Summary
Nous présentons une méthode d’injection cellulaire via la technologie de jet d’eau sans aiguille couplée à une séquelle d’investigations post-accouchement en termes de viabilité cellulaire, de prolifération et de mesures d’élasticité.
Abstract
L’incontinence urinaire (IU) est une affection très répandue caractérisée par une déficience du muscle du sphincter urétral. Les branches de la médecine régénérative, en particulier la thérapie cellulaire, sont de nouvelles approches pour améliorer et restaurer la fonction du sphincter urétral. Même si l’injection de cellules fonctionnelles actives est systématiquement effectuée en milieu clinique à l’aiguille et à la seringue, ces approches présentent des inconvénients et des limites importants. Dans ce contexte, la technologie du jet d’eau sans aiguille (WJ) est une méthode réalisable et innovante qui permet d’injecter des cellules viables par cystoscopie guidée visuellement dans le sphincter urétral. Dans la présente étude, nous avons utilisé WJ pour administrer des cellules stromales dérivées du tissu adipeux porcin (pADSC) dans le tissu urétral cadavérique et avons ensuite étudié l’effet de l’administration de WJ sur le rendement cellulaire et la viabilité. Nous avons également évalué les caractéristiques biomécaniques (c.-à-d. l’élasticité) par des mesures de microscopie à force atomique (AFM). Nous avons montré que les pADSC délivrés par WJ étaient significativement réduits dans leur élasticité cellulaire. La viabilité était significativement plus faible par rapport aux témoins, mais elle est toujours supérieure à 80%.
Introduction
L’incontinence urinaire (IU) est un trouble répandu avec une prévalence de 1,8 à 30,5% dans les populations européennes1 et se caractérise principalement par un dysfonctionnement du sphincter urétral. D’un point de vue clinique, un traitement chirurgical est souvent offert aux patients lorsque les thérapies conservatrices ou la physiothérapie ne parviennent pas à traiter et à soulager les symptômes émergents.
La thérapie cellulaire pour la réparation régénérative potentielle du dysfonctionnement du complexe du sphincter est devenue une approche d’avant-garde pour le traitement de la pathologie de l’UI 2,3. Ses principaux objectifs sont de remplacer, réparer et restaurer la fonctionnalité biologique du tissu endommagé. Dans les modèles animaux pour l’IU, la greffe de cellules souches a montré des résultats prometteurs dans les résultats urodynamiques 2,4,5. Les cellules souches apparaissent comme des candidates cellulaires optimales car elles ont la capacité de subir un auto-renouvellement et une différenciation multipotente, aidant ainsi la régénération des tissus affectés6. Malgré le potentiel régénératif à venir, l’utilisation pratique de la thérapie cellulaire reste entravée car l’administration mini-invasive de cellules est toujours confrontée à plusieurs défis concernant la précision de l’injection et la couverture de la cible. Même si l’approche actuelle utilisée pour l’administration des cellules est l’injection par un système aiguille-seringue7, il en résulte généralement un déficit global de cellules viables, avec des viabilités rapportées aussi faibles que 1% à 31% après la transplantation8. En outre, il a également été démontré que l’administration de cellules par injection d’aiguille affecte le placement, le taux de rétention, ainsi que la distribution des cellules transplantées dans le tissu ciblé 9,10,11. Une approche novatrice réalisable qui surmonte la limitation susmentionnée est l’administration de cellules sans aiguille via la technologie du jet d’eau.
La technologie du jet d’eau (WJ) émerge comme une nouvelle approche qui permet l’administration à haut débit de cellules par cystoscope sous contrôle visuel dans le sphincter urétral12,13. Le WJ permet la livraison de cellules à différentes pressions (E = effets en bar) allant de E5 à E8013. Dans la première phase, une solution isotonique (phase de pénétration tissulaire) est appliquée à haute pression (c.-à-d. E60 ou E80) afin de desserrer la matrice extracellulaire entourant le tissu ciblé et d’ouvrir de petites micro-lacunes interconnectées. Dans la deuxième phase (la phase d’injection), la pression est abaissée en quelques millisecondes (c’est-à-dire jusqu’à E10) afin de délivrer doucement les cellules dans le tissu ciblé. Suite à cette application en deux phases, les cellules ne sont pas soumises à une pression supplémentaire contre le tissu lorsqu’elles sont éjectées, mais flottent dans un flux à basse pression dans une zone caverneuse remplie de liquide13. Dans un contexte de modèle ex vivo où des cellules souches ont été injectées via WJ dans le tissu urétral cadavérique, les cellules viables pourraient ensuite être aspirées et extraites du tissu et élargies in vitro13. Bien qu’une étude réalisée en 2020 par Weber et al. ait démontré la faisabilité et l’applicabilité de WJ pour délivrer des cardiomyocytes sans empreinte dans le myocarde14, il faut garder à l’esprit que la technologie WJ est encore au stade de prototype.
Le protocole suivant décrit comment préparer et étiqueter les cellules stromales dérivées du tissu adipeux porcin (pADSC) et comment les administrer dans le liquide de capture et le tissu cadavérique via la technologie WJ et les aiguilles de cystoscopie Williams (WN). Après injection cellulaire, la vitalité et l’élasticité cellulaires par microscopie à force atomique (AFM) sont évaluées. Via des instructions étape par étape, le protocole donne une approche claire et concise pour acquérir des données fiables. La section de discussion présente et décrit les principaux avantages, limites et perspectives d’avenir de la technique. L’administration de cellules par WJ ainsi que les analyses post-traduction de séquelles rapportées ici remplacent l’injection d’aiguille standard et fournissent un cadre d’administration de cellules solides pour la guérison régénérative du tissu cible. Dans nos études récentes, nous avons fourni des preuves que WJ a délivré des cellules plus précisément et au moins à une viabilité comparable par rapport aux injections d’aiguilles 15,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Les échantillons de tissu adipeux porcin ont été obtenus à l’Institut de chirurgie expérimentale de l’Université de Tuebingen. Toutes les procédures ont été approuvées par les autorités locales de protection des animaux sous le numéro d’expérimentation animale CU1/16.
1. Isolement des cellules stromales dérivées du tissu adipeux porcin
- Utiliser du tissu adipeux porcin livré par l’Institut de chirurgie expérimentale dans un tube centrifuge de 50 mL au laboratoire.
