,5% в европейских популяциях1 и характеризуется в первую очередь неисправностью уретрального сфинктера. С клинической точки зрения хирургическое лечение часто предлагается пациентам, когда консервативная терапия или физиотерапия не могут решить и облегчить возникающие симптомы.
Клеточная терапия потенциальной регенеративной репарации сфинктерного комплекса возникает как авангардный подход к лечению патологииUI 2,3. Его основными целями являются замена, восстановление и восстановление биологической функциональности поврежденной ткани. На животных моделях для пользовательского интерфейса трансплантация стволовых клеток показала многообещающие результаты в уродинамических исходах 2,4,5. Стволовые клетки возникают как оптимальные клеточные кандидаты, поскольку они обладают способностью подвергаться самообновлению и мультипотентной дифференцировке, таким образом, способствуя регенерации пораженной ткани6. Несмотря на предстоящий регенеративный потенциал, практическое использование клеточной терапии остается затрудненным, поскольку минимально инвазивная доставка клеток по-прежнему сталкивается с рядом проблем, касающихся точности инъекций и охвата мишени. Несмотря на то, что текущий подход, используемый для доставки клеток, представляет собой инъекцию через систему иглы-шприца7, он обычно приводит к общему дефициту жизнеспособных клеток, при этом заявленные жизнеспособности составляют всего 1%-31% после трансплантации8. Кроме того, было также показано, что доставка клеток с помощью инъекции иглы влияет на размещение, скорость удержания, а также на распределение трансплантированных клеток в целевой ткани 9,10,11. Осуществимым, новым подходом, который преодолевает вышеупомянутое ограничение, является доставка клеток без игл с помощью водоструйной технологии.
Технология Waterjet (WJ) становится новым подходом, который обеспечивает высокую пропускную способность доставки клеток цистоскопом под визуальным контролем в уретральном сфинктере12,13. WJ обеспечивает доставку ячеек при различных давлениях (E = эффекты в барах) в диапазоне от E5 до E8013. В первой фазе (фазе проникновения в ткани) изотонический раствор наносят с высоким давлением (т.е. Е60 или Е80) с целью ослабления внеклеточного матрикса, окружающего ткани-мишень, и открытия небольших соединительных микролакунов. Во второй фазе (фазе инъекции) давление понижается в течение миллисекунд (т.е. до Е10), чтобы мягко доставить клетки в ткани-мишени. После этого двухэтапного применения клетки не подвергаются дополнительному давлению на ткань при выбросе, а плавают в потоке низкого давления в заполненную жидкостью кавернозную область13. В условиях модели ex vivo, где стволовые клетки вводились через WJ в трупную ткань уретры, жизнеспособные клетки могли быть впоследствии аспирированы и извлечены из ткани и дополнительно расширены in vitro13. Хотя исследование 2020 года Weber et al. продемонстрировало осуществимость и применимость WJ для доставки кардиомиоцитов без следов в миокард14, следует иметь в виду, что технология WJ все еще находится на стадии прототипа.
Следующий протокол описывает, как подготовить и маркировать стромальные клетки, полученные из жировой ткани свиней (pADSC), и как доставить их в улавливающую жидкость и трупную ткань с помощью технологии WJ и игл цистоскопии Уильямса (WN). После клеточной инъекции оценивается клеточная жизнеспособность и эластичность с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ). Посредством пошаговых инструкций протокол дает четкий и лаконичный подход к получению достоверных данных. В дискуссионном разделе представлены и описаны основные преимущества, ограничения и будущие перспективы методики. Доставка WJ клеток, а также анализы sequela post translation, о которых сообщается здесь, заменяют стандартную инъекцию иглы и обеспечивают прочную основу для доставки клеток для регенеративного заживления ткани-мишени. В наших недавних исследованиях мы предоставили доказательства того, что WJ доставлял клетки более точно и, по крайней мере, с сопоставимой жизнеспособностью по сравнению с инъекциями иглы15,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Образцы жировой ткани свиней были получены из Института экспериментальной хирургии при Университете Тюбингена. Все процедуры были одобрены местными органами по защите животных под номером эксперимента на животных CU1/16.
1. Выделение стромальных клеток, полученных из жировой ткани свиней
- Используйте жировую ткань свиней, доставленную из Института экспериментальной хирургии в центрифужной трубке объемом 50 мл в лабораторию.
- Переложить ткань на стерильную чашку Петри под стерильной скамьей и измельчить ее двумя скальпелями (No10) до мелких фрагментов и кашицы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ножницы также можно использовать для получения небольших фрагментов. Чем меньше фрагменты, тем лучше для последующего пищеварения.- Переложите мелкие фрагменты/кашицу в центрифужную трубку объемом 50 мл и инкубируйте ее с 5 мл раствора гомогенизатора в течение 30 мин при 37 °C на шейкере. Раствор гомогенизатора представляет собой PBS с 1% бычьим сывороточным альбумином (BSA) (стоковый раствор: 1 % (мас./об.) BSA в PBS) и 0,1% коллагеназой типа I.
ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда готовьте раствор гомогенизатора свежим. Шейкер имеет круговое встряхивающее движение на медленной скорости 25-500 об/мин.
- Переложите мелкие фрагменты/кашицу в центрифужную трубку объемом 50 мл и инкубируйте ее с 5 мл раствора гомогенизатора в течение 30 мин при 37 °C на шейкере. Раствор гомогенизатора представляет собой PBS с 1% бычьим сывороточным альбумином (BSA) (стоковый раствор: 1 % (мас./об.) BSA в PBS) и 0,1% коллагеназой типа I.
