Summary
Presentamos un método de inyección celular a través de la tecnología de chorro de agua sin aguja junto con una secuela de investigaciones posteriores a la entrega en términos de mediciones de viabilidad celular, proliferación y elasticidad.
Abstract
La incontinencia urinaria (IU) es una afección altamente prevalente caracterizada por la deficiencia del músculo del esfínter uretral. Las ramas de la medicina regenerativa, particularmente la terapia celular, son enfoques novedosos para mejorar y restaurar la función del esfínter uretral. A pesar de que la inyección de células funcionales activas se realiza rutinariamente en entornos clínicos con aguja y jeringa, estos enfoques tienen desventajas y limitaciones significativas. En este contexto, la tecnología de chorro de agua sin aguja (WJ) es un método factible e innovador que puede inyectar células viables mediante cistoscopia guiada visualmente en el esfínter uretral. En el presente estudio, utilizamos WJ para administrar células estromales derivadas del tejido adiposo porcino (pADSC) en el tejido uretral cadavérico y posteriormente investigamos el efecto de la entrega de WJ sobre el rendimiento y la viabilidad celular. También evaluamos las características biomecánicas (es decir, la elasticidad) mediante mediciones de microscopía de fuerza atómica (AFM). Demostramos que las pADSC administradas por WJ se redujeron significativamente en su elasticidad celular. La viabilidad fue significativamente menor en comparación con los controles, pero todavía está por encima del 80%.
Introduction
La incontinencia urinaria (IU) es un trastorno generalizado con una prevalencia del 1,8 al 30,5% en las poblaciones europeas1 y se caracteriza principalmente por el mal funcionamiento del esfínter uretral. Desde una perspectiva clínica, el tratamiento quirúrgico a menudo se ofrece a los pacientes cuando las terapias conservadoras o la fisioterapia no abordan y alivian los síntomas emergentes.
La terapia celular para la potencial reparación regenerativa del mal funcionamiento del complejo del esfínter ha ido emergiendo como un enfoque vanguardista para el tratamiento de la patología de la IU 2,3. Sus principales objetivos son reemplazar, reparar y restaurar la funcionalidad biológica del tejido dañado. En modelos animales para IU, el trasplante de células madre ha mostrado resultados prometedores en resultados urodinámicos 2,4,5. Las células madre surgen como candidatas celulares óptimas, ya que tienen la capacidad de someterse a la autorrenovación y la diferenciación multipotente, lo que ayuda a la regeneración del tejido afectado6. A pesar del potencial regenerativo que se avecina, el uso práctico de la terapia celular sigue siendo obstaculizado, ya que la administración mínimamente invasiva de células aún enfrenta varios desafíos relacionados con la precisión de la inyección y la cobertura del objetivo. A pesar de que el enfoque actual utilizado para la administración de células es la inyección a través de un sistema de aguja-jeringa7, generalmente resulta en un déficit general de células viables, con viabilidades reportadas tan bajas como 1% - 31% después del trasplante8. Además, también se ha demostrado que la administración de células a través de la inyección con aguja afecta la colocación, la tasa de retención y la distribución de las células trasplantadas en el tejido objetivo 9,10,11. Un enfoque factible y novedoso que supera la limitación mencionada anteriormente es la entrega de células sin agujas a través de la tecnología de chorro de agua.
La tecnología de chorro de agua (WJ) está emergiendo como un nuevo enfoque que permite la entrega de células de alto rendimiento por cistoscopio bajo control visual en el esfínter uretral12,13. El WJ permite la entrega de células a diferentes presiones (E = efectos en bar) que van desde E5 hasta E8013. En la primera fase, (fase de penetración tisular) se aplica solución isotónica con alta presión (es decir, E60 o E80) para aflojar la matriz extracelular que rodea el tejido objetivo y abrir pequeñas microlacuras de interconexión. En la segunda fase (la fase de inyección), la presión se reduce en milisegundos (es decir, hasta E10) para entregar suavemente las células al tejido objetivo. Después de esta aplicación de dos fases escalonadas, las células no se someten a presión adicional contra el tejido cuando se expulsan, sino que flotan en una corriente de baja presión en un área cavernosa llena de líquido13. En un entorno de modelo ex vivo donde las células madre se inyectaron a través de WJ en el tejido de la uretra cadavérica, las células viables podrían aspirarse y recuperarse posteriormente del tejido y expandirse aún más in vitro13. Aunque un estudio de 2020 realizado por Weber et al. demostró la viabilidad y aplicabilidad de WJ para entregar cardiomiocitos sin huella en el miocardio14, debe tenerse en cuenta que la tecnología WJ aún se encuentra en una etapa de prototipo.
