Summary
Apresentamos um método de injeção celular através da tecnologia de jato de água livre de agulhas, juntamente com uma sequência de investigações pós-entrega em termos de viabilidade celular, proliferação e medidas de elasticidade.
Abstract
A incontinência urinária (UI) é uma condição altamente prevalente caracterizada pela deficiência do músculo esfíncter uretral. Os ramos da medicina regenerativa, particularmente a terapia celular, são novas abordagens para melhorar e restaurar a função de esfíncter uretral. Embora a injeção de células funcionais ativas seja realizada rotineiramente em ambientes clínicos por agulha e seringa, essas abordagens têm desvantagens e limitações significativas. Neste contexto, a tecnologia de jato d'água livre de agulhas (WJ) é um método viável e inovador que pode injetar células viáveis por cistoscopia guiada visual no esfíncter uretrais. No presente estudo, utilizamos o WJ para fornecer células estromais derivadas do tecido adiposo porcina (pADSCs) em tecido uretral cadavérico e, posteriormente, investigamos o efeito da entrega de WJ no rendimento e viabilidade celular. Também avaliamos as características biomecânicas (ou seja, elasticidade) por medições de microscopia de força atômica (AFM). Mostramos que o WJ entregou pADSCs foram significativamente reduzidos em sua elasticidade celular. A viabilidade foi significativamente menor em relação aos controles, mas ainda está acima de 80%.
Introduction
A incontinência urinária (UI) é uma doença generalizada com prevalência de 1,8 - 30,5% nas populações europeias1 e caracteriza-se principalmente pelo mau funcionamento do esfíncter uretral. Do ponto de vista clínico, o tratamento cirúrgico é frequentemente oferecido aos pacientes quando terapias conservadoras ou fisioterapia não conseguem abordar e aliviar os sintomas emergentes.
A terapia celular para o potencial reparo regenerativo do mau funcionamento do complexo esfíncter vem surgindo como uma abordagem vanguardista para o tratamento da patologia da interfacedo usuário 2,3. Seus principais objetivos são substituir, reparar e restaurar a funcionalidade biológica do tecido danificado. Em modelos animais para interface do usuário, o transplante de células-tronco tem mostrado resultados promissores em desfechos uroddinâmicos 2,4,5. As células-tronco surgem como candidatos celulares ideais, pois têm a capacidade de se submeter à autoconexão e diferenciação multipotente, auxiliando assim a regeneração tecidual afetada6. Apesar do próximo potencial regenerativo, o uso prático da terapia celular permanece dificultado, pois o parto minimamente invasivo das células ainda enfrenta vários desafios em relação à precisão da injeção e à cobertura do alvo. Embora a abordagem atual usada para o parto celular seja a injeção através de um sistema de seringaagulha 7, geralmente resulta em um déficit geral de células viáveis, com viabilidades relatadas tão baixas quanto 1%- 31% pós-transplante8. Além disso, a entrega de células por injeção de agulha também tem sido demonstrada para afetar a colocação, a taxa de retenção, bem como a distribuição de células transplantadas no tecido alvo 9,10,11. Uma abordagem viável e nova que supera a limitação acima mencionada é a entrega de células livres de agulhas através da tecnologia de jatos d'água.
A tecnologia waterjet (WJ) está emergindo como uma nova abordagem que permite a entrega de alta throughput de células por cistoscópio sob controle visual no esfíncter uretral12,13. O WJ permite a entrega de células em diferentes pressões (E = efeitos na barra) que variam de E5 a E8013. Na primeira fase, a solução isotônica (fase de penetração tecidual) é aplicada com alta pressão (ou seja, E60 ou E80) a fim de afrouxar a matriz extracelular em torno do tecido direcionado e abrir pequenas micro-lacunas interligadas. Na segunda fase (fase de injeção), a pressão é reduzida dentro de milissegundos (ou seja, até E10) a fim de entregar suavemente as células no tecido alvo. Após esta aplicação em fase de duas etapas, as células não são submetidas a pressão adicional contra o tecido quando ejetadas, mas estão flutuando em um fluxo de baixa pressão em uma área cavernosa cheia de líquido13. Em uma configuração modelo ex vivo onde as células-tronco foram injetadas via WJ em tecido uretra cadavérico, as células viáveis poderiam ser posteriormente aspiradas e recuperadas do tecido e expandidas in vitro13. Embora um estudo de 2020 da Weber et al. tenha demonstrado a viabilidade e aplicabilidade do WJ para fornecer cardiomiócitos sem pegada no miocárdio14, é preciso ter em mente que a tecnologia WJ ainda está em fase de protótipo.
O protocolo a seguir descreve como preparar e rotular células estromais derivadas de tecido suíno (pADSC) e como entregá-las em tecido fluido de captura e cadavérico através da tecnologia WJ e agulhas de cistoscopia williams (WN). A injeção pós-celular, a vitalidade celular e a elasticidade via microscopia de força atômica (AFM) são avaliadas. Por meio de instruções passo a passo, o protocolo oferece uma abordagem clara e concisa para adquirir dados confiáveis. A seção de discussão apresenta e descreve as principais vantagens, limitações e perspectivas futuras da técnica. A entrega de células wj, bem como as análises de pós-tradução sequela relatadas aqui estão substituindo a injeção padrão da agulha e fornecem uma estrutura de entrega de células sólidas para cicatrização regenerativa do tecido alvo. Em nossos estudos recentes, fornecemos evidências de que o WJ forneceu células com mais precisão e pelo menos viabilidade comparável quando comparadas às injeções de agulha15,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
As amostras de tecido adiposo porcina foram obtidas do Instituto de Cirurgia Experimental da Universidade de Tuebingen. Todos os procedimentos foram aprovados pelas autoridades locais de bem-estar animal sob o número de experimento animal CU1/16.