- Чтобы остановить инкубацию, добавьте 10 мл питательной среды [Dulbecco's Modified Eagle's Medium - низкий уровень глюкозы (DMEM-LG), 2,5% раствор натриевой соли HEPES (1 М), 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% L-глутамина (200 мМ), 1% пенициллина-стрептомицина (10000 Ед/мл пенициллина; 10 000 мкг/мл стрептомицина) и 1% амфотерицина B (250 мкг/мл)].
ПРИМЕЧАНИЕ: Питательные среды могут быть подготовлены заранее. Антибиотики и противогрибковые препараты необходимы при приготовлении питательных сред для клеточной культуры для защиты клеток от загрязнений. - Инкубировать трубки центрифуги в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Аспирировать фракцию с адипоцитами, которая легче и поэтому плавает поверх жидкости, пипеткой 10 мл и выбросить ее.
- Фильтруйте оставшуюся стромальную фракцию через клеточное сито 100 мкм с полиэтилентерефталатной (ПЭТ) мембраной, свободной от тяжелых металлов, чтобы удерживать фрагменты жировой ткани и извлекать только клеточную суспензию.
- Центрифугируйте фильтрованную клеточную суспензию в течение 7 мин при 630 х г при комнатной температуре.
- Повторно суспендируйте ячейку гранулы в 2 мл PBS, чтобы промыть клетки один раз.
- Центрифугируйте клеточную суспензию снова в течение 7 мин при 630 х г при комнатной температуре.
- После центрифугирования и повторной суспензии клеточной гранулы в 10 мл питательной среды на колбу, семенные клетки в 75см2 колбы для культивирования клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от размера ячейки гранулы после стадии промывки PBS, семенные ячейки в одной-четырех колбах.
2. Культивирование стромальных клеток жировой ткани свиней
- Сбор и прохождение клеток, когда они достигают 70% слияния.
- Промыть ячейки 10 мл PBS дважды и аспирировать PBS полностью.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходим для удаления оставшихся питательных сред, которые дополняются 10% FBS. FBS имеет несколько ингибиторов протеазы, которые могут препятствовать функции последующей трипсинизации. - Добавьте 3 мл 0,05%-трипсина-ЭДТА на колбу для отделения клеток.
- Инкубировать колбы в течение 3 мин при 37 °C.
- Проверьте под микроскопом, если клетки отсоединены.
ПРИМЕЧАНИЕ: Иногда требуется еще некоторое время, чтобы отсоединить ячейки. В этом случае инкубировать колбы в течение максимум 5 мин при 37 °C. - Чтобы остановить процесс инкубации и отсоединения, добавьте 3 мл питательных сред.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как отмечалось выше, среда роста дополняется 10% FBS, который содержит ингибиторы протеазы. - Переложите отсоединенные ячейки в центрифугированную трубку и центрифугу в течение 7 мин при 630 х г при комнатной температуре.
- Повторно суспендируют клетки в 10 мл питательных сред и подсчитывают их гемоцитометром.
- Семенные клетки с плотностью инокуляции 3 х 105 клеток на колбу 75см2 .
3. Маркировка клеток кальцеином-АМ
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки, вводимые в трупные ткани, окрашиваются зелено-флуоресцентным мембранопроницаемым живым клеточным пятном и красно-флуоресцентным индикатором непроницаемой мембраны, чтобы убедиться, что извлеченные клетки совпадают с введенными клетками, а не фрагментами тканей уретры.
- Дважды промывайте ячейки 10 мл PBS.
- Добавьте 5 мл раствора красителя на 75см2 колбы. Раствор красителя состоит из питательной среды с 2 мкМ зелено-флуоресцентного мембранопроницаемого красителя живых клеток и 4 мкМ красно-флуоресцентного мембранно-непроницаемого показателя жизнеспособности.
- Инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре в темное время суток.
- Аспирировать и выбросить раствор красителя.
- Дважды промыть клетки 10 мл PBS.
- Добавьте питательные среды и задокументируйте зеленый и красный флуоресцентный сигнал с помощью флуоресцентной микроскопии.
- Поместите колбу размером 75см2 на стол микроскопа, используйте объектив 10x, выберите отсутствие флуоресцентного фильтра и убедитесь, что проходящий световой путь активен.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все эти шаги выполняются вручную на микроскопе. - Параллельно с шагом 3.6.1 откройте программное обеспечение.
- Нажмите кнопку Live на вкладке Locate , чтобы получить живое изображение ячеек в колбе на столе и сфокусироваться на них с помощью грубых и тонких регулировочных дисков.
ПРИМЕЧАНИЕ: На правом прицеле живое изображение появится после активации кнопки Live . - В подвкладке Компоненты микроскопа выберите правильный объектив (10x).
- На подвкладке Камера установите флажок Автоматическая экспозиция.
- Нажмите кнопку Snap , чтобы сделать первый снимок с проходящим светом.
- Вставьте шкалу масштабирования, используя вкладку Графика в строке меню и выбрав Масштабная шкала.
- Сохраните изображение, используя вкладку Файлы в строке меню и выбрав Сохранить как czi.
- Для флуоресцентных снимков измените фильтр на фильтр, специфичный для зеленой или красной флуоресценции, и выберите траекторию отраженного света.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти изменения должны быть сделаны вручную на микроскопе. - Нажмите еще раз кнопку Live на вкладке Locate , чтобы получить динамическое изображение ячеек.
- Нажмите кнопку Snap , чтобы сделать второй снимок с зеленой или красной флуоресценцией.
- Вставьте шкалу масштабирования, используя вкладку Графика в строке меню и выбрав Масштабная шкала.
- Сохраните изображение, используя вкладку Файлы в строке меню и выбрав Сохранить как czi.
