Summary
Vi presenterer en metode for celleinjeksjon via nålfri vannjetteknologi kombinert med en oppfølger av undersøkelser etter levering når det gjelder cellulær levedyktighet, spredning og elastisitetsmålinger.
Abstract
Urininkontinens (UI) er en svært utbredt tilstand preget av mangelen på urinrørssfinktermuskelen. Regenerative medisingrener, spesielt celleterapi, er nye tilnærminger for å forbedre og gjenopprette urinrørssfinkterfunksjonen. Selv om injeksjon av aktive funksjonelle celler rutinemessig utføres i kliniske omgivelser med nål og sprøyte, har disse tilnærmingene betydelige ulemper og begrensninger. I denne sammenhengen er nålfri waterjet (WJ)-teknologi en gjennomførbar og innovativ metode som kan injisere levedyktige celler ved visuell guidet cystoskopi i urinrørssfinkteren. I den nåværende studien brukte vi WJ til å levere svine fettvevsavledede stromale celler (pADSCer) i kadaverisk urinrørsvev og undersøkte deretter effekten av WJ-levering på celleutbytte og levedyktighet. Vi vurderte også de biomekaniske egenskapene (dvs. elastisitet) ved målinger av atomkraftmikroskopi (AFM). Vi viste at WJ leverte pADSCer ble betydelig redusert i deres cellulære elastisitet. Levedyktigheten var betydelig lavere sammenlignet med kontroller, men er fortsatt over 80%.
Introduction
Urininkontinens (UI) er en utbredt lidelse med en prevalens på 1,8 - 30,5% i europeiske populasjoner1 og er hovedsakelig preget av funksjonsfeil i urinrørssfinkteren. Fra et klinisk perspektiv tilbys kirurgisk behandling ofte til pasienter når konservative terapier eller fysioterapi ikke klarer å adressere og lindre de fremvoksende symptomene.
Celleterapi for potensiell regenerativ reparasjon av sphincterkompleksfeilen har dukket opp som en avantgarde-tilnærming for behandling av UI-patologi 2,3. Hovedmålene er å erstatte, reparere og gjenopprette den biologiske funksjonaliteten til det skadede vevet. I dyremodeller for UI har stamcelletransplantasjon vist lovende resultater i urodynamiske utfall 2,4,5. Stamceller oppstår som optimale cellulære kandidater som de har evnen til å gjennomgå selvfornyelse og multipotent differensiering, og dermed hjelpe den berørte vev regenerering6. Til tross for det kommende regenerative potensialet, forblir den praktiske bruken av celleterapi hindret, da minimal invasiv levering av celler fortsatt står overfor flere utfordringer med hensyn til injeksjonspresisjon og dekning av målet. Selv om den nåværende tilnærmingen som brukes til cellelevering er injeksjon gjennom et sprøytesystem7, resulterer det vanligvis i et samlet underskudd av levedyktige celler, med rapporterte viaevner så lave som 1%- 31% etter transplantasjon8. I tillegg har cellelevering via nåleinjeksjon også vist seg å påvirke plasseringen, oppbevaringsgraden, samt distribusjon av transplanterte celler i det målrettede vevet 9,10,11. En gjennomførbar, ny tilnærming som overvinner ovennevnte begrensning er nålfri cellelevering via vannstråleteknologi.
Waterjet (WJ) teknologi dukker opp som en ny tilnærming som muliggjør høy gjennomstrømning levering av celler ved cystoskop under visuell kontroll i urinrør sphincter12,13. WJ muliggjør cellelevering ved ulike trykk (E = effekter i bar) fra E5 til E8013. I den første fasen påføres (vevsinntrengningsfase) isotonisk løsning med høyt trykk (dvs. E60 eller E80) for å løsne den ekstracellulære matrisen rundt vevet som er målrettet og åpne små sammenkoblede mikro-laktuna. I den andre fasen (injeksjonsfasen) senkes trykket innen millisekunder (dvs. opp til E10) for å forsiktig levere cellene inn i det målrettede vevet. Etter denne to trinnfaseapplikasjonen blir cellene ikke utsatt for ekstra trykk mot vevet når de kastes ut, men flyter i en lavtrykksstrøm inn i et væskefylt huleområde13. I en ex vivo modell setting hvor stamceller ble injisert via WJ i kadaverisk urinrør vev, levedyktige celler kunne etterpå aspireres og hentes fra vevet og ytterligere utvidet in vitro13. Selv om en studie fra 2020 av Weber et al. demonstrerte WJs gjennomførbarhet og anvendbarhet for å levere fotavtrykkfrie kardiomyocytter inn i myokardiet14, må den tas i betraktning at WJ-teknologien fortsatt er i et prototypestadium.
Følgende protokoll beskriver hvordan du klargjør og merker porcin fettvevsavledede stromalceller (pADSC) og hvordan du leverer dem til fangstvæske og kadavervev via WJ-teknologi og Williams cystoskopinåler (WN). Post cellulær injeksjon vurderes cellulær vitalitet og elastisitet via atomkraftmikroskopi (AFM). Via trinnvise instruksjoner gir protokollen en klar og kortfattet tilnærming for å skaffe pålitelige data. Diskusjonsdelen presenterer og beskriver teknikkens store fordeler, begrensninger og fremtidsperspektiver. WJ-leveransen av celler samt oppfølgeren postoversettelsesanalyser rapportert her erstatter standard nåleinjeksjon og gir et solid celleleveringsrammeverk for regenerativ helbredelse av målvevet. I våre nylige studier ga vi bevis for at WJ leverte celler mer presist og i det minste i sammenlignbar levedyktighet sammenlignet med nåleinjeksjoner15,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Porcine fettvevsprøvene ble hentet fra Institutt for eksperimentell kirurgi ved Universitetet i Tuebingen. Alle prosedyrer ble godkjent av lokale dyrevelferdsmyndigheter under dyreforsøksnummer CU1/16.
