Summary
Wir stellen eine Methode der Zellinjektion mittels nadelfreier Wasserstrahltechnologie vor, die mit einer Folge von Untersuchungen nach der Entbindung in Bezug auf Zelllebensfähigkeit, Proliferation und Elastizitätsmessungen verbunden ist.
Abstract
Harninkontinenz (UI) ist eine weit verbreitete Erkrankung, die durch den Mangel des Harnröhrenschließmuskels gekennzeichnet ist. Regenerative Medizinzweige, insbesondere die Zelltherapie, sind neuartige Ansätze zur Verbesserung und Wiederherstellung der Funktion des Harnröhrenschließmuskels. Obwohl die Injektion aktiver funktioneller Zellen routinemäßig in klinischen Umgebungen mit Nadel und Spritze durchgeführt wird, haben diese Ansätze erhebliche Nachteile und Einschränkungen. In diesem Zusammenhang ist die Technologie des nadelfreien Wasserstrahls (WJ) eine praktikable und innovative Methode, die lebensfähige Zellen durch visuell geführte Zystoskopie in den Harnröhrenschließmuskel injizieren kann. In der vorliegenden Studie haben wir WJ verwendet, um porcine Fettgewebe-abgeleitete Stromazellen (pADSCs) in kadaverisches Harnröhrengewebe zu liefern und anschließend die Wirkung der WJ-Abgabe auf die Zellausbeute und -lebensfähigkeit zu untersuchen. Wir bewerteten auch die biomechanischen Eigenschaften (d.h. Elastizität) durch Rasterkraftmikroskopie (AFM) Messungen. Wir zeigten, dass die von WJ gelieferten pADSCs in ihrer zellulären Elastizität signifikant reduziert waren. Die Lebensfähigkeit war im Vergleich zu Kontrollen deutlich geringer, liegt aber immer noch über 80%.
Introduction
Harninkontinenz (UI) ist eine weit verbreitete Erkrankung mit einer Prävalenz von 1,8 - 30,5% in der europäischen Bevölkerung 1 und ist in erster Linie durch Fehlfunktionen des Harnröhrenschließmuskels gekennzeichnet. Aus klinischer Sicht wird Patienten häufig eine chirurgische Behandlung angeboten, wenn konservative Therapien oder Physiotherapie die auftretenden Symptome nicht ansprechen und lindern.
Die Zelltherapie zur möglichen regenerativen Reparatur der Fehlfunktion des Schließmuskelkomplexes hat sich zu einem avantgardistischen Ansatz für die Behandlung der UI-Pathologieentwickelt 2,3. Seine Hauptziele sind der Ersatz, die Reparatur und die Wiederherstellung der biologischen Funktionalität des beschädigten Gewebes. In Tiermodellen für UI hat die Stammzelltransplantation vielversprechende Ergebnisse bei urodynamischen Ergebnissengezeigt 2,4,5. Stammzellen entstehen als optimale zelluläre Kandidaten, da sie die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und multipotenten Differenzierung haben und so die betroffene Geweberegeneration unterstützen6. Trotz des bevorstehenden regenerativen Potenzials bleibt der praktische Einsatz der Zelltherapie behindert, da die minimal-invasive Abgabe von Zellen immer noch vor mehreren Herausforderungen hinsichtlich der Injektionspräzision und der Abdeckung des Ziels steht. Obwohl der derzeitige Ansatz für die Zellabgabe die Injektion durch ein Nadelspritzensystem7 ist, führt dies in der Regel zu einem Gesamtdefizit an lebensfähigen Zellen, wobei die berichteten Lebensfähigkeiten nach der Transplantation nur 1% bis 31% betragen8. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Zellabgabe über die Nadelinjektion auch die Platzierung, die Retentionsrate sowie die Verteilung der transplantierten Zellen in das Zielgewebe beeinflusst 9,10,11. Ein praktikabler, neuartiger Ansatz, der die oben genannte Einschränkung überwindet, ist die nadelfreie Zellabgabe mittels Wasserstrahltechnologie.
Die Waterjet (WJ) -Technologie entwickelt sich zu einem neuen Ansatz, der eine Hochdurchsatzabgabe von Zellen per Zystoskop unter visueller Kontrolle im Harnröhrenschließmuskelermöglicht 12,13. Der WJ ermöglicht die Zellabgabe bei unterschiedlichen Drücken (E = Effekte in bar) von E5 bis E8013. In der ersten Phase (Gewebepenetrationsphase) wird isotonische Lösung mit hohem Druck (d.h. E60 oder E80) aufgetragen, um die extrazelluläre Matrix, die das Gewebe umgibt, gezielt zu lockern und kleine miteinander verbindende Mikrolücken zu öffnen. In der zweiten Phase (der Injektionsphase) wird der Druck innerhalb von Millisekunden gesenkt (d.h. bis zu E10), um die Zellen schonend in das Zielgewebe zu bringen. Nach dieser zweistufigen Anwendung werden die Zellen beim Ausstoßen keinem zusätzlichen Druck gegen das Gewebe ausgesetzt, sondern schweben in einem Niederdruckstrom in einen flüssigkeitsgefüllten kavernösen Bereich13. In einem Ex-vivo-Modell, in dem Stammzellen über WJ in das kadaverische Harnröhrengewebe injiziert wurden, konnten lebensfähige Zellen anschließend aspiriert und aus dem Gewebe gewonnen und in vitro13 weiter ausgebaut werden. Obwohl eine Studie von Weber et al. aus dem Jahr 2020 die Machbarkeit und Anwendbarkeit von WJ zur Bereitstellung von Fußabdruck-freien Kardiomyozyten in das Myokard14 gezeigt hat, muss berücksichtigt werden, dass sich die WJ-Technologie noch in einem Prototypenstadium befindet.
