Summary
Presentiamo un metodo di iniezione cellulare tramite tecnologia waterjet senza ago accoppiato con una sequela di indagini post-parto in termini di vitalità cellulare, proliferazione ed misure di elasticità.
Abstract
L'incontinenza urinaria (UI) è una condizione altamente prevalente caratterizzata dalla carenza del muscolo sfintere uretrale. I rami della medicina rigenerativa, in particolare la terapia cellulare, sono nuovi approcci per migliorare e ripristinare la funzione dello sfintere uretrale. Anche se l'iniezione di cellule funzionali attive viene eseguita di routine in contesti clinici con ago e siringa, questi approcci presentano svantaggi e limitazioni significativi. In questo contesto, la tecnologia waterjet (WJ) senza ago è un metodo fattibile e innovativo in grado di iniettare cellule vitali mediante cistoscopia guidata visivamente nello sfintere uretrale. Nel presente studio, abbiamo utilizzato WJ per fornire cellule stromali derivate dal tessuto adiposo suino (pADSC) nel tessuto uretrale cadaverico e successivamente abbiamo studiato l'effetto della consegna di WJ sulla resa cellulare e sulla vitalità. Abbiamo anche valutato le caratteristiche biomeccaniche (cioè l'elasticità) mediante misurazioni al microscopio a forza atomica (AFM). Abbiamo dimostrato che le pADSC consegnate da WJ erano significativamente ridotte nella loro elasticità cellulare. La redditività è stata significativamente inferiore rispetto ai controlli, ma è ancora superiore all'80%.
Introduction
L'incontinenza urinaria (UI) è una malattia diffusa con una prevalenza dell'1,8 - 30,5% nelle popolazioni europee1 ed è caratterizzata principalmente da malfunzionamenti dello sfintere uretrale. Da un punto di vista clinico, il trattamento chirurgico viene spesso offerto ai pazienti quando le terapie conservative o la fisioterapia non riescono ad affrontare e alleviare i sintomi emergenti.
La terapia cellulare per la potenziale riparazione rigenerativa del malfunzionamento del complesso sfinterico sta emergendo come approccio all'avanguardia per il trattamento della patologia UI 2,3. I suoi obiettivi principali sono sostituire, riparare e ripristinare la funzionalità biologica del tessuto danneggiato. Nei modelli animali per l'UI, il trapianto di cellule staminali ha mostrato risultati promettenti in esiti urodinamici 2,4,5. Le cellule staminali si presentano come candidati cellulari ottimali in quanto hanno la capacità di subire l'auto-rinnovamento e la differenziazione multipotente, aiutando così la rigenerazione del tessuto interessato6. Nonostante l'imminente potenziale rigenerativo, l'uso pratico della terapia cellulare rimane ostacolato poiché la somministrazione minimamente invasiva di cellule deve ancora affrontare diverse sfide riguardanti la precisione dell'iniezione e la copertura del bersaglio. Anche se l'attuale approccio utilizzato per la consegna cellulare è l'iniezione attraverso un sistema di siringa ad ago7, di solito si traduce in un deficit complessivo di cellule vitali, con viabilità segnalate a partire dall'1% al 31% dopo il trapianto8. Inoltre, la somministrazione di cellule tramite iniezione con ago ha anche dimostrato di influenzare il posizionamento, il tasso di ritenzione e la distribuzione delle cellule trapiantate nel tessuto bersaglio 9,10,11. Un approccio fattibile e nuovo che supera la limitazione di cui sopra è la consegna di cellule senza ago tramite la tecnologia a getto d'acqua.
La tecnologia Waterjet (WJ) sta emergendo come un nuovo approccio che consente la consegna ad alto rendimento delle cellule tramite cistoscopio sotto controllo visivo nello sfintere uretrale12,13. Il WJ consente l'erogazione di celle a diverse pressioni (E = effetti in bar) che vanno da E5 a E8013. Nella prima fase, (fase di penetrazione tissutale) la soluzione isotonica viene applicata ad alta pressione (cioè E60 o E80) al fine di allentare la matrice extracellulare che circonda il tessuto bersaglio e aprire piccole micro-lacune interconnesse. Nella seconda fase (la fase di iniezione), la pressione viene abbassata entro millisecondi (cioè fino a E10) per consegnare delicatamente le cellule nel tessuto bersaglio. A seguito di questa applicazione in due fasi, le cellule non sono sottoposte a pressione aggiuntiva contro il tessuto quando vengono espulse, ma galleggiano in un flusso a bassa pressione in un'area cavernosa piena di liquido13. In un ambiente modello ex vivo in cui le cellule staminali sono state iniettate tramite WJ nel tessuto cadaverico dell'uretra, le cellule vitali potrebbero essere successivamente aspirate e recuperate dal tessuto e ulteriormente espanse in vitro13. Sebbene uno studio del 2020 di Weber et al. abbia dimostrato la fattibilità e l'applicabilità di WJ per fornire cardiomiociti privi di impronta nel miocardio14, va tenuto presente che la tecnologia WJ è ancora in fase di prototipo.