1. Isolering av svine fettvevsavledede stromalceller
- Bruk porcin fettvev levert fra Institutt for eksperimentell kirurgi i et 50 ml sentrifugerør til laboratoriet.
- Overfør vevet til en steril Petri-tallerken under den sterile benken og hakk det med to skalpeller (nr. 10) til små fragmenter og mos.
MERK: Saks kan også brukes for å få små fragmenter. Jo mindre fragmentene er, desto bedre for følgende fordøyelse.- Overfør de små fragmentene/mushen til et 50 ml sentrifugerør og inkuber det med 5 ml homogenisatoroppløsning i 30 minutter ved 37 °C på en shaker. Homogenisatorløsningen er PBS med 1% bovint serumalbumin (BSA) (lagerløsning: 1 % (w/v) BSA i PBS) og 0,1 % kollagenalos type I.
MERK: Klargjør alltid homogenisatoroppløsningen på nytt. Shakeren har en sirkulær ristingsbevegelse med en langsom hastighet 25-500 rpm.
- Overfør de små fragmentene/mushen til et 50 ml sentrifugerør og inkuber det med 5 ml homogenisatoroppløsning i 30 minutter ved 37 °C på en shaker. Homogenisatorløsningen er PBS med 1% bovint serumalbumin (BSA) (lagerløsning: 1 % (w/v) BSA i PBS) og 0,1 % kollagenalos type I.
- For å stoppe inkubasjonen, tilsett 10 ml vekstmedier [Dulbecco's Modified Eagle's Medium - low glucose (DMEM-LG), 2,5% HEPES natriumsaltoppløsning (1 M), 10% foster bovint serum (FBS), 1% L-Glutamin (200 mM), 1% Penicillin-Streptomycin (10000 U/mL Penic; 10 000 μg/ml streptomycin) og 1 % amfotericin B (250 μg/ml)].
MERK: Vekstmedier kan tilberedes på forhånd. Antibiotika og antifungale legemidler er nødvendige for å forberede vekstmediene for cellekultur for å beskytte celler mot forurensninger. - Inkuber sentrifugerørene i 10 min ved romtemperatur.
- Aspirer fraksjonen med adipocytter, som er lettere og derfor svømmer på toppen av væsken, med en 10 ml pipette og kast den.
- Filtrer den gjenværende stromale fraksjonen gjennom en 100 μm cellesikte med en polyetylentereftalat (PET) membran fri for tungmetaller for å holde tilbake fettvevsfragmenter og for å hente bare celleopphenget.
- Sentrifuger den filtrerte cellefjæringen i 7 min ved 630 x g ved romtemperatur.
- Resuspend cellepellet i 2 ml PBS for å vaske cellene en gang.
- Sentrifuger cellefjæringen igjen i 7 min ved 630 x g ved romtemperatur.
- Etter sentrifugering og gjentatt resuspensjon av cellepellet i 10 ml vekstmedier per kolbe, frøceller i 75 cm2 cellekulturflasker.
MERK: Avhengig av størrelsen på cellepellet etter vasketrinnet med PBS, frøceller i en til fire kolber.
2. Celle dyrking av svin fettvev-avledede stromale celler
- Høst og passasje celler når de når 70% samløp.
- Vask celler med 10 ml PBS to ganger og aspirer PBS helt.
MERK: Dette trinnet er nødvendig for å fjerne gjenværende vekstmedier, som suppleres med 10% FBS. FBS har flere proteasehemmere som kan hindre funksjonen til følgende trypsinisering. - Tilsett 3 ml 0,05%-Trypsin-EDTA per kolbe for å løsne cellene.
- Inkuber kolber i 3 min ved 37 °C.
- Kontroller under mikroskopet om cellene er koblet fra.
MERK: Noen ganger tar det litt mer tid å løsne cellene. I dette tilfellet inkuberer du kolber i maksimalt 5 min ved 37 °C. - For å stoppe inkubasjons- og avløsningsprosessen, legg til 3 ml vekstmedier.
MERK: Som nevnt ovenfor kompletteres vekstmedier med 10% FBS som inneholder proteasehemmere. - Overfør de frittliggende cellene til et sentrifugeringsrør og sentrifuger i 7 min ved 630 x g ved romtemperatur.
- Resuspend cellene i 10 ml vekstmedier og telle dem med et hemocytometer.
- Frøceller med en inokulasjonstetthet på 3 x 105 celler per 75 cm2 kolbe.
3. Merking av celler med calcein-AM
MERK: Celler som injiseres i kadaveriske vev, er farget med en grønn fluorescerende membrangjennomtrengelig levende celleflekk og en rød-fluorescerende membran-ugjennomtrengelig levedyktighetsindikator for å bekrefte at ekstraherte celler er de samme som de injiserte cellene og ikke vevsfragmenter i urinrøret.
- Vask celler to ganger med 10 ml PBS.
- Tilsett 5 ml fargestoffoppløsning per 75 cm2 kolbe. Fargestoffløsningen består av vekstmedier med 2 μM av den grønn-fluorescerende membrangjennomtrengelige levende cellefargen og 4 μM rødfluorescerende membran-ugjennomtrengelig levedyktighetsindikator.
- Inkuber i 30 min ved romtemperatur i mørket.
- Aspirer og kast fargestoffløsningen.
- Vask cellene igjen to ganger med 10 ml PBS.
- Tilsett vekstmedier og dokumenter det grønne og røde fluorescenssignalet ved fluorescensmikroskopi.
- Plasser 75 cm2-kolben på mikroskopbordet, bruk 10x-målet, velg ikke noe fluorescensfilter og sørg for at den overførte lysbanen er aktiv.
MERK: Alle disse trinnene utføres manuelt på mikroskopet. - Åpne programmet parallelt med trinn 3.6.1.
- Trykk på Live-knappen under Finn-fanen for å få et levende bilde av cellene i kolben på bordet og fokuser på dem med de grove og fine justeringsstasjonene.