Das folgende Protokoll beschreibt, wie Schweinefettgewebe-abgeleitete Stromazellen (pADSC) hergestellt und markiert werden und wie sie über die WJ-Technologie und Williams-Zystoskopie-Nadeln (WN) in Capture-Fluid- und Leichengewebe abgegeben werden. Nach der zellulären Injektion wird die zelluläre Vitalität und Elastizität mittels Rasterkraftmikroskopie (AFM) beurteilt. Über Schritt-für-Schritt-Anleitungen bietet das Protokoll einen klaren und prägnanten Ansatz zur Erfassung zuverlässiger Daten. Der Diskussionsteil stellt die wichtigsten Vorteile, Einschränkungen und Zukunftsperspektiven der Technik vor und beschreibt sie. Die WJ-Abgabe von Zellen sowie die hier berichteten Folgeanalysen nach der Translation ersetzen die Standardnadelinjektion und bieten einen soliden Zellabgaberahmen für die regenerative Heilung des Zielgewebes. In unseren jüngsten Studien haben wir den Nachweis erbracht, dass WJ Zellen im Vergleich zu Nadelinjektionen15,16 präziser und zumindest mit vergleichbarer Lebensfähigkeit lieferte.
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Protocol
Die Proben des Schweinefettgewebes stammen vom Institut für Experimentelle Chirurgie der Universität Tübingen. Alle Verfahren wurden von den örtlichen Tierschutzbehörden unter der Tierversuchsnummer CU1/16 genehmigt.
1. Isolierung von aus Schweinefettgewebe gewonnenen Stromazellen
- Verwenden Sie porcines Fettgewebe, das vom Institut für Experimentelle Chirurgie in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen an das Labor geliefert wird.
- Das Gewebe in eine sterile Petrischale unter der sterilen Bank geben und mit zwei Skalpellen (Nr. 10) zu kleinen Fragmenten und Brei zerkleinern.
HINWEIS: Eine Schere kann auch verwendet werden, um kleine Fragmente zu erhalten. Je kleiner die Fragmente sind, desto besser für die anschließende Verdauung.- Die kleinen Fragmente/der Brei in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen geben und mit 5 ml Homogenisatorlösung für 30 min bei 37 °C auf einem Shaker inkubieren. Die Homogenisatorlösung ist PBS mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) (Stammlösung: 1% (w/v) BSA in PBS) und 0,1% Kollagenase Typ I.
HINWEIS: Bereiten Sie die Homogenisatorlösung immer frisch vor. Der Shaker hat eine kreisförmige Schüttelbewegung bei einer langsamen Geschwindigkeit von 25-500 U / min.
- Die kleinen Fragmente/der Brei in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen geben und mit 5 ml Homogenisatorlösung für 30 min bei 37 °C auf einem Shaker inkubieren. Die Homogenisatorlösung ist PBS mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) (Stammlösung: 1% (w/v) BSA in PBS) und 0,1% Kollagenase Typ I.
- Um die Inkubation zu stoppen, fügen Sie 10 ml Wachstumsmedien hinzu [Dulbecco's Modified Eagle's Medium - Low Glucose (DMEM-LG), 2,5% HEPES Natriumsalzlösung (1 M), 10% fetales Rinderserum (FBS), 1% L-Glutamin (200 mM), 1% Penicillin-Streptomycin (10000 U/ml Penicillin; 10.000 μg/ml Streptomycin) und 1% Amphotericin B (250 μg/ml)].
HINWEIS: Wachstumsmedien können im Vorfeld vorbereitet werden. Antibiotika und Antimykotika sind bei der Herstellung der Wachstumsmedien für die Zellkultur notwendig, um Zellen vor Kontaminationen zu schützen. - Inkubieren Sie die Zentrifugenröhrchen für 10 min bei Raumtemperatur.
- Aspirieren Sie die Fraktion mit Adipozyten, die leichter ist und daher auf der Flüssigkeit schwimmt, mit einer 10 ml Pipette und entsorgen Sie sie.
- Filtern Sie die verbleibende Stromafraktion durch ein 100 μm Zellsieb mit einer schwermetallfreien Polyethylenterephthalat-Membran (PET), um Fettgewebefragmente zurückzuhalten und nur die Zellsuspension zu erhalten.
- Die filtrierte Zellsuspension 7 min bei 630 x g bei Raumtemperatur zentrifugieren.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 2 ml PBS, um die Zellen einmal zu waschen.
- Die Zellsuspension erneut für 7 min bei 630 x g bei Raumtemperatur zentrifugieren.
- Nach Zentrifugation und wiederholter Resuspension des Zellpellets in 10 ml Wachstumsmedien pro Kolben, Samenzellen in 75 cm2 Zellkulturflaschen.
HINWEIS: Je nach Größe des Zellpellets nach dem Waschschritt mit PBS Samenzellen in ein bis vier Kolben.
2. Zellkultivierung von aus Schweinefettgewebe gewonnenen Stromazellen
- Ernte und Passage von Zellen, wenn sie 70% Konfluenz erreichen.
- Waschen Sie Zellen mit 10 ml PBS zweimal und aspirieren Sie PBS vollständig.
HINWEIS: Dieser Schritt ist notwendig, um verbleibende Wachstumsmedien zu entfernen, die durch 10% FBS ergänzt werden. FBS hat mehrere Proteasehemmer, die die Funktion der folgenden Trypsinisierung behindern können. - Fügen Sie 3 ml 0,05%-Trypsin-EDTA pro Flasche hinzu, um die Zellen zu lösen.
- Kolben für 3 min bei 37 °C inkubieren.
- Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob sich Zellen lösen.
HINWEIS: Manchmal dauert es etwas länger, bis die Zellen abgelöst sind. In diesem Fall Kolben für maximal 5 min bei 37 °C inkubieren. - Um den Inkubations- und Ablösungsprozess zu stoppen, fügen Sie 3 ml Wachstumsmedien hinzu.
HINWEIS: Wie oben erwähnt, werden Wachstumsmedien durch 10% FBS ergänzt, die Proteasehemmer enthalten. - Die abgelösten Zellen für 7 min bei 630 x g bei Raumtemperatur in ein Zentrifugationsröhrchen und eine Zentrifuge überführen.
- Suspendieren Sie die Zellen in 10 ml Wachstumsmedien und zählen Sie sie mit einem Hämozytometer.