- Transférer le tissu dans une boîte de Petri stérile sous le banc stérile et le hacher avec deux scalpels (n ° 10) en petits fragments et en bouillie.
REMARQUE: Les ciseaux peuvent également être utilisés afin d’obtenir de petits fragments. Plus les fragments sont petits, mieux c’est pour la digestion suivante.- Transférer les petits fragments/bouillie dans un tube centrifuge de 50 mL et l’incuber avec 5 mL de solution homogénéisatrice pendant 30 min à 37 °C sur un agitateur. La solution homogénéisatrice est le PBS avec 1 % d’albumine sérique bovine (BSA) (solution mère : 1 % (p/v) de BSA dans le PBS) et 0,1 % de collagénase de type I.
REMARQUE: Toujours préparer la solution d’homogénéisateur fraîchement. Le shaker a un mouvement de secousse circulaire à une vitesse lente de 25 à 500 tr / min.
- Transférer les petits fragments/bouillie dans un tube centrifuge de 50 mL et l’incuber avec 5 mL de solution homogénéisatrice pendant 30 min à 37 °C sur un agitateur. La solution homogénéisatrice est le PBS avec 1 % d’albumine sérique bovine (BSA) (solution mère : 1 % (p/v) de BSA dans le PBS) et 0,1 % de collagénase de type I.
- Pour arrêter l’incubation, ajouter 10 mL de milieu de croissance [Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - low glucose (DMEM-LG), solution de sel de sodium HEPES à 2,5 % (1 M), sérum fœtal bovin (FBS), 1 % de L-glutamine (200 mM), 1 % de pénicilline-streptomycine (10000 U/mL de pénicilline ; 10 000 μg/mL de streptomycine) et 1 % d’amphotéricine B (250 μg/mL)].
REMARQUE: Les supports de croissance peuvent être préparés à l’avance. Les antibiotiques et les médicaments antifongiques sont nécessaires dans la préparation du milieu de croissance pour la culture cellulaire afin de protéger les cellules contre les contaminations. - Incuber les tubes de centrifugeuse pendant 10 min à température ambiante.
- Aspirer la fraction avec des adipocytes, qui est plus léger et donc nager sur le liquide, avec une pipette de 10 mL et la jeter.
- Filtrer la fraction stromale restante à travers un tamis cellulaire de 100 μm avec une membrane de polyéthylène téréphtalate (PET) exempte de métaux lourds pour retenir les fragments de tissu adipeux et récupérer uniquement la suspension cellulaire.
- Centrifuger la suspension filtrante de la cellule pendant 7 min à 630 x g à température ambiante.
- Remettez en suspension la pastille de cellule dans 2 mL de PBS pour laver les cellules une fois.
- Centrifuger à nouveau la suspension de la cellule pendant 7 min à 630 x g à température ambiante.
- Après centrifugation et remise en suspension répétée de la pastille cellulaire dans 10 mL de milieu de croissance par fiole, les cellules de semence dans des flacons de culture cellulaire de 75 cm2 .
REMARQUE: Selon la taille de la pastille de cellule après l’étape de lavage avec PBS, les cellules de semence dans une à quatre fioles.
2. Culture cellulaire de cellules stromales dérivées du tissu adipeux porcin
- Récolter et passer les cellules lorsqu’elles atteignent 70% de confluence.
- Lavez les cellules avec 10 mL de PBS deux fois et aspirez complètement le PBS.
REMARQUE: Cette étape est nécessaire pour supprimer les milieux de croissance restants, qui sont complétés par 10% FBS. FBS a plusieurs inhibiteurs de la protéase qui peuvent entraver la fonction de la trypsinisation suivante. - Ajouter 3 mL de 0,05 %-trypsine-EDTA par flacon pour détacher les cellules.
- Incuber les flacons pendant 3 min à 37 °C.
- Vérifiez au microscope si les cellules sont détachées.
REMARQUE: Parfois, il faut un peu plus de temps pour détacher les cellules. Dans ce cas, incuber les flacons pendant 5 min au maximum à 37 °C. - Pour arrêter le processus d’incubation et de détachement, ajoutez 3 mL de milieu de croissance.
REMARQUE: Comme indiqué ci-dessus, les milieux de croissance sont complétés par 10% fbS qui contient des inhibiteurs de la protéase. - Transférer les cellules détachées dans un tube de centrifugation et centrifuger pendant 7 min à 630 x g à température ambiante.
- Ressuspendez les cellules dans 10 mL de milieux de croissance et comptez-les avec un hémocytomètre.
- Cellules de semence avec une densité d’inoculation de 3 x 105 cellules par flacon de 75 cm2 .
3. Marquage des cellules avec la calcéine-AM
REMARQUE: Les cellules injectées dans les tissus cadavériques sont colorées avec une coloration de cellules vivantes perméable à la membrane fluorescente verte et un indicateur de viabilité imperméable à la membrane fluorescente rouge pour vérifier que les cellules extraites sont les mêmes que les cellules injectées et non les fragments de tissu de l’urètre.
- Lavez les cellules deux fois avec 10 mL de PBS.
- Ajouter 5 mL de solution de colorant par fiole de 75 cm2 . La solution de colorant se compose de milieux de croissance avec 2 μM du colorant de cellules vivantes perméable à la membrane fluorescente verte et un indicateur de viabilité imperméable à la membrane fluorescente rouge de 4 μM.
- Incuber pendant 30 min à température ambiante dans l’obscurité.
- Aspirer et jeter la solution de colorant.
- Lavez à nouveau les cellules deux fois avec 10 mL de PBS.
- Ajoutez des milieux de croissance et documentez le signal de fluorescence vert et rouge par microscopie à fluorescence.
- Placez la fiole de 75 cm2 sur la table du microscope, utilisez l’objectif 10x, ne sélectionnez aucun filtre de fluorescence et assurez-vous que le chemin de lumière transmis est actif.
REMARQUE: Ces étapes sont toutes effectuées manuellement sur le microscope. - Parallèlement à l’étape 3.6.1, ouvrez le logiciel.
- Appuyez sur le bouton Live sous l’onglet Localiser pour obtenir une image en direct des cellules dans la fiole du tableau et vous concentrer sur elles avec les lecteurs de réglage grossiers et fins.