1. Isolamento de células estromais derivadas do tecido adiposo suíno
- Use tecido adiposo porcino entregue do Instituto de Cirurgia Experimental em um tubo de centrífuga de 50 mL para o laboratório.
- Transfira o tecido para uma placa de Petri estéril sob o banco estéril e pique-o com dois bisturis (Nº 10) para pequenos fragmentos e mingau.
NOTA: A tesoura também pode ser usada para obter pequenos fragmentos. Quanto menores forem os fragmentos, melhor para a digestão seguinte.- Transfira os pequenos fragmentos/mush em um tubo centrífuga de 50 mL e incuba-o com 5 mL de solução homogeneizadora por 30 min a 37 °C em um shaker. A solução homogeneizadora é a PBS com 1% de gândice de soro bovino (BSA) (solução de estoque: 1 % (w/v) BSA na PBS) e 0,1% colagenase tipo I.
NOTA: Prepare sempre a solução de homogeneizador de forma recente. O agitador tem um movimento de agitação circular a uma velocidade lenta de 25-500 rpm.
- Transfira os pequenos fragmentos/mush em um tubo centrífuga de 50 mL e incuba-o com 5 mL de solução homogeneizadora por 30 min a 37 °C em um shaker. A solução homogeneizadora é a PBS com 1% de gândice de soro bovino (BSA) (solução de estoque: 1 % (w/v) BSA na PBS) e 0,1% colagenase tipo I.
- Para parar a incubação, adicionar 10 mL de mídia de crescimento [Dulbecco's Modified Eagle's Medium - baixa glicose (DMEM-LG), 2,5% solução de sal de sódio HEPES (1 M), 10% de soro bovino fetal (FBS), 1% L-Glutamina (200 mM), 1% Penicilina-Estreptomicina (1000 U/mL Penicillina; Streptomicina 10.000 μg/mL) e 1% Anfotericina B (250 μg/mL)].
NOTA: A mídia de crescimento pode ser preparada com antecedência. Antibióticos e antifúngicos são necessários na preparação da mídia de crescimento para a cultura celular para proteger as células de contaminações. - Incubar os tubos de centrífuga por 10 minutos à temperatura ambiente.
- Aspire a fração com adipócitos, que é mais leve e, portanto, nadando em cima do líquido, com uma pipeta de 10 mL e descarte-a.
- Filtre a fração estromal restante através de uma peneira celular de 100 μm com uma membrana de tereftalato de polietileno (PET) livre de metais pesados para reter fragmentos de tecido adiposo e recuperar apenas a suspensão celular.
- Centrifugar a suspensão celular filtrada por 7 min a 630 x g em temperatura ambiente.
- Resuspense a pelota celular em 2 mL de PBS para lavar as células uma vez.
- Centrifugar novamente a suspensão celular por 7 min a 630 x g em temperatura ambiente.
- Após centrifugação e ressuspensão repetida da pelota celular em 10 mL de mídia de crescimento por frasco, células de sementes em frascos de cultura celular de 75 cm2 .
NOTA: Dependendo do tamanho da pelota celular após a etapa de lavagem com PBS, células de sementes em um a quatro frascos.
2. Cultivo celular de células estéticas derivadas do tecido suíno
- Células de colheita e passagem quando atingem 70% de confluência.
- Lave as células com 10 mL de PBS duas vezes e aspire a PBS completamente.
NOTA: Esta etapa é necessária para remover a mídia de crescimento restante, que é complementada por 10% de FBS. FBS possui vários inibidores de protease que podem dificultar a função da tentainização a seguir. - Adicione 3 mL de 0,05%-Trypsin-EDTA por frasco para desprender as células.
- Incubar frascos por 3 min a 37 °C.
- Verifique sob o microscópio se as células estão separadas.
NOTA: Às vezes leva mais tempo para desprender as células. Neste caso, incubar frascos para máxima de 5 min a 37 °C. - Para parar o processo de incubação e desapego, adicione 3 mL de mídia de crescimento.
NOTA: Como observado acima, a mídia de crescimento é complementada por 10% de FBS que contém inibidores de protease. - Transfira as células separadas para um tubo de centrifugação e centrífuga por 7 min a 630 x g em temperatura ambiente.
- Resuspenda as células em 10 mL de mídia de crescimento e contá-las com um hemótmetro.
- Células de sementes com densidade de inoculação de 3 x 105 células por frasco de 75 cm2 .
3. Rotulagem de células com calcein-AM
NOTA: As células que são injetadas em tecidos cadavéricos estão manchadas com uma mancha de célula viva permeável de membrana verde-fluorescente e um indicador de viabilidade de membrana-impermeável de membrana vermelha-fluorescente para verificar se as células extraídas são as mesmas das células injetadas e não fragmentos teciduais da uretra.
- Lave as células duas vezes com 10 mL de PBS.
- Adicione 5 mL de solução de corante por frasco de 75 cm2 . A solução de corante consiste em mídia de crescimento com 2 μM do corante de células vivas verde-fluorescente permeável e 4 μM de viabilidade de membrana-impermeável.
- Incubar por 30 minutos à temperatura ambiente no escuro.
- Aspire e descarte a solução de corante.
- Lave as células novamente duas vezes com 10 mL de PBS.
- Adicione mídia de crescimento e documente o sinal de fluorescência verde e vermelha por microscopia de fluorescência.
- Coloque o frasco de 75 cm2 na tabela do microscópio, use o objetivo de 10x, selecione nenhum filtro de fluorescência e certifique-se de que o caminho da luz transmitida esteja ativo.
NOTA: Estas etapas são todas executadas manualmente no microscópio. - Paralelamente à etapa 3.6.1, abra o programa de software.
- Pressione o botão Viver sob a guia Localizar para obter uma imagem ao vivo das células no frasco sobre a mesa e concentre-se neles com os drives de ajuste grosseiro e fino.