- Samenzellen mit einer Impfdichte von 3 x 105 Zellen pro 75 cm2 Kolben.
3. Markierung von Zellen mit Calcein-AM
HINWEIS: Zellen, die in Leichengewebe injiziert werden, werden mit einem grün-fluoreszierenden membrandurchlässigen Lebendzellfleck und einem rot-fluoreszierenden Membran-Undurchsichtigkeits-Lebensfähigkeitsindikator gefärbt, um zu überprüfen, ob die extrahierten Zellen mit den injizierten Zellen und nicht mit Gewebefragmenten der Harnröhre identisch sind.
- Waschen Sie Zellen zweimal mit 10 ml PBS.
- 5 ml Farbstofflösung pro 75 cm2 Kolben zugeben. Die Farbstofflösung besteht aus Wachstumsmedien mit 2 μM des grün-fluoreszierenden membrandurchlässigen Lebendzellfarbstoffs und einem 4 μM rot-fluoreszierenden Membran-Undurchsichtigkeitsanzeiger.
- 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
- Aspirieren und verwerfen Sie die Farbstofflösung.
- Waschen Sie die Zellen noch einmal zweimal mit 10 ml PBS.
- Fügen Sie Wachstumsmedien hinzu und dokumentieren Sie das grüne und rote Fluoreszenzsignal durch Fluoreszenzmikroskopie.
- Legen Sie den 75 cm2 Kolben auf den Mikroskoptisch, verwenden Sie das 10-fache Objektiv, wählen Sie keinen Fluoreszenzfilter und stellen Sie sicher, dass der Durchlichtweg aktiv ist.
HINWEIS: Diese Schritte werden alle manuell am Mikroskop durchgeführt. - Öffnen Sie parallel zu Schritt 3.6.1 das Softwareprogramm.
- Drücken Sie die Live-Taste unter der Registerkarte "Suchen", um ein Live-Bild der Zellen im Kolben auf dem Tisch zu erhalten, und konzentrieren Sie sich mit den groben und Feinjustierlaufwerken auf sie.
HINWEIS: Auf der rechten Seite erscheint das Livebild, sobald der Live-Button aktiviert ist. - Wählen Sie im Unterreiter Mikroskopkomponenten das richtige Ziel (10x) aus.
- Setzen Sie auf der Unterregisterkarte Kamera ein Häkchen auf die automatische Belichtung.
- Drücken Sie die Taste Snap, um das erste Bild mit Durchlicht aufzunehmen.
- Fügen Sie die Maßstabsleiste ein, indem Sie die Registerkarte Grafiken in der Menüleiste verwenden und Maßstabsleiste auswählen.
- Speichern Sie das Bild, indem Sie die Registerkarte Dateien in der Menüleiste verwenden und als czi speichern auswählen.
- Für die Fluoreszenzbilder ändern Sie den Filter auf den für grüne oder rote Fluoreszenz spezifischen Filter und wählen Sie den reflektierten Lichtpfad.
HINWEIS: Diese Änderungen müssen manuell am Mikroskop vorgenommen werden. - Drücken Sie erneut die Live-Taste unter der Registerkarte Suchen , um ein Livebild der Zellen zu erhalten.
- Drücken Sie die Taste Snap, um das zweite Bild mit grüner oder roter Fluoreszenz aufzunehmen.
- Fügen Sie die Maßstabsleiste ein, indem Sie die Registerkarte Grafiken in der Menüleiste verwenden und Maßstabsleiste auswählen.
- Speichern Sie das Bild, indem Sie die Registerkarte Dateien in der Menüleiste verwenden und als czi speichern auswählen.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.6.9 bis 3.6.13 mit dem anderen Fluoreszenzkanal.
- Legen Sie den 75 cm2 Kolben auf den Mikroskoptisch, verwenden Sie das 10-fache Objektiv, wählen Sie keinen Fluoreszenzfilter und stellen Sie sicher, dass der Durchlichtweg aktiv ist.
4. Bereiten Sie Harnröhrengewebeproben für Injektionen vor
- Sezieren Sie die Harnröhre und die verbindende Blase aus dem Schwein.
HINWEIS: Für die Experimente wurden Harnröhrengewebeproben aus frischen Leichenproben erwachsener weiblicher Landrassenschweine verwendet. - Transportieren Sie es in Säcken auf nassem Eis ins Labor.
HINWEIS: Die Proben sollten bis zur Weiterverarbeitung auf Eis gelassen werden. Den Proben wurden keine Zusatzstoffe zugesetzt. - Legen Sie die Harnröhre mit der Blase auf einen Schwamm, der die Elastizität des unteren Beckenbodens nachahmt.
- Verwenden Sie die Blase, um die Orientierung (proximal, distal, dorsal und ventral) der Harnröhre zu bestimmen. Dies ist möglich durch die Lokalisation der Harnleiter und der drei Bänder, die die Blase in der Bauch- und Beckenhöhle fixieren. Die drei Bänder sind die beiden Vesicae lateralia-Bänder an den Seiten der Blase und die Vesicae medianum, die aus der ventralen Oberfläche der Blase entspringen (Abbildung 1).
- Schneiden Sie die Harnröhre längs auf der Rückenseite mit Hilfe eines Katheters auf.
- Injizieren Sie die Zellen in die geöffnete Harnröhre, wie in den folgenden Kapiteln beschrieben.
5. Injektionen von Zellen über eine Williams-Nadel in Flüssigkeiten und Gewebeproben
- Erntezellen wie in Schritt 2 beschrieben.
- Im Gegensatz zu Schritt 2.9 können Sie die Zelldichte für Injektionen auf 2,4 x 10 6 Zellen pro ml einstellen.
HINWEIS: Bei Injektionen in Gewebeproben markieren Sie die Zellen mit einer grün-fluoreszierenden membrandurchlässigen Lebendzelle. - Saugen Sie die Zellsuspension mit einer Spritze ab und tragen Sie die zystoskopische Williams-Injektionsnadel (WN) darauf auf.