REMARQUE: Sur la vue de droite, l’image en direct apparaîtra une fois le bouton Live activé. - Dans le sous-onglet Composants du microscope, sélectionnez l’objectif correct (10x).
- Dans le sous-onglet Appareil photo, cochez la case Exposition automatique.
- Appuyez sur le bouton Snap pour prendre la première photo avec la lumière transmise.
- Insérez la barre d’échelle à l’aide de l’onglet Graphiques de la barre de menus et en sélectionnant Barre d’échelle.
- Enregistrez l’image à l’aide de l’onglet Fichiers de la barre de menus et en sélectionnant Enregistrer en tant que czi.
- Pour les images de fluorescence, remplacez le filtre par celui spécifique à la fluorescence verte ou rouge et sélectionnez le chemin de la lumière réfléchie.
REMARQUE: Ces modifications doivent être effectuées manuellement sur le microscope. - Appuyez à nouveau sur le bouton Live sous l’onglet Localiser pour obtenir une image en direct des cellules.
- Appuyez sur le bouton Snap pour prendre la deuxième photo avec une fluorescence verte ou rouge.
- Insérez la barre d’échelle à l’aide de l’onglet Graphiques de la barre de menus et en sélectionnant Barre d’échelle.
- Enregistrez l’image à l’aide de l’onglet Fichiers de la barre de menus et en sélectionnant Enregistrer en tant que czi.
- Répétez les étapes 3.6.9 à 3.6.13 avec l’autre canal de fluorescence.
- Placez la fiole de 75 cm2 sur la table du microscope, utilisez l’objectif 10x, ne sélectionnez aucun filtre de fluorescence et assurez-vous que le chemin de lumière transmis est actif.
4. Préparer des échantillons de tissu urétral pour les injections
- Disséquez l’urètre et la vessie de connexion hors du porc.
REMARQUE: Des échantillons de tissu urétral provenant d’échantillons cadavériques frais de porcs de race locale femelle adultes ont été utilisés pour les expériences. - Transportez-le au laboratoire dans des sacs sur de la glace humide.
REMARQUE: Les échantillons doivent être laissés sur la glace jusqu’à un traitement ultérieur. Aucun additif n’a été ajouté aux échantillons. - Placez l’urètre avec la vessie sur une éponge, qui imite l’élasticité du plancher pelvien inférieur.
- Utilisez la vessie pour déterminer l’orientation (proximale, distale, dorsale et ventrale) de l’urètre. Ceci est possible grâce à la localisation des uretères et des trois ligaments qui fixent la vessie dans la cavité abdominale et pelvienne. Les trois ligaments sont les deux ligaments vesicae lateralia sur les côtés de la vessie et le vesicae medianum, qui provient de la surface ventrale de la vessie (Figure 1).
- Coupez l’urètre longitudinalement sur la face dorsale à l’aide d’un cathéter.
- Injectez les cellules dans l’urètre ouvert comme décrit dans les chapitres suivants.
5. Injections de cellules via une aiguille Williams dans des fluides et des échantillons de tissus
- Récoltez les cellules comme décrit à l’étape 2.
- Contrairement à l’étape 2.9, ajuster la densité cellulaire pour les injections à 2,4 x 106 cellules par mL.
REMARQUE: Pour les injections dans des échantillons de tissus, marquez les cellules avec une cellule vivante perméable à la membrane fluorescente verte. - Aspirez la suspension cellulaire avec une seringue et appliquez-y l’aiguille d’injection cystoscopique Williams (WN).
- Tenez l’aiguille peu au-dessus des 2 mL de milieu de croissance dans un tube de centrifugation de 15 mL ou insérez l’aiguille dans le tissu urétral ouvert. Dans les deux cas, injecter manuellement 250 μL de cellules.
REMARQUE: Les cellules injectées dans l’urètre cadavérique forment un dôme d’injection. - Prélever les cellules injectées dans les milieux directement par centrifugation pendant 7 min à 630 x g à température ambiante.
- Pour les cellules injectées dans l’urètre cadavérique, aspirez-les hors du dôme d’injection avec une aiguille 18G appliquée sur une seringue.
- Transférer les cellules injectées et aspirées dans un tube de centrifugation et centrifuger pendant 7 min à 630 x g à température ambiante par rapport aux cellules injectées dans le milieu.
- Après centrifugation, remettre les cellules en suspension dans 4 mL de milieu de croissance dans les deux cas.
- Déterminer le rendement cellulaire et la viabilité à l’aide de l’exclusion du colorant bleu Trypan avec un hémocytomètre.
- Bien mélanger 20 μL de suspension cellulaire avec 20 μL de bleu trypan.
- Remplir 10 μL de ce mélange dans chaque chambre de l’hémocytomètre.
REMARQUE: Les deux chambres sont remplies et comptées pour obtenir une optimisation statistique en doublant l’échantillonnage. - Au microscope, comptez les cellules dans les quatre carrés d’angle.
REMARQUE: Comptez les cellules qui brillent en blanc (non colorées) comme des cellules viables, tandis que les cellules qui brillent en bleu (colorées) sont comptées comme des cellules mortes. - Pour calculer le nombre de cellules par mL, calculez la moyenne des deux chambres, divisez ce nombre par deux et multipliez-le par 104.
6. Injections de cellules par jet d’eau dans des fluides et des échantillons de tissus
- Récoltez les cellules comme décrit à l’étape 2.
- Contrairement aux étapes 2.9 et 5.2, ajuster la densité cellulaire pour les injections à 6 x 106 cellules par mL.
REMARQUE: Pour les injections dans des échantillons de tissus, utilisez des cellules marquées avec une cellule vivante perméable à la membrane fluorescente verte. - Remplissez la suspension de la cellule dans l’unité de dosage du dispositif WJ.
- Tenez la buse d’injection peu au-dessus des 2 mL de milieu de croissance dans un tube de centrifugation de 15 mL ou peu au-dessus du tissu urètre ouvert.
- Dans les deux cas, injecter 100 μL de cellules par l’appareil en utilisant une pression élevée pour la pénétration tissulaire suivie d’une phase à basse pression pour les injections cellulaires. Utilisez les réglages de pression E60-10.