Il seguente protocollo descrive come preparare ed etichettare le cellule stromali derivate dal tessuto adiposo suino (pADSC) e come consegnarle nel fluido di cattura e nel tessuto cadaverico tramite la tecnologia WJ e gli aghi per cistoscopia Williams (WN). Dopo l'iniezione cellulare, viene valutata la vitalità e l'elasticità cellulare tramite microscopia a forza atomica (AFM). Tramite istruzioni dettagliate, il protocollo fornisce un approccio chiaro e conciso per acquisire dati affidabili. La sezione di discussione presenta e descrive i principali vantaggi, limiti e prospettive future della tecnica. La consegna delle cellule WJ e le analisi post traduzione della sequela riportate qui stanno sostituendo l'iniezione standard dell'ago e forniscono un quadro di consegna delle cellule solide per la guarigione rigenerativa del tessuto bersaglio. Nei nostri recenti studi abbiamo fornito prove che WJ ha consegnato le cellule in modo più preciso e almeno con una vitalità comparabile rispetto alle iniezioni di ago15,16.
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Protocol
I campioni di tessuto adiposo suino sono stati ottenuti dall'Istituto di Chirurgia Sperimentale dell'Università di Tubinga. Tutte le procedure sono state approvate dalle autorità locali per il benessere degli animali con il numero di esperimento animale CU1/16.
1. Isolamento delle cellule stromali derivate dal tessuto adiposo suino
- Utilizzare tessuto adiposo suino consegnato dall'Istituto di Chirurgia Sperimentale in un tubo centrifugo da 50 ml al laboratorio.
- Trasferire il tessuto in una capsula di Petri sterile sotto il banco sterile e tritarlo con due bisturi (n. 10) in piccoli frammenti e poltiglia.
NOTA: Le forbici possono essere utilizzate anche per ottenere piccoli frammenti. Più piccoli sono i frammenti, meglio è per la successiva digestione.- Trasferire i piccoli frammenti/poltiglia in un tubo centrifugo da 50 mL e incubarlo con 5 mL di soluzione omogeneizzante per 30 minuti a 37 °C su uno shaker. La soluzione omogeneizzante è PBS con albumina sierica bovina all'1% (BSA) (soluzione madre: 1 % (p/v) BSA in PBS) e collagenasi di tipo I allo 0,1%.
NOTA: Preparare sempre la soluzione omogeneizzante al momento. Lo shaker ha un movimento di scuotimento circolare a bassa velocità 25-500 giri / min.
- Trasferire i piccoli frammenti/poltiglia in un tubo centrifugo da 50 mL e incubarlo con 5 mL di soluzione omogeneizzante per 30 minuti a 37 °C su uno shaker. La soluzione omogeneizzante è PBS con albumina sierica bovina all'1% (BSA) (soluzione madre: 1 % (p/v) BSA in PBS) e collagenasi di tipo I allo 0,1%.
- Per interrompere l'incubazione, aggiungere 10 ml di mezzi di crescita [Dulbecco's Modified Eagle's Medium - low glucose (DMEM-LG), 2,5% HEPES soluzione salina di sodio (1 M), 10% siero bovino fetale (FBS), 1% L-Glutamino (200 mM), 1% Penicillina-Streptomicina (10000 U/mL Penicillina; 10.000 μg/mL Streptomicina) e 1% Amfotericina B (250 μg/mL)].
NOTA: i mezzi di crescita possono essere preparati in anticipo. Antibiotici e farmaci antifungini sono necessari nella preparazione dei mezzi di crescita per la coltura cellulare per proteggere le cellule dalle contaminazioni. - Incubare i tubi della centrifuga per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Aspirare la frazione con adipociti, che è più leggero e quindi nuota sopra il liquido, con una pipetta da 10 ml e scartarla.
- Filtrare la frazione stromale rimanente attraverso un setaccio cellulare da 100 μm con una membrana in polietilene tereftalato (PET) priva di metalli pesanti per trattenere frammenti di tessuto adiposo e recuperare solo la sospensione cellulare.
- Centrifugare la sospensione a celle filtrate per 7 min a 630 x g a temperatura ambiente.
- Risospesciare il pellet cellulare in 2 ml di PBS per lavare le celle una volta.
- Centrifugare nuovamente la sospensione cellulare per 7 minuti a 630 x g a temperatura ambiente.
- Dopo centrifugazione e ripetuta risospensione del pellet cellulare in 10 ml di terreno di crescita per pallone, cellule di semi in palloni dicoltura a 2 cellule da 75 cm.
NOTA: A seconda delle dimensioni del pellet cellulare dopo la fase di lavaggio con PBS, le cellule di seme in uno o quattro palloni.
2. Coltivazione cellulare di cellule stromali derivate dal tessuto adiposo suino
- Raccogliere e passare le cellule quando raggiungono il 70% di confluenza.
- Lavare le celle con 10 ml di PBS due volte e aspirare completamente PBS.
NOTA: questo passaggio è necessario per rimuovere i mezzi di crescita rimanenti, che sono integrati dal 10% di FBS. FBS ha diversi inibitori della proteasi che possono ostacolare la funzione della seguente tripsinizzazione. - Aggiungere 3 ml di 0,05%-Tripsina-EDTA per pallone per staccare le cellule.
- Incubare i palloni per 3 minuti a 37 °C.
- Controllare al microscopio se le cellule sono staccate.
NOTA: a volte ci vuole un po 'più di tempo per staccare le celle. In questo caso, incubare i palloni per un massimo di 5 minuti a 37 °C. - Per interrompere il processo di incubazione e distacco, aggiungere 3 ml di mezzi di crescita.