- Halten Sie die Nadel entweder kurz über die 2 ml Wachstumsmedien in einem 15 ml Zentrifugationsröhrchen oder führen Sie die Nadel in das geöffnete Harnröhrengewebe ein. In beiden Fällen werden 250 μL Zellen manuell injiziert.
HINWEIS: Zellen, die in die Kadaverharnröhre injiziert werden, bilden eine Injektionskuppel. - Sammeln Sie Zellen, die direkt durch Zentrifugation für 7 min bei 630 x g bei Raumtemperatur in Medien injiziert werden.
- Für Zellen, die in die Kadaverharnröhre injiziert werden, saugen Sie sie mit einer 18G-Nadel, die auf eine Spritze aufgetragen wird, aus der Injektionskuppel ab.
- Transfer der injizierten und aspirierten Zellen in ein Zentrifugationsröhrchen und eine Zentrifuge für 7 min bei 630 x g bei Raumtemperatur vergleichbar mit den in Medien injizierten Zellen.
- Nach der Zentrifugation die Zellen in beiden Fällen in 4 ml Wachstumsmedien resuspendieren.
- Bestimmen Sie die Zellausbeute und Lebensfähigkeit mit Hilfe des Trypan-Blaufarbstoffausschlusses mit einem Hämozytometer.
- Mischen Sie 20 μL Zellsuspension gründlich mit 20 μL Trypanblau.
- Füllen Sie 10 μL dieser Mischung in jede Kammer des Hämozytometers.
HINWEIS: Beide Kammern werden gefüllt und gezählt, um eine statistische Optimierung durch Verdoppelung der Probenahme zu erhalten. - Zählen Sie unter dem Mikroskop Zellen in allen vier Eckquadraten.
HINWEIS: Zählen Sie Zellen, die weiß (ungefärbt) leuchten, als lebensfähige Zellen, während blau leuchtende (gefärbte) Zellen als tote Zellen gezählt werden. - Um die Zellzahl pro ml zu berechnen, berechnen Sie den Mittelwert der beiden Kammern, teilen Sie diese Zahl durch zwei und multiplizieren Sie sie mit 104.
6. Injektionen von Zellen über Wasserstrahl in Flüssigkeiten und Gewebeproben
- Erntezellen wie in Schritt 2 beschrieben.
- Im Gegensatz zu den Schritten 2.9 und 5.2 können Sie die Zelldichte für Injektionen auf 6 x 106 Zellen pro ml einstellen.
HINWEIS: Für Injektionen in Gewebeproben verwenden Sie Zellen, die mit einer grün-fluoreszierenden membrandurchlässigen lebenden Zelle markiert sind. - Füllen Sie die Zellsuspension in die Dosiereinheit des WJ-Gerätes.
- Halten Sie die Einspritzdüse entweder kurz über den 2 ml Wachstumsmedien in einem 15 ml Zentrifugationsröhrchen oder kurz über dem geöffneten Harnröhrengewebe.
- In beiden Fällen injizieren Sie 100 μL Zellen durch das Gerät unter Verwendung eines hohen Drucks für die Gewebepenetration, gefolgt von einer Niederdruckphase für Zellinjektionen. Verwenden Sie die Druckeinstellungen E60-10.
HINWEIS: Zellen, die in die Kadaverharnröhre injiziert werden, bilden eine Injektionskuppel. - Sammeln Sie Zellen, die direkt durch Zentrifugation für 7 min bei 630 x g bei Raumtemperatur in Medien injiziert werden.
- Für Zellen, die in die Kadaverharnröhre injiziert werden, saugen Sie sie mit einer 18G-Nadel, die auf eine Spritze aufgetragen wird, aus der Injektionskuppel ab.
- Transfer der injizierten und aspirierten Zellen in ein Zentrifugationsröhrchen und eine Zentrifuge für 7 min bei 630 x g bei Raumtemperatur vergleichbar mit den in Medien injizierten Zellen.
- Nach der Zentrifugation resuspendieren Sie die Zellen in beiden Fällen in 4 ml Wachstumsmedien.
- Die Zellausbeute und Lebensfähigkeit wird mit Hilfe des Trypan-Blaufarbstoffausschlusses mit einem Hämozytometer bestimmt, wie in 5.10 ausführlich beschrieben.
7. Biomechanische Beurteilung der zellulären Elastizität durch Rasterkraftmikroskopie (AFM)
- Vorbereitung von Proben
HINWEIS: Die entnommenen Zellen nach der Injektion werden nun weiteren Analysen durch AFM unterzogen. Zusätzlich werden Zellen, die nicht injiziert wurden, als Kontrollen verwendet.- Samenzellen in Gewebekulturschalen mit einer Dichte von 5 x 105 Zellen pro Schale.
HINWEIS: Samen Sie eine Gewebekulturschale pro Bedingung aus. Die Bedingungen sind Kontrollen, ADSCs, die von WJ oder WN in Medien injiziert werden, und ADSCs, die von WJ oder WN in Leichengewebe injiziert werden. - Inkubieren Sie Zellen in Gewebekulturschalen für 3 h bei 37 °C.
HINWEIS: Um Varianzen durch Zellen in der G1-Phase und während der Mitose zu vermeiden, haben wir AFM-Messungen 3 h nach dem Zellaussaatschritt durchgeführt. - Ersetzen Sie kurz vor der Messung mit dem AFM die Wachstumsmedien durch 3 ml Leibovitz' L-15-Medien ohne L-Glutamin.
- Legen Sie die Gewebekulturschale in den Probenhalter des AFM-Geräts und schalten Sie den Petrischalenheizungssatz bei 37 °C ein.
- Samenzellen in Gewebekulturschalen mit einer Dichte von 5 x 105 Zellen pro Schale.
- Vorbereitung der AFM- und Cantilever-Kalibrierung
- Verwenden Sie einen Glasblock, der für Messungen in Flüssigkeiten spezifiziert ist, und stellen Sie ihn am AFM-Halter ein.
HINWEIS: Die Oberseite des Glasblocks muss gerade und parallel zum AFM-Halter sein. - Platzieren Sie den Ausleger vorsichtig auf der Oberfläche des Glasblocks. Die Spitze A muss über der polierten optischen Ebene liegen.