MERK: Ved høyre øyekast vises live-bildet når Live-knappen er aktivert. - I mikroskopkomponentene i underkategorien velger du riktig målsetting (10x).
- Merk av for Automatisk eksponering på underfanen Kamera.
- Trykk på knappen Fest for å ta det første bildet med overført lys.
- Sett inn skalalinjen ved hjelp av kategorien Grafikk på menylinjen, og velg Skalalinje.
- Lagre bildet ved hjelp av kategorien Filer på menylinjen, og velg Lagre som czi.
- For fluorescensbildene endrer du filteret til det som er spesifikt for grønn eller rød fluorescens, og velger den reflekterte lysbanen.
MERK: Disse endringene må gjøres manuelt på mikroskopet. - Trykk på nytt Live-knappen under Finn-fanen for å få et levende bilde av cellene.
- Trykk på knappen Fest for å ta det andre bildet med enten grønn eller rød fluorescens.
- Sett inn skalalinjen ved hjelp av kategorien Grafikk på menylinjen, og velg Skalalinje.
- Lagre bildet ved hjelp av kategorien Filer på menylinjen, og velg Lagre som czi.
- Gjenta trinn 3.6.9 til 3.6.13 med den andre fluorescenskanalen.
- Plasser 75 cm2-kolben på mikroskopbordet, bruk 10x-målet, velg ikke noe fluorescensfilter og sørg for at den overførte lysbanen er aktiv.
4. Forbered urinrørsvevsprøver til injeksjonsvæsker
- Disseker urinrøret og tilkoblingsblæren ut av grisen.
MERK: Urinrørsvevsprøver fra ferske kadaverprøver av voksne kvinnelige landrace griser ble brukt til forsøkene. - Transporter den til laboratoriet i poser på våt is.
MERK: Prøvene bør stå på is inntil videre behandling. Ingen tilsetningsstoffer ble lagt til prøvene. - Plasser urinrøret med blæren på en svamp, som etterligner elastisiteten til det nedre bekkenbunnen.
- Bruk blæren til å bestemme retningen (proksimal, distal, dorsal og ventral) av urinrøret. Dette er mulig på grunn av lokalisering av urinlederne og de tre leddbåndene som fikser blæren i buk- og bekkenhulen. De tre leddbåndene er de to vesikae lateralia ligamentene på sidene av blæren og vesicae medianum, som oppstår fra blærens ventrale overflate (figur 1).
- Klipp opp urinrøret langsgående på dorsalsiden ved hjelp av et kateter.
- Injiser cellene i den åpne urinrøret som beskrevet i følgende kapitler.
5. Injeksjoner av celler via en Williams nål i væsker og vev prøver
- Høst celler som beskrevet i trinn 2.
- I motsetning til trinn 2.9 justerer du celletettheten for injeksjoner til 2,4 x 106 celler per ml.
MERK: For injeksjoner i vevsprøver merker cellene med en grønn fluorescerende membrangjennomtrengelig levende celle. - Aspirer cellefjæringen med en sprøyte og påfør Williams cystoskopisk injeksjonsnål (WN) på den.
- Enten hold nålen kort tid over 2 ml vekstmedier i et 15 ml sentrifugeringsrør eller sett nålen inn i det åpne urinrøret. I begge tilfeller injisere 250 μL celler manuelt.
MERK: Celler som injiseres i urinrøret danner en injeksjonskuppel. - Samle celler injisert i media direkte ved sentrifugering i 7 min ved 630 x g ved romtemperatur.
- For celler som injiseres i urinrøret, aspirer dem ut av injeksjonskuppelen med en 18G nål påført på en sprøyte.
- Overfør de injiserte og aspirerte cellene til et sentrifugeringsrør og sentrifuger i 7 min ved 630 x g ved romtemperatur tilsvarende cellene som injiseres i media.
- Etter sentrifugering, resuspend cellene i 4 ml vekstmedier i begge tilfeller.
- Bestem celleutbytte og levedyktighet ved hjelp av Trypan blå fargestoffekskludering med et hemocytometer.
- Bland 20 μL celleoppheng grundig med 20 μL Trypan blå.
- Fyll 10 μL av denne blandingen i hvert kammer på hemocytometeret.
MERK: Begge kamrene fylles og telles for å få statistisk optimalisering ved å doble prøvetakingen. - Under et mikroskop teller du celler i alle fire hjørne firkanter.
MERK: Tell celler som skinner i hvitt (ubegrunnet) som levedyktige celler, mens celler som skinner blått (farget) regnes som døde celler. - For å beregne cellenummeret per ml, beregn gjennomsnittet av de to kamrene, del dette tallet med to og multipliser det med 104.
6. Injeksjoner av celler via Waterjet i væsker og vevsprøver
- Høst celler som beskrevet i trinn 2.
- I motsetning til trinn 2.9 og 5.2 justerer du celletettheten for injeksjoner til 6 x 106 celler per ml.
MERK: For injeksjoner i vevsprøver brukes celler merket med en grønn-fluorescerende membrangjennomtrengelig levende celle. - Fyll celleopphenget i doseringsenheten på WJ-enheten.
- Hold enten injeksjonsdysen kort tid over 2 ml vekstmedier i et 15 ml sentrifugeringsrør eller kort tid over det åpne urinrøret.
- I begge tilfeller injisere 100 μL av celler av enheten ved hjelp av et høyt trykk for vev penetrasjon etterfulgt av en lavtrykksfase for celleinjeksjoner. Bruk trykkinnstillingene E60-10.
MERK: Celler som injiseres i urinrøret danner en injeksjonskuppel. - Samle celler injisert i media direkte ved sentrifugering i 7 min ved 630 x g ved romtemperatur.
- For celler som injiseres i urinrøret, aspirer dem ut av injeksjonskuppelen med en 18G nål påført på en sprøyte.
- Overfør de injiserte og aspirerte cellene til et sentrifugeringsrør og sentrifuger i 7 min ved 630 x g ved romtemperatur tilsvarende cellene som injiseres i media.