NOTA: À vista certa, a imagem ao vivo aparecerá assim que o botão Live for ativado. - Nos componentes do microscópio de subse, selecione o objetivo correto (10x).
- Na câmera de sub-guia, aplique uma marca de verificação para Exposição Automática.
- Pressione o botão Pressione o botão Pressione a primeira foto com a luz transmitida.
- Insira a barra de escala usando a guia Gráficos na barra de menu e selecionando a Barra de Escala.
- Salve a imagem usando a guia Arquivos na barra de menu e selecionando Salvar como czi.
- Para as imagens de fluorescência, altere o filtro para aquele específico para fluorescência verde ou vermelha e selecione o caminho da luz refletida.
NOTA: Essas alterações devem ser feitas manualmente no microscópio. - Pressione novamente o botão Viver sob a guia Localizar para obter uma imagem ao vivo das células.
- Pressione o botão Clique para tirar a segunda foto com fluorescência verde ou vermelha.
- Insira a barra de escala usando a guia Gráficos na barra de menu e selecionando a Barra de Escala.
- Salve a imagem usando a guia Arquivos na barra de menu e selecionando Salvar como czi.
- Repetir passos 3.6.9 a 3.6.13 com o outro canal de fluorescência.
- Coloque o frasco de 75 cm2 na tabela do microscópio, use o objetivo de 10x, selecione nenhum filtro de fluorescência e certifique-se de que o caminho da luz transmitida esteja ativo.
4. Prepare amostras de tecido uretral para injeções
- Dissecar a uretra e a bexiga conectada do porco.
NOTA: Foram utilizadas amostras de tecido uretral de amostras cadavéricas frescas de suínos adultos de terra fêmeas para os experimentos. - Transporte para o laboratório em sacos em gelo molhado.
NOTA: As amostras devem ser deixadas no gelo até um processamento mais aprofundado. Nenhum aditivo foi adicionado às amostras. - Coloque a uretra com a bexiga sobre uma esponja, que imita a elasticidade do assoalho pélvico inferior.
- Use a bexiga para determinar a orientação (proximal, distal, dorsal e ventral) da uretra. Isso é possível devido à localização dos ureteres e dos três ligamentos que fixam a bexiga na cavidade abdominal e pélvica. Os três ligamentos são os dois ligamentos vesicae lateralia nas laterais da bexiga e o medianum vesicae, que surge da superfície ventral da bexiga (Figura 1).
- Abra a uretra longitudinalmente no lado dorsal com auxílio de um cateter.
- Injete as células na uretra aberta, conforme descrito nos capítulos seguintes.
5. Injeções de células através de uma agulha Williams em fluidos e amostras de tecido
- Células de colheita descritas na etapa 2.
- Em contraste com a etapa 2.9, ajuste a densidade celular para injeções para 2,4 x 106 células por mL.
NOTA: Para injeções em amostras de tecido, rotule as células com uma célula viva permeável de membrana verde-fluorescente. - Aspire a suspensão celular com uma seringa e aplique a agulha de injeção cistoscópica williams (WN) nela.
- Segure a agulha logo acima dos 2 mL de mídia de crescimento em um tubo de centrifugação de 15 mL ou insira a agulha no tecido uretra aberto. Em ambos os casos, injete 250 μL de células manualmente.
NOTA: As células injetadas na uretra cadavêmica formam uma cúpula de injeção. - Coletar células injetadas na mídia diretamente por centrifugação por 7 min a 630 x g em temperatura ambiente.
- Para células injetadas na uretra cadavírica, aspire-as para fora da cúpula de injeção com uma agulha 18G aplicada em uma seringa.
- Transfira as células injetadas e aspiradas em um tubo de centrifugação e centrífuga por 7 minutos a 630 x g em temperatura ambiente comparativamente com as células injetadas na mídia.
- Após a centrifugação, resuspende as células em 4 mL de mídia de crescimento em ambos os casos.
- Determine o rendimento celular e a viabilidade por auxílio da exclusão de corante azul Trypan com um hemócito.
- Misture 20 μL de suspensão celular completamente com 20 μL de azul Trypan.
- Encha 10 μL desta mistura em cada câmara do hemócito.
NOTA: Ambas as câmaras são preenchidas e contadas para obter otimização estatística dobrando a amostragem. - Sob um microscópio, conte células em todos os quatro quadrados de canto.
NOTA: As células de contagem brilhando em branco (não manchadas) como células viáveis, enquanto as células que brilham azul (manchadas) são contadas como células mortas. - Para calcular o número de celular por mL, calcule a média das duas câmaras, divida esse número por dois e multiplique-o com 104.
6. Injeções de células via jato de água em fluidos e amostras de tecido
- Células de colheita descritas na etapa 2.
- Em contraste com as etapas 2.9 e 5.2, ajuste a densidade celular para injeções para 6 x 106 células por mL.
NOTA: Para injeções em amostras de tecido, use células rotuladas com uma célula viva permeável de membrana verde-fluorescente. - Encha a suspensão da célula na unidade de dosagem do dispositivo WJ.
- Segure o bocal de injeção logo acima dos 2 mL de mídia de crescimento em um tubo de centrifugação de 15 mL ou logo acima do tecido de uretra aberto.
- Em ambos os casos, injete 100 μL de células pelo dispositivo usando uma alta pressão para penetração tecidual seguida de uma fase de baixa pressão para injeções celulares. Use as configurações de pressão E60-10.
NOTA: As células injetadas na uretra cadavêmica formam uma cúpula de injeção. - Coletar células injetadas na mídia diretamente por centrifugação por 7 min a 630 x g em temperatura ambiente.
- Para células injetadas na uretra cadavírica, aspire-as para fora da cúpula de injeção com uma agulha 18G aplicada em uma seringa.