HINWEIS: Zerkratzen Sie nicht die polierte optische Oberfläche des Glasblocks, da Kratzer zu Interferenzen in den Messungen führen können. Die Spitze A muss über die polierte optische Ebene hinausragen, da sonst die Reflexion des Lasers des AFM auf den Photodetektor nicht möglich ist. - Um den Ausleger auf dem Glasblock zu stabilisieren, fügen Sie eine Metallfeder mit Hilfe einer Pinzette hinzu.
- Wenn der Ausleger auf dem Glasblock befestigt ist, legen Sie den Block auf den AFM-Kopf und verriegeln Sie den integrierten Verriegelungsmechanismus.
- Montieren Sie den AFM-Kopf am AFM-Gerät.
HINWEIS: Die Feder muss zur linken Seite zeigen, um richtig platziert zu werden. Ist dies nicht der Fall, korrigieren Sie die Position des Glasblocks und stellen Sie den AFM-Kopf erneut ein. - Initialisieren Sie das Software-Setup und öffnen Sie die Software zusammen mit dem Laserausrichtungsfenster und den Einstellungen der Annäherungsparameter. Schalten Sie zusätzlich den Schrittmotor, das Laserlicht und die CCD-Kamera ein.
- Identifizieren Sie die Auslegerspitze A mit der CCD-Kamera.
- Senken Sie den Ausleger, bis er vollständig in das Medium eingetaucht ist. Verwenden Sie die Schrittmotorfunktion, um dieses Ziel zu erreichen.
- Sobald der Ausleger vollständig mit Medium bedeckt ist, wird der Laser mit den Einstellschrauben auf dem Ausleger ausgerichtet. Der reflektierte Strahl muss auf die Mitte des Photodetektors fallen und die Summe der Signale muss 1 V oder höher sein. Die seitlichen und vertikalen Durchbiegungen sollten nahe bei 0 liegen.
HINWEIS: Wenn das Zentrum erreicht ist, können in der Laserausrichtungsfunktion sowie die Signalwerte überwacht werden. Sind die Signalwerte nicht korrekt, sind weitere Anpassungen notwendig. - Führen Sie nun den Scanner Approach mit den Anflugparametern aus (Tabelle 1).
- Ziehen Sie den Ausleger um 100 μm ein, sobald er den Boden erreicht hat, indem Sie die Taste Retract drücken.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass an diesem Feld keine Zelle angebracht ist, bei der der Ansatz durchgeführt wird, da dies die Kalibrierung verfälschen würde. - Richten Sie die Run-Parameter gemäß den folgenden Spezifikationen ein: Sollwert 1 V, Zuglänge 90 μm, Geschwindigkeit: 5 μm/s, Abtastrate: 2000 Hz und als Verzögerungsmodus: Konstante Kraft.
- Starten Sie die Messung der Kalibrierkraft-Abstandskurve durch Drücken der Taste Ausführen.
HINWEIS: Durch Klicken auf die Schaltfläche Ausführen in der Software wird eine Kraft-Distanz-Kurve erhalten. - Wählen Sie den Bereich der linearen Anpassung der eingezogenen Kurve in der Software auf der erhaltenen Kalibrierkraft-Abstandskurve. Berechnen Sie die Federkonstantenmessung durch die Software.
- Kalibrieren Sie den Ausleger nach den genauen Parametern und Schritten, wie von Danalache et al.17 beschrieben.
- Verwenden Sie einen Glasblock, der für Messungen in Flüssigkeiten spezifiziert ist, und stellen Sie ihn am AFM-Halter ein.
- Messung der Elastizität einzelner Zellen
- Identifizieren Sie eine Zelle visuell und konzentrieren Sie sich darauf. Platzieren Sie die Computermaus in der Mitte der Zelle. Um die Messgenauigkeit zu verbessern, positionieren Sie die AFM-Spitze direkt über dem Zellkern.
HINWEIS: Die Computermaus wird als visuelle Markierung verwendet, um die Zielstelle der Einrückung zu identifizieren. - Konzentrieren Sie sich nun auf den Ausleger und bewegen Sie ihn auf der Computermaus.
- Beginnen Sie die Messung mit Ausführen mit den in Tabelle 2 angegebenen Parametern.
HINWEIS: Es werden die Sollwertparameter verwendet, die durch Kalibrierung des Auslegers erhalten werden. Darüber hinaus wird eine Zelle dreimal gemessen. Messen Sie mindestens 50 Zellen.
- Identifizieren Sie eine Zelle visuell und konzentrieren Sie sich darauf. Platzieren Sie die Computermaus in der Mitte der Zelle. Um die Messgenauigkeit zu verbessern, positionieren Sie die AFM-Spitze direkt über dem Zellkern.
- Datenverarbeitung
- Verarbeiten Sie die Daten nach genauen Schritten und Parametern, wie zuvor von Danalache17 beschrieben.
- Speichern und exportieren Sie die Datei.
8. Statistische Auswertung
- Öffnen Sie die Statistiksoftware.
- Wählen Sie die Option Neues Dataset aus.
HINWEIS: Zwei Dateien werden geöffnet. Einer ist der "DataSet" und der andere ist die "Output" -Datei. - Wählen Sie die DataSet-Datei aus, und öffnen Sie die Registerkarte Variablenansicht .
- Fügen Sie die numerischen Variablen für die Injektion an der Stelle (Capture Fluid oder Leichengewebe), die Kategorie (Kontrolle, WJ-Injektion, WN-Injektion) und die Elastizität ein.
- Fügen Sie die gemessenen Elastizitätsdaten mit der entsprechenden Site-Injektion und Kategorienummer auf der Registerkarte Datenansicht ein.
- Analysieren Sie die Daten, indem Sie die Menüleistenregisterkarte | analysieren auswählen Deskriptive Statistik und wählen Sie Explorative Datenanalyse.
- Wählen Sie als abhängige Variable die Option Elastizität und Faktorliste aus, und wählen Sie Kategorie aus.