- Etter sentrifugering, resuspend celler i 4 ml vekstmedier i begge tilfeller.
- Bestem celleutbytte og levedyktighet ved hjelp av Trypan blå fargestoffekskludering med et hemocytometer som beskrevet i detalj i 5.10.
7. Biomekanisk vurdering av cellulær elastisitet ved atomkraftmikroskopi (AFM)
- Utarbeidelse av prøver
MERK: De hentede cellene etter injeksjonen er nå gjenstand for videre analyser av AFM. I tillegg brukes celler som ikke ble satt inn, som kontroller.- Frøceller i vevskulturretter med en tetthet på 5 x 105 celler per tallerken.
MERK: Frø en vevskulturrett per tilstand. Betingelsene er kontroller, ADSCer injisert av WJ eller WN i medier og ADSCer injisert av WJ eller WN i kadavervev. - Inkuber celler i vevskulturretter i 3 timer ved 37 °C.
MERK: For å unngå varianser på grunn av celler i G1-fase og under mitose, utførte vi AFM-målinger 3 timer etter cellesåingstrinnet. - Rett før målingen med AFM erstatter vekstmediene med 3 ml Leibovitz's L-15-medier uten L-glutamin.
- Plasser vevskulturfatet i prøveholderen på AFM-enheten og slå på Petri-varmeren som er satt til 37 °C.
- Frøceller i vevskulturretter med en tetthet på 5 x 105 celler per tallerken.
- Fremstilling av AFM- og cantileverkalibrering
- Bruk en glassblokk som er spesifisert for målinger i væsker, og juster den på AFM-holderen.
MERK: Glassblokkens øvre overflate må være rett og parallelt med AFM-holderen. - Plasser forsiktig cantilever på overflaten av glassblokken. Spissen A må ligge over det polerte optiske planet.
MERK: Ikke skrap den polerte optiske overflaten på glassblokken fordi riper kan føre til forstyrrelser i målingene. Spissen A må stikke ut over det polerte optiske planet fordi ellers er ikke refleksjonen av laseren til AFM til fotodetektoren mulig. - For å stabilisere cantilever på glassblokken, legg til en metallisk fjær ved hjelp av pinsett.
- Når cantileveren er festet på glassblokken, plasser blokken på AFM-hodet og lås den integrerte låsemekanismen.
- Monter AFM-hodet på AFM-enheten.
MERK: Fjæren må vende mot venstre side for å bli plassert riktig. Hvis dette ikke er tilfelle, korrigerer du plasseringen av glassblokken og justerer AFM-hodet igjen. - Initialiser programvareoppsettet og åpne programvaren sammen med laserjusteringsvinduet og innstillingene for tilnærmingsparametere. I tillegg slår du på steppermotoren, laserlyset og CCD-kameraet.
- Identifiser cantilever-spissen A ved hjelp av CCD-kameraet.
- Senk cantilever til den er helt dyppet i mediet. Bruk steppermotorfunksjonen for å nå dette målet.
- Når cantilever er fullstendig dekket av medium, er laseren justert på toppen av cantilever ved hjelp av justeringsskruene. Den reflekterte strålen må falle på midten av fotodetektoren, og summen av signalene må være 1 V eller høyere. De laterale og vertikale avbøyningene skal være nær 0.
MERK: Hvis senteret nås, kan det overvåkes i laserjusteringsfunksjonen så vel som signalverdiene. Hvis signalverdiene ikke er riktige, er det nødvendig med ytterligere justeringer. - Kjør nå skanneren Tilnærming med tilnærmingsparameterne (tabell 1).
- Trekk tilbake cantilever med 100 μm når den når bunnen ved å trykke på Tilbaketrekk-knappen .
MERK: Forsikre deg om at ingen celler er festet til det feltet hvis tilnærmingen er gjort fordi dette ville forfalske kalibreringen. - Sett opp Run-parametrene i henhold til følgende spesifikasjoner: Setpoint 1 V, Pulling Length 90 μm, Velocity: 5 μm/s, Samplingsfrekvens: 2000 Hz og som forsinkelsesmodus: Konstant kraft.
- Start målingen av kalibreringskraftavstandskurven ved å trykke på knappen Kjør.
MERK: Ved å klikke på Kjør-knappen i programvaren oppnås en kraftavstandskurve. - Velg området for lineær passform av den tilbaketrukne kurven i programvaren på den oppnådde kalibreringskraftavstandskurven. Beregn våren konstant måling av programvaren.
- Kalibrer cantileveren ved å følge de nøyaktige parametrene og trinnene som beskrevet av Danalache et al.17.
- Bruk en glassblokk som er spesifisert for målinger i væsker, og juster den på AFM-holderen.
- Måling av elastisiteten til individuelle celler
- Identifiser en celle visuelt og fokuser på den. Plasser datamusen midt i cellen. For å forbedre målepresisjonen plasserer du AFM-spissen rett over cellekjernen.
MERK: Datamusen brukes som visuell markør for å identifisere målstedet for innrykk. - Fokuser nå på cantilever og flytt den på datamusen.
- Start målingen med Kjør med parameterne angitt i tabell 2.
MERK: Den innstilte punktparameteren oppnådd ved kalibrering av cantilever brukes. Videre måles en celle tre ganger. Mål minst 50 celler.
- Identifiser en celle visuelt og fokuser på den. Plasser datamusen midt i cellen. For å forbedre målepresisjonen plasserer du AFM-spissen rett over cellekjernen.
- Databehandling
- Behandle dataene ved å følge nøyaktige trinn og parametere som tidligere beskrevet av Danalache17.
- Lagre og eksporter filen.
8. Statistisk analyse
- Åpne den statistiske programvaren.
- Velg det merkede området for Nytt datasett.
MERK: To filer åpnes. Den ene er "DataSet" og den andre er "Output" -filen. - Velg DataSet-filen , og åpne kategorien Variabelvisning .