El siguiente protocolo describe cómo preparar y etiquetar las células estromales derivadas del tejido adiposo porcino (pADSC) y cómo administrarlas en el líquido de captura y el tejido cadavérico a través de la tecnología WJ y las agujas de cistoscopia Williams (WN). Después de la inyección celular, se evalúa la vitalidad y elasticidad celular a través de la microscopía de fuerza atómica (AFM). A través de instrucciones paso a paso, el protocolo ofrece un enfoque claro y conciso para adquirir datos confiables. La sección de discusión presenta y describe las principales ventajas, limitaciones y perspectivas futuras de la técnica. La entrega de células WJ, así como los análisis posteriores a la traducción de secuelas informados aquí están reemplazando la inyección de aguja estándar y proporcionan un marco de administración de células sólidas para la curación regenerativa del tejido objetivo. En nuestros estudios recientes proporcionamos evidencia de que WJ administró células con mayor precisión y al menos en viabilidad comparable en comparación con las inyecciones con aguja15,16.
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Protocol
Las muestras de tejido adiposo porcino se obtuvieron del Instituto de Cirugía Experimental de la Universidad de Tuebingen. Todos los procedimientos fueron aprobados por las autoridades locales de bienestar animal bajo el número de experimento animal CU1/16.
1. Aislamiento de células estromales derivadas del tejido adiposo porcino
- Use tejido adiposo porcino entregado desde el Instituto de Cirugía Experimental en un tubo centrífugo de 50 ml al laboratorio.
- Transfiera el tejido a una placa de Petri estéril debajo del banco estéril y pica con dos bisturíes (No. 10) a pequeños fragmentos y papilla.
NOTA: Las tijeras también se pueden usar para obtener pequeños fragmentos. Cuanto más pequeños sean los fragmentos, mejor para la siguiente digestión.- Transfiera los pequeños fragmentos/papilla a un tubo centrífugo de 50 ml e incube con 5 ml de solución homogeneizadora durante 30 min a 37 °C en un agitador. La solución homogeneizadora es PBS con albúmina sérica bovina (BSA) al 1% (solución madre: 1% (p/v) BSA en PBS) y colagenasa tipo I al 0,1%.
NOTA: Siempre prepare la solución homogeneizadora fresca. El agitador tiene un movimiento de agitación circular a una velocidad lenta de 25-500 rpm.
- Transfiera los pequeños fragmentos/papilla a un tubo centrífugo de 50 ml e incube con 5 ml de solución homogeneizadora durante 30 min a 37 °C en un agitador. La solución homogeneizadora es PBS con albúmina sérica bovina (BSA) al 1% (solución madre: 1% (p/v) BSA en PBS) y colagenasa tipo I al 0,1%.
- Para detener la incubación, agregue 10 ml de medios de crecimiento [Dulbecco's Modified Eagle's Medium - low glucose (DMEM-LG), 2.5% HEPES sodium salt solution (1 M), 10% fetal bovine serum (FBS), 1% L-Glutamin (200 mM), 1% Peniciillin-Streptomycin (10000 U/mL Penicillin; 10,000 μg/mL Streptomycin) y 1% Amphotericin B (250 μg/mL)].
NOTA: Los medios de crecimiento se pueden preparar de antemano. Los antibióticos y los medicamentos antimicóticos son necesarios en la preparación de los medios de crecimiento para el cultivo celular para proteger las células de las contaminaciones. - Incubar los tubos de la centrífuga durante 10 min a temperatura ambiente.
- Aspirar la fracción con adipocitos, que es más ligera y por lo tanto nadar sobre el líquido, con una pipeta de 10 ml y desecharla.
- Filtre la fracción estromal restante a través de un tamiz celular de 100 μm con una membrana de tereftalato de polietileno (PET) libre de metales pesados para retener fragmentos de tejido adiposo y recuperar solo la suspensión celular.
- Centrifugar la suspensión de celda filtrada durante 7 min a 630 x g a temperatura ambiente.
- Resuspend el pellet celular en 2 ml de PBS para lavar las células una vez.
- Centrifugar la suspensión celular de nuevo durante 7 min a 630 x g a temperatura ambiente.
- Después de la centrifugación y la resuspensión repetida del pellet celular en 10 ml de medios de crecimiento por matraz, las células de semilla en matraces de cultivo celular de 75 cm2 .
NOTA: Dependiendo del tamaño del pellet celular después de la etapa de lavado con PBS, las células de semilla en uno a cuatro matraces.
2. Cultivo celular de células del estroma derivadas del tejido adiposo porcino
- Células de cosecha y paso cuando alcanzan el 70% de confluencia.
- Lave las células con 10 ml de PBS dos veces y aspire PBS por completo.
NOTA: Este paso es necesario para eliminar los medios de crecimiento restantes, que se complementan con un 10% de FBS. FBS tiene varios inhibidores de la proteasa que pueden dificultar la función de la siguiente tripsinización. - Añadir 3 mL de 0,05%-Tripsina-EDTA por matraz para separar las células.
- Incubar matraces durante 3 min a 37 °C.
- Verifique bajo el microscopio si las células están desprendidas.
NOTA: A veces se necesita algo más de tiempo para separar las celdas. En este caso, incubar matraces durante un máximo de 5 min a 37 °C. - Para detener el proceso de incubación y desprendimiento, agregue 3 ml de medios de crecimiento.