- Transfira as células injetadas e aspiradas em um tubo de centrifugação e centrífuga por 7 minutos a 630 x g em temperatura ambiente comparativamente com as células injetadas na mídia.
- Após a centrifugação, resuspend as células em 4 mL de mídia de crescimento em ambos os casos.
- Determine o rendimento e a viabilidade celular por auxílio da exclusão de corante azul Trypan com um hemócito, conforme descrito em detalhes em 5.10.
7. Avaliação biomecânica da elasticidade celular por microscopia de força atômica (AFM)
- Preparação de amostras
NOTA: As células recuperadas após a injeção estão agora sujeitas a novas análises pela AFM. Além disso, as células que não foram injetadas são usadas como controles.- Células de sementes em pratos de cultura tecidual com uma densidade de 5 x 105 células por prato.
NOTA: Semente um prato de cultura de tecido por condição. As condições são controles, ADSCs injetados por WJ ou WN em mídia e ADSCs injetados por WJ ou WN em tecido cadavérico. - Incubar células em pratos de cultura tecidual por 3 h a 37 °C.
NOTA: Para evitar variâncias devido às células na fase G1 e durante a mitose, realizamos medições afm 3 h após a etapa de semeadura celular. - Logo antes da medição com o AFM substituir a mídia de crescimento por 3 mL da mídia L-15 de Leibovitz sem L-glutamina.
- Coloque a placa de cultura tecidual no suporte de amostra do dispositivo AFM e ligue o aquecedor de placa de Petri a 37 °C.
- Células de sementes em pratos de cultura tecidual com uma densidade de 5 x 105 células por prato.
- Preparação da AFM e calibração cantilever
- Use um bloco de vidro especificado para medições em líquidos e ajuste-o no suporte AFM.
NOTA: A superfície superior do bloco de vidro deve ser reta e paralela ao suporte AFM. - Coloque cuidadosamente o cantilever na superfície do bloco de vidro. A ponta A deve estar sobre o plano óptico polido.
NOTA: Não arranhe a superfície óptica polida do bloco de vidro porque arranhões podem levar a interferências nas medições. A ponta A deve se projetar sobre o plano óptico polido porque, caso contrário, o reflexo do laser do AFM para o fotodetetor não é possível. - Para estabilizar a cantilever no bloco de vidro, adicione uma mola metálica com o auxílio de pinças.
- Quando o cantilever estiver fixado no bloco de vidro coloque o bloco na cabeça AFM e bloqueie o mecanismo de bloqueio integrado.
- Monte a cabeça AFM no dispositivo AFM.
NOTA: A mola deve enfrentar o lado esquerdo para ser colocada corretamente. Se este não for o caso, corrija a posição do bloco de vidro e ajuste novamente a cabeça AFM. - Inicialize a configuração do software e abra o software juntamente com a janela de alinhamento a laser e as configurações do parâmetro de aproximação. Além disso, ligue o motor do estepe, a luz laser e a câmera CCD.
- Identifique a ponta cantilever A usando a câmera CCD.
- Abaixe o cantilever até que esteja totalmente mergulhado no meio. Use a função do motor do estepe para atingir este objetivo.
- Uma vez que o cantilever esteja totalmente coberto por meio, o laser é alinhado em cima do cantilever usando os parafusos de ajuste. O feixe refletido deve cair no centro do fotodetetor e a soma dos sinais deve ser de 1 V ou mais. As deflexões laterais e verticais devem ser próximas de 0.
NOTA: Se o centro for atingido pode ser monitorado na função de alinhamento do laser, bem como nos valores do sinal. Se os valores do sinal não estiverem corretos, novos ajustes ão necessários. - Execute agora o scanner Abordagem com os parâmetros de aproximação (Tabela 1).
- Retraia o cantilever por 100 μm quando chegar à parte inferior pressionando o botão Retrair .
NOTA: Certifique-se de que nenhuma célula está anexada nesse campo se a abordagem for feita porque isso falsificaria a calibração. - Configure os parâmetros de Execução de acordo com as seguintes especificações: Setpoint 1 V, Pull Length 90 μm, Velocity: 5 μm/s, Taxa de amostra: 2000 Hz e como modo de atraso: Força Constante.
- Inicie a curva de velocidade de calibração medindo pressionando o botão Executar.
NOTA: Clicando no botão Executar no software, uma curva de distância de força é obtida. - Selecione a região de ajuste linear da curva retraída no software na curva de distância de força de calibração obtida. Calcule a medição constante da mola pelo software.
- Calibrar a cantilever seguindo os parâmetros e passos exatos descritos por Danalache et al.17.
- Use um bloco de vidro especificado para medições em líquidos e ajuste-o no suporte AFM.
- Medindo a elasticidade das células individuais
- Identifique visualmente uma célula e foque nela. Coloque o mouse do computador no meio da célula. Para melhorar a precisão das medições, posicione a ponta AFM diretamente acima do núcleo celular.
NOTA: O mouse do computador é usado como marcador visual para identificar o local alvo do recuo. - Agora concentre-se no cantilever e mova-o no mouse do computador.
- Inicie a medição com run com os parâmetros apresentados na Tabela 2.
NOTA: O parâmetro de ponto de configuração obtido pela calibração do cantilever é utilizado. Além disso, uma célula é medida três vezes. Meça pelo menos 50 células.
- Identifique visualmente uma célula e foque nela. Coloque o mouse do computador no meio da célula. Para melhorar a precisão das medições, posicione a ponta AFM diretamente acima do núcleo celular.
- Processamento de dados
- Processe os dados seguindo as etapas exatas e parâmetros descritos anteriormente por Danalache17.
- Salve e exporte o arquivo.
8. Análise estatística
- Abra o software estatístico.
- Escolha a seleção do Novo Conjunto de Dados.