NOTA: Come notato sopra, i mezzi di crescita sono integrati dal 10% di FBS che contiene inibitori della proteasi. - Trasferire le celle staccate in un tubo di centrifugazione e centrifugare per 7 minuti a 630 x g a temperatura ambiente.
- Risospesce le cellule in 10 ml di mezzi di crescita e contarle con un emocitometro.
- Cellule di semi con una densità di inoculazione di 3 x 105 celle per 75 cm2 pallone.
3. Etichettatura delle cellule con calcein-AM
NOTA: Le cellule che vengono iniettate nei tessuti cadaverici sono macchiate con una macchia di cellule vive permeabile alla membrana fluorescente verde e un indicatore di vitalità impermeabile alla membrana rosso-fluorescente per verificare che le cellule estratte siano le stesse delle cellule iniettate e non frammenti di tessuto dell'uretra.
- Lavare le celle due volte con 10 ml di PBS.
- Aggiungere 5 ml di soluzione colorante per un matraccio da 75 cm2 . La soluzione colorante è costituita da mezzi di crescita con 2 μM di colorante a cellule vive permeabile alla membrana verde-fluorescente e 4 μM indicatore di vitalità a membrana rosso-fluorescente.
- Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente al buio.
- Aspirare ed eliminare la soluzione colorante.
- Lavare di nuovo le celle due volte con 10 ml di PBS.
- Aggiungi mezzi di crescita e documenta il segnale di fluorescenza verde e rosso mediante microscopia a fluorescenza.
- Posizionare il pallone da 75 cm2 sul tavolo del microscopio, utilizzare l'obiettivo 10x, non selezionare alcun filtro di fluorescenza e assicurarsi che il percorso della luce trasmessa sia attivo.
NOTA: Questi passaggi vengono tutti eseguiti manualmente al microscopio. - Parallelamente al passaggio 3.6.1, aprire il programma software.
- Premere il pulsante Live sotto la scheda Individua per ottenere un'immagine in tempo reale delle celle nel pallone sul tavolo e concentrarsi su di esse con le unità di regolazione grossolane e fini.
NOTA: a vista la vista destra apparirà l'immagine dal vivo una volta attivato il pulsante Live . - Nella sottoscheda Componenti del microscopio, selezionare l'obiettivo corretto (10x).
- Nella sottoscheda Fotocamera, applicare un segno di spunta per Esposizione automatica.
- Premere il pulsante Snap per scattare la prima foto con la luce trasmessa.
- Inserire la barra di scala utilizzando la scheda Grafica nella barra dei menu e selezionando Barra di scala.
- Salvare l'immagine utilizzando la scheda File nella barra dei menu e selezionando Salva come czi.
- Per le immagini a fluorescenza cambiare il filtro con quello specifico per la fluorescenza verde o rossa e selezionare il percorso della luce riflessa.
NOTA: Queste modifiche devono essere eseguite manualmente al microscopio. - Premere nuovamente il pulsante Live sotto la scheda Individua per ottenere un'immagine live delle celle.
- Premere il pulsante Snap per scattare la seconda foto con fluorescenza verde o rossa.
- Inserire la barra di scala utilizzando la scheda Grafica nella barra dei menu e selezionando Barra di scala.
- Salvare l'immagine utilizzando la scheda File nella barra dei menu e selezionando Salva come czi.
- Ripetere i passaggi da 3.6.9 a 3.6.13 con l'altro canale di fluorescenza.
- Posizionare il pallone da 75 cm2 sul tavolo del microscopio, utilizzare l'obiettivo 10x, non selezionare alcun filtro di fluorescenza e assicurarsi che il percorso della luce trasmessa sia attivo.
4. Preparare campioni di tessuto uretrale per iniezioni
- Sezionare l'uretra e la vescica di collegamento fuori dal maiale.
NOTA: per gli esperimenti sono stati utilizzati campioni di tessuto uretrale da campioni cadaverici freschi di suini femmine adulti di razza autoctona. - Trasportarlo in laboratorio in sacchetti su ghiaccio bagnato.
NOTA: I campioni devono essere lasciati sul ghiaccio fino a un'ulteriore elaborazione. Nessun additivo è stato aggiunto ai campioni. - Posizionare l'uretra con la vescica su una spugna, che imita l'elasticità del pavimento pelvico inferiore.
- Utilizzare la vescica per determinare l'orientamento (prossimale, distale, dorsale e ventrale) dell'uretra. Ciò è possibile grazie alla localizzazione degli ureteri e dei tre legamenti che fissano la vescica nella cavità addominale e pelvica. I tre legamenti sono i due legamenti lateralia vesicae ai lati della vescica e il mediano vesicae, che nasce dalla superficie ventrale della vescica (Figura 1).
- Tagliare l'uretra longitudinalmente sul lato dorsale con l'aiuto di un catetere.
- Iniettare le cellule nell'uretra aperta come descritto nei capitoli seguenti.
5. Iniezioni di cellule tramite un ago Williams in fluidi e campioni di tessuto
- Cellule di raccolta come descritto nel passaggio 2.
- A differenza del passaggio 2.9, regolare la densità cellulare per iniezioni a 2,4 x 106 celle per ml.
NOTA: Per le iniezioni in campioni di tessuto etichettare le cellule con una cellula viva permeabile alla membrana verde-fluorescente. - Aspirare la sospensione cellulare con una siringa e applicarvi l'ago per iniezione cistoscopica Williams (WN).