NOTA: Como se señaló anteriormente, los medios de crecimiento se complementan con un 10% de FBS que contiene inhibidores de la proteasa. - Transfiera las células separadas a un tubo de centrifugación y centrífuga durante 7 min a 630 x g a temperatura ambiente.
- Resuspend las células en 10 ml de medios de crecimiento y contarlas con un hemocitómetro.
- Células de semilla con una densidad de inoculación de 3 x 105 células por matraz de 75 cm2 .
3. Etiquetado de células con calceína-AM
NOTA: Las células que se inyectan en los tejidos cadavéricos se tiñen con una tinción de células vivas permeable a la membrana verde fluorescente y un indicador de viabilidad impermeable a la membrana fluorescente roja para verificar que las células extraídas son las mismas que las células inyectadas y no fragmentos de tejido de la uretra.
- Lave las células dos veces con 10 ml de PBS.
- Añadir 5 ml de solución de colorante por cada75 cm 2 matraz. La solución de colorante consiste en medios de crecimiento con 2 μM del colorante de células vivas permeable a la membrana verde-fluorescente y 4 μM de indicador de viabilidad impermeante a la membrana rojo-fluorescente.
- Incubar durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
- Aspire y deseche la solución de tinte.
- Lave las células nuevamente dos veces con 10 ml de PBS.
- Agregue medios de crecimiento y documente la señal de fluorescencia verde y roja mediante microscopía de fluorescencia.
- Coloque el matraz de 75 cm2 sobre la mesa del microscopio, use el objetivo 10x, seleccione ningún filtro de fluorescencia y asegúrese de que la trayectoria de la luz transmitida esté activa.
NOTA: Todos estos pasos se realizan manualmente en el microscopio. - En paralelo al paso 3.6.1, abra el programa de software.
- Presione el botón Live debajo de la pestaña Localizar para obtener una imagen en vivo de las celdas en el matraz de la mesa y concéntrese en ellas con las unidades de ajuste gruesas y finas.
NOTA: A la vista derecha, la imagen en vivo aparecerá una vez que se active el botón Live . - En la subpestaña Componentes del microscopio, seleccione el objetivo correcto (10x).
- En la subpestaña Cámara, aplique una marca de verificación para Exposición automática.
- Pulse el botón Snap para tomar la primera foto con la luz transmitida.
- Inserte la barra de escala mediante la ficha Gráficos de la barra de menús y seleccionando Barra de escala.
- Guarde la imagen utilizando la pestaña Archivos en la barra de menús y seleccionando Guardar como czi.
- Para las imágenes de fluorescencia, cambie el filtro al específico para la fluorescencia verde o roja y seleccione la trayectoria de la luz reflejada.
NOTA: Estos cambios deben hacerse manualmente en el microscopio. - Presione nuevamente el botón Live debajo de la pestaña Localizar para obtener una imagen en vivo de las celdas.
- Presione el botón Snap para tomar la segunda foto con fluorescencia verde o roja.
- Inserte la barra de escala mediante la ficha Gráficos de la barra de menús y seleccionando Barra de escala.
- Guarde la imagen utilizando la pestaña Archivos en la barra de menús y seleccionando Guardar como czi.
- Repita los pasos 3.6.9 a 3.6.13 con el otro canal de fluorescencia.
- Coloque el matraz de 75 cm2 sobre la mesa del microscopio, use el objetivo 10x, seleccione ningún filtro de fluorescencia y asegúrese de que la trayectoria de la luz transmitida esté activa.
4. Preparar muestras de tejido uretral para inyecciones
- Diseccionar la uretra y la vejiga de conexión fuera del cerdo.
NOTA: Para los experimentos se utilizaron muestras de tejido uretral de muestras cadavéricas frescas de cerdos autóctonos hembras adultas. - Transportarlo al laboratorio en bolsas sobre hielo húmedo.
NOTA: Las muestras deben dejarse en hielo hasta su posterior procesamiento. No se agregaron aditivos a las muestras. - Coloque la uretra con la vejiga sobre una esponja, que imita la elasticidad del suelo pélvico inferior.
- Use la vejiga para determinar la orientación (proximal, distal, dorsal y ventral) de la uretra. Esto es posible debido a la localización de los uréteres y los tres ligamentos que fijan la vejiga en la cavidad abdominal y pélvica. Los tres ligamentos son los dos ligamentos vesicae lateralia a los lados de la vejiga y el vesicae medianum, que surge de la superficie ventral de la vejiga (Figura 1).
- Abra la uretra longitudinalmente en el lado dorsal con la ayuda de un catéter.
- Inyecte las células en la uretra abierta como se describe en los siguientes capítulos.
5. Inyecciones de células a través de una aguja Williams en fluidos y muestras de tejido
- Cosechar células como se describe en el paso 2.
- En contraste con el paso 2.9, ajuste la densidad celular para inyecciones a 2.4 x 106 células por ml.
NOTA: Para inyecciones en muestras de tejido, etiquete las células con una célula viva permeable a la membrana verde fluorescente. - Aspire la suspensión celular con una jeringa y aplíquele la aguja de inyección cistoscópica (WN) de Williams.