REMARQUE: Les cellules injectées dans l’urètre cadavérique forment un dôme d’injection. - Prélever les cellules injectées dans les milieux directement par centrifugation pendant 7 min à 630 x g à température ambiante.
- Pour les cellules injectées dans l’urètre cadavérique, aspirez-les hors du dôme d’injection avec une aiguille 18G appliquée sur une seringue.
- Transférer les cellules injectées et aspirées dans un tube de centrifugation et centrifuger pendant 7 min à 630 x g à température ambiante par rapport aux cellules injectées dans le milieu.
- Après centrifugation, remettre en suspension les cellules dans 4 mL de milieu de croissance dans les deux cas.
- Déterminer le rendement cellulaire et la viabilité à l’aide de l’exclusion du colorant bleu Trypan à l’aide d’un hémocytomètre tel que décrit en détail au point 5.10.
7. Évaluation biomécanique de l’élasticité cellulaire par microscopie à force atomique (AFM)
- Préparation des échantillons
REMARQUE: Les cellules récupérées après l’injection sont maintenant soumises à d’autres analyses par AFM. De plus, les cellules qui n’ont pas été injectées sont utilisées comme témoins.- Cellules de graines dans des boîtes de culture tissulaire d’une densité de 5 x 105 cellules par plat.
REMARQUE: Semez un plat de culture tissulaire par condition. Les conditions sont des témoins, des ADSC injectés par WJ ou WN dans des milieux et des ADSC injectés par WJ ou WN dans du tissu cadavérique. - Incuber des cellules dans des boîtes de culture tissulaire pendant 3 h à 37 °C.
REMARQUE: Pour éviter les variances dues aux cellules en phase G1 et pendant la mitose, nous avons effectué des mesures AFM 3 h après l’étape d’ensemencement cellulaire. - Juste avant la mesure avec l’AFM, remplacez le milieu de croissance par 3 mL du milieu L-15 de Leibovitz sans L-glutamine.
- Placez la boîte de culture tissulaire dans le porte-échantillon du dispositif AFM et allumez le réchauffeur de boîte de Petri réglé à 37 °C.
- Cellules de graines dans des boîtes de culture tissulaire d’une densité de 5 x 105 cellules par plat.
- Préparation de l’étalonnage AFM et cantilever
- Utilisez un bloc de verre spécifié pour les mesures dans les liquides et ajustez-le sur le support AFM.
REMARQUE: La surface supérieure du bloc de verre doit être droite et parallèle au support AFM. - Placez soigneusement le porte-à-faux sur la surface du bloc de verre. La pointe A doit se poser sur le plan optique poli.
REMARQUE: Ne pas rayer la surface optique polie du bloc de verre car les rayures pourraient entraîner des interférences dans les mesures. La pointe A doit dépasser sur le plan optique poli car sinon la réflexion du laser de l’AFM sur le photodétecteur n’est pas possible. - Pour stabiliser le porte-à-faux sur le bloc de verre, ajoutez un ressort métallique à l’aide d’une pince à épiler.
- Lorsque le porte-à-faux est fixé sur le bloc de verre, placez le bloc sur la tête AFM et verrouillez le mécanisme de verrouillage intégré.
- Montez la tête AFM sur le périphérique AFM.
REMARQUE: Le ressort doit faire face au côté gauche pour être placé correctement. Si ce n’est pas le cas, corrigez la position du bloc de verre et ajustez à nouveau la tête AFM. - Initialisez la configuration du logiciel et ouvrez le logiciel avec la fenêtre d’alignement laser et les paramètres d’approche. De plus, allumez le moteur pas à pas, la lumière laser et la caméra CCD.
- Identifiez l’embout A en porte-à-faux à l’aide de la caméra CCD.
- Abaissez le porte-à-faux jusqu’à ce qu’il soit complètement plongé dans le milieu. Utilisez la fonction moteur pas à pas pour atteindre cet objectif.
- Une fois que le porte-à-faux est entièrement recouvert de support, le laser est aligné sur le dessus du porte-à-faux à l’aide des vis de réglage. Le faisceau réfléchi doit tomber sur le centre du photodétecteur et la somme des signaux doit être de 1 V ou plus. Les déviations latérales et verticales doivent être proches de 0.
REMARQUE: Si le centre est atteint peut être surveillé dans la fonction d’alignement laser ainsi que les valeurs du signal. Si les valeurs du signal ne sont pas correctes, d’autres ajustements sont nécessaires. - Exécutez maintenant l’approche de l’analyseur avec les paramètres d’approche (Tableau 1).
- Rétractez le porte-à-faux de 100 μm une fois qu’il atteint le bas en appuyant sur le bouton Rétracter .
REMARQUE: Assurez-vous qu’aucune cellule n’est attachée à ce champ si l’approche est effectuée, car cela falsifierait l’étalonnage. - Configurez les paramètres d’exécution selon les spécifications suivantes: Point de consigne 1 V, Longueur de traction 90 μm, Vitesse: 5 μm / s, Fréquence d’échantillonnage: 2000 Hz et en mode retard: Force constante.
- Démarrez la mesure de la courbe force-distance d’étalonnage en appuyant sur le bouton Exécuter.
REMARQUE: En cliquant sur le bouton Exécuter dans le logiciel, une courbe force-distance est obtenue. - Sélectionnez la région d’ajustement linéaire de la courbe rétractée dans le logiciel sur la courbe force-distance d’étalonnage obtenue. Calculez la mesure de la constante du ressort par le logiciel.
- Calibrez le porte-à-faux en suivant les paramètres et les étapes exacts décrits par Danalache et al.17.
- Utilisez un bloc de verre spécifié pour les mesures dans les liquides et ajustez-le sur le support AFM.
- Mesure de l’élasticité des cellules individuelles
- Identifiez visuellement une cellule et concentrez-vous dessus. Placez la souris de l’ordinateur au milieu de la cellule. Pour améliorer la précision des mesures, positionnez la pointe AFM directement au-dessus du noyau cellulaire.
REMARQUE: La souris de l’ordinateur est utilisée comme marqueur visuel pour identifier le site cible de l’indentation. - Maintenant, concentrez-vous sur le porte-à-faux et déplacez-le sur la souris de l’ordinateur.
- Démarrez la mesure avec Exécuter avec les paramètres indiqués dans le tableau 2.