- Повторите шаги 3.6.9-3.6.13 с другим флуоресцентным каналом.
- Поместите колбу размером 75см2 на стол микроскопа, используйте объектив 10x, выберите отсутствие флуоресцентного фильтра и убедитесь, что проходящий световой путь активен.
4. Подготовьте образцы ткани уретры к инъекциям
- Рассекните уретру и соединительный мочевой пузырь из свиньи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспериментов использовались образцы ткани уретры из свежих трупных образцов взрослых самок свиней ландраса. - Транспортируйте его в лабораторию в мешках на мокром льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы следует оставить на льду до дальнейшей обработки. Никаких добавок в образцы не добавлялось. - Поместите уретру с мочевым пузырем на губку, которая имитирует эластичность нижнего тазового дна.
- Используйте мочевой пузырь для определения ориентации (проксимальной, дистальной, дорсальной и вентральной) уретры. Это возможно благодаря локализации мочеточников и трех связок, которые фиксируют мочевой пузырь в брюшной и тазовой полости. Три связки представляют собой две связки vesicae lateralia по бокам мочевого пузыря и vesicae medianum, которая возникает из вентральной поверхности мочевого пузыря (рисунок 1).
- Разрежьте уретру продольно с дорсальной стороны с помощью катетера.
- Введите клетки в открытую уретру, как описано в следующих главах.
5. Инъекции клеток с помощью иглы Уильямса в жидкости и образцы тканей
- Соберите клетки, как описано в шаге 2.
- В отличие от шага 2.9, отрегулируйте плотность клеток для инъекций до 2,4 х 106 клеток на мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для инъекций в образцы тканей маркируют клетки зелено-флуоресцентной мембранопроницаемой живой клеткой. - Аспирируйте клеточную суспензию шприцем и нанесите на нее цистоскопическую инъекционную иглу Уильямса (WN).
- Либо держите иглу вскоре над 2 мл питательной среды в центрифугирующей трубке объемом 15 мл, либо вставьте иглу в открытую ткань уретры. В обоих случаях вводят 250 мкл клеток вручную.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки, вводимые в трупную уретру, образуют инъекционный купол. - Собирают клетки, вводимые в среду непосредственно путем центрифугирования в течение 7 мин при 630 х г при комнатной температуре.
- Для клеток, введенных в трупную уретру, аспирируйте их из купола инъекции иглой 18G, нанесенной на шприц.
- Перекладывают введенные и аспирированные клетки в центрифугированную трубку и центрифугу в течение 7 мин при 630 х г при комнатной температуре по сравнению с клетками, вводимыми в среду.
- После центрифугирования повторно суспендируют клетки в 4 мл ростовых сред в обоих случаях.
- Определение выхода и жизнеспособности клеток с помощью исключения красителя трипан синего с помощью гемоцитометра.
- Тщательно смешайте 20 мкл клеточной суспензии с 20 мкл трипана синего.
- Заполните 10 мкл этой смеси в каждой камере гемоцитометра.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обе камеры заполняются и подсчитываются для получения статистической оптимизации путем удвоения выборки. - Под микроскопом подсчитайте клетки во всех четырех угловых квадратах.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подсчитайте клетки, сияющие белым цветом (неокрашенными), как жизнеспособные клетки, тогда как клетки, сияющие синим цветом (окрашенные), считаются мертвыми клетками. - Чтобы вычислить число ячеек на мл, вычислите среднее из двух камер, разделите это число на два и умножьте его на 104.
6. Инъекции клеток с помощью Waterjet в жидкости и образцы тканей
- Соберите клетки, как описано в шаге 2.
- В отличие от шагов 2.9 и 5.2, отрегулируйте плотность клеток для инъекций до 6 х 106 клеток на мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для инъекций в образцы тканей используют клетки, помеченные зелено-флуоресцентной мембранопроницаемой живой клеткой. - Заполните клеточную суспензию в дозирующий блок устройства WJ.
- Либо держите инъекционную насадку вблизи 2 мл питательной среды в центрифугированной трубке объемом 15 мл или вскоре над открытой тканью уретры.
- В обоих случаях вводят 100 мкл клеток устройством с использованием высокого давления для проникновения в ткани с последующей фазой низкого давления для инъекций клеток. Используйте настройки давления Е60-10.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки, вводимые в трупную уретру, образуют инъекционный купол. - Собирают клетки, вводимые в среду непосредственно путем центрифугирования в течение 7 мин при 630 х г при комнатной температуре.
- Для клеток, введенных в трупную уретру, аспирируйте их из купола инъекции иглой 18G, нанесенной на шприц.
- Перекладывают введенные и аспирированные клетки в центрифугированную трубку и центрифугу в течение 7 мин при 630 х г при комнатной температуре по сравнению с клетками, вводимыми в среду.
- После центрифугирования повторно суспендируют клетки в 4 мл питательной среды в обоих случаях.
- Определение выхода и жизнеспособности клеток с помощью исключения красителя трипанового синего с помощью гемоцитометра, как подробно описано в 5.10.
7. Биомеханическая оценка клеточной эластичности методом атомно-силовой микроскопии (АСМ)
- Подготовка образцов
ПРИМЕЧАНИЕ: Восстановленные клетки после инъекции теперь подлежат дальнейшему анализу AFM. Кроме того, клетки, которые не были введены, используются в качестве контроля.- Семена клеток в тканевой культуре посуды плотностью 5 х 105 клеток на блюдо.