- Sett inn de numeriske variablene for injeksjon på stedet (fangstvæske eller kadavervev), kategori (kontroll, WJ-injeksjon, WN-injeksjon) og elastisitet.
- Sett inn de målte elastisitetsdataene med tilhørende områdeinjeksjon og kategorinummer i kategorien Datavisning .
- Analysere dataene ved å velge menylinjefanen Analyser | Beskrivende statistikk og velg Utforskende dataanalyse.
- Velg Elastisitet og faktorliste som avhengig variabel, velg Kategori.
MERK: Resultatene vises i "Output" -filen, inkludert en boksplott som brukes til resultatdelen. - Hvis du vil utføre en statistisk test, velger du Uavhengige eksempler i den ikke-parametriske testen under menylinjefanen Analyser.
- I den nye åpne filen beholder du innstillingene i kategorien Målsetting og Innstillinger.
- Åpne fanen Felt, og velg Elastisitet som testfelt og kategori som grupper.
- Trykk Kjør.
MERK: Resultatene vises i "Output" -filen. For disse analysene utføres en Mann-U-Whitney-test. - Inkluder resultatet av den ikke-parametriske testen i bokstegningen for den utforskende dataanalysen.
- Lagre filene ved å velge Fil på menylinjen og velge Lagre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter cellelevering via de to tilnærmingene var levedyktigheten til celler levert gjennom WN (97,2 ± 2 %, n=10, p<0,002) høyere sammenlignet med injeksjoner av WJ ved hjelp av E60-10-innstillingene (85,9 ± 0,16 %, n=12) (figur 2). Biomekaniske vurderingsresultater viste at: WN-injeksjoner av celler i fangstvæske viste ingen signifikant forskjell med hensyn til elastisk moduli (EM; 0,992 kPa) sammenlignet med kontrollene (1,176 kPa; figur 3A), mens WJ-injeksjoner utløste en signifikant reduksjon av cellulær EM (0,440 kPa, p<0,001, figur 3B). En reduksjon på 40 - 50% av EM etter WJ-injeksjoner ble notert. Selv om WN-injeksjoner i kadaverisk urinrørvev ikke ga noen signifikant forskjell i cellulær EM (figur 4A) ble det notert en signifikant reduksjon i EM etter WJ-injeksjoner i vevsprøver (0,890 kPa til 0,429 kPa; p<0,00, figur 4B). Dermed ble absolutte EM-verdier etter WJ-injeksjon dermed redusert med 51%. Samlet viser resultatene at mens WJ-cellelevering oppfyller et absolutt krav til en klinisk implementering der mer enn 80% levedyktige celler etter levering18 , etter WJ-levering, påvirkes celle elastisk moduli. En lavere cellulær EM kan lette migrering av funksjoner i cellene etter WJ-levering. I et så bredere fordelings- og utvalg av regenerative kapasiteter i ønsket region19.
Figur 1. Anatomi av svineblæren og urinrøret og injeksjonssteder. A) Den ventrale siden av svineblæren og urinrøret med de tre leddbåndene som fester blæren i buk- og bekkenhulen, vises. I tillegg vises urinlederne som slutter på dorsalsiden av blæren. B) Representativt bilde av urinrøret som brukes til WJ og WN injeksjon. Langsgående vises dorsal åpnet urinrør med injeksjonskupler sirklet i svart. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Cellulære levedyktighetsbestemmelsesinjeksjoner via WN og WJ. pADSCer injisert via WN eller WJ ble samlet inn etter injeksjon og telt via Trypan-utelukkelse for å bestemme levedyktigheten. Den cellulære levedyktigheten ble betydelig redusert etter WJ-injeksjon sammenlignet med celler levert via WN. p<0.001. Dataene vises grafisk som gjennomsnitt med standardavvik. Forkortelser: WJ - waterjet, WN - Williams nål. Figur tilpasset danalache et al. 202119. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Sammenligning av den kvantifiserte Youngs moduli av henholdsvis WN WJ leverte celler til fangstmedier og deres tilsvarende kontroller. Ingen merkbar forskjell i EM ble observert i boxplots for kontrollen (ubehandlet) cellemonolayers og WN leverte celler (A). Derimot kan en betydelig reduksjon i elastisitet noteres mellom boksplotene til kontrollcellene og WJ-gruppen (B). ns - ikke signifikant, p > 0,05, ***p<0,001. Forkortelser: WJ - waterjet, WN - Williams nål. Figur tilpasset danalache et al. 202119. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4. Sammenligning av kvantifiserte Youngs moduli av henholdsvis WN WJ leverte celler i kadaverisk urinrør og deres tilsvarende kontroller. Det ble ikke observert noen merkbar forskjell mellom celler levert via WN-celler og deres tilsvarende kontroller (A). En betydelig reduksjon i elastisitet ble notert mellom WJ-leverte celler og kontrollcellemonolayeren (B). ns - ikke signifikant, p > 0,05, ***p<0,001. Forkortelser: WJ - waterjet, WN - Williams nål. Figur tilpasset danalache et al. 202119. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Parameter for tilnærming | Verdi |
| Tilnærming IGain | 3,0 Hz |
| Tilnærming PGain | 0.0002 |
| Nærmer seg målhøyde | 10,0 μm |
| Settpunkt for tilnærming | 3,00 V |
| Opprinnelig plan for tilnærming | 0,00 V |
Tabell 1. Parametere for tilnærming.
| Kjør parameter | Verdi |
| Angi punkt | 10 nN |
| Z Bevegelse / Utvid hastighet | Konstant hastighet/ |
| 5,0 μm/s | |
| Tidspunkt for kontakt | 0,0 s |
| Trekklengde | 90 μm |
| Forsinkelsesmodus | Konstant kraft |
| Samplingsfrekvens | 2000 Hz |
Tabell 2. Kjør parametere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I den nåværende studien demonstrerte og presenterte vi en trinnvis tilnærming for WJ-celleleveringsprosedyren og brukte en oppfølger av kvantitative undersøkelser for å vurdere effekten av WJ-levering på cellulære egenskaper: cellulær levedyktighet og biomekaniske egenskaper (dvs. EM). Etter WJ-injeksjon var 85,9% av de høstede cellene levedyktige. Når det gjelder WN-injeksjon, beholdt 97,2% av cellene sin levedyktighet etter injeksjon. Dermed oppfyller WJ-tilnærmingen et absolutt krav til en klinisk implementering: mer enn 80% levedyktige celler etter levering18. Mens en standardisert og reproduserbar protokoll oppnås med WJ-tilnærmingen, er utfallet av nåleinjeksjonslevering svært avhengig av størrelsen og dysen på sprøyten og nålen, trykket, strømningshastigheten og legen som utfører injeksjonen selv19.