NOTA: Dois arquivos são abertos. Um é o "DataSet" e o outro é o arquivo "Saída". - Selecione o arquivo DataSet e abra a guia Exibição variável .
- Insira as variáveis numéricas para injeção no local (fluido de captura ou tecido cadavérico), categoria (controle, injeção de WJ, injeção de WN) e elasticidade.
- Insira os dados de elasticidade medidos com a injeção do local correspondente e o número da categoria na guia Data View .
- Analise os dados selecionando a guia barra de menu Analisar | Estatísticas descritivas e escolha análise de dados exploratórios.
- Como variável dependente, selecione Elasticidade e lista de fatores selecionar Categoria.
NOTA: Os resultados são exibidos no arquivo "Saída", incluindo um plot de caixa que é usado para a seção resultados. - Para realizar um teste estatístico, selecione as Amostras Independentes dentro do Teste Não Paramétrico na guia barra de menu Analisar.
- No novo arquivo aberto mantenha as configurações na guia Objetivo e Configurações.
- Abra a guia Campos e escolha Elasticidade como Campos de Teste e Categoria como Grupos.
- Pressione Run.
NOTA: Os resultados são exibidos no arquivo "Saída". Para estas análises é realizado um teste Mann-U-Whitney. - Inclua o resultado do teste não paramétrico no gráfico da caixa da análise de dados exploratórios.
- Salve os arquivos selecionando Arquivo na barra de menu e escolhendo Salvar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Após a entrega de células através das duas abordagens, a viabilidade das células entregues através da WN (97,2 ± 2%, n=10, p<0,002) foi maior quando comparada às injeções por WJ utilizando as configurações E60-10 (85,9 ± 0,16%, n=12) (Figura 2). Os resultados da avaliação biomecânica mostraram que: as injeções de WN de células em fluido de captura não apresentaram diferença significativa em relação ao moduli elástico (EM; 0,992 kPa) quando comparado com os controles (1.176 kPa; Figura 3A), enquanto as injeções de WJ desencadearam uma redução significativa do EM celular (0,440 kPa, p<0,001, Figura 3B). Observou-se uma diminuição de 40 a 50% do EM após as injeções de WJ. Embora, as injeções de WN no tecido uretra cadavérico não produziram diferença significativa no EM celular (Figura 4A) uma redução significativa no EM foi notada após injeções de WJ em amostras de tecido (0,890 kPa a 0,429 kPa; p<0,00, Figura 4B). Assim, os valores absolutos de EM após a injeção de WJ foram, assim, reduzidos em 51%. Coletivamente, os resultados mostram que, enquanto o parto de células WJ cumpre um requisito absoluto para uma implementação clínica onde mais de 80% das células viáveis após o parto18 , pós-entrega do WJ o moduli elástico celular são afetados. Um EM celular mais baixo pode facilitar a migração de características das células após a entrega do WJ. Em uma distribuição tão ampla e gama de capacidades regenerativas na regiãodesejada 19.
Figura 1. Anatomia da bexiga suína e uretra e locais de injeção. A) O lado ventral da bexiga suína e da uretra com os três ligamentos que fixam a bexiga na cavidade abdominal e pélvica são mostrados. Além disso, os ureteres que terminam no lado dorsal da bexiga são mostrados. B) Imagem representativa da uretra cadavírica usada para injeção de WJ e WN. Longitudinalmente, a uretra dorsal aberta com cúpulas de injeção circuladas em preto são mostradas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Injeções de determinação de viabilidade celular via WN e WJ. pADSCs injetados via WN ou WJ foram coletados após a injeção e contados via exclusão trypan para determinar a viabilidade. A viabilidade celular foi significativamente reduzida após a injeção de WJ quando comparada com as células fornecidas via WN. p<0.001. Os dados são exibidos graficamente como médios com desvio padrão. Abreviaturas: WJ - jato d'água, WN - Agulha Williams. Figura adaptada de Danalache et al. 202119. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. A comparação do moduli de Young quantificado da WN, respectivamente, wj entregou células em mídia de captura e seus controles correspondentes. Nenhuma diferença notável no EM foi observada nas boxplots para as monocamadas de células de controle (não tratadas) e células entregues wn (A). Em contraste, pode-se notar uma diminuição significativa da elasticidade entre as estatas das células de controle e o grupo WJ (B). ns - não significativo, p > 0,05, ***p<0.001. Abreviaturas: WJ - jato d'água, WN - Agulha Williams. Figura adaptada de Danalache et al. 202119. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Comparação do moduli de Young quantificado de WN, respectivamente, WJ entregou células em uretra cadavêmica e seus controles correspondentes. Não foi observada diferença notável entre as células fornecidas através de células WN e seus controles correspondentes (A). Observou-se uma diminuição significativa da elasticidade entre as células entregues pelo WJ e a monocamada de célula de controle (B). ns - não significativo, p > 0,05, ***p<0.001. Abreviaturas: WJ - jato d'água, WN - Agulha Williams. Figura adaptada de Danalache et al. 202119. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Parâmetro de aproximação | Valor |
| Abordagem IGain | 3.0 Hz |
| Abordagem PGain | 0.0002 |
| Aproximação da altura do alvo | 10,0 μm |
| Ponto de configuração de abordagem | 3.00 V |
| Abordagem linha de base | 0,00 V |
Mesa 1. Parâmetros de aproximação.
| Parâmetro de execução | Valor |
| Definir ponto | 10 nN |
| Movimento Z/ Velocidade de extensão | Velocidade constante/ |
| 5,0 μm/s | |
| Horário de contato | 0.0 s |
| Comprimento de puxar | 90 μm |
| Modo de atraso | Força Constante |
| Taxa de amostragem | 2000 Hz |
Mesa 2. Executar parâmetros.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
No presente estudo, demonstramos e apresentamos uma abordagem passo a passo para o procedimento de entrega de células WJ e empregamos uma sequência de investigações quantitativas para avaliar o efeito da entrega de WJ em características celulares: viabilidade celular e características biomecânicas (ou seja, EM). Após a injeção de WJ, 85,9% das células colhidas eram viáveis. Em termos de injeção de WN, 97,2% das células mantiveram sua viabilidade após a injeção. Assim, a abordagem do WJ preenche um requisito absoluto para uma implementação clínica: mais de 80% de células viáveis apóso parto 18. Enquanto um protocolo padronizado e reprodutível é alcançado com a abordagem WJ, o resultado do parto de injeção de agulha é altamente dependente do tamanho e bocal da seringa e agulha, pressão, taxa de fluxo e o médico realizando a injeção emsi 19.