- Sostenga la aguja poco por encima de los 2 ml de medios de crecimiento en un tubo de centrifugación de 15 ml o inserte la aguja en el tejido de la uretra abierto. En ambos casos inyectar 250 μL de células manualmente.
NOTA: Las células inyectadas en la uretra cadavérica forman una cúpula de inyección. - Recoger las células inyectadas en el medio directamente por centrifugación durante 7 min a 630 x g a temperatura ambiente.
- Para las células inyectadas en la uretra cadavérica, aspire fuera de la cúpula de inyección con una aguja de 18G aplicada en una jeringa.
- Transfiera las células inyectadas y aspiradas a un tubo de centrifugación y centrífuga durante 7 min a 630 x g a temperatura ambiente en comparación con las células inyectadas en el medio.
- Después de la centrifugación, resuspend las células en 4 ml de medios de crecimiento en ambos casos.
- Determine el rendimiento celular y la viabilidad con la ayuda de la exclusión del tinte azul Trypan con un hemocitómetro.
- Mezclar 20 μL de suspensión celular a fondo con 20 μL de azul de tripano.
- Llene 10 μL de esta mezcla en cada cámara del hemocitómetro.
NOTA: Ambas cámaras se llenan y se cuentan para obtener una optimización estadística al duplicar el muestreo. - Bajo un microscopio, cuente las células en los cuatro cuadrados de las esquinas.
NOTA: Cuente las células que brillan en blanco (no teñidas) como células viables, mientras que las células que brillan en azul (teñidas) se cuentan como células muertas. - Para calcular el número de celdas por ml, calcule la media de las dos cámaras, divida este número por dos y multiplíquelo por 104.
6. Inyecciones de células a través de chorro de agua en fluidos y muestras de tejido
- Cosechar células como se describe en el paso 2.
- En contraste con los pasos 2.9 y 5.2, ajuste la densidad celular para inyecciones a 6 x 106 células por ml.
NOTA: Para las inyecciones en muestras de tejido, use células etiquetadas con una célula viva permeable a la membrana verde fluorescente. - Llene la suspensión celular en la unidad de dosificación del dispositivo WJ.
- Sostenga la boquilla de inyección poco por encima de los 2 ml de medios de crecimiento en un tubo de centrifugación de 15 ml o poco por encima del tejido de la uretra abierto.
- En ambos casos, inyecte 100 μL de células mediante el dispositivo utilizando una alta presión para la penetración en el tejido seguida de una fase de baja presión para las inyecciones celulares. Utilice los ajustes de presión E60-10.
NOTA: Las células inyectadas en la uretra cadavérica forman una cúpula de inyección. - Recoger las células inyectadas en el medio directamente por centrifugación durante 7 min a 630 x g a temperatura ambiente.
- Para las células inyectadas en la uretra cadavérica, aspire fuera de la cúpula de inyección con una aguja de 18G aplicada en una jeringa.
- Transfiera las células inyectadas y aspiradas a un tubo de centrifugación y centrífuga durante 7 min a 630 x g a temperatura ambiente en comparación con las células inyectadas en el medio.
- Después de la centrifugación, resuspend las células en 4 ml de medios de crecimiento en ambos casos.
- Determinar el rendimiento celular y la viabilidad con la ayuda de la exclusión del tinte azul Trypan con un hemocitómetro como se describe en detalle en 5.10.
7. Evaluación biomecánica de la elasticidad celular por microscopía de fuerza atómica (AFM)
- Preparación de muestras
NOTA: Las células recuperadas después de la inyección ahora están sujetas a análisis adicionales por AFM. Además, las células que no se inyectaron se utilizan como controles.- Células de semillas en platos de cultivo de tejidos con una densidad de 5 x 105 células por plato.
NOTA: Separe un plato de cultivo de tejidos por condición. Las condiciones son controles, ADSC inyectados por WJ o WN en medios y ADSC inyectados por WJ o WN en tejido cadavérico. - Incubar células en platos de cultivo de tejidos durante 3 h a 37 °C.
NOTA: Para evitar variaciones debidas a células en fase G1 y durante la mitosis, realizamos mediciones de AFM 3 h después de la etapa de siembra celular. - Justo antes de la medición con el AFM reemplace el medio de crecimiento con 3 ml de medios L-15 de Leibovitz sin L-glutamina.
- Coloque la placa de cultivo de tejidos en el soporte de muestras del dispositivo AFM y encienda el calentador de placa de Petri a 37 °C.
- Células de semillas en platos de cultivo de tejidos con una densidad de 5 x 105 células por plato.
- Preparación de calibración AFM y voladizo
- Utilice un bloque de vidrio que esté especificado para mediciones en líquidos y ajústelo en el soporte AFM.
NOTA: La superficie superior del bloque de vidrio debe ser recta y paralela al soporte AFM. - Coloque cuidadosamente el voladizo en la superficie del bloque de vidrio. La punta A debe colocarse sobre el plano óptico pulido.