ПРИМЕЧАНИЕ: Посейте по одному блюду для культивирования тканей в каждом состоянии. Условиями являются контроль, ADSC, вводимые WJ или WN в среду, и ADSC, вводимые WJ или WN в трупную ткань. - Инкубировать клетки в чашках для культивирования тканей в течение 3 ч при 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать дисперсий из-за клеток в фазе G1 и во время митоза, мы выполнили измерения AFM через 3 ч после стадии посева клеток. - Непосредственно перед измерением с помощью AFM замените среду роста 3 мл среды L-15 Лейбовица без L-глутамина.
- Поместите чашку для культивирования тканей в держатель для образцов устройства AFM и включите нагреватель чашки Петри при температуре 37 °C.
- Семена клеток в тканевой культуре посуды плотностью 5 х 105 клеток на блюдо.
- Подготовка АСМ и консольной калибровки
- Используйте стеклянный блок, предназначенный для измерений в жидкостях, и отрегулируйте его на держателе AFM.
ПРИМЕЧАНИЕ: Верхняя поверхность стеклоблока должна быть прямой и параллельно держателю AFM. - Аккуратно поместите консоль на поверхность стеклоблока. Наконечник А должен лежать над полированной оптической плоскостью.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не царапайте полированную оптическую поверхность стеклоблока, так как царапины могут привести к помехам в измерениях. Наконечник А должен выступать над полированной оптической плоскостью, поскольку в противном случае отражение лазера АСМ к фотоприемнику невозможно. - Чтобы стабилизировать консоль на стеклоблоке, добавьте металлическую пружину с помощью пинцета.
- Когда консоль закреплена на стеклоблоке, поместите блок на головку AFM и заблокируйте встроенный запирающий механизм.
- Установите головку AFM на устройство AFM.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пружина должна быть обращена в левую сторону, чтобы быть правильно размещенной. Если это не так, исправьте положение стеклянного блока и снова отрегулируйте головку AFM. - Инициализируйте настройку программного обеспечения и откройте программное обеспечение вместе с окном лазерного выравнивания и настройками параметров подхода. Дополнительно включите шаговый двигатель, лазерный свет и ПЗС-камеру.
- Определите консольный наконечник А с помощью ПЗС-камеры.
- Опустите консоль до тех пор, пока она полностью не будет погружена в среду. Используйте функцию шагового двигателя для достижения этой цели.
- Как только консоль полностью покрыта средой, лазер выравнивается поверх консольного кантилевера с помощью регулировочных винтов. Отраженный луч должен упасть на центр фотоприемника, а сумма сигналов должна составлять 1 В или выше. Боковые и вертикальные прогибы должны быть близки к 0.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если центр достигнут, можно контролировать в функции лазерного выравнивания, а также значения сигнала. Если значения сигнала неверны, необходимы дальнейшие корректировки. - Запустите сейчас сканер Approach с параметрами подхода (таблица 1).
- Втяните консоль на 100 мкм, как только она достигнет дна, нажав кнопку Втянуть .
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что ни одна ячейка не прикреплена к этому полю, если подход выполнен, потому что это сфальсифицирует калибровку. - Настройте параметры Run в соответствии со следующими спецификациями: Заданное значение 1 В, Длина вытягивания 90 мкм, Скорость: 5 мкм/с, Частота дискретизации: 2000 Гц и в режиме задержки: Постоянная сила.
- Запустите измерение калибровочной кривой силы-расстояния, нажав кнопку Run.
ПРИМЕЧАНИЕ: При нажатии кнопки «Выполнить» в программном обеспечении получается кривая силы-расстояния. - Выберите область линейной подгонки втягивающейся кривой в программном обеспечении на полученной калибровочной кривой сила-расстояние. Рассчитайте измерение постоянной пружины с помощью программного обеспечения.
- Калибруйте консоль, следуя точным параметрам и шагам, описанным Danalache et al.17.
- Используйте стеклянный блок, предназначенный для измерений в жидкостях, и отрегулируйте его на держателе AFM.
- Измерение эластичности отдельных клеток
- Визуально определите клетку и сосредоточьтесь на ней. Поместите компьютерную мышь в середину ячейки. Чтобы повысить точность измерений, расположите наконечник AFM непосредственно над ядром клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Компьютерная мышь используется в качестве визуального маркера для идентификации целевого сайта отступа. - Теперь сосредоточьтесь на консольном устройстве и переместите его на компьютерную мышь.
- Начните измерение с Run с параметрами, приведенными в таблице 2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используются параметр заданного значения, полученный при калибровке консольного аппарата. Кроме того, одна клетка измеряется три раза. Измерьте не менее 50 клеток.
- Визуально определите клетку и сосредоточьтесь на ней. Поместите компьютерную мышь в середину ячейки. Чтобы повысить точность измерений, расположите наконечник AFM непосредственно над ядром клетки.
- Обработка данных
- Обрабатывайте данные, следуя точным шагам и параметрам, как описано ранее в Danalache17.
- Сохраните и экспортируйте файл.
8. Статистический анализ
- Откройте статистическое программное обеспечение.
- Выберите выбрать Новый набор данных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Открываются два файла. Одним из них является "DataSet", а другим - файл "Output". - Выберите файл DataSet и откройте вкладку Представление переменных .
- Вставьте числовые переменные для инъекции в месте (захват жидкости или трупной ткани), категории (контроль, инъекция WJ, инъекция WN) и эластичности.
- Вставьте измеренные данные об эластичности с соответствующей инъекцией сайта и номером категории на вкладке Представление данных .
- Проанализируйте данные, выбрав вкладку в строке меню Анализ | Описательная статистика и выберите Исследовательский анализ данных.
- В качестве зависимой переменной выберите Эластичность , а в списке факторов выберите Категория.
ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты отображаются в файле "Output", включая график поля, который используется для раздела результатов. - Чтобы выполнить статистический тест, выберите Независимые выборки в непараметрическом тесте на вкладке в строке меню Анализ.
- В новом открытом файле сохраните настройки на вкладке Цель и Настройки.
- Откройте вкладку Поля и выберите Эластичность в качестве тестовых полей и Категория в качестве групп.
- Нажмите кнопку Выполнить.
ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты отображаются в файле "Output". Для этих анализов проводится тест Манна-У-Уитни. - Включите результат непараметрического теста в прямоугольный график анализа исследовательских данных.
- Сохраните файлы, выбрав Файл в строке меню и выбрав Сохранить.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После доставки клеток с помощью двух подходов жизнеспособность клеток, доставленных через WN (97,2 ± 2%, n = 10, p<0,002), была выше по сравнению с инъекциями WJ с использованием настроек E60-10 (85,9 ± 0,16%, n = 12) (рисунок 2). Результаты биомеханической оценки показали, что: инъекции ВН клеткам в улавливающей жидкости не показали существенных различий в отношении модулей упругости (ЭМ; 0,992 кПа) по сравнению с контрольной группой (1,176 кПа; Рисунок 3A), в то время как инъекции WJ вызывали значительное снижение клеточной ЭМ (0,440 кПа, p<0,001, рисунок 3B). Отмечено снижение на 40 - 50% ЭМ после инъекций WJ. Несмотря на то, что инъекции WN в трупную ткань уретры не дали существенной разницы в клеточном ЭМ (рисунок 4A), значительное снижение ЭМ было отмечено после инъекций WJ в образцы тканей (от 0,890 кПа до 0,429 кПа; p<0,00, рисунок 4B). Таким образом, абсолютные значения ЭМ после инъекции WJ были тем самым снижены на 51%. В совокупности результаты показывают, что, хотя доставка WJ-клеток удовлетворяет абсолютному требованию для клинической реализации, где более 80% жизнеспособных клеток после доставки18 , после доставки WJ влияют модули упругости клеток. Более низкий клеточный ЭМ может облегчить миграцию особенностей клеток после доставки WJ. При таком более широком распределении и диапазоне регенеративных мощностей в желаемом регионе19.
Рисунок 1. Анатомия мочевого пузыря и уретры свиней и мест инъекций. А) Показана вентральная сторона свиного пузыря и уретры с тремя связками, фиксирующими мочевой пузырь в брюшной и тазовой полости. Дополнительно показаны мочеточники, которые заканчиваются на спинной стороне мочевого пузыря. Б) Репрезентативное изображение трупной уретры, используемой для инъекций WJ и WN. Продольно показана спинная открытая уретра с инъекционными куполами, обведенными черным цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2. Инъекции для определения клеточной жизнеспособности с помощью WN и WJ. pADSC, вводимые через WN или WJ, собирали после инъекции и подсчитывали с помощью исключения Трипана для определения жизнеспособности. Клеточная жизнеспособность была значительно снижена после инъекции WJ по сравнению с клетками, доставляемыми через WN. С<0.001. Данные графически отображаются как среднее значение со стандартным отклонением. Сокращения: WJ - водяная струя, WN - игла Уильямса. Рисунок адаптирован из Danalache et al. 202119. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3. Сравнение количественных модулей Юнга WN соответственно WJ доставило ячейки в среду захвата и соответствующие им контрольные элементы. Заметной разницы в ЭМ не наблюдалось в бокс-графиках для контрольных (необработанных) монослоев клеток и клеток, доставляемых ВН (А). Напротив, значительное снижение эластичности может быть отмечено между бокс-графиками контрольных клеток и группой WJ (B). ns - незначимые, p > 0,05, ***p<0,001. Сокращения: WJ - водяная струя, WN - игла Уильямса. Рисунок адаптирован из Danalache et al. 202119. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4. Сравнение количественных модулей Юнга WN соответственно WJ доставило клетки в трупную уретру и соответствующие им контрольные элементы. Не наблюдалось заметной разницы между клетками, доставленными через клетки WN, и их соответствующими контрольными группами (A). Отмечено значительное снижение эластичности между доставленными WJ клетками и монослоем контрольной ячейки (B). ns - незначимые, p > 0,05, ***p<0,001. Сокращения: WJ - водяная струя, WN - игла Уильямса. Рисунок адаптирован из Danalache et al. 202119. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Параметр подхода | Ценность |
| Подход iGain | 3,0 Гц |
| Подход к PGain | 0.0002 |
| Приблизиться к целевой высоте | 10.0 мкм |
| Заданное значение подхода | 3,00 В |
| Исходные условия подхода | 0,00 В |
Таблица 1. Параметры подхода.
| Параметр запуска | Ценность |
| Заданное значение | 10 нН |
| Z Движение / Увеличение скорости | Постоянная скорость/ |
| 5.0 мкм/с | |
| Время контакта | 0.0 с |
| Длина тяги | 90 мкм |
| Режим задержки | Постоянная сила |
| Частота дискретизации | 2000 Гц |
Таблица 2. Параметры запуска.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В настоящем исследовании мы продемонстрировали и представили пошаговый подход к процедуре доставки WJ-клеток и использовали продолжение количественных исследований для оценки влияния доставки WJ на клеточные характеристики: жизнеспособность клеток и биомеханические особенности (т.е. ЭМ). После инъекции WJ 85,9% собранных клеток были жизнеспособными. С точки зрения инъекции WN, 97,2% клеток сохранили свою жизнеспособность после инъекции. Таким образом, подход WJ удовлетворяет абсолютному требованию для клинической реализации: более 80% жизнеспособных клеток после родов18. В то время как стандартизированный и воспроизводимый протокол достигается с помощью подхода WJ, результат доставки инъекции иглы сильно зависит от размера и сопла шприца и иглы, давления, скорости потока и врача, выполняющего саму инъекцию19.