Estudos que empregam a entrega de células WJ em modelos animais vivos mostraram que, por uma pressão de ejeção variada, a profundidade de penetração pode ser adaptada ao tecido alvo e, como tal, à aplicação clínica desejada13,16. As injeções de células transuretrais em animais vivos sob controle visual relataram deslocamento ou perda de células em cerca de 50% dos animais tratados20, enquanto as injeções de WJ relataram taxas precisas de injeção celular acima de 90% (Linzenbold et al.16 e observação inédita). O padrão dourado atual para entrega de células (injeções de agulha) requer penetração da cânula em um tecido direcionado. Portanto, a tradução celular da agulha causa lesões e traumas em todos os casos. Na uretra, isso pode realmente causar toxificação de anúncios de inflamação devido a germes e toxinas encontradas mesmo na urina saudável. Além disso, o tempo de operação do usuário na injeção de WJ é significativamente menor quando comparado a uma injeção de agulha: as células são colocadas dentro de milissegundos na camada de tecido pretendida, presetting os níveis de pressão. Em contraste, a profundidade de penetração na injeção de agulha em áreas remotas por endoscopia depende das habilidades e experiência do cirurgião. Espera-se também que a reprodutibilidade da injeção de WJ seja superior, mas atualmente existem apenas dados pré-clínicosde 15,16,20 e menos de 200 animais foram investigados. Em nosso estudo recente, observamos que a elasticidade celular é reduzida pela aplicação do WJ quando comparada às injeções de agulha21. Isso pode ser atribuído ao estresse da tesoura das células em maior velocidade durante o parto do WJ. Além disso, uma eventual perda celular pode ser compensada por uma maior precisão de colocação celular e ejeção dentro da região de interesse como alcançado com a entrega guiada pelo WJ pela cistoscopia guiada visual22.
É sabido que as forças mecânicas direcionam o comportamento das células-tronco, o potencial de regeneração, bem como sua viabilidade e funcionalidade subsequentes pós-transplante 10,23. O advento da AFM atômica forneceu uma poderosa ferramenta para quantificar as propriedades mecânicas de células vivas únicas em resolução em nano escala em condições aquosas 24,25,26,27. AFM é um método confiável e altamente sensível que pode detectar e registrar rigidezs que variam de menos de 100 Pa a 106 Pa, cobrindo assim uma ampla gama para a maioria dos tecidos e células28. De fato, a mecânica celular está emergindo como biomarcador livre de rótulos para avaliar o estado celular e, tanto no estado fisiológico quanto patológico29, e a elasticidade celular é a resposta sinérgica e cumulativa do núcleo - o crosstalk do citoesqueleto. Está bem estabelecido que quando uma célula é submetida a forças externas, essas forças são transmitidas da membrana plasmática através do citoesqueleto para o núcleo, resultando em deformações intranucleares e reorganização 30,31,32. Portanto, o núcleo, há muito visto como o material genômico e o aparelho de transcrição, é um ator-chave na mecanotransdução celular, bem como32. De fato, a importância da mecânica nuclear e das conexões nucleo-citosqueletal, em todas as funções e mutações celulares, em lamins e linkers do nucleo-esqueleto ao complexo de citoesqueleto (LINC) - estão na base de início de várias patologias 33,34. Essas forças também podem indicar artefatos celulares. Especificamente, as forças geradas externas realmente se propagam ao longo de filamentos citoesqueléticos e são ainda mais transmitidas para a lâmina nuclear através do complexo LINC; em resposta a essas forças, o núcleo, de fato, torna-se mais rígido35,36, mesclando assim os dois processos intimamente entrelaçados e conectados. Esta também é a lógica de nossa abordagem e nossas medidas de mecânica nuclear. Além disso, uma colocação precisa do cantilever no topo da superfície nuclear também garante um alto grau de reprodutibilidade e reduz as variações devido à heterogeneidade celular e ao apego ao substrato.
Embora a elasticidade celular esteja emergindo como biomarcador livre de rótulos para avaliar o estado celular e em ambos os estados fisiológicos e patológicos29, o moduli elástico medido são marcados por grandes variações mesmo no mesmo tipocelular 37. Um método para neutralizar tais variações sugeridas por Schillers et al. é a implementação de procedimentos de AFM nanomecânicos padronizados (SNAP) que garantem uma alta reprodutibilidade e aplicabilidade de medidas de elasticidade como um marcador quantitativo confiável para células em vários estados38. Além disso, embora os parâmetros experimentais empregados nas análises da AFM, como velocidade de recuo, forma e tamanho de recuo, bem como representação precisa da geometria da ponta no encaixe do modelo 39, influenciem os valores absolutos medidos40,41, esses parâmetros não devem impactar os resultados dentro de um estudo ou uma tendência medida.
No entanto, tenha em mente que as indentações afm estão restritas à análise da superfície externa das células e são, portanto, incapazes de digitalizar o interior de uma membrana celular ou estruturas intracelulares particulares. Usukura et al. propuseram um método "sem ruptura" que rompe a membrana celular e remove os componentes citoplasmó-solúveis42, permitindo assim investigações intracelulares AFM. Em nosso estudo, no entanto, o foco foi colocado na avaliação do moduli elástico médio em vez de sondar componentes intracelulares distintos e seletivos.