NOTA: No raye la superficie óptica pulida del bloque de vidrio porque los arañazos podrían provocar interferencias en las mediciones. La punta A debe sobresalir sobre el plano óptico pulido porque de lo contrario no es posible la reflexión del láser del AFM al fotodetector. - Para estabilizar el voladizo en el bloque de vidrio, agregue un resorte metálico con la ayuda de pinzas.
- Cuando el voladizo esté fijado en el bloque de vidrio, colóquelo en el cabezal AFM y bloquee el mecanismo de bloqueo integrado.
- Monte el cabezal AFM en el dispositivo AFM.
NOTA: El resorte debe estar orientado hacia el lado izquierdo para colocarse correctamente. Si este no es el caso, corrija la posición del bloque de vidrio y ajuste el cabezal AFM nuevamente. - Inicialice la configuración del software y abra el software junto con la ventana de alineación láser y la configuración del parámetro de aproximación. Además, encienda el motor paso a paso, la luz láser y la cámara CCD.
- Identifique la punta A en voladizo utilizando la cámara CCD.
- Baje el voladizo hasta que esté completamente sumergido en el medio. Utilice la función de motor paso a paso para alcanzar este objetivo.
- Una vez que el voladizo está completamente cubierto por medio, el láser se alinea en la parte superior del voladizo mediante el uso de los tornillos de ajuste. El haz reflejado debe caer sobre el centro del fotodetector y la suma de las señales debe ser de 1 V o superior. Las deflexiones laterales y verticales deben estar cerca de 0.
NOTA: Si se alcanza el centro se puede monitorear en la función de alineación láser, así como los valores de la señal. Si los valores de la señal no son correctos, es necesario realizar más ajustes. - Ejecute ahora el enfoque del analizador con los parámetros de aproximación (Tabla 1).
- Retraiga el voladizo en 100 μm una vez que llegue a la parte inferior presionando el botón Retract .
NOTA: Asegúrese de que no haya ninguna celda conectada a ese campo donde se realiza el enfoque, ya que esto falsificaría la calibración. - Configure los parámetros Run de acuerdo con las siguientes especificaciones: Setpoint 1 V, Longitud de tracción 90 μm, Velocidad: 5 μm / s, Frecuencia de muestreo: 2000 Hz y como modo de retardo: Fuerza constante.
- Inicie la medición de la curva fuerza-distancia de calibración pulsando el botón Ejecutar.
NOTA: Al hacer clic en el botón Ejecutar en el software se obtiene una curva fuerza-distancia. - Seleccione la región de ajuste lineal de la curva retraída en el software en la curva fuerza-distancia de calibración obtenida. Calcule la medición de la constante del resorte mediante el software.
- Calibrar el voladizo siguiendo los parámetros y pasos exactos descritos por Danalache et al.17.
- Utilice un bloque de vidrio que esté especificado para mediciones en líquidos y ajústelo en el soporte AFM.
- Medición de la elasticidad de células individuales
- Identifique visualmente una célula y concéntrese en ella. Coloque el mouse de la computadora en el centro de la celda. Para mejorar la precisión de las mediciones, coloque la punta AFM directamente sobre el núcleo celular.
NOTA: El ratón del equipo se utiliza como marcador visual para identificar el sitio de destino de la sangría. - Ahora concéntrese en el voladizo y muévalo en el mouse de la computadora.
- Inicie la medición con Run con los parámetros indicados en la Tabla 2.
NOTA: Se utiliza el parámetro de punto de ajuste obtenido por calibración del voladizo. Además, una célula se mide tres veces. Mida al menos 50 células.
- Identifique visualmente una célula y concéntrese en ella. Coloque el mouse de la computadora en el centro de la celda. Para mejorar la precisión de las mediciones, coloque la punta AFM directamente sobre el núcleo celular.
- Procesamiento de datos
- Procese los datos siguiendo los pasos y parámetros exactos descritos anteriormente por Danalache17.
- Guarde y exporte el archivo.
8. Análisis estadístico
- Abra el software estadístico.
- Elija la selección de Nuevo conjunto de datos.
NOTA: Se abren dos archivos. Uno es el "DataSet" y el otro es el archivo "Output". - Seleccione el archivo DataSet y abra la ficha Vista de variables .
- Inserte las variables numéricas para la inyección en el sitio (fluido de captura o tejido cadavérico), categoría (control, inyección WJ, inyección WN) y elasticidad.
- Inserte los datos de elasticidad medidos con su correspondiente inyección de sitio y número de categoría en la pestaña Vista de datos .
- Analice los datos seleccionando la pestaña de la barra de menús Analizar | Estadística descriptiva y elija Análisis exploratorio de datos.
- Como variable dependiente, seleccione Elasticidad y lista de factores seleccione Categoría.
NOTA: Los resultados se muestran en el archivo "Salida", incluido un gráfico de cuadro que se utiliza para la sección de resultados. - Para realizar una prueba estadística, seleccione muestras independientes dentro de la prueba no paramétrica en la pestaña Analizar de la barra de menús.
- En el nuevo archivo abierto, mantenga la configuración en la pestaña Objetivo y Configuración.
- Abra la pestaña Campos y elija Elasticidad como campos de prueba y Categoría como grupos.