REMARQUE: Les paramètres de consigne obtenus par étalonnage du porte-à-faux sont utilisés. De plus, une cellule est mesurée trois fois. Mesurez au moins 50 cellules.
- Identifiez visuellement une cellule et concentrez-vous dessus. Placez la souris de l’ordinateur au milieu de la cellule. Pour améliorer la précision des mesures, positionnez la pointe AFM directement au-dessus du noyau cellulaire.
- Traitement des données
- Traitez les données en suivant les étapes et les paramètres exacts décrits précédemment par Danalache17.
- Enregistrez et exportez le fichier.
8. Analyse statistique
- Ouvrez le logiciel statistique.
- Choisissez la sélection De nouveaux jeux de données.
REMARQUE : Deux fichiers sont ouverts. L’un est le « DataSet » et l’autre est le fichier « Output ». - Sélectionnez le fichier DataSet et ouvrez l’onglet Affichage variable .
- Insérez les variables numériques pour l’injection au site (liquide de capture ou tissu cadavérique), la catégorie (contrôle, injection WJ, injection WN) et l’élasticité.
- Insérez les données d’élasticité mesurées avec leur numéro d’injection de site et de catégorie correspondant dans l’onglet Vue des données .
- Analysez les données en sélectionnant l’onglet de la barre de menus Analyser | Statistiques descriptives et choisissez Analyse exploratoire des données.
- En tant que variable dépendante, sélectionnez Élasticité et liste des facteurs, sélectionnez Catégorie.
REMARQUE: Les résultats sont affichés dans le fichier « Sortie », y compris un diagramme de boîte qui est utilisé pour la section des résultats. - Pour effectuer un test statistique, sélectionnez les échantillons indépendants dans le test non paramétrique sous l’onglet Analyser de la barre de menus.
- Dans le nouveau fichier ouvert, conservez les paramètres dans l’onglet Objectif et Paramètres.
- Ouvrez l’onglet Champs et choisissez Élasticité comme Champs de test et Catégorie comme Groupes.
- Appuyez sur Exécuter.
REMARQUE: Les résultats sont affichés dans le fichier « Sortie ». Pour ces analyses, un test de Mann-U-Whitney est effectué. - Inclure le résultat du test non paramétrique dans le diagramme en boîte de l’analyse exploratoire des données.
- Enregistrez les fichiers en sélectionnant Fichier dans la barre de menus et en choisissant Enregistrer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Après l’administration de cellules par les deux approches, la viabilité des cellules délivrées par le WN (97,2 ± 2 %, n = 10, p<0,002) était plus élevée que celle des injections par WJ utilisant les paramètres E60-10 (85,9 ± 0,16 %, n = 12) (Figure 2). Les résultats de l’évaluation biomécanique ont montré que : les injections de cellules dans le liquide de capture n’ont montré aucune différence significative par rapport aux modules élastiques (EM; 0,992 kPa) par rapport aux témoins (1,176 kPa; Figure 3A), tandis que les injections de WJ ont déclenché une réduction significative de l’EM cellulaire (0,440 kPa, p<0,001, Figure 3B). Une diminution de 40 à 50% de l’EM après les injections de WJ a été notée. Même si les injections de WN dans le tissu cadavérique n’ont donné aucune différence significative dans l’EM cellulaire (Figure 4A), une réduction significative de l’EM a été notée après les injections de WJ dans des échantillons de tissus (0,890 kPa à 0,429 kPa; p<00, Figure 4B). Ainsi, les valeurs EM absolues après injection de WJ ont ainsi été réduites de 51%. Collectivement, les résultats montrent que si l’administration de cellules WJ répond à une exigence absolue pour une mise en œuvre clinique où plus de 80% de cellules viables après l’accouchement18 , après la livraison WJ, les modules élastiques cellulaires sont affectés. Un EM cellulaire inférieur pourrait faciliter la migration des caractéristiques des cellules après l’accouchement WJ. Dans une distribution et une gamme aussi larges de capacités de régénération dans la région souhaitée19.
Graphique 1. Anatomie de la vessie porcine et de l’urètre et des sites d’injection. A) La face ventrale de la vessie porcine et de l’urètre avec les trois ligaments fixant la vessie dans la cavité abdominale et pelvienne sont montrés. De plus, les uretères qui se terminent sur la face dorsale de la vessie sont montrés. B) Image représentative de l’urètre cadavérique utilisé pour l’injection de WJ et de WN. Longitudinalement, l’urètre ouvert dorsal avec des dômes d’injection encerclés en noir sont montrés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 2. Injections de détermination de la viabilité cellulaire via WN et WJ. Les pADSC injectés via WN ou WJ ont été collectés après l’injection et comptés via l’exclusion de Trypan pour déterminer la viabilité. La viabilité cellulaire a été significativement réduite après l’injection de WJ par rapport aux cellules délivrées via WN. p<0,001. Les données sont affichées graphiquement sous forme de moyenne avec écart-type. Abréviations : WJ - jet d’eau, WN - aiguille Williams. Figure adaptée de Danalache et al. 202119. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 3. Comparaison des modules quantifiés de Young de WN respectivement WJ a livré des cellules dans les milieux de capture et leurs témoins correspondants. Aucune différence notable dans l’EM n’a été observée dans les boxplots pour les monocouches de cellules témoins (non traitées) et les cellules délivrées par WN (A). En revanche, une diminution significative de l’élasticité peut être notée entre les boxplots des cellules témoins et le groupe WJ (B). ns - non significatif, p > 0,05, ***p<0,001. Abréviations : WJ - jet d’eau, WN - aiguille Williams. Figure adaptée de Danalache et al. 202119. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 4. Comparaison des modules quantifiés de Young de WN respectivement WJ a délivré des cellules dans l’urètre cadavérique et leurs témoins correspondants. Aucune différence notable n’a été observée entre les cellules délivrées par les cellules WN et leurs témoins correspondants (A). Une diminution significative de l’élasticité a été notée entre les cellules délivrées par WJ et la monocouche de la cellule témoin (B). ns - non significatif, p > 0,05, ***p<0,001. Abréviations : WJ - jet d’eau, WN - aiguille Williams. Figure adaptée de Danalache et al. 202119. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Paramètre d’approche | Valeur |
| Approche IGain | 3,0 Hz |
| Approche PGain | 0.0002 |
| Atteindre la hauteur cible | 10,0 μm |
| Point de consigne de l’approche | 3,00 V |
| Approche de référence | 0,00 V |
Tableau 1. Paramètres d’approche.