Исследования, использующие доставку WJ-клеток на живых животных моделях, показали, что путем изменения давления выброса глубина проникновения может быть адаптирована к целевой ткани и, как таковая, к желаемому клиническому применению13,16. Трансуретральные клеточные инъекции живым животным, находящимся под визуальным контролем, сообщали о неправильном размещении или потере клеток примерно у 50% животных, получавшихлечение 20, в то время как инъекции WJ сообщали о точных показателях инъекций клеток выше 90% (Linzenbold et al.16 и неопубликованные наблюдения). Нынешний золотой стандарт доставки клеток (инъекции иглы) требует проникновения канюли в целевую ткань. Таким образом, трансляция игольчатых клеток вызывает травму и травму во всех случаях. В уретре это может фактически вызвать воспаление и токсикацию из-за микробов и токсинов, обнаруженных даже в здоровой моче. Кроме того, время работы пользователя при инъекции WJ значительно короче по сравнению с инъекцией иглы: клетки помещаются в течение миллисекунд в предполагаемый слой ткани путем предварительной установки уровней давления. Напротив, глубина проникновения при инъекции иглы в отдаленные районы с помощью эндоскопии зависит от навыков и опыта хирурга. Ожидается, что воспроизводимость инъекций WJ также будет лучше, но в настоящее время существует только доклинические данные 15,16,20 и исследовано менее 200 животных. В нашем недавнем исследовании мы отметили, что клеточная эластичность снижается при применении WJ по сравнению с инъекциями иглы21. Это можно объяснить напряжением сдвига ячеек с более высокой скоростью во время доставки WJ. Кроме того, возможная потеря клеток может быть компенсирована более высокой точностью размещения и выброса клеток в интересующей области, как это достигается с помощью WJ, управляемой доставкой с помощью визуальной цистоскопии22.
Хорошо известно, что механические силы управляют поведением стволовых клеток, потенциалом регенерации, а также их последующей жизнеспособностью и функциональностью после трансплантации 10,23. Появление атомного AFM обеспечило мощный инструмент для количественной оценки механических свойств одиночных живых клеток в наномасштабном разрешении в водных условиях 24,25,26,27. AFM является надежным и высокочувствительным методом, который может обнаруживать и регистрировать жесткость в диапазоне от менее 100 Па до 106 Па, тем самым охватывая широкий диапазон для большинства тканей и клеток28. Фактически, клеточная механика становится биомаркером без меток для оценки состояния клетки, и как в физиологическом, так и в патологическом состоянии29 и эластичность клеток является синергетическим и кумулятивным ответом ядра - перекрестных помех цитоскелета. Хорошо известно, что когда клетка подвергается воздействию внешних сил, эти силы передаются от плазматической мембраны через цитоскелет к ядру, что приводит к внутриядерным деформациям и реорганизации 30,31,32. Поэтому ядро, долгое время рассматриваемое как геномный материал и транскрипционный аппарат, является ключевым игроком в клеточной механотрансдукции, а также32. На самом деле значение ядерной механики и нуклео-цитоскелетных связей, во всех клеточных функциях и мутациях, в ламинах и линкерах комплекса нуклеоскелета с комплексом цитоскелета (ЛИНК) - лежат в основе возникновения ряда патологий 33,34. Эти силы также могут указывать на клеточные артефакты. В частности, внешние генерируемые силы фактически распространяются вдоль цитоскелетных нитей и далее передаются в ядерную пластинку через комплекс ЛИНК; в ответ на эти силы ядро, по сути, становится жестче 35,36, сливая таким образом два тесно переплетенных и связанных процесса. Это также является обоснованием нашего подхода и наших измерений ядерной механики. Кроме того, точное размещение консольного аппарата поверх ядерной поверхности также обеспечивает высокую степень воспроизводимости и уменьшает вариации из-за неоднородности клеток и прикрепления к субстрату.
Несмотря на то, что эластичность клеток появляется как биомаркер без меток для оценки состояния клетки и как в физиологическом, так и в патологическом состояниях29, измеренные модули упругости отмечены большими вариациями даже в одном и том же типе клеток37. Метод противодействия таким вариациям, предложенный Schillers et al., заключается в реализации стандартизированных наномеханических процедур AFM (SNAP), которые обеспечивают высокую воспроизводимость и применимость измерений упругости в качестве надежного количественного маркера к клеткам в различных состояниях38. Кроме того, несмотря на то, что экспериментальные параметры, используемые в анализах AFM, такие как скорость отступа, форма и размер индентора, а также точное представление геометрии наконечника в модели 39, влияют на абсолютные измеренные значения40,41, эти параметры не должны влиять на результаты в рамках одного исследования или измеренную тенденцию.
Однако имейте в виду, что углубления ОВМ ограничены анализом внешней поверхности клеток и, таким образом, не способны сканировать внутреннюю часть клеточной мембраны или конкретные внутриклеточные структуры. Usukura et al. предложили метод «снятия крыши», который разрывает клеточную мембрану и удаляет цитоплазматически-растворимые компоненты42, что позволяет проводить AFM-внутриклеточные исследования. Однако в нашем исследовании основное внимание уделялось оценке средних модулей упругости, а не зондированию отдельных и селективных внутриклеточных компонентов.