- Tenere l'ago poco sopra i 2 mL di terreno di crescita in un tubo di centrifugazione da 15 mL o inserire l'ago nel tessuto dell'uretra aperto. In entrambi i casi iniettare manualmente 250 μL di cellule.
NOTA: Le cellule iniettate nell'uretra cadaverica formano una cupola di iniezione. - Raccogliere le cellule iniettate nel fluido direttamente mediante centrifugazione per 7 minuti a 630 x g a temperatura ambiente.
- Per le cellule iniettate nell'uretra cadaverica, aspirarle fuori dalla cupola di iniezione con un ago da 18 G applicato su una siringa.
- Trasferire le celle iniettate e aspirate in un tubo di centrifugazione e centrifuga per 7 minuti a 630 x g a temperatura ambiente in modo comparabile alle cellule iniettate nel mezzo.
- Dopo la centrifugazione, risospese le cellule in 4 ml di terreno di crescita in entrambi i casi.
- Determinare la resa cellulare e la vitalità con l'aiuto dell'esclusione del colorante blu Trypan con un emocitometro.
- Mescolare accuratamente 20 μL di sospensione cellulare con 20 μL di tripano blu.
- Riempire 10 μL di questa miscela in ogni camera dell'emocitometro.
NOTA: Entrambe le camere vengono riempite e contate per ottenere un'ottimizzazione statistica raddoppiando il campionamento. - Al microscopio, conta le cellule in tutti e quattro i quadrati d'angolo.
NOTA: Contare le cellule che brillano in bianco (non macchiate) come cellule vitali mentre le cellule che brillano di blu (macchiate) sono contate come cellule morte. - Per calcolare il numero di celle per mL, calcolare la media delle due camere, dividere questo numero per due e moltiplicarlo per 104.
6. Iniezioni di cellule tramite Waterjet in fluidi e campioni di tessuto
- Cellule di raccolta come descritto nel passaggio 2.
- A differenza dei passaggi 2.9 e 5.2, regolare la densità delle celle per le iniezioni a 6 x 106 celle per ml.
NOTA: Per le iniezioni in campioni di tessuto utilizzare cellule etichettate con una cellula viva permeabile alla membrana verde-fluorescente. - Riempire la sospensione cellulare nell'unità di dosaggio del dispositivo WJ.
- Tenere l'ugello di iniezione poco sopra i 2 mL di terreno di crescita in un tubo di centrifugazione da 15 ml o poco sopra il tessuto uretrale aperto.
- In entrambi i casi iniettare 100 μL di cellule dal dispositivo utilizzando un'alta pressione per la penetrazione dei tessuti seguita da una fase a bassa pressione per le iniezioni cellulari. Utilizzare le impostazioni di pressione E60-10.
NOTA: Le cellule iniettate nell'uretra cadaverica formano una cupola di iniezione. - Raccogliere le cellule iniettate nel fluido direttamente mediante centrifugazione per 7 minuti a 630 x g a temperatura ambiente.
- Per le cellule iniettate nell'uretra cadaverica, aspirarle fuori dalla cupola di iniezione con un ago da 18 G applicato su una siringa.
- Trasferire le celle iniettate e aspirate in un tubo di centrifugazione e centrifuga per 7 minuti a 630 x g a temperatura ambiente in modo comparabile alle cellule iniettate nel mezzo.
- Dopo la centrifugazione, in entrambi i casi le cellule risospese in 4 mL di terreno di crescita.
- Determinare la resa cellulare e la vitalità con l'aiuto dell'esclusione del colorante blu Trypan con un emocitometro come descritto in dettaglio in 5.10.
7. Valutazione biomeccanica dell'elasticità cellulare mediante microscopia a forza atomica (AFM)
- Preparazione dei campioni
NOTA: Le cellule recuperate dopo l'iniezione sono ora soggette a ulteriori analisi da parte di AFM. Inoltre, le cellule che non sono state iniettate vengono utilizzate come controlli.- Cellule di semi in piatti di coltura tissutale con una densità di 5 x 105 cellule per piatto.
NOTA: Seminare un piatto di coltura tissutale per condizione. Le condizioni sono controlli, ADSC iniettati da WJ o WN in media e ADSC iniettati da WJ o WN nel tessuto cadaverico. - Incubare le cellule in piatti di coltura tissutale per 3 ore a 37 °C.
NOTA: Per evitare variazioni dovute alle cellule in fase G1 e durante la mitosi, abbiamo eseguito misurazioni AFM 3 ore dopo la fase di semina cellulare. - Poco prima della misurazione con l'AFM sostituire il mezzo di crescita con 3 ml di L-15 di Leibovitz senza L-glutammina.
- Posizionare la parabola di coltura tissutale nel portacampioni del dispositivo AFM e accendere il riscaldatore della capsula di Petri impostato a 37 °C.
- Cellule di semi in piatti di coltura tissutale con una densità di 5 x 105 cellule per piatto.
- Preparazione della calibrazione AFM e a sbalzo
- Utilizzare un mattone di vetro specificato per le misurazioni in liquidi e regolarlo sul supporto AFM.
NOTA: la superficie superiore del mattone di vetro deve essere diritta e parallela al supporto AFM. - Posizionare con attenzione il cantilever sulla superficie del blocco di vetro. La punta A deve essere posata sul piano ottico lucido.