Coletivamente, a consistência e confiabilidade dos dados da AFM cedidos depende fortemente da experiência técnica do respectivo operador e pode ser tendenciosa pela variabilidade biológica38. Contabilizando todas as variáveis sensíveis que podem afetar os resultados reais da AFM, os valores elásticos absolutos relatados neste estudo não podem ser generalizados e são bastante específicos para nossa configuração experimental.
No geral, nosso estudo fornece evidências21 , bem como um protocolo passo-a-passo para a superioridade das injeções de WJ sobre injeções de agulha para regime de terapia celular regenerativa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores J.K., M.D., T.A., A.S., W.K.A. não têm nada a revelar. Os autores W.L. e M.D.E. são funcionários da ERBE Medizintechnik Tenente Tübingen, produtora do ERBEJet2 e do protótipo WJ empregado neste estudo.
Acknowledgments
Agradecemos aos nossos coautores das publicações originais pela ajuda e apoio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL centrifuge tube | Greiner BioOne | 227261 | |
| 1 mL BD Luer-LokTM Syringe | BD Plastik Inc | n.a. | |
| 100 µm cell sieve | Greiner BioOne | 542000 | |
| 15 mL centrifuge tube | Greiner BioOne | 188271 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Corning Incorporated | 353136 | |
| AFM head | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
| AFM processing software | Bruker | JPK00518 | |
| AFM software | Bruker | JPK00518 | |
| AFM system Cell Hesion 200 | Bruker | JPK00518 | |
| All-In-One-Al cantilever | Budget Sensors | AIO-10 | tip A, Conatct Mode, Shape: Beam Force Constant: 0.2 N/m (0.04 - 0.7 N/m) Resonance Frequency: 15 kHz (10 - 20 kHz) Length: 500 µm (490 - 510 µm) Width: 30 µm (35 - 45 µm) Thickness: 2.7 µm (1.7 - 3.7 µm) |
| Amphotericin B solution | Sigma | A2942 | 250 µg/ml |
| Atomic Force Microscope (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| BD Microlance 3 18G | BD | 304622 | |
| bovine serum albumin | Gibco | A10008-01 | |
| Cantilever | All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | tip A, k ¼ 0.2 N/m |
| C-chip disposable hemocytometer | NanoEnTek | 631-1098 | |
| centrifuge: Rotina 420R | Hettich Zentrifugen | ||
| Collagenase, Type I, powder | Gibco | 17100-017 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - low glucose | Sigma | D5546 | |
| Feather disposable scalpel (No. 10) | Feather | 02.001.30.010 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
| HEPES sodium salt solution (1 M) | Sigma | H3662 | |
| Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| laboratory bags | Brand | 759705 | |
| Leibovitz's L-15 medium without l-glutamine | Merck | F1315 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
| L-glutamine | Lonza | BE 17-605C1 | 200 mM |
| LIVE/DEADTM Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | L3224 | Calcein AM and EthD-1 are used from this kit. |
| Microscope software: Zen 2.6 | Zeiss | ||
| Microscope: AxioVertA.1 | Zeiss | ||
| Nelaton-Catheter female | Bicakcilar | 19512051 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 10000 U/ml Penicillin 10000 µg/ml Streptomycin |
| Petri dish heater associated with AFM | Bruker | T-05-0117 | |
| Petri dish heater associated with AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-015 | |
| Statistical Software: SPSS Statistics 22 | IBM | ||
| Sterile Petri dish - CellStar | Greiner BioOne | 664160 | |
| Tissue culture dishes | TPP AG | TPP93040 | |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Trypan Blue 0.4% 0.85% NaCl |
Lonza | 17-942E | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | |
| Waterjet: ERBEJET2 device | Erbe Elektromedizin GmbH | ||
| Williams Cystoscopic Injection Needle | Cook Medical | G14220 | 23G, 5.0 Fr, 35 cm |
References
- Milsom, I., et al. Global prevalence and economic burden of urgency urinary incontinence: a systematic review. European Urology. 65 (1), 79-95 (2014).
- Lee, J. Y., et al. The effects of periurethral muscle-derived stem cell injection on leak point pressure in a rat model of stress urinary incontinence. International Urogynecology Journal and Pelvic Floor Dysfunction. 14 (1), 31-37 (2003).
- Tran, C., Damaser, M. S. The potential role of stem cells in the treatment of urinary incontinence. Therapeutic Advances in Urology. 7 (1), 22-40 (2015).
- Fu, Q., Song, X. F., Liao, G. L., Deng, C. L., Cui, L. Myoblasts differentiated from adipose-derived stem cells to treat stress urinary incontinence. Urology. 75 (3), 718-723 (2010).
- Corcos, J., et al. marrow mesenchymal stromal cell therapy for external urethral sphincter restoration in a rat model of stress urinary incontinence. Neurourology and Urodynamics. 30 (3), 447-455 (2011).
- Smaldone, M. C., Chen, M. L., Chancellor, M. B. Stem cell therapy for urethral sphincter regeneration. Minerva Urologica e Nefrologica. 61 (1), 27-40 (2009).
- Perin, E. C., López, J. Methods of stem cell delivery in cardiac diseases. Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine. 3, Suppl 1 110-113 (2006).
- Zhang, M., et al. Cardiomyocyte grafting for cardiac repair: graft cell death and anti-death strategies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (5), 907-921 (2001).
- Amer, M. H., White, L. J., Shakesheff, K. M. The effect of injection using narrow-bore needles on mammalian cells: administration and formulation considerations for cell therapies. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (5), 640-650 (2015).