- Presione Ejecutar.
NOTA: Los resultados se muestran en el archivo "Salida". Para estos análisis se realiza una prueba de Mann-U-Whitney. - Incluya el resultado de la prueba no paramétrica en el diagrama de caja del análisis exploratorio de datos.
- Guarde los archivos seleccionando Archivo en la barra de menús y eligiendo Guardar.
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Representative Results
Después de la administración celular a través de los dos enfoques, la viabilidad de las células administradas a través del WN (97,2 ± 2%, n = 10, p<0,002) fue mayor en comparación con las inyecciones de WJ utilizando la configuración E60-10 (85,9 ± 0,16%, n = 12) (Figura 2). Los resultados de la evaluación biomecánica mostraron que: las inyecciones de WN de células en el fluido de captura no mostraron diferencias significativas con respecto a los módulos elásticos (EM; 0,992 kPa) en comparación con los controles (1,176 kPa; Figura 3A), mientras que las inyecciones de WJ desencadenaron una reducción significativa de la EM celular (0.440 kPa, p<0.001, Figura 3B). Se observó una disminución del 40 al 50% de la EM después de las inyecciones de WJ. Aunque las inyecciones de WN en el tejido cadavérico de la uretra no produjeron diferencias significativas en la EM celular (Figura 4A), se observó una reducción significativa en la EM después de las inyecciones de WJ en muestras de tejido (0,890 kPa a 0,429 kPa; p<0,00, Figura 4B). Por lo tanto, los valores absolutos de EM después de la inyección de WJ se redujeron en un 51%. En conjunto, los resultados muestran que mientras que la entrega de células WJ cumple con un requisito absoluto para una implementación clínica donde más del 80% de las células viables después de la entrega18 , después de la entrega de WJ, los módulos elásticos celulares se ven afectados. Una EM celular más baja podría facilitar la migración de las características de las células después de la entrega de WJ. En una distribución y gama tan amplias de capacidades regenerativas en la región deseada19.
Figura 1. Anatomía de la vejiga porcina y la uretra y sitios de inyección. A) Se muestra el lado ventral de la vejiga porcina y la uretra con los tres ligamentos que fijan la vejiga en la cavidad abdominal y pélvica. Además, se muestran los uréteres que terminan en el lado dorsal de la vejiga. B) Imagen representativa de la uretra cadavérica utilizada para la inyección de WJ y WN. Longitudinalmente, se muestra la uretra dorsal abierta con cúpulas de inyección rodeadas de negro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Inyecciones de determinación de viabilidad celular vía WN y WJ. Los pADSC inyectados a través de WN o WJ se recogieron después de la inyección y se contaron mediante exclusión de Trypan para determinar la viabilidad. La viabilidad celular se redujo significativamente después de la inyección de WJ en comparación con las células administradas a través de WN. p<0.001. Los datos se muestran gráficamente como media con desviación estándar. Abreviaturas: WJ - chorro de agua, WN - aguja Williams. Figura adaptada de Danalache et al. 202119. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Comparación de los módulos cuantificados de Young de WN respectivamente WJ entregó células en medios de captura y sus controles correspondientes. No se observaron diferencias notables en la EM en las diagramas de caja para las monocapas celulares de control (no tratadas) y las células administradas por WN (A). Por el contrario, se puede observar una disminución significativa de la elasticidad entre las tramas de caja de las células de control y el grupo WJ (B). ns - no significativo, p > 0,05, ***p<0,001. Abreviaturas: WJ - chorro de agua, WN - aguja Williams. Figura adaptada de Danalache et al. 202119. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Comparación de los módulos cuantificados de Young de WN respectivamente WJ entregó células en la uretra cadavérica y sus controles correspondientes. No se observaron diferencias notables entre las células administradas a través de células WN y sus controles correspondientes (A). Se observó una disminución significativa en la elasticidad entre las células administradas por WJ y la monocapa de célula de control (B). ns - no significativo, p > 0,05, ***p<0,001. Abreviaturas: WJ - chorro de agua, WN - aguja Williams. Figura adaptada de Danalache et al. 202119. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Parámetro de aproximación | Valor |
| Acercarse a IGain | 3,0 Hz |
| Enfoque PGain | 0.0002 |
| Aproximación a la altura del objetivo | 10,0 μm |
| Punto de consigna de aproximación | 3,00 V |
| Línea de base de aproximación | 0,00 V |
Tabla 1. Parámetros de aproximación.
| Parámetro Run | Valor |
| Punto de ajuste | 10 nN |
| Movimiento Z / Extender velocidad | Velocidad constante/ |
| 5,0 μm/s | |
| Hora de contacto | 0,0 s |
| Longitud de tracción | 90 μm |
| Modo de retardo | Fuerza constante |
| Frecuencia de muestreo | 2000 Hz |
Tabla 2. Ejecutar parámetros.