| Paramètre Run | Valeur |
| Balle de set | 10 nN |
| Mouvement Z / Étendre la vitesse | Vitesse constante/ |
| 5,0 μm/s | |
| Heure de contact | 0,0 s |
| Longueur de traction | 90 μm |
| Mode de retard | Force constante |
| Taux d’échantillonnage | 2000 Hz |
Tableau 2. Paramètres d’exécution.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dans la présente étude, nous avons démontré et présenté une approche étape par étape pour la procédure d’administration de cellules WJ et utilisé une séquelle d’investigations quantitatives pour évaluer l’effet de l’administration WJ sur les caractéristiques cellulaires: viabilité cellulaire et caractéristiques biomécaniques (c.-à-d. EM). Après l’injection de WJ, 85,9% des cellules récoltées étaient viables. En termes d’injection de WN, 97,2% des cellules ont conservé leur viabilité après l’injection. Ainsi, l’approche WJ répond à une exigence absolue pour une mise en œuvre clinique : plus de 80% de cellules viables après l’accouchement18. Bien qu’un protocole normalisé et reproductible soit obtenu avec l’approche WJ, le résultat de l’administration de l’injection d’aiguille dépend fortement de la taille et de la buse de la seringue et de l’aiguille, de la pression, du débit et du médecin effectuant l’injection lui-même19.
Des études utilisant l’administration de cellules WJ dans des modèles animaux vivants ont montré qu’en faisant varier la pression d’éjection, la profondeur de pénétration peut être adaptée au tissu ciblé et, en tant que tel, à l’application clinique souhaitée13,16. Les injections de cellules transurétrales chez des animaux vivants sous contrôle visuel ont signalé un mauvais placement ou une perte de cellules chez environ 50 % des animaux traités20, tandis que les injections de WJ ont rapporté des taux d’injection cellulaire précis supérieurs à 90 % (Linzenbold et al.16 et observation non publiée). La norme d’or actuelle pour l’administration de cellules (injections d’aiguilles) exige la pénétration de la canule dans un tissu ciblé. Par conséquent, la traduction des cellules de l’aiguille provoque des blessures et des traumatismes dans tous les cas. Dans l’urètre, cela peut en fait provoquer une inflammation et une toxification dues aux germes et aux toxines présents même dans l’urine saine. De plus, le temps de fonctionnement de l’utilisateur dans l’injection WJ est significativement plus court par rapport à une injection à l’aiguille: les cellules sont placées en quelques millisecondes dans la couche tissulaire prévue en préréglant les niveaux de pression. En revanche, la profondeur de pénétration lors de l’injection d’aiguilles dans des zones éloignées par endoscopie dépend des compétences et de l’expérience du chirurgien. La reproductibilité de l’injection de WJ devrait également être supérieure, mais à l’heure actuelle, seules des données précliniques existent 15,16,20 et moins de 200 animaux ont été étudiés. Dans notre étude récente, nous avons noté que l’élasticité cellulaire est réduite par l’application de WJ par rapport aux injectionsd’aiguilles 21. Cela peut être attribué à la contrainte de cisaillement des cellules à une vitesse plus élevée pendant l’administration de WJ. De plus, la perte cellulaire éventuelle pourrait être compensée par une plus grande précision du placement et de l’éjection des cellules dans la région d’intérêt, comme cela a été réalisé avec l’accouchement guidé par WJ par cystoscopie guidée visuelle22.
Il est bien connu que les forces mécaniques dirigent le comportement des cellules souches, le potentiel de régénération ainsi que leur viabilité et leur fonctionnalité ultérieures après la transplantation 10,23. L’avènement de l’AFM atomique a fourni un outil puissant pour quantifier les propriétés mécaniques de cellules vivantes uniques en résolution nanométrique dans des conditions aqueuses 24,25,26,27. L’AFM est une méthode fiable et très sensible qui permet de détecter et d’enregistrer des rigidités allant de moins de 100 Pa à 106 Pa, couvrant ainsi une large gamme pour la majorité des tissus et cellules28. En fait, la mécanique cellulaire émerge comme biomarqueur sans étiquette pour évaluer l’état cellulaire et dans l’état physiologique et pathologique29 et l’élasticité cellulaire est la réponse synergique et cumulative du noyau - diaphonie du cytosquelette. Il est bien établi que lorsqu’une cellule est soumise à des forces externes, ces forces sont transmises de la membrane plasmique via le cytosquelette au noyau, entraînant des déformations intranucléaires et une réorganisation 30,31,32. Par conséquent, le noyau, longtemps considéré comme le matériel génomique et l’appareil de transcription, est également un acteur clé de la mécanotransduction cellulaire32. En fait, l’importance de la mécanique nucléaire et des connexions nucléo-cytosquelettiques, dans toutes les fonctions et mutations cellulaires, dans les lamines et les liants du nucléo-squelette au complexe du cytosquelette (LINC) - sont à la base de plusieurs pathologies 33,34. Ces forces pourraient également indiquer des artefacts cellulaires. Plus précisément, les forces générées externes se propagent le long des filaments du cytosquelette et sont ensuite transmises à la lame nucléaire à travers le complexe LINC; en réponse à ces forces, le noyau, en fait, devient plus rigide35,36, fusionnant ainsi les deux processus étroitement liés et liés. C’est aussi la raison d’être de notre approche et de nos mesures en mécanique nucléaire. De plus, un placement précis du porte-à-faux sur la surface nucléaire assure également un haut degré de reproductibilité et réduit les variations dues à l’hétérogénéité cellulaire et à la fixation au substrat.
Même si l’élasticité cellulaire émerge comme biomarqueur sans étiquette pour évaluer l’état cellulaire et dans les états physiologiques et pathologiques29, les modules élastiques mesurés sont marqués par de grandes variations même dans le même type cellulaire37. Une méthode pour contrer de telles variations, comme suggéré par Schillers et al., est la mise en œuvre de procédures AFM nanomécaniques normalisées (SNAP) qui assurent une reproductibilité et une applicabilité élevées des mesures d’élasticité en tant que marqueur quantitatif fiable pour les cellules dans divers états38. De plus, même si les paramètres expérimentaux utilisés dans les analyses AFM, tels que la vitesse d’indentation, la forme et la taille du pénétrateur ainsi que la représentation précise de la géométrie de la pointe dans l’ajustement du modèle 39, influencent les valeurs absolues mesurées40,41, ces paramètres ne devraient pas avoir d’impact sur les résultats d’une étude ou d’une tendance mesurée.