NOTA: non graffiare la superficie ottica lucida del mattone di vetro perché i graffi potrebbero causare interferenze nelle misurazioni. La punta A deve sporgere sul piano ottico lucido perché altrimenti non è possibile la riflessione del laser dell'AFM al fotorivelatore. - Per stabilizzare il cantilever sul mattone di vetro, aggiungere una molla metallica con l'aiuto di una pinzetta.
- Quando il cantilever è fissato sul mattone di vetro, posizionare il blocco sulla testa AFM e bloccare il meccanismo di bloccaggio integrato.
- Montare la testa AFM sul dispositivo AFM.
NOTA: La molla deve essere rivolta verso il lato sinistro per essere posizionata correttamente. In caso contrario, correggere la posizione del mattone di vetro e regolare nuovamente la testa AFM. - Inizializzare la configurazione del software e aprire il software insieme alla finestra di allineamento laser e alle impostazioni dei parametri di avvicinamento. Inoltre, accendere il motore passo-passo, la luce laser e la telecamera CCD.
- Identificare la punta A a sbalzo utilizzando la telecamera CCD.
- Abbassare il cantilever fino a quando non è completamente immerso nel mezzo. Utilizzare la funzione del motore passo-passo per raggiungere questo obiettivo.
- Una volta che il cantilever è completamente coperto dal mezzo, il laser viene allineato sulla parte superiore del cantilever utilizzando le viti di regolazione. Il fascio riflesso deve cadere sul centro del fotorivelatore e la somma dei segnali deve essere di 1 V o superiore. Le deflessioni laterali e verticali dovrebbero essere vicine a 0.
NOTA: Se il centro viene raggiunto può essere monitorato nella funzione di allineamento laser così come i valori del segnale. Se i valori del segnale non sono corretti, sono necessarie ulteriori regolazioni. - Eseguire ora lo scanner Approach con i parametri di approccio (Tabella 1).
- Ritrarre il cantilever di 100 μm una volta raggiunto il fondo premendo il pulsante Retract .
NOTA: assicurarsi che nessuna cella sia attaccata a quel campo in cui viene eseguito l'approccio perché ciò falsificherebbe la calibrazione. - Impostare i parametri run in base alle seguenti specifiche: Setpoint 1 V, Lunghezza di trazione 90 μm, Velocità: 5 μm/s, Frequenza di campionamento: 2000 Hz e come modalità di ritardo: Forza costante.
- Avviare la misurazione della curva forza-distanza di calibrazione premendo il pulsante Esegui.
NOTA: Facendo clic sul pulsante Esegui nel software si ottiene una curva forza-distanza. - Selezionare la regione di adattamento lineare della curva retratta nel software sulla curva forza-distanza di calibrazione ottenuta. Calcola la misurazione della costante della molla tramite il software.
- Calibrare il cantilever seguendo i parametri e i passaggi esatti descritti da Danalache et al.17.
- Utilizzare un mattone di vetro specificato per le misurazioni in liquidi e regolarlo sul supporto AFM.
- Misurare l'elasticità delle singole cellule
- Identifica visivamente una cellula e concentrati su di essa. Posizionare il mouse del computer al centro della cella. Per migliorare la precisione delle misurazioni, posizionare la punta AFM direttamente sopra il nucleo della cella.
NOTA: il mouse del computer viene utilizzato come marcatore visivo per identificare il sito di rientro di destinazione. - Ora concentrati sul cantilever e spostalo sul mouse del computer.
- Iniziare la misurazione con Run con i parametri indicati nella Tabella 2.
NOTA: vengono utilizzati i parametri del set point ottenuti mediante calibrazione del cantilever. Inoltre, una cellula viene misurata tre volte. Misurare almeno 50 celle.
- Identifica visivamente una cellula e concentrati su di essa. Posizionare il mouse del computer al centro della cella. Per migliorare la precisione delle misurazioni, posizionare la punta AFM direttamente sopra il nucleo della cella.
- Elaborazione dati
- Elaborare i dati seguendo passaggi e parametri esatti come precedentemente descritto da Danalache17.
- Salvare ed esportare il file.
8. Analisi statistica
- Aprire il software statistico.
- Scegliere la selezione di Nuovo set di dati.
NOTA: vengono aperti due file. Uno è il "DataSet" e l'altro è il file "Output". - Selezionare il file DataSet e aprire la scheda Visualizzazione variabile .
- Inserire le variabili numeriche per l'iniezione in sito (fluido di cattura o tessuto cadaverico), categoria (controllo, iniezione WJ, iniezione WN) ed elasticità.
- Inserire i dati di elasticità misurati con l'iniezione del sito e il numero di categoria corrispondenti nella scheda Visualizzazione dati .
- Analizza i dati selezionando la scheda della barra dei menu Analizza | Statistiche descrittive e scegliere Analisi esplorativa dei dati.
- Come variabile dipendente, selezionare Elasticità e l'elenco fattori selezionare Categoria.
NOTA: i risultati vengono visualizzati nel file "Output", incluso un box plot utilizzato per la sezione dei risultati. - Per eseguire un test statistico, selezionare Campioni indipendenti all'interno del Test non parametrico nella scheda Analizza della barra dei menu.
- Nel nuovo file aperto mantenere le impostazioni nella scheda Obiettivo e Impostazioni.