В совокупности согласованность и надежность полученных данных ОВМ в значительной степени зависят от технического опыта соответствующего оператора и могут быть смещены биологической изменчивостью38. Учитывая все чувствительные переменные, которые могут повлиять на фактические результаты AFM, абсолютные упругие значения, представленные в этом исследовании, не могут быть обобщены и довольно специфичны для нашей экспериментальной установки.
В целом, наше исследование предоставляет доказательства21 , а также пошаговый протокол для превосходства инъекций WJ над инъекциями игл для регенеративной клеточной терапии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам J.K., M.D, T.A., A.S., W.K.A. нечего раскрывать. Авторы W.L. и M.D.E. являются сотрудниками ERBE Medizintechnik Lt. Tübingen, производителя ERBEJet2 и прототипа WJ, используемого в этом исследовании.
Acknowledgments
Мы благодарим наших соавторов из оригинальных публикаций за помощь и поддержку.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL centrifuge tube | Greiner BioOne | 227261 | |
| 1 mL BD Luer-LokTM Syringe | BD Plastik Inc | n.a. | |
| 100 µm cell sieve | Greiner BioOne | 542000 | |
| 15 mL centrifuge tube | Greiner BioOne | 188271 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Corning Incorporated | 353136 | |
| AFM head | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
| AFM processing software | Bruker | JPK00518 | |
| AFM software | Bruker | JPK00518 | |
| AFM system Cell Hesion 200 | Bruker | JPK00518 | |
| All-In-One-Al cantilever | Budget Sensors | AIO-10 | tip A, Conatct Mode, Shape: Beam Force Constant: 0.2 N/m (0.04 - 0.7 N/m) Resonance Frequency: 15 kHz (10 - 20 kHz) Length: 500 µm (490 - 510 µm) Width: 30 µm (35 - 45 µm) Thickness: 2.7 µm (1.7 - 3.7 µm) |
| Amphotericin B solution | Sigma | A2942 | 250 µg/ml |
| Atomic Force Microscope (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| BD Microlance 3 18G | BD | 304622 | |
| bovine serum albumin | Gibco | A10008-01 | |
| Cantilever | All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | tip A, k ¼ 0.2 N/m |
| C-chip disposable hemocytometer | NanoEnTek | 631-1098 | |
| centrifuge: Rotina 420R | Hettich Zentrifugen | ||
| Collagenase, Type I, powder | Gibco | 17100-017 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - low glucose | Sigma | D5546 | |
| Feather disposable scalpel (No. 10) | Feather | 02.001.30.010 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
| HEPES sodium salt solution (1 M) | Sigma | H3662 | |
| Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| laboratory bags | Brand | 759705 | |
| Leibovitz's L-15 medium without l-glutamine | Merck | F1315 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
| L-glutamine | Lonza | BE 17-605C1 | 200 mM |
| LIVE/DEADTM Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | L3224 | Calcein AM and EthD-1 are used from this kit. |
| Microscope software: Zen 2.6 | Zeiss | ||
| Microscope: AxioVertA.1 | Zeiss | ||
| Nelaton-Catheter female | Bicakcilar | 19512051 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 10000 U/ml Penicillin 10000 µg/ml Streptomycin |
| Petri dish heater associated with AFM | Bruker | T-05-0117 | |
| Petri dish heater associated with AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-015 | |
| Statistical Software: SPSS Statistics 22 | IBM | ||
| Sterile Petri dish - CellStar | Greiner BioOne | 664160 | |
| Tissue culture dishes | TPP AG | TPP93040 | |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Trypan Blue 0.4% 0.85% NaCl |
Lonza | 17-942E | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | |
| Waterjet: ERBEJET2 device | Erbe Elektromedizin GmbH | ||
| Williams Cystoscopic Injection Needle | Cook Medical | G14220 | 23G, 5.0 Fr, 35 cm |
References
- Milsom, I., et al. Global prevalence and economic burden of urgency urinary incontinence: a systematic review. European Urology. 65 (1), 79-95 (2014).
- Lee, J. Y., et al. The effects of periurethral muscle-derived stem cell injection on leak point pressure in a rat model of stress urinary incontinence. International Urogynecology Journal and Pelvic Floor Dysfunction. 14 (1), 31-37 (2003).
- Tran, C., Damaser, M. S. The potential role of stem cells in the treatment of urinary incontinence. Therapeutic Advances in Urology. 7 (1), 22-40 (2015).
- Fu, Q., Song, X. F., Liao, G. L., Deng, C. L., Cui, L. Myoblasts differentiated from adipose-derived stem cells to treat stress urinary incontinence. Urology. 75 (3), 718-723 (2010).
- Corcos, J., et al. marrow mesenchymal stromal cell therapy for external urethral sphincter restoration in a rat model of stress urinary incontinence. Neurourology and Urodynamics. 30 (3), 447-455 (2011).
- Smaldone, M. C., Chen, M. L., Chancellor, M. B. Stem cell therapy for urethral sphincter regeneration. Minerva Urologica e Nefrologica. 61 (1), 27-40 (2009).
- Perin, E. C., López, J. Methods of stem cell delivery in cardiac diseases. Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine. 3, Suppl 1 110-113 (2006).
- Zhang, M., et al. Cardiomyocyte grafting for cardiac repair: graft cell death and anti-death strategies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (5), 907-921 (2001).
- Amer, M. H., White, L. J., Shakesheff, K. M. The effect of injection using narrow-bore needles on mammalian cells: administration and formulation considerations for cell therapies. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (5), 640-650 (2015).
- Amer, M. H., Rose, F. R. A. J., Shakesheff, K. M., Modo, M., White, L. J. Translational considerations in injectable cell-based therapeutics for neurological applications: concepts, progress and challenges. NPJ Regenerative Medicine. 2, 23-23 (2017).