- Amer, M. H., Rose, F. R. A. J., Shakesheff, K. M., Modo, M., White, L. J. Translational considerations in injectable cell-based therapeutics for neurological applications: concepts, progress and challenges. NPJ Regenerative Medicine. 2, 23-23 (2017).
- Linzenbold, W., Fech, A., Hofmann, M., Aicher, W. K., Enderle, M. D. Novel Techniques to Improve Precise Cell Injection. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6367 (2021).
- Adamo, A., Roushdy, O., Dokov, R., Sharei, A., Jensen, K. F. Microfluidic jet injection for delivering macromolecules into cells. Journal of Micromechanics and Microengineering: Structures, Devices, and Systems. 23, 035026 (2013).
- Jäger, L., et al. A novel waterjet technology for transurethral cystoscopic injection of viable cells in the urethral sphincter complex. Neurourology and Urodynamics. 39 (2), 594-602 (2020).
- Weber, M., et al. Hydrojet-based delivery of footprint-free iPSC-derived cardiomyocytes into porcine myocardium. Scientific Reports. 10 (1), 16787 (2020).
- Jäger, L., et al. A novel waterjet technology for transurethral cystoscopic injection of viable cells in the urethral sphincter complex. Neurourology and Urodynamics. 39 (2), 594-602 (2020).
- Linzenbold, W., et al. Rapid and precise delivery of cells in the urethral sphincter complex by a novel needle-free waterjet technology. BJU International. 127 (4), 463-472 (2021).
- Danalache, M., Tiwari, A., Sigwart, V., Hofmann, U. K. Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis. Journal of Visualized Experiments. (159), e61041 (2020).
- Gálvez-Martín, P., Hmadcha, A., Soria, B., Calpena-Campmany, A. C., Clares-Naveros, B. Study of the stability of packaging and storage conditions of human mesenchymal stem cell for intra-arterial clinical application in patient with critical limb ischemia. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 86 (3), 459-468 (2014).
- Danalache, M., et al. Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stromal Cells by a Novel Waterjet Technology. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), (2021).
- Amend, B., et al. Precise injection of human mesenchymal stromal cells in the urethral sphincter complex of Göttingen minipigs without unspecific bulking effects. Neurourology and Urodynamics. 36 (7), 1723-1733 (2017).
- Danalache, M., et al. Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stromal Cells by a Novel Waterjet Technology. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), 3958 (2021).
- Strasser, H., et al. 328: Transurethral Ultrasound Guided Stem Cell Therapy of Urinary Incontinence. Journal of Urology. 175 (4), 107 (2006).
- Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 18 (12), 728-742 (2017).
- Ding, Y., Xu, G. -K., Wang, G. -F. On the determination of elastic moduli of cells by AFM based indentation. Scientific Reports. 7 (1), 45575 (2017).
- Charras, G. T., Horton, M. A. Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation. Biophysical Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).
- Carl, P., Schillers, H. Elasticity measurement of living cells with an atomic force microscope: data acquisition and processing. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 457 (2), 551-559 (2008).
- Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. Journal of Biomechanics. 41 (2), 454-464 (2008).
- Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the mechanical properties of living cells using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (76), e50497 (2013).
- Li, M., Dang, D., Liu, L., Xi, N., Wang, Y. Atomic Force Microscopy in Characterizing Cell Mechanics for Biomedical Applications: A Review. IEEE Trans Nanobioscience. 16 (6), 523-540 (2017).
- Morimoto, A., et al. A conserved KASH domain protein associates with telomeres, SUN1, and dynactin during mammalian meiosis. The Journal of Cell Biology. 198 (2), 165 (2012).
- Lombardi, M. L., et al. The interaction between nesprins and sun proteins at the nuclear envelope is critical for force transmission between the nucleus and cytoskeleton. Journal of Biological Chemistry. 286 (30), 26743-26753 (2011).
- Isermann, P., Lammerding, J. Nuclear Mechanics and Mechanotransduction in Health and Disease. Current Biology. 23 (24), 1113-1121 (2013).
- Méjat, A. LINC complexes in health and disease. Nucleus. 1 (1), 40-52 (2010).
- Folker, E. S., Östlund, C., Luxton, G. G., Worman, H. J., Gundersen, G. G. Lamin A variants that cause striated muscle disease are defective in anchoring transmembrane actin-associated nuclear lines for nuclear movement. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (1), 131-136 (2011).
- Guilluy, C., et al. Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus. Nature cell biology. 16 (4), 376-381 (2014).
- Fischer, T., Hayn, A., Mierke, C. T. Effect of Nuclear Stiffness on Cell Mechanics and Migration of Human Breast Cancer Cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 393 (2020).
- Kuznetsova, T. G., Starodubtseva, M. N., Yegorenkov, N. I., Chizhik, S. A., Zhdanov, R. I. Atomic force microscopy probing of cell elasticity. Micron. 38 (8), 824-833 (2007).
- Schillers, H., et al. Standardized Nanomechanical Atomic Force Microscopy Procedure (SNAP) for Measuring Soft and Biological Samples. Scientific Reports. 7 (1), 5117 (2017).
- Costa, K. D., Yin, F. C. Analysis of indentation: implications for measuring mechanical properties with atomic force microscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 121 (5), 462-471 (1999).
- Stolz, M., et al. Dynamic elastic modulus of porcine articular cartilage determined at two different levels of tissue organization by indentation-type atomic force microscopy. Biophysical Journal. 86 (5), (2004).
- Park, S., Costa, K. D., Ateshian, G. A., Hong, K. S. Mechanical properties of bovine articular cartilage under microscale indentation loading from atomic force microscopy. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H. 223 (3), 339-347 (2009).
- Usukura, E., Narita, A., Yagi, A., Ito, S., Usukura, J. An Unroofing Method to Observe the Cytoskeleton Directly at Molecular Resolution Using Atomic Force Microscopy. Scientific Reports. 6 (1), 27472 (2016).