- Aprire la scheda Campi e scegliere Elasticità come campi di test e Categoria come gruppi.
- Premere Esegui.
NOTA: i risultati vengono visualizzati nel file "Output". Per queste analisi viene eseguito un test di Mann-U-Whitney. - Includere il risultato del test non parametrico nel box plot dell'analisi esplorativa dei dati.
- Salvare i file selezionando File nella barra dei menu e scegliendo Salva.
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Representative Results
Dopo la somministrazione cellulare attraverso i due approcci, la vitalità delle cellule erogate attraverso il WN (97,2 ± 2%, n = 10, p <0,002) era più elevata rispetto alle iniezioni di WJ utilizzando le impostazioni E60-10 (85,9 ± 0,16%, n = 12) (Figura 2). I risultati della valutazione biomeccanica hanno mostrato che: le iniezioni di WN di cellule nel fluido di cattura non mostravano differenze significative rispetto ai moduli elastici (EM; 0,992 kPa) rispetto ai controlli (1,176 kPa; Figura 3A), mentre le iniezioni di WJ hanno innescato una significativa riduzione dell'EM cellulare (0,440 kPa, p<0,001, Figura 3B). È stata osservata una diminuzione del 40-50% dei mercati emergenti dopo le iniezioni di WJ. Anche se le iniezioni di WN nel tessuto cadaverico dell'uretra non hanno prodotto differenze significative nell'EM cellulare (Figura 4A), è stata osservata una significativa riduzione dell'EM dopo le iniezioni di WJ in campioni di tessuto (da 0,890 kPa a 0,429 kPa; p<0,00, Figura 4B). Pertanto, i valori EM assoluti dopo l'iniezione di WJ sono stati ridotti del 51%. Collettivamente, i risultati mostrano che mentre la consegna delle cellule WJ soddisfa un requisito assoluto per un'implementazione clinica in cui oltre l'80% delle cellule vitali dopo la consegna18 , dopo la consegna WJ i moduli elastici delle cellule sono interessati. Un EM cellulare più basso potrebbe facilitare la migrazione delle caratteristiche delle cellule dopo la consegna WJ. In una distribuzione e una gamma così ampia di capacità rigenerative nella regione desiderata19.
Figura 1. Anatomia della vescica suina e dell'uretra e siti di iniezione. A) Vengono mostrati il lato ventrale della vescica suina e dell'uretra con i tre legamenti che fissano la vescica nella cavità addominale e pelvica. Inoltre, vengono mostrati gli ureteri che terminano sul lato dorsale della vescica. B) Immagine rappresentativa dell'uretra cadaverica utilizzata per l'iniezione di WJ e WN. Longitudinalmente, vengono mostrate l'uretra dorsale aperta con cupole di iniezione cerchiate in nero. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Iniezioni di determinazione della vitalità cellulare tramite WN e WJ. Le pADSC iniettate tramite WN o WJ sono state raccolte dopo l'iniezione e contate tramite esclusione di Trypan per determinare la vitalità. La vitalità cellulare è stata significativamente ridotta dopo l'iniezione di WJ rispetto alle cellule erogate tramite WN. p<0.001. I dati vengono visualizzati graficamente come media con deviazione standard. Abbreviazioni: WJ - waterjet, WN - Williams needle. Figura adattata da Danalache et al. 202119. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Confronto dei moduli quantificati di Young di WN rispettivamente WJ ha consegnato le cellule nei mezzi di cattura e i loro controlli corrispondenti. Nessuna differenza notevole nell'EM è stata osservata nei boxplot per i monostrati cellulari di controllo (non trattati) e nelle cellule consegnate WN (A). Al contrario, si può notare una significativa diminuzione dell'elasticità tra i boxplot delle celle di controllo e il gruppo WJ (B). ns - non significativo, p > 0,05, ***p<0,001. Abbreviazioni: WJ - waterjet, WN - Williams needle. Figura adattata da Danalache et al. 202119. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Confronto dei moduli quantificati di Young di WN rispettivamente WJ ha consegnato cellule in uretra cadaverica e i loro controlli corrispondenti. Non è stata osservata alcuna differenza notevole tra le cellule erogate tramite cellule WN e i loro corrispondenti controlli (A). Una significativa diminuzione dell'elasticità è stata osservata tra le cellule consegnate WJ e il monostrato della cellula di controllo (B). ns - non significativo, p > 0,05, ***p<0,001. Abbreviazioni: WJ - waterjet, WN - Williams needle. Figura adattata da Danalache et al. 202119. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Parametro di approccio | Valore |
| Approccio IGain | 3,0 Hz |
| Approccio PGain | 0.0002 |
| Altezza target di avvicinamento | 10,0 μm |
| Setpoint di approccio | 3,00 V |
| Linea di base dell'approccio | 0,00 V |
Tabella 1. Parametri di approccio.
| Parametro Run | Valore |
| Set point | 10 nN |
| Movimento Z / Estendere la velocità | Velocità costante/ |
| 5,0 μm/s | |
| Tempo di contatto | 0,0 s |
| Lunghezza di trazione | 90 μm |
| Modalità ritardo | Forza costante |
| Frequenza di campionamento | 2000 Hz |
Tabella 2. Esegui parametri.