- Linzenbold, W., Fech, A., Hofmann, M., Aicher, W. K., Enderle, M. D. Novel Techniques to Improve Precise Cell Injection. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6367 (2021).
- Adamo, A., Roushdy, O., Dokov, R., Sharei, A., Jensen, K. F. Microfluidic jet injection for delivering macromolecules into cells. Journal of Micromechanics and Microengineering: Structures, Devices, and Systems. 23, 035026 (2013).
- Jäger, L., et al. A novel waterjet technology for transurethral cystoscopic injection of viable cells in the urethral sphincter complex. Neurourology and Urodynamics. 39 (2), 594-602 (2020).
- Weber, M., et al. Hydrojet-based delivery of footprint-free iPSC-derived cardiomyocytes into porcine myocardium. Scientific Reports. 10 (1), 16787 (2020).
- Jäger, L., et al. A novel waterjet technology for transurethral cystoscopic injection of viable cells in the urethral sphincter complex. Neurourology and Urodynamics. 39 (2), 594-602 (2020).
- Linzenbold, W., et al. Rapid and precise delivery of cells in the urethral sphincter complex by a novel needle-free waterjet technology. BJU International. 127 (4), 463-472 (2021).
- Danalache, M., Tiwari, A., Sigwart, V., Hofmann, U. K. Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis. Journal of Visualized Experiments. (159), e61041 (2020).
- Gálvez-Martín, P., Hmadcha, A., Soria, B., Calpena-Campmany, A. C., Clares-Naveros, B. Study of the stability of packaging and storage conditions of human mesenchymal stem cell for intra-arterial clinical application in patient with critical limb ischemia. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 86 (3), 459-468 (2014).
- Danalache, M., et al. Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stromal Cells by a Novel Waterjet Technology. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), (2021).
- Amend, B., et al. Precise injection of human mesenchymal stromal cells in the urethral sphincter complex of Göttingen minipigs without unspecific bulking effects. Neurourology and Urodynamics. 36 (7), 1723-1733 (2017).
- Danalache, M., et al. Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stromal Cells by a Novel Waterjet Technology. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), 3958 (2021).
- Strasser, H., et al. 328: Transurethral Ultrasound Guided Stem Cell Therapy of Urinary Incontinence. Journal of Urology. 175 (4), 107 (2006).
- Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 18 (12), 728-742 (2017).
- Ding, Y., Xu, G. -K., Wang, G. -F. On the determination of elastic moduli of cells by AFM based indentation. Scientific Reports. 7 (1), 45575 (2017).
- Charras, G. T., Horton, M. A. Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation. Biophysical Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).
- Carl, P., Schillers, H. Elasticity measurement of living cells with an atomic force microscope: data acquisition and processing. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 457 (2), 551-559 (2008).
- Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. Journal of Biomechanics. 41 (2), 454-464 (2008).
- Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the mechanical properties of living cells using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (76), e50497 (2013).
- Li, M., Dang, D., Liu, L., Xi, N., Wang, Y. Atomic Force Microscopy in Characterizing Cell Mechanics for Biomedical Applications: A Review. IEEE Trans Nanobioscience. 16 (6), 523-540 (2017).
- Morimoto, A., et al. A conserved KASH domain protein associates with telomeres, SUN1, and dynactin during mammalian meiosis. The Journal of Cell Biology. 198 (2), 165 (2012).
- Lombardi, M. L., et al. The interaction between nesprins and sun proteins at the nuclear envelope is critical for force transmission between the nucleus and cytoskeleton. Journal of Biological Chemistry. 286 (30), 26743-26753 (2011).
- Isermann, P., Lammerding, J. Nuclear Mechanics and Mechanotransduction in Health and Disease. Current Biology. 23 (24), 1113-1121 (2013).
- Méjat, A. LINC complexes in health and disease. Nucleus. 1 (1), 40-52 (2010).
- Folker, E. S., Östlund, C., Luxton, G. G., Worman, H. J., Gundersen, G. G. Lamin A variants that cause striated muscle disease are defective in anchoring transmembrane actin-associated nuclear lines for nuclear movement. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (1), 131-136 (2011).
- Guilluy, C., et al. Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus. Nature cell biology. 16 (4), 376-381 (2014).
- Fischer, T., Hayn, A., Mierke, C. T. Effect of Nuclear Stiffness on Cell Mechanics and Migration of Human Breast Cancer Cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 393 (2020).
- Kuznetsova, T. G., Starodubtseva, M. N., Yegorenkov, N. I., Chizhik, S. A., Zhdanov, R. I. Atomic force microscopy probing of cell elasticity. Micron. 38 (8), 824-833 (2007).
- Schillers, H., et al. Standardized Nanomechanical Atomic Force Microscopy Procedure (SNAP) for Measuring Soft and Biological Samples. Scientific Reports. 7 (1), 5117 (2017).
- Costa, K. D., Yin, F. C. Analysis of indentation: implications for measuring mechanical properties with atomic force microscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 121 (5), 462-471 (1999).
- Stolz, M., et al. Dynamic elastic modulus of porcine articular cartilage determined at two different levels of tissue organization by indentation-type atomic force microscopy. Biophysical Journal. 86 (5), (2004).
- Park, S., Costa, K. D., Ateshian, G. A., Hong, K. S. Mechanical properties of bovine articular cartilage under microscale indentation loading from atomic force microscopy. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H. 223 (3), 339-347 (2009).
- Usukura, E., Narita, A., Yagi, A., Ito, S., Usukura, J. An Unroofing Method to Observe the Cytoskeleton Directly at Molecular Resolution Using Atomic Force Microscopy. Scientific Reports. 6 (1), 27472 (2016).