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Discussion
En el presente estudio, demostramos y presentamos un enfoque paso a paso para el procedimiento de entrega de células WJ y empleamos una secuela de investigaciones cuantitativas para evaluar el efecto de la entrega de WJ en las características celulares: viabilidad celular y características biomecánicas (es decir, EM). Después de la inyección de WJ, el 85,9% de las células cosechadas eran viables. En términos de inyección de WN, el 97,2% de las células conservaron su viabilidad después de la inyección. Por lo tanto, el enfoque WJ cumple con un requisito absoluto para una implementación clínica: más del 80% de células viables después del parto18. Si bien se logra un protocolo estandarizado y reproducible con el enfoque WJ, el resultado de la administración de la inyección con aguja depende en gran medida del tamaño y la boquilla de la jeringa y la aguja, la presión, la velocidad de flujo y el médico que realiza la inyección19.
Los estudios que emplearon la entrega de células WJ en modelos animales vivos mostraron que al variar la presión de eyección, la profundidad de penetración puede adaptarse al tejido objetivo y, como tal, a la aplicación clínica deseada13,16. Las inyecciones de células transuretrales en animales vivos bajo control visual informaron extravío o pérdida de células en aproximadamente el 50% de los animales tratados20, mientras que las inyecciones de WJ informaron tasas precisas de inyección celular superiores al 90% (Linzenbold et al.16 y observación no publicada). El estándar de oro actual para la administración celular (inyecciones con aguja) requiere la penetración de la cánula en un tejido específico. Por lo tanto, la traducción de células de aguja causa lesiones y traumatismos en todos los casos. En la uretra, esto en realidad puede causar inflamación y toxificación debido a los gérmenes y toxinas que se encuentran incluso en la orina sana. Además, el tiempo de operación del usuario en la inyección de WJ es significativamente más corto en comparación con una inyección con aguja: las células se colocan dentro de milisegundos en la capa de tejido prevista preestableciendo los niveles de presión. Por el contrario, la profundidad de penetración en la inyección de agujas en áreas remotas por endoscopia depende de las habilidades y la experiencia del cirujano. También se espera que la reproducibilidad de la inyección de WJ sea superior, pero actualmente solo existen datos preclínicosde 15,16,20 y se investigaron menos de 200 animales. En nuestro estudio reciente observamos que la elasticidad celular se reduce por la aplicación de WJ en comparación con las inyecciones con aguja21. Esto se puede atribuir a la tensión de cizallamiento de las células a mayor velocidad durante la entrega de WJ. Además, la eventual pérdida celular podría compensarse con una mayor precisión de colocación y eyección celular dentro de la región de interés, como se logra con la administración guiada por WJ mediante cistoscopia guiada visual22.
Es bien sabido que las fuerzas mecánicas dirigen el comportamiento de las células madre, el potencial de regeneración, así como su posterior viabilidad y funcionalidad post-trasplante 10,23. El advenimiento de la AFM atómica proporcionó una poderosa herramienta para cuantificar las propiedades mecánicas de células vivas individuales en resolución a nanoescala en condiciones acuosas 24,25,26,27. AFM es un método confiable y altamente sensible que puede detectar y registrar rigideces que van desde menos de 100 Pa a 106 Pa, cubriendo así un amplio rango para la mayoría de los tejidos y células28. De hecho, la mecánica celular está emergiendo como biomarcador libre de etiquetas para evaluar el estado celular y en estado fisiológico y patológico29 y la elasticidad celular es la respuesta sinérgica y acumulativa de la diafonía núcleo-citoesqueleto. Está bien establecido que cuando una célula es sometida a fuerzas externas, estas fuerzas se transmiten desde la membrana plasmática a través del citoesqueleto hasta el núcleo, dando lugar a deformaciones intranucleares y reorganización 30,31,32. Por lo tanto, el núcleo, visto durante mucho tiempo como el material genómico y el aparato de transcripción, es un jugador clave en la mecanotransducción celular también32. De hecho, la importancia de la mecánica nuclear y las conexiones nucleo-citoesqueléticas, en todas las funciones y mutaciones celulares, en las laminas y enlazadores del nucleoesqueleto al complejo citoesqueleto (LINC) - están en la base de inicio de varias patologías 33,34. Estas fuerzas también podrían indicar artefactos celulares. Específicamente, las fuerzas generadas externamente en realidad se propagan a lo largo de los filamentos citoesqueléticos y se transmiten a la lámina nuclear a través del complejo LINC; en respuesta a estas fuerzas, el núcleo, de hecho, se vuelve más rígido35,36, fusionando así los dos procesos estrechamente entrelazados y conectados. Esta es también la razón de ser de nuestro enfoque y nuestras mediciones de mecánica nuclear. Además, una colocación precisa del voladizo en la parte superior de la superficie nuclear también garantiza un alto grado de reproducibilidad y reduce las variaciones debidas a la heterogeneidad celular y la unión al sustrato.