HINWEIS: Die Ergebnisse werden in der Datei "Ausgabe" angezeigt, einschließlich eines Boxplots, das für den Ergebnisabschnitt verwendet wird. - Um einen statistischen Test durchzuführen, wählen Sie im nichtparametrischen Test unter dem Menüleistenreiter Analysieren die Option Unabhängige Stichproben aus.
- In der neu geöffneten Datei behalten Sie die Einstellungen im Reiter Ziel und Einstellungen bei.
- Öffnen Sie den Reiter Felder und wählen Sie Elastizität als Testfelder und Kategorie als Gruppen.
- Drücken Sie auf Ausführen.
HINWEIS: Die Ergebnisse werden in der Datei "Ausgabe" angezeigt. Für diese Analysen wird ein Mann-U-Whitney-Test durchgeführt. - Fügen Sie das Ergebnis des nichtparametrischen Tests in das Boxplot der explorativen Datenanalyse ein.
- Speichern Sie die Dateien, indem Sie in der Menüleiste Datei und Speichern auswählen.
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Representative Results
Nach der Zellabgabe über die beiden Ansätze war die Lebensfähigkeit der über die WN gelieferten Zellen (97,2 ± 2%, n=10, p<0,002) höher als bei Injektionen durch WJ unter Verwendung der E60-10-Einstellungen (85,9 ± 0,16%, n=12) (Abbildung 2). Die Ergebnisse der biomechanischen Bewertung zeigten, dass: WN-Injektionen von Zellen in Einfangflüssigkeit zeigten keinen signifikanten Unterschied in Bezug auf die Elastizitätsmodule (EM; 0,992 kPa) im Vergleich zu den Kontrollen (1,176 kPa; Abbildung 3A), während WJ-Injektionen eine signifikante Reduktion der zellulären EM auslösten (0,440 kPa, p<0,001, Abbildung 3B). Eine Abnahme von 40 - 50% der EM nach WJ-Injektionen wurde festgestellt. Obwohl WN-Injektionen in Leichenharnröhrengewebe keinen signifikanten Unterschied in der zellulären EM ergaben (Abbildung 4A), wurde nach WJ-Injektionen in Gewebeproben eine signifikante Reduktion der EM festgestellt (0,890 kPa bis 0,429 kPa; p<0,00, Abbildung 4B). Somit wurden die absoluten EM-Werte nach WJ-Injektion dadurch um 51% reduziert. Insgesamt zeigen die Ergebnisse, dass, während die WJ-Zellabgabe eine absolute Anforderung für eine klinische Implementierung erfüllt, bei der mehr als 80% lebensfähige Zellen nach der Lieferung18 , nach der WJ-Abgabe die Zellelastizitätsmodule betroffen sind. Eine niedrigere zelluläre EM könnte die Migration von Merkmalen der Zellen nach der WJ-Abgabe erleichtern. In einer so breiteren Verteilung und Palette von regenerativen Kapazitäten in der gewünschten Region19.
Abbildung 1. Anatomie der Schweineblase und der Harnröhre sowie der Injektionsstellen. A) Die ventrale Seite der Schweineblase und der Harnröhre mit den drei Bändern, die die Blase in der Bauch- und Beckenhöhle fixieren, sind dargestellt. Zusätzlich werden die Harnleiter gezeigt, die auf der dorsalen Seite der Blase enden. B) Repräsentatives Bild der Leichenharnröhre, die für die WJ- und WN-Injektion verwendet wird. Längsschnittlich ist die dorsal geöffnete Harnröhre mit schwarz umkreisten Injektionsdomen dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2. Injektionen zur Bestimmung der zellulären Lebensfähigkeit über WN und WJ. pADSCs, die über WN oder WJ injiziert wurden, wurden nach der Injektion gesammelt und über den Trypan-Ausschluss gezählt, um die Lebensfähigkeit zu bestimmen. Die zelluläre Lebensfähigkeit war nach der WJ-Injektion im Vergleich zu Zellen, die über WN abgegeben wurden, signifikant reduziert. S<0,001 Die Daten werden grafisch als Mittelwert mit Standardabweichung dargestellt. Abkürzungen: WJ - waterjet, WN - Williams needle. Abbildung nach Danalache et al. 202119. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3. Vergleich der quantifizierten Young-Module von WN bzw. WJ abgegebenen Zellen in Capture-Medien und deren entsprechende Kontrollen. In den Boxplots für die (unbehandelten) Zellmonoschichten und die mit WN gelieferten Zellen (A) wurde kein nennenswerter Unterschied in EM beobachtet. Im Gegensatz dazu kann eine signifikante Abnahme der Elastizität zwischen den Boxplots der Kontrollzellen und der WJ-Gruppe (B) festgestellt werden. ns - nicht signifikant, p > 0.05, ***p<0.001. Abkürzungen: WJ - waterjet, WN - Williams needle. Abbildung nach Danalache et al. 202119. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4. Vergleich der quantifizierten Young-Module von WN bzw. WJ lieferten Zellen in die kadaverische Harnröhre und deren entsprechende Kontrollen. Es wurde kein nennenswerter Unterschied zwischen Zellen, die über WN-Zellen geliefert werden, und ihren entsprechenden Kontrollen beobachtet (A). Eine signifikante Abnahme der Elastizität wurde zwischen den WJ gelieferten Zellen und der Kontrollzell-Monoschicht (B) festgestellt. ns - nicht signifikant, p > 0.05, ***p<0.001. Abkürzungen: WJ - waterjet, WN - Williams needle. Abbildung nach Danalache et al. 202119. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Parameter "Ansatz" | Wert |
| Vorgehensweise IGain | 3,0 Hz |
| Anfahrt PGain | 0.0002 |
| Annäherungszielhöhe | 10,0 μm |
| Ansatz-Sollwert | 3,00 V |
| Ausgangswert des Ansatzes | 0,00 V |
Tabelle 1. Annäherungsparameter.
| Parameter ausführen | Wert |
| Satzball | 10 nN |
| Z-Bewegung / Geschwindigkeit verlängern | Konstante Geschwindigkeit / |
| 5,0 μm/s | |
| Kontaktzeit | 0,0 s |
| Zuglänge | 90 μm |
| Verzögerungsmodus | Konstante Kraft |
| Abtastrate | 2000 Hz |
Tabelle 2. Führen Sie Parameter aus.