Cependant, gardez à l’esprit que les indentations AFM sont limitées à l’analyse de la surface externe des cellules et sont donc incapables de scanner l’intérieur d’une membrane cellulaire ou de structures intracellulaires particulières. Usukura et al. ont proposé une méthode de « dévoilement » qui brise la membrane cellulaire et élimine les composants cytoplasmiques solubles42, permettant ainsi des investigations intracellulaires AFM. Dans notre étude, cependant, l’accent a été mis sur l’évaluation des modules élastiques moyens plutôt que sur l’exploration de composants intracellulaires distincts et sélectifs.
Collectivement, la cohérence et la fiabilité des données AFM produites dépendent fortement de l’expérience technique de l’opérateur respectif et pourraient être biaisées par la variabilité biologique38. En tenant compte de toutes les variables sensibles qui pourraient affecter les résultats réels de l’AFM, les valeurs élastiques absolues rapportées dans cette étude ne peuvent pas être généralisées et sont plutôt spécifiques pour notre configuration expérimentale.
Dans l’ensemble, notre étude fournit des preuves21 ainsi qu’un protocole étape par étape pour la supériorité des injections de WJ sur les injections à l’aiguille pour le régime de thérapie cellulaire régénérative.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs J.K., M.D, T.A., A.S., W.K. A. n’ont rien à divulguer. Les auteurs W.L. et M.D.E. sont des employés d’ERBE Medizintechnik Lt. Tübingen, le producteur de l’ERBEJet2 et du prototype WJ utilisé dans cette étude.
Acknowledgments
Nous remercions nos co-auteurs des publications originales pour leur aide et leur soutien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL centrifuge tube | Greiner BioOne | 227261 | |
| 1 mL BD Luer-LokTM Syringe | BD Plastik Inc | n.a. | |
| 100 µm cell sieve | Greiner BioOne | 542000 | |
| 15 mL centrifuge tube | Greiner BioOne | 188271 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Corning Incorporated | 353136 | |
| AFM head | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
| AFM processing software | Bruker | JPK00518 | |
| AFM software | Bruker | JPK00518 | |
| AFM system Cell Hesion 200 | Bruker | JPK00518 | |
| All-In-One-Al cantilever | Budget Sensors | AIO-10 | tip A, Conatct Mode, Shape: Beam Force Constant: 0.2 N/m (0.04 - 0.7 N/m) Resonance Frequency: 15 kHz (10 - 20 kHz) Length: 500 µm (490 - 510 µm) Width: 30 µm (35 - 45 µm) Thickness: 2.7 µm (1.7 - 3.7 µm) |
| Amphotericin B solution | Sigma | A2942 | 250 µg/ml |
| Atomic Force Microscope (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| BD Microlance 3 18G | BD | 304622 | |
| bovine serum albumin | Gibco | A10008-01 | |
| Cantilever | All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | tip A, k ¼ 0.2 N/m |
| C-chip disposable hemocytometer | NanoEnTek | 631-1098 | |
| centrifuge: Rotina 420R | Hettich Zentrifugen | ||
| Collagenase, Type I, powder | Gibco | 17100-017 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - low glucose | Sigma | D5546 | |
| Feather disposable scalpel (No. 10) | Feather | 02.001.30.010 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
| HEPES sodium salt solution (1 M) | Sigma | H3662 | |
| Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| laboratory bags | Brand | 759705 | |
| Leibovitz's L-15 medium without l-glutamine | Merck | F1315 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
| L-glutamine | Lonza | BE 17-605C1 | 200 mM |
| LIVE/DEADTM Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | L3224 | Calcein AM and EthD-1 are used from this kit. |
| Microscope software: Zen 2.6 | Zeiss | ||
| Microscope: AxioVertA.1 | Zeiss | ||
| Nelaton-Catheter female | Bicakcilar | 19512051 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 10000 U/ml Penicillin 10000 µg/ml Streptomycin |
| Petri dish heater associated with AFM | Bruker | T-05-0117 | |
| Petri dish heater associated with AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-015 | |
| Statistical Software: SPSS Statistics 22 | IBM | ||
| Sterile Petri dish - CellStar | Greiner BioOne | 664160 | |
| Tissue culture dishes | TPP AG | TPP93040 | |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Trypan Blue 0.4% 0.85% NaCl |
Lonza | 17-942E | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | |
| Waterjet: ERBEJET2 device | Erbe Elektromedizin GmbH | ||
| Williams Cystoscopic Injection Needle | Cook Medical | G14220 | 23G, 5.0 Fr, 35 cm |
References
- Milsom, I., et al. Global prevalence and economic burden of urgency urinary incontinence: a systematic review. European Urology. 65 (1), 79-95 (2014).
- Lee, J. Y., et al. The effects of periurethral muscle-derived stem cell injection on leak point pressure in a rat model of stress urinary incontinence. International Urogynecology Journal and Pelvic Floor Dysfunction. 14 (1), 31-37 (2003).
- Tran, C., Damaser, M. S. The potential role of stem cells in the treatment of urinary incontinence. Therapeutic Advances in Urology. 7 (1), 22-40 (2015).
- Fu, Q., Song, X. F., Liao, G. L., Deng, C. L., Cui, L. Myoblasts differentiated from adipose-derived stem cells to treat stress urinary incontinence. Urology. 75 (3), 718-723 (2010).
- Corcos, J., et al. marrow mesenchymal stromal cell therapy for external urethral sphincter restoration in a rat model of stress urinary incontinence. Neurourology and Urodynamics. 30 (3), 447-455 (2011).
- Smaldone, M. C., Chen, M. L., Chancellor, M. B. Stem cell therapy for urethral sphincter regeneration. Minerva Urologica e Nefrologica. 61 (1), 27-40 (2009).
- Perin, E. C., López, J. Methods of stem cell delivery in cardiac diseases. Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine. 3, Suppl 1 110-113 (2006).