A pesar de que la elasticidad celular está emergiendo como biomarcador libre de etiquetas para evaluar el estado celular y tanto en estados fisiológicos como patológicos29, los módulos elásticos medidos están marcados por grandes variaciones incluso en el mismo tipo de célula37. Un método para contrarrestar tales variaciones como lo sugerido por Schillers et al. es la implementación de procedimientos nanomecánicos estandarizados de AFM (SNAP) que aseguran una alta reproducibilidad y aplicabilidad de las mediciones de elasticidad como un marcador cuantitativo confiable a células en varios estados38. Además, aunque los parámetros experimentales empleados en los análisis de AFM, como la velocidad de indentación, la forma y el tamaño del indentador, así como la representación precisa de la geometría de la punta en el ajuste del modelo 39, influyen en los valores absolutos medidos40,41, estos parámetros no deben afectar los resultados dentro de un estudio o una tendencia medida.
Sin embargo, tenga en cuenta que las hendiduras de AFM están restringidas al análisis de la superficie externa de las células y, por lo tanto, son incapaces de escanear el interior de una membrana celular o estructuras intracelulares particulares. Usukura et al. propusieron un método de "destechado" que rompe la membrana celular y elimina los componentes citoplasmáticos-solubles42, permitiendo así las investigaciones intracelulares de AFM. En nuestro estudio, sin embargo, el enfoque se centró en la evaluación de los módulos elásticos promedio en lugar de sondear componentes intracelulares distintos y selectivos.
Colectivamente, la consistencia y confiabilidad de los datos de AFM producidos depende en gran medida de la experiencia técnica del operador respectivo y podría estar sesgada por la variabilidad biológica38. Teniendo en cuenta todas las variables sensibles que podrían afectar los resultados reales de AFM, los valores elásticos absolutos informados en este estudio no se pueden generalizar y son bastante específicos para nuestra configuración experimental.
En general, nuestro estudio proporciona evidencia21 , así como un protocolo paso a paso para la superioridad de las inyecciones de WJ sobre las inyecciones con aguja para el régimen de terapia celular regenerativa.
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Disclosures
Los autores J.K., M.D, T.A., A.S., W.K. A. no tienen nada que revelar. Los autores W.L. y M.D.E. son empleados de ERBE Medizintechnik Lt. Tübingen, el productor del ERBEJet2 y el prototipo WJ empleado en este estudio.
Acknowledgments
Agradecemos a nuestros coautores de las publicaciones originales por su ayuda y apoyo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL centrifuge tube | Greiner BioOne | 227261 | |
| 1 mL BD Luer-LokTM Syringe | BD Plastik Inc | n.a. | |
| 100 µm cell sieve | Greiner BioOne | 542000 | |
| 15 mL centrifuge tube | Greiner BioOne | 188271 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Corning Incorporated | 353136 | |
| AFM head | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
| AFM processing software | Bruker | JPK00518 | |
| AFM software | Bruker | JPK00518 | |
| AFM system Cell Hesion 200 | Bruker | JPK00518 | |
| All-In-One-Al cantilever | Budget Sensors | AIO-10 | tip A, Conatct Mode, Shape: Beam Force Constant: 0.2 N/m (0.04 - 0.7 N/m) Resonance Frequency: 15 kHz (10 - 20 kHz) Length: 500 µm (490 - 510 µm) Width: 30 µm (35 - 45 µm) Thickness: 2.7 µm (1.7 - 3.7 µm) |
| Amphotericin B solution | Sigma | A2942 | 250 µg/ml |
| Atomic Force Microscope (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| BD Microlance 3 18G | BD | 304622 | |
| bovine serum albumin | Gibco | A10008-01 | |
| Cantilever | All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | tip A, k ¼ 0.2 N/m |
| C-chip disposable hemocytometer | NanoEnTek | 631-1098 | |
| centrifuge: Rotina 420R | Hettich Zentrifugen | ||
| Collagenase, Type I, powder | Gibco | 17100-017 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - low glucose | Sigma | D5546 | |
| Feather disposable scalpel (No. 10) | Feather | 02.001.30.010 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
| HEPES sodium salt solution (1 M) | Sigma | H3662 | |
| Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| laboratory bags | Brand | 759705 | |
| Leibovitz's L-15 medium without l-glutamine | Merck | F1315 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
| L-glutamine | Lonza | BE 17-605C1 | 200 mM |
| LIVE/DEADTM Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | L3224 | Calcein AM and EthD-1 are used from this kit. |
| Microscope software: Zen 2.6 | Zeiss | ||
| Microscope: AxioVertA.1 | Zeiss | ||
| Nelaton-Catheter female | Bicakcilar | 19512051 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 10000 U/ml Penicillin 10000 µg/ml Streptomycin |
| Petri dish heater associated with AFM | Bruker | T-05-0117 | |
| Petri dish heater associated with AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-015 | |
| Statistical Software: SPSS Statistics 22 | IBM | ||
| Sterile Petri dish - CellStar | Greiner BioOne | 664160 | |
| Tissue culture dishes | TPP AG | TPP93040 | |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Trypan Blue 0.4% 0.85% NaCl |
Lonza | 17-942E | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | |
| Waterjet: ERBEJET2 device | Erbe Elektromedizin GmbH | ||
| Williams Cystoscopic Injection Needle | Cook Medical | G14220 | 23G, 5.0 Fr, 35 cm |
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