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Discussion
In der vorliegenden Studie demonstrierten und präsentierten wir einen Schritt-für-Schritt-Ansatz für das WJ-Zellabgabeverfahren und verwendeten eine Folge quantitativer Untersuchungen, um den Einfluss der WJ-Abgabe auf die zellulären Eigenschaften zu bewerten: zelluläre Lebensfähigkeit und biomechanische Merkmale (d.h. EM). Nach der WJ-Injektion waren 85,9% der geernteten Zellen lebensfähig. In Bezug auf die WN-Injektion behielten 97,2% der Zellen ihre Lebensfähigkeit nach der Injektion bei. Damit erfüllt der WJ-Ansatz eine absolute Voraussetzung für eine klinische Umsetzung: mehr als 80% lebensfähige Zellen nach der Entbindung18. Während mit dem WJ-Ansatz ein standardisiertes und reproduzierbares Protokoll erreicht wird, hängt das Ergebnis der Nadelinjektion stark von der Größe und Düse der Spritze und der Nadel, dem Druck, der Durchflussrate und dem Arzt ab, der die Injektion selbst durchführt19.
Studien mit WJ-Zellabgabe in lebenden Tiermodellen zeigten, dass durch Variation des Ejektionsdrucks die Eindringtiefe an das Zielgewebe und damit an die gewünschte klinische Anwendung angepasst werden kann13,16. Transurethrale Zellinjektionen bei lebenden Tieren unter visueller Kontrolle berichteten über eine Fehlplatzierung oder den Verlust von Zellen bei etwa 50% der behandelten Tiere 20, während WJ-Injektionen genaue Zellinjektionsraten von über90% berichteten (Linzenbold et al.16 und unveröffentlichte Beobachtung). Der aktuelle goldene Standard für die Zellabgabe (Nadelinjektionen) erfordert das Eindringen der Kanüle in ein Zielgewebe. Daher verursacht die Nadelzelltranslation in allen Fällen Verletzungen und Traumata. In der Harnröhre kann dies tatsächlich zu Entzündungen und Toxifizierung aufgrund von Keimen und Toxinen führen, die sogar im gesunden Urin vorkommen. Darüber hinaus ist die Benutzeroperationszeit bei der WJ-Injektion im Vergleich zu einer Nadelinjektion deutlich kürzer: Die Zellen werden innerhalb von Millisekunden in die vorgesehene Gewebeschicht eingebracht, indem die Druckniveaus voreingestellt werden. Im Gegensatz dazu hängt die Eindringtiefe bei der Nadelinjektion in abgelegenen Gebieten durch Endoskopie von den Fähigkeiten und Erfahrungen des Chirurgen ab. Es wird auch erwartet, dass die Reproduzierbarkeit der WJ-Injektion überlegen sein wird, aber derzeit existieren nur präklinische Daten15,16,20 und weniger als 200 Tiere wurden untersucht. In unserer aktuellen Studie haben wir festgestellt, dass die zelluläre Elastizität durch die WJ-Anwendung im Vergleich zu Nadelinjektionenreduziert wird 21. Dies ist auf die Scherspannung von Zellen in höherer Geschwindigkeit während der WJ-Abgabe zurückzuführen. Darüber hinaus könnte ein eventueller Zellverlust durch eine höhere Präzision der Zellplatzierung und -auswurf innerhalb des interessierenden Bereichs kompensiert werden, wie dies bei der WJ-geführten Abgabe durch visuell geführte Zystoskopieerreicht wird 22.
Es ist bekannt, dass mechanische Kräfte das Verhalten von Stammzellen, das Regenerationspotenzial sowie deren spätere Lebensfähigkeit und Funktionalität nach der Transplantation steuern 10,23. Das Aufkommen des atomaren AFM bot ein leistungsfähiges Werkzeug zur Quantifizierung der mechanischen Eigenschaften einzelner lebender Zellen in nanoskaliger Auflösung unter wässrigen Bedingungen 24,25,26,27. AFM ist eine zuverlässige und hochempfindliche Methode, die Steifigkeiten von weniger als 100 Pa bis 106 Pa erkennen und aufzeichnen kann und damit einen weiten Bereich für die meisten Gewebe und Zellen abdeckt28. Tatsächlich entwickelt sich die Zellmechanik zu einem markierungsfreien Biomarker für die Bewertung des Zellzustands und sowohl im physiologischen als auch im pathologischen Zustand29 und die Zellelastizität ist die synergetische und kumulative Reaktion des Zellkerns - Zytoskelett-Crosstalk. Es ist allgemein bekannt, dass, wenn eine Zelle äußeren Kräften ausgesetzt ist, diese Kräfte von der Plasmamembran über das Zytoskelett auf den Kern übertragen werden, was zu intranukleären Deformationen und Reorganisationführt 30,31,32. Daher ist der Kern, der lange Zeit als genomisches Material und Transkriptionsapparat angesehen wurde, ein Schlüsselspieler in der zellulären Mechanotransduktionsowie 32. In der Tat ist die Bedeutung der Kernmechanik und der nukleo-zytoskelettalen Verbindungen, in allen zellulären Funktionen und Mutationen, in Laminen und Linkern des Nukleoskeletts zum Zytoskelett (LINC) -Komplex - am Anfang mehrerer Pathologien 33,34. Diese Kräfte könnten auch auf zelluläre Artefakte hinweisen. Insbesondere breiten sich extern erzeugte Kräfte tatsächlich entlang zytoskelettaler Filamente aus und werden weiter auf die Kernlamina über den LINC-Komplex übertragen; Als Reaktion auf diese Kräfte wird der Kern in der Tat steifer35,36 und verschmilzt so die beiden eng miteinander verflochtenen und verbundenen Prozesse. Dies ist auch die Begründung unseres Ansatzes und unserer nuklearmechanischen Messungen. Darüber hinaus sorgt eine präzise Platzierung des Auslegers auf der Kernoberfläche für ein hohes Maß an Reproduzierbarkeit und reduziert Variationen aufgrund der Zellheterogenität und der Bindung an das Substrat.