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Discussion
Nel presente studio, abbiamo dimostrato e presentato un approccio graduale per la procedura di consegna delle cellule WJ e abbiamo impiegato una sequela di indagini quantitative per valutare l'effetto della consegna di WJ sulle caratteristiche cellulari: vitalità cellulare e caratteristiche biomeccaniche (cioè EM). Dopo l'iniezione di WJ, l'85,9% delle cellule raccolte era vitale. In termini di iniezione di WN, il 97,2% delle cellule ha mantenuto la propria vitalità dopo l'iniezione. Pertanto, l'approccio WJ soddisfa un requisito assoluto per un'implementazione clinica: oltre l'80% di cellule vitali dopo la consegna18. Mentre un protocollo standardizzato e riproducibile viene raggiunto con l'approccio WJ, il risultato della somministrazione dell'iniezione dell'ago dipende fortemente dalle dimensioni e dall'ugello della siringa e dell'ago, dalla pressione, dalla portata e dal medico che esegue l'iniezionestessa 19.
Studi che impiegano la somministrazione di cellule WJ in modelli animali viventi hanno dimostrato che variando la pressione di espulsione, la profondità di penetrazione può essere adattata al tessuto bersaglio e, come tale, all'applicazione clinica desiderata13,16. Le iniezioni di cellule transuretrali in animali vivi sotto controllo visivo hanno riportato un posizionamento errato o una perdita di cellule in circa il 50% degli animali trattati20, mentre le iniezioni di WJ hanno riportato tassi di iniezione cellulare precisi superiori al 90% (Linzenbold et al.16 e osservazione non pubblicata). L'attuale standard aureo per la somministrazione cellulare (iniezioni di ago) richiede la penetrazione della cannula in un tessuto mirato. Pertanto, la traduzione delle cellule dell'ago provoca lesioni e traumi in tutti i casi. Nell'uretra, questo può effettivamente causare infiammazione e tossificazione a causa di germi e tossine presenti anche nelle urine sane. Inoltre, il tempo di funzionamento dell'utente nell'iniezione di WJ è significativamente più breve rispetto a un'iniezione con ago: le cellule vengono posizionate entro millisecondi nello strato di tessuto previsto preimpostando i livelli di pressione. Al contrario, la profondità di penetrazione sull'iniezione dell'ago in aree remote mediante endoscopia dipende dalle capacità e dall'esperienza del chirurgo. Anche la riproducibilità dell'iniezione di WJ dovrebbe essere superiore, ma attualmente esistono solo dati pre-clinici 15,16,20 e meno di 200 animali sono stati studiati. Nel nostro recente studio abbiamo notato che l'elasticità cellulare è ridotta dall'applicazione di WJ rispetto alle iniezioni di ago21. Ciò può essere attribuito allo sforzo di taglio delle cellule a velocità più elevata durante la consegna di WJ. Inoltre, l'eventuale perdita cellulare potrebbe essere compensata da una maggiore precisione di posizionamento ed espulsione delle cellule all'interno della regione di interesse, come ottenuto con la consegna guidata da WJ mediante cistoscopia22 guidata visivamente.
È noto che le forze meccaniche dirigono il comportamento delle cellule staminali, il potenziale di rigenerazione e la loro successiva vitalità e funzionalità post-trapianto 10,23. L'avvento dell'AFM atomico ha fornito un potente strumento per quantificare le proprietà meccaniche delle singole cellule viventi in risoluzione su scala nanometrica in condizioni acquose 24,25,26,27. AFM è un metodo affidabile e altamente sensibile in grado di rilevare e registrare rigidità che vanno da meno di 100 Pa a 106 Pa, coprendo così una vasta gamma per la maggior parte dei tessuti e delle cellule28. Infatti, la meccanica cellulare sta emergendo come biomarcatore label-free per valutare lo stato cellulare e nello stato sia fisiologico che patologico29 e l'elasticità cellulare è la risposta sinergica e cumulativa del crosstalk nucleo - citoscheletro. È ben noto che quando una cellula è sottoposta a forze esterne, queste forze vengono trasmesse dalla membrana plasmatica attraverso il citoscheletro al nucleo, con conseguenti deformazioni intranucleari e riorganizzazione 30,31,32. Pertanto il nucleo, a lungo visto come materiale genomico e apparato di trascrizione, è un attore chiave anche nella meccanotrasduzione cellulare32. Infatti, l'importanza della meccanica nucleare e delle connessioni nucleo-citoscheletriche, in tutte le funzioni cellulari e mutazioni, nelle lamine e nei linker del nucleo-scheletro al complesso citoscheletro (LINC) - sono alla base iniziale di diverse patologie 33,34. Queste forze potrebbero anche indicare artefatti cellulari. In particolare, le forze generate dall'esterno si propagano effettivamente lungo i filamenti citoscheletrici e vengono ulteriormente trasmesse alla lamina nucleare attraverso il complesso LINC; in risposta a queste forze, il nucleo, infatti, diventapiù rigido 35,36, fondendo così i due processi strettamente intrecciati e connessi. Questa è anche la logica del nostro approccio e delle nostre misurazioni di meccanica nucleare. Inoltre, un posizionamento preciso del cantilever sulla superficie nucleare garantisce anche un elevato grado di riproducibilità e riduce le variazioni dovute all'eterogeneità cellulare e all'attaccamento al substrato.