- Zhang, M., et al. Cardiomyocyte grafting for cardiac repair: graft cell death and anti-death strategies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (5), 907-921 (2001).
- Amer, M. H., White, L. J., Shakesheff, K. M. The effect of injection using narrow-bore needles on mammalian cells: administration and formulation considerations for cell therapies. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (5), 640-650 (2015).
- Amer, M. H., Rose, F. R. A. J., Shakesheff, K. M., Modo, M., White, L. J. Translational considerations in injectable cell-based therapeutics for neurological applications: concepts, progress and challenges. NPJ Regenerative Medicine. 2, 23-23 (2017).
- Linzenbold, W., Fech, A., Hofmann, M., Aicher, W. K., Enderle, M. D. Novel Techniques to Improve Precise Cell Injection. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6367 (2021).
- Adamo, A., Roushdy, O., Dokov, R., Sharei, A., Jensen, K. F. Microfluidic jet injection for delivering macromolecules into cells. Journal of Micromechanics and Microengineering: Structures, Devices, and Systems. 23, 035026 (2013).
- Jäger, L., et al. A novel waterjet technology for transurethral cystoscopic injection of viable cells in the urethral sphincter complex. Neurourology and Urodynamics. 39 (2), 594-602 (2020).
- Weber, M., et al. Hydrojet-based delivery of footprint-free iPSC-derived cardiomyocytes into porcine myocardium. Scientific Reports. 10 (1), 16787 (2020).
- Jäger, L., et al. A novel waterjet technology for transurethral cystoscopic injection of viable cells in the urethral sphincter complex. Neurourology and Urodynamics. 39 (2), 594-602 (2020).
- Linzenbold, W., et al. Rapid and precise delivery of cells in the urethral sphincter complex by a novel needle-free waterjet technology. BJU International. 127 (4), 463-472 (2021).
- Danalache, M., Tiwari, A., Sigwart, V., Hofmann, U. K. Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis. Journal of Visualized Experiments. (159), e61041 (2020).
- Gálvez-Martín, P., Hmadcha, A., Soria, B., Calpena-Campmany, A. C., Clares-Naveros, B. Study of the stability of packaging and storage conditions of human mesenchymal stem cell for intra-arterial clinical application in patient with critical limb ischemia. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 86 (3), 459-468 (2014).
- Danalache, M., et al. Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stromal Cells by a Novel Waterjet Technology. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), (2021).
- Amend, B., et al. Precise injection of human mesenchymal stromal cells in the urethral sphincter complex of Göttingen minipigs without unspecific bulking effects. Neurourology and Urodynamics. 36 (7), 1723-1733 (2017).
- Danalache, M., et al. Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stromal Cells by a Novel Waterjet Technology. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), 3958 (2021).
- Strasser, H., et al. 328: Transurethral Ultrasound Guided Stem Cell Therapy of Urinary Incontinence. Journal of Urology. 175 (4), 107 (2006).
- Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 18 (12), 728-742 (2017).
- Ding, Y., Xu, G. -K., Wang, G. -F. On the determination of elastic moduli of cells by AFM based indentation. Scientific Reports. 7 (1), 45575 (2017).
- Charras, G. T., Horton, M. A. Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation. Biophysical Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).
- Carl, P., Schillers, H. Elasticity measurement of living cells with an atomic force microscope: data acquisition and processing. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 457 (2), 551-559 (2008).
- Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. Journal of Biomechanics. 41 (2), 454-464 (2008).
- Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the mechanical properties of living cells using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (76), e50497 (2013).
- Li, M., Dang, D., Liu, L., Xi, N., Wang, Y. Atomic Force Microscopy in Characterizing Cell Mechanics for Biomedical Applications: A Review. IEEE Trans Nanobioscience. 16 (6), 523-540 (2017).
- Morimoto, A., et al. A conserved KASH domain protein associates with telomeres, SUN1, and dynactin during mammalian meiosis. The Journal of Cell Biology. 198 (2), 165 (2012).
- Lombardi, M. L., et al. The interaction between nesprins and sun proteins at the nuclear envelope is critical for force transmission between the nucleus and cytoskeleton. Journal of Biological Chemistry. 286 (30), 26743-26753 (2011).
- Isermann, P., Lammerding, J. Nuclear Mechanics and Mechanotransduction in Health and Disease. Current Biology. 23 (24), 1113-1121 (2013).
- Méjat, A. LINC complexes in health and disease. Nucleus. 1 (1), 40-52 (2010).
- Folker, E. S., Östlund, C., Luxton, G. G., Worman, H. J., Gundersen, G. G. Lamin A variants that cause striated muscle disease are defective in anchoring transmembrane actin-associated nuclear lines for nuclear movement. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (1), 131-136 (2011).
- Guilluy, C., et al. Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus. Nature cell biology. 16 (4), 376-381 (2014).
- Fischer, T., Hayn, A., Mierke, C. T. Effect of Nuclear Stiffness on Cell Mechanics and Migration of Human Breast Cancer Cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 393 (2020).
- Kuznetsova, T. G., Starodubtseva, M. N., Yegorenkov, N. I., Chizhik, S. A., Zhdanov, R. I. Atomic force microscopy probing of cell elasticity. Micron. 38 (8), 824-833 (2007).
- Schillers, H., et al. Standardized Nanomechanical Atomic Force Microscopy Procedure (SNAP) for Measuring Soft and Biological Samples. Scientific Reports. 7 (1), 5117 (2017).
- Costa, K. D., Yin, F. C. Analysis of indentation: implications for measuring mechanical properties with atomic force microscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 121 (5), 462-471 (1999).
- Stolz, M., et al. Dynamic elastic modulus of porcine articular cartilage determined at two different levels of tissue organization by indentation-type atomic force microscopy. Biophysical Journal. 86 (5), (2004).
- Park, S., Costa, K. D., Ateshian, G. A., Hong, K. S. Mechanical properties of bovine articular cartilage under microscale indentation loading from atomic force microscopy. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H. 223 (3), 339-347 (2009).
- Usukura, E., Narita, A., Yagi, A., Ito, S., Usukura, J. An Unroofing Method to Observe the Cytoskeleton Directly at Molecular Resolution Using Atomic Force Microscopy. Scientific Reports. 6 (1), 27472 (2016).