Studier som benytter WJ cellelevering i levende dyremodeller viste at ved varierende utkastelsestrykk kan penetrasjonsdybden tilpasses det målrettede vevet og som sådan til ønsket klinisk anvendelse13,16. Transuretrale celleinjeksjoner hos levende dyr under visuell kontroll rapporterte feilplassering eller tap av celler hos ca. 50% av dyrene som ble behandlet20, mens WJ-injeksjoner rapporterte presise celleinjeksjonsrater over 90% (Linzenbold et al.16 og upublisert observasjon). Den nåværende gyldne standarden for cellelevering (nåleinjeksjoner) krever penetrasjon av kanylen i et målrettet vev. Derfor forårsaker nålcelleoversettelse skade og traumer i alle tilfeller. I urinrøret kan dette faktisk forårsake betennelse ad toxification på grunn av bakterie og giftstoffer som finnes i selv i sunn urin. I tillegg er brukeroperasjonstiden i WJ-injeksjon betydelig kortere sammenlignet med en nåleinjeksjon: cellene plasseres innen millisekunder i det tiltenkte vevslaget ved å forhåndsinnstille trykknivået. I kontrast er penetrasjonsdybden på nåleinjeksjon i avsidesliggende områder ved endoskopi avhengig av kirurgens ferdigheter og erfaring. Reproduserbarheten av WJ-injeksjon forventes også å være overlegen, men for tiden finnes det bare prekliniske data 15,16,20 og mindre enn 200 dyr ble undersøkt. I vår nylige studie bemerket vi at cellulær elastisitet reduseres ved WJ-applikasjon sammenlignet med nåleinjeksjoner21. Dette kan tilskrives skjærspenningen til celler i høyere hastighet under WJ-levering. Videre kan eventuelt celletap kompenseres av en høyere presisjon av celleplassering og utkastelse innenfor interesseområdet som oppnås med WJ veiledet levering ved visuell veiledet cystoskopi22.
Det er velkjent at mekaniske krefter direkte stamcelleadferd, regenereringspotensial samt deres etterfølgende levedyktighet og funksjonalitet etter transplantasjon 10,23. Fremveksten av atomisk AFM ga et kraftig verktøy for å kvantifisere de mekaniske egenskapene til enkelt levende celler i nanoskalaoppløsning under vandige forhold 24,25,26,27. AFM er en pålitelig og svært følsom metode som kan oppdage og registrere stivheter som spenner fra mindre enn 100 Pa til 106 Pa, og dermed dekker et bredt spekter for de fleste vev og celler28. Faktisk fremstår cellemekanikk som etikettfri biomarkør for evaluering av celletilstand og i både fysiologisk og patologisk tilstand29 og celleelastisitet er den synergetiske og kumulative responsen til kjernen - cytoskeleton krysstale. Det er godt fastslått at når en celle blir utsatt for eksterne krefter, overføres disse kreftene fra plasmamembranen via cytoskjelettet til kjernen, noe som resulterer i intra-nukleære deformasjoner og omorganisering 30,31,32. Derfor er kjernen, lenge sett på som det genomiske materialet og transkripsjonsapparatet, en nøkkelspiller i den cellulære mekanotransduksjonen også32. Faktisk er betydningen av kjernemekanikk og nukleo-cytoskeletale forbindelser, i alle cellulære funksjoner og mutasjoner, i laminer og linkere av nukleo-skjelettet til cytoskjelettkomplekset (LINC) - ved utbruddet av flere patologier 33,34. Disse kreftene kan også indikere cellulære artefakter. Spesielt forplanter eksterne genererte krefter seg faktisk langs cytoskeletale filamenter og overføres videre til kjernefysisk lamina over LINC-komplekset; Som svar på disse kreftene blir kjernen faktisk stivere35,36, og fusjonerer dermed de to tett sammenflettede og tilkoblede prosessene. Dette er også begrunnelsen for vår tilnærming og våre kjernefysiske mekanikkmålinger. Videre sikrer en presis plassering av cantileveren på toppen av atomoverflaten også en høy grad av reproduserbarhet og reduserer variasjoner på grunn av celle heterogenitet og vedlegg til substratet.
Selv om celleelastisitet fremstår som etikettfri biomarkør for evaluering av celletilstanden og i både fysiologiske og patologiske tilstander29, er den målte elastiske modulen preget av store variasjoner selv i samme celletype37. En metode for å motvirke slike variasjoner som foreslått av Schillers et al. er implementeringen av standardiserte nanomekaniske AFM-prosedyrer (SNAP) som sikrer høy reproduserbarhet og anvendbarhet av elastisitetsmålinger som en pålitelig kvantitativ markør for celler i ulike tilstander38. Selv om eksperimentelle parametere som brukes i AFM-analysene, som innrykkshastighet, innrykksform og -størrelse samt nøyaktig representasjon av spissgeometri i modelltilpasning 39, påvirker de absolutt målte verdiene40,41, bør disse parametrene ikke påvirke resultatene i en studie eller en målt tendens.