Anche se l'elasticità cellulare sta emergendo come biomarcatore label-free per valutare lo stato cellulare e sia negli stati fisiologici che patologici29, i moduli elastici misurati sono caratterizzati da grandi variazioni anche nello stesso tipo di cellula37. Un metodo per contrastare tali variazioni come suggerito da Schillers et al. è l'implementazione di procedure AFM nanomeccaniche standardizzate (SNAP) che garantiscono un'elevata riproducibilità e applicabilità delle misurazioni di elasticità come marcatore quantitativo affidabile per le cellule in vari stati38. Inoltre, anche se i parametri sperimentali impiegati nelle analisi AFM, come la velocità di indentazione, la forma e le dimensioni del penetratore, nonché la rappresentazione accurata della geometria della punta nel raccordo del modello 39, influenzano i valori assoluti misurati40,41, questi parametri non dovrebbero influire sui risultati all'interno di uno studio o di una tendenza misurata.
Tuttavia, tieni presente che le rientranze AFM sono limitate all'analisi della superficie esterna delle cellule e sono, quindi, incapaci di scansionare l'interno di una membrana cellulare o di particolari strutture intracellulari. Usukura et al. hanno proposto un metodo di "unroofing" che rompe la membrana cellulare e rimuove i componenti citoplasmatico-solubili42, consentendo così indagini intracellulari AFM. Nel nostro studio, tuttavia, l'attenzione è stata posta sulla valutazione dei moduli elastici medi piuttosto che sondare componenti intracellulari distinti e selettivi.
Collettivamente, la coerenza e l'affidabilità dei dati AFM prodotti dipendono fortemente dall'esperienza tecnica del rispettivo operatore e potrebbero essere influenzate dalla variabilità biologica38. Tenendo conto di tutte le variabili sensibili che potrebbero influenzare i risultati effettivi dell'AFM, i valori elastici assoluti riportati in questo studio non possono essere generalizzati e sono piuttosto specifici per la nostra configurazione sperimentale.
Nel complesso, il nostro studio fornisce prove21 e un protocollo passo-passo per la superiorità delle iniezioni di WJ rispetto alle iniezioni di ago per il regime di terapia cellulare rigenerativa.
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Disclosures
Gli autori J.K., M.D, T.A., A.S., W.K. A. non hanno nulla da rivelare. Gli autori W.L. e M.D.E. sono dipendenti di ERBE Medizintechnik Lt. Tübingen, il produttore dell'ERBEJet2 e del prototipo WJ impiegato in questo studio.
Acknowledgments
Ringraziamo i nostri co-autori delle pubblicazioni originali per il loro aiuto e supporto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL centrifuge tube | Greiner BioOne | 227261 | |
| 1 mL BD Luer-LokTM Syringe | BD Plastik Inc | n.a. | |
| 100 µm cell sieve | Greiner BioOne | 542000 | |
| 15 mL centrifuge tube | Greiner BioOne | 188271 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Corning Incorporated | 353136 | |
| AFM head | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
| AFM processing software | Bruker | JPK00518 | |
| AFM software | Bruker | JPK00518 | |
| AFM system Cell Hesion 200 | Bruker | JPK00518 | |
| All-In-One-Al cantilever | Budget Sensors | AIO-10 | tip A, Conatct Mode, Shape: Beam Force Constant: 0.2 N/m (0.04 - 0.7 N/m) Resonance Frequency: 15 kHz (10 - 20 kHz) Length: 500 µm (490 - 510 µm) Width: 30 µm (35 - 45 µm) Thickness: 2.7 µm (1.7 - 3.7 µm) |
| Amphotericin B solution | Sigma | A2942 | 250 µg/ml |
| Atomic Force Microscope (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| BD Microlance 3 18G | BD | 304622 | |
| bovine serum albumin | Gibco | A10008-01 | |
| Cantilever | All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | tip A, k ¼ 0.2 N/m |
| C-chip disposable hemocytometer | NanoEnTek | 631-1098 | |
| centrifuge: Rotina 420R | Hettich Zentrifugen | ||
| Collagenase, Type I, powder | Gibco | 17100-017 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - low glucose | Sigma | D5546 | |
| Feather disposable scalpel (No. 10) | Feather | 02.001.30.010 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
| HEPES sodium salt solution (1 M) | Sigma | H3662 | |
| Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| laboratory bags | Brand | 759705 | |
| Leibovitz's L-15 medium without l-glutamine | Merck | F1315 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
| L-glutamine | Lonza | BE 17-605C1 | 200 mM |
| LIVE/DEADTM Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | L3224 | Calcein AM and EthD-1 are used from this kit. |
| Microscope software: Zen 2.6 | Zeiss | ||
| Microscope: AxioVertA.1 | Zeiss | ||
| Nelaton-Catheter female | Bicakcilar | 19512051 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 10000 U/ml Penicillin 10000 µg/ml Streptomycin |
| Petri dish heater associated with AFM | Bruker | T-05-0117 | |
| Petri dish heater associated with AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-015 | |
| Statistical Software: SPSS Statistics 22 | IBM | ||
| Sterile Petri dish - CellStar | Greiner BioOne | 664160 | |
| Tissue culture dishes | TPP AG | TPP93040 | |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Trypan Blue 0.4% 0.85% NaCl |
Lonza | 17-942E | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | |
| Waterjet: ERBEJET2 device | Erbe Elektromedizin GmbH | ||
| Williams Cystoscopic Injection Needle | Cook Medical | G14220 | 23G, 5.0 Fr, 35 cm |
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