Obwohl sich die Zellelastizität als markierungsfreier Biomarker zur Bewertung des Zellzustands und sowohl im physiologischen als auch im pathologischen Zustand29 herauskristallisiert, sind die gemessenen Elastizitätsmodule durch große Variationen selbst im gleichen Zelltyp37 gekennzeichnet. Eine von Schillers et al. vorgeschlagene Methode, um solchen Variationen entgegenzuwirken, ist die Implementierung standardisierter nanomechanischer AFM-Verfahren (SNAP), die eine hohe Reproduzierbarkeit und Anwendbarkeit von Elastizitätsmessungen als zuverlässiger quantitativer Marker für Zellen in verschiedenen Zuständen gewährleisten38. Auch wenn experimentelle Parameter, die in den AFM-Analysen verwendet werden, wie Eindringgeschwindigkeit, Eindringform und -größe sowie genaue Darstellung der Spitzengeometrie in Modellanpassung 39, die absoluten Messwerte40,41 beeinflussen, sollten diese Parameter die Ergebnisse innerhalb einer Studie oder eine gemessene Tendenz nicht beeinflussen.
Beachten Sie jedoch, dass AFM-Eindrücke auf die Analyse der äußeren Oberfläche von Zellen beschränkt sind und daher nicht in der Lage sind, das Innere einer Zellmembran oder bestimmte intrazelluläre Strukturen abzutasten. Usukura et al. schlugen eine "Unroofing" -Methode vor, die die Zellmembran bricht und die zytoplasmatisch löslichen Komponenten42 entfernt, wodurch AFM-intrazelluläre Untersuchungen ermöglicht werden. In unserer Studie lag der Fokus jedoch auf der Beurteilung der durchschnittlichen Elastizitätsmodule und nicht auf der Untersuchung verschiedener und selektiver intrazellulärer Komponenten.
Insgesamt hängt die Konsistenz und Zuverlässigkeit der gelieferten AFM-Daten stark von der technischen Erfahrung des jeweiligen Betreibers ab und könnte durch biologische Variabilitätverzerrt sein 38. Unter Berücksichtigung aller empfindlichen Variablen, die die tatsächlichen AFM-Ergebnisse beeinflussen könnten, können die in dieser Studie berichteten absoluten Elastizitätswerte nicht verallgemeinert werden und sind ziemlich spezifisch für unseren Versuchsaufbau.
Insgesamt liefert unsere Studie Evidenz21 sowie ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Überlegenheit von WJ-Injektionen gegenüber Nadelinjektionen für regenerative Zelltherapien.
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Disclosures
Die Autoren J.K., M.D, T.A., A.S., W.K. A. haben nichts offenzulegen. Die Autoren W.L. und M.D.E. sind Mitarbeiter der ERBE Medizintechnik Lt. Tübingen, dem Hersteller des ERBEJet2 und des in dieser Studie verwendeten WJ-Prototyps.
Acknowledgments
Wir danken unseren Co-Autoren aus den Originalpublikationen für ihre Hilfe und Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL centrifuge tube | Greiner BioOne | 227261 | |
| 1 mL BD Luer-LokTM Syringe | BD Plastik Inc | n.a. | |
| 100 µm cell sieve | Greiner BioOne | 542000 | |
| 15 mL centrifuge tube | Greiner BioOne | 188271 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Corning Incorporated | 353136 | |
| AFM head | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
| AFM processing software | Bruker | JPK00518 | |
| AFM software | Bruker | JPK00518 | |
| AFM system Cell Hesion 200 | Bruker | JPK00518 | |
| All-In-One-Al cantilever | Budget Sensors | AIO-10 | tip A, Conatct Mode, Shape: Beam Force Constant: 0.2 N/m (0.04 - 0.7 N/m) Resonance Frequency: 15 kHz (10 - 20 kHz) Length: 500 µm (490 - 510 µm) Width: 30 µm (35 - 45 µm) Thickness: 2.7 µm (1.7 - 3.7 µm) |
| Amphotericin B solution | Sigma | A2942 | 250 µg/ml |
| Atomic Force Microscope (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| BD Microlance 3 18G | BD | 304622 | |
| bovine serum albumin | Gibco | A10008-01 | |
| Cantilever | All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | tip A, k ¼ 0.2 N/m |
| C-chip disposable hemocytometer | NanoEnTek | 631-1098 | |
| centrifuge: Rotina 420R | Hettich Zentrifugen | ||
| Collagenase, Type I, powder | Gibco | 17100-017 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - low glucose | Sigma | D5546 | |
| Feather disposable scalpel (No. 10) | Feather | 02.001.30.010 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
| HEPES sodium salt solution (1 M) | Sigma | H3662 | |
| Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| laboratory bags | Brand | 759705 | |
| Leibovitz's L-15 medium without l-glutamine | Merck | F1315 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
| L-glutamine | Lonza | BE 17-605C1 | 200 mM |
| LIVE/DEADTM Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | L3224 | Calcein AM and EthD-1 are used from this kit. |
| Microscope software: Zen 2.6 | Zeiss | ||
| Microscope: AxioVertA.1 | Zeiss | ||
| Nelaton-Catheter female | Bicakcilar | 19512051 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 10000 U/ml Penicillin 10000 µg/ml Streptomycin |
| Petri dish heater associated with AFM | Bruker | T-05-0117 | |
| Petri dish heater associated with AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-015 | |
| Statistical Software: SPSS Statistics 22 | IBM | ||
| Sterile Petri dish - CellStar | Greiner BioOne | 664160 | |
| Tissue culture dishes | TPP AG | TPP93040 | |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Trypan Blue 0.4% 0.85% NaCl |
Lonza | 17-942E | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | |
| Waterjet: ERBEJET2 device | Erbe Elektromedizin GmbH | ||
| Williams Cystoscopic Injection Needle | Cook Medical | G14220 | 23G, 5.0 Fr, 35 cm |
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