Husk imidlertid at AFM-innrykk er begrenset til analysen av den ytre overflaten av celler og dermed ikke er i stand til å skanne innsiden av en cellemembran eller bestemte intracellulære strukturer. Usukura et al. foreslo en "unroofing" metode som bryter cellulær membran og fjerner cytoplasmatisk-løselige komponenter42, og dermed tillater AFM-intracellulære undersøkelser. I vår studie ble det imidlertid lagt vekt på vurdering av gjennomsnittlig elastisk moduli i stedet for å undersøke distinkte og selektive intracellulære komponenter.
Samlet sett avhenger konsistensen og påliteligheten til de gitte AFM-dataene sterkt av den tekniske opplevelsen til den respektive operatøren og kan være partisk av biologisk variasjon38. Når vi tar høyde for alle sensitive variabler som kan påvirke de faktiske AFM-resultatene, kan de absolutte elastiske verdiene som rapporteres i denne studien ikke generaliseres og er ganske spesifikke for vårt eksperimentelle oppsett.
Totalt sett gir studien vår bevis21 samt en trinnvis protokoll for overlegenheten av WJ-injeksjoner over nåleinjeksjoner for regenerativ celleterapiregime.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne J.K., M.D, T.A., A.S., W.K. A. har ingenting å avsløre. Forfatterne W.L. og M.D.E. er ansatte i ERBE Medizintechnik Lt. Tübingen, produsenten av ERBEJet2 og WJ-prototypen som brukes i denne studien.
Acknowledgments
Vi takker våre medforfattere fra de opprinnelige publikasjonene for deres hjelp og støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL centrifuge tube | Greiner BioOne | 227261 | |
| 1 mL BD Luer-LokTM Syringe | BD Plastik Inc | n.a. | |
| 100 µm cell sieve | Greiner BioOne | 542000 | |
| 15 mL centrifuge tube | Greiner BioOne | 188271 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Corning Incorporated | 353136 | |
| AFM head | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
| AFM processing software | Bruker | JPK00518 | |
| AFM software | Bruker | JPK00518 | |
| AFM system Cell Hesion 200 | Bruker | JPK00518 | |
| All-In-One-Al cantilever | Budget Sensors | AIO-10 | tip A, Conatct Mode, Shape: Beam Force Constant: 0.2 N/m (0.04 - 0.7 N/m) Resonance Frequency: 15 kHz (10 - 20 kHz) Length: 500 µm (490 - 510 µm) Width: 30 µm (35 - 45 µm) Thickness: 2.7 µm (1.7 - 3.7 µm) |
| Amphotericin B solution | Sigma | A2942 | 250 µg/ml |
| Atomic Force Microscope (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| BD Microlance 3 18G | BD | 304622 | |
| bovine serum albumin | Gibco | A10008-01 | |
| Cantilever | All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | tip A, k ¼ 0.2 N/m |
| C-chip disposable hemocytometer | NanoEnTek | 631-1098 | |
| centrifuge: Rotina 420R | Hettich Zentrifugen | ||
| Collagenase, Type I, powder | Gibco | 17100-017 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - low glucose | Sigma | D5546 | |
| Feather disposable scalpel (No. 10) | Feather | 02.001.30.010 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
| HEPES sodium salt solution (1 M) | Sigma | H3662 | |
| Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| laboratory bags | Brand | 759705 | |
| Leibovitz's L-15 medium without l-glutamine | Merck | F1315 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
| L-glutamine | Lonza | BE 17-605C1 | 200 mM |
| LIVE/DEADTM Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | L3224 | Calcein AM and EthD-1 are used from this kit. |
| Microscope software: Zen 2.6 | Zeiss | ||
| Microscope: AxioVertA.1 | Zeiss | ||
| Nelaton-Catheter female | Bicakcilar | 19512051 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 10000 U/ml Penicillin 10000 µg/ml Streptomycin |
| Petri dish heater associated with AFM | Bruker | T-05-0117 | |
| Petri dish heater associated with AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-015 | |
| Statistical Software: SPSS Statistics 22 | IBM | ||
| Sterile Petri dish - CellStar | Greiner BioOne | 664160 | |
| Tissue culture dishes | TPP AG | TPP93040 | |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Trypan Blue 0.4% 0.85% NaCl |
Lonza | 17-942E | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | |
| Waterjet: ERBEJET2 device | Erbe Elektromedizin GmbH | ||
| Williams Cystoscopic Injection Needle | Cook Medical | G14220 | 23G, 5.0 Fr, 35 cm |
References
- Milsom, I., et al. Global prevalence and economic burden of urgency urinary incontinence: a systematic review. European Urology. 65 (1), 79-95 (2014).
- Lee, J. Y., et al. The effects of periurethral muscle-derived stem cell injection on leak point pressure in a rat model of stress urinary incontinence. International Urogynecology Journal and Pelvic Floor Dysfunction. 14 (1), 31-37 (2003).
- Tran, C., Damaser, M. S. The potential role of stem cells in the treatment of urinary incontinence. Therapeutic Advances in Urology. 7 (1), 22-40 (2015).
- Fu, Q., Song, X. F., Liao, G. L., Deng, C. L., Cui, L. Myoblasts differentiated from adipose-derived stem cells to treat stress urinary incontinence. Urology. 75 (3), 718-723 (2010).
- Corcos, J., et al. marrow mesenchymal stromal cell therapy for external urethral sphincter restoration in a rat model of stress urinary incontinence. Neurourology and Urodynamics. 30 (3), 447-455 (2011).
- Smaldone, M. C., Chen, M. L., Chancellor, M. B. Stem cell therapy for urethral sphincter regeneration. Minerva Urologica e Nefrologica. 61 (1), 27-40 (2009).
- Perin, E. C., López, J. Methods of stem cell delivery in cardiac diseases. Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine. 3, Suppl 1 110-113 (2006).
- Zhang, M., et al. Cardiomyocyte grafting for cardiac repair: graft cell death and anti-death strategies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (5), 907-921 (2001).
- Amer, M. H., White, L. J., Shakesheff, K. M. The effect of injection using narrow-bore needles on mammalian cells: administration and formulation considerations for cell therapies. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (5), 640-650 (2015).
- Amer, M. H., Rose, F. R. A. J., Shakesheff, K. M., Modo, M., White, L. J. Translational considerations in injectable cell-based therapeutics for neurological applications: concepts, progress and challenges. NPJ Regenerative Medicine. 2, 23-23 (2017).
- Linzenbold, W., Fech, A., Hofmann, M., Aicher, W. K., Enderle, M. D. Novel Techniques to Improve Precise Cell Injection. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6367 (2021).
- Adamo, A., Roushdy, O., Dokov, R., Sharei, A., Jensen, K. F. Microfluidic jet injection for delivering macromolecules into cells. Journal of Micromechanics and Microengineering: Structures, Devices, and Systems. 23, 035026 (2013).
- Jäger, L., et al. A novel waterjet technology for transurethral cystoscopic injection of viable cells in the urethral sphincter complex. Neurourology and Urodynamics. 39 (2), 594-602 (2020).
- Weber, M., et al. Hydrojet-based delivery of footprint-free iPSC-derived cardiomyocytes into porcine myocardium. Scientific Reports. 10 (1), 16787 (2020).
- Jäger, L., et al. A novel waterjet technology for transurethral cystoscopic injection of viable cells in the urethral sphincter complex. Neurourology and Urodynamics. 39 (2), 594-602 (2020).
- Linzenbold, W., et al. Rapid and precise delivery of cells in the urethral sphincter complex by a novel needle-free waterjet technology. BJU International. 127 (4), 463-472 (2021).
- Danalache, M., Tiwari, A., Sigwart, V., Hofmann, U. K. Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis. Journal of Visualized Experiments. (159), e61041 (2020).
- Gálvez-Martín, P., Hmadcha, A., Soria, B., Calpena-Campmany, A. C., Clares-Naveros, B. Study of the stability of packaging and storage conditions of human mesenchymal stem cell for intra-arterial clinical application in patient with critical limb ischemia. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 86 (3), 459-468 (2014).
- Danalache, M., et al. Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stromal Cells by a Novel Waterjet Technology. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), (2021).
- Amend, B., et al. Precise injection of human mesenchymal stromal cells in the urethral sphincter complex of Göttingen minipigs without unspecific bulking effects. Neurourology and Urodynamics. 36 (7), 1723-1733 (2017).
- Danalache, M., et al. Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stromal Cells by a Novel Waterjet Technology. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), 3958 (2021).
- Strasser, H., et al. 328: Transurethral Ultrasound Guided Stem Cell Therapy of Urinary Incontinence. Journal of Urology. 175 (4), 107 (2006).
- Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 18 (12), 728-742 (2017).
- Ding, Y., Xu, G. -K., Wang, G. -F. On the determination of elastic moduli of cells by AFM based indentation. Scientific Reports. 7 (1), 45575 (2017).
- Charras, G. T., Horton, M. A. Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation. Biophysical Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).
- Carl, P., Schillers, H. Elasticity measurement of living cells with an atomic force microscope: data acquisition and processing. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 457 (2), 551-559 (2008).
- Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. Journal of Biomechanics. 41 (2), 454-464 (2008).
- Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the mechanical properties of living cells using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (76), e50497 (2013).
- Li, M., Dang, D., Liu, L., Xi, N., Wang, Y. Atomic Force Microscopy in Characterizing Cell Mechanics for Biomedical Applications: A Review. IEEE Trans Nanobioscience. 16 (6), 523-540 (2017).
- Morimoto, A., et al. A conserved KASH domain protein associates with telomeres, SUN1, and dynactin during mammalian meiosis. The Journal of Cell Biology. 198 (2), 165 (2012).
- Lombardi, M. L., et al. The interaction between nesprins and sun proteins at the nuclear envelope is critical for force transmission between the nucleus and cytoskeleton. Journal of Biological Chemistry. 286 (30), 26743-26753 (2011).
- Isermann, P., Lammerding, J. Nuclear Mechanics and Mechanotransduction in Health and Disease. Current Biology. 23 (24), 1113-1121 (2013).
- Méjat, A. LINC complexes in health and disease. Nucleus. 1 (1), 40-52 (2010).
- Folker, E. S., Östlund, C., Luxton, G. G., Worman, H. J., Gundersen, G. G. Lamin A variants that cause striated muscle disease are defective in anchoring transmembrane actin-associated nuclear lines for nuclear movement. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (1), 131-136 (2011).
- Guilluy, C., et al. Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus. Nature cell biology. 16 (4), 376-381 (2014).
- Fischer, T., Hayn, A., Mierke, C. T. Effect of Nuclear Stiffness on Cell Mechanics and Migration of Human Breast Cancer Cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 393 (2020).
- Kuznetsova, T. G., Starodubtseva, M. N., Yegorenkov, N. I., Chizhik, S. A., Zhdanov, R. I. Atomic force microscopy probing of cell elasticity. Micron. 38 (8), 824-833 (2007).
- Schillers, H., et al. Standardized Nanomechanical Atomic Force Microscopy Procedure (SNAP) for Measuring Soft and Biological Samples. Scientific Reports. 7 (1), 5117 (2017).
- Costa, K. D., Yin, F. C. Analysis of indentation: implications for measuring mechanical properties with atomic force microscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 121 (5), 462-471 (1999).
- Stolz, M., et al. Dynamic elastic modulus of porcine articular cartilage determined at two different levels of tissue organization by indentation-type atomic force microscopy. Biophysical Journal. 86 (5), (2004).
- Park, S., Costa, K. D., Ateshian, G. A., Hong, K. S. Mechanical properties of bovine articular cartilage under microscale indentation loading from atomic force microscopy. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H. 223 (3), 339-347 (2009).
- Usukura, E., Narita, A., Yagi, A., Ito, S., Usukura, J. An Unroofing Method to Observe the Cytoskeleton Directly at Molecular Resolution Using Atomic Force Microscopy. Scientific Reports. 6 (1), 27472 (2016).
