Summary
I detta protokoll beskriver vi hur man injicerar musens fosterhålighet vid E7.5 med lentivirus, vilket leder till enhetlig transduktion av hela neuralplattan, med minimala skadliga effekter på överlevnad eller embryonal utveckling.
Abstract
Att manipulera genuttryck i den utvecklande mushjärnan i livmodern har stor potential för funktionella genetikstudier. Det har dock tidigare i stor utsträckning varit begränsat till manipulering av embryonala stadier efter neurulering. Ett protokoll utvecklades för att injicera fosterhålan vid embryonal dag (E) 7.5 och leverera lentivirus, kodande cDNA eller shRNA, riktat mot >95% av neuralplattan och neurala vapenceller, vilket bidrar till den framtida hjärnan, ryggmärgen och perifera nervsystemet. Detta protokoll beskriver de steg som är nödvändiga för att uppnå framgångsrik transduktion, inklusive slipning av glaskapillärnålarna, graviditetsverifiering, utvecklingsuppsättning med ultraljudsavbildning och optimala injektionsvolymer matchade med embryonala stadier.
Efter detta protokoll är det möjligt att uppnå transduktion av >95% av den utvecklande hjärnan med högtiter lentivirus och därmed utföra genetisk manipulation av hela hjärnan. Däremot är det möjligt att uppnå mosaiktransduktion med hjälp av lägre virala titrar, vilket möjliggör genetisk screening eller härstamningsspårning. Injektion vid E7.5 riktar sig också mot ektoderm och neural crest som bidrar till distinkta fack i ögat, tungan och perifera nervsystemet. Denna teknik erbjuder således möjligheten att manipulera genuttryck i musneurala platt- och ektoderm-härledda vävnader från prenöruleringsstadier, med fördelen att minska antalet möss som används i experiment.
Introduction
Hjärnan och ryggmärgen är bland de första organen som initierar bildning under embryogenesen 1,2. Även om generna som är associerade med neurodevelopmental störningar identifieras, har den funktionella förhöret av genetiska varianter släpat efter 3,4. Eftersom genereringen av villkorliga knockoutmöss kan ta månader eller år är en alternativ teknik för att snabbt undersöka genfunktionen i den utvecklande hjärnan av intresse. I musembryon sker neurulering - den morfogenetiska processen genom vilken neuralplattan omvandlas till neuralröret för att ge upphov till centrala nervsystemet (CNS) - mellan dag 8 och 10 efter befruktningen5. Före neuruleringens början består neuralplattan, som en del av ektodermen, av ett enda lager av kolumnarceller som kommer att sprida sig och differentieras till de många neuronala och glialcelltyperna inom CNS 6,7. Därför, för att experimentellt inducera långvariga förändringar av genuttryck i CNS, erbjuder inriktning på neuralplattan uppenbara fördelar, inklusive tillgängligheten för alla stamceller.
Inom neurovetenskapen har i ovoelektroporation 8,9 och viral transduktion av musembryon använts för att manipulera embryonala CNS-genuttryck. Det utvecklande kycklingembryot har varit en modell för att studera genfunktion under ryggmärgsutveckling på grund av tillgängligheten av kycklingembryot i ägget och den resulterande lättheten att manipulera genuttryck. I synnerhet genererar elektroporering i ovo plasmider experimentella och kontrollförhållanden i varje ryggmärgsrygg. Elektroporering orsakar cellmembranpermeabilisering och leder negativt laddat DNA bort från den (negativa) katoden mot den (positiva) anoden genom att applicera en elektrisk puls via två elektroder på embryot. Hos möss har elektroporering i livmodern i allmänhet begränsats till embryonala stadier där neurulering har slutförts, och hjärnan eller ryggmärgen består redan av flera cellskikt, vilket resulterar i låg elektroporationseffektivitet10. Plasmidelektroporation resulterar i övergående genuttryck och riktar sig i allmänhet till få celler.
Ultraljudsstyrd i utero mikroinjektion har använts för att manipulera olika embryonala strukturer såsom hud och hjärna11,12,13,14. Injektioner riktade mot det framväxande murina CNS har dock visat låg effekt eller har negativt påverkat embryonal överlevnad12,13,14. Därför utvecklades ett förbättrat protokoll för leverans av högtiter lentivirus in i fosterhålan (AC) vid E7.5, som kallades NEPTUNUS för neural plate targeting med in uteronano-injection15. Injektioner resulterade i en långvarig måleffekt på >95% av hela hjärnan vid E13.5. Dessutom infördes ett iscensättningssteg under ultraljudsverifiering av graviditet för att sortera kvinnor och graviditeter efter utvecklingsstadium för att minimera onödiga procedurer på försöksdjur och maximera injektionsframgången. Injektionseffektivitet och överlevnad är tätt kopplade till ökningen av AC-storleken. Därför beskriver detta dokument hur man mäter AC-storlek före injektion för att leverera en lämplig volym till AC som inte kommer att orsaka resorption av embryot. NEPTUNUS är ett robust alternativ till nuvarande in utero-metoder och kan anpassas för flera användningsområden, inklusive, men inte begränsat till, vinst och förlust av funktionsstudier, härstamningsspårning eller screening15,16.
Protocol
CD1-möss av vildtyp inhystes enligt europeiska bestämmelser, med en vanlig dag- och nattcykel med mat och vatten ad libitum. CD1-honor parades med CD1-hanar över natten och vaginala pluggar kontrollerades på morgonen (E0.3). Endast gravida kvinnor användes för injektionen. Etiskt godkännande för alla försök som beskrivs här beviljades av Jordbruksverket.
1. Beredning av glasnålar: nåldragning och slipning
OBS: Även om förgrundsnålar kan köpas, möjliggör dragnålar internt enkla justeringar av nållängd, borrning och avfasningsvinkel.
- Montera en glaskapillär i mikropipetten/kapillärdragaren. Använd följande inställningar med den angivna utrustningen (se materialförteckningen): värm 580 enheter; hastighet 140 enheter; tid 200 enheter; tryck 500-800 enheter.
OBS: Enheterna för olika parametrar definieras av kapillärdragaren. Enheter kan variera för olika utrustningar. - Tryck på Dra för att dra isär kapillären och producera två glaskapillärer med avsmalnande ändar.
OBS: Efter dragning smälts spetsarna på de två glaskapillärerna på grund av mikropipettdragarens höga temperatur. - Skär spetsen med kirurgisk sax för att få en nållängd på ~ 7 mm (mätt från vilken nålen börjar avsmalna) (figur 1A).
OBS: För E7.5-injektioner är en lång och fin nål avgörande eftersom injektionsområdet är mycket litet och känsligt. Korta och vidsträckta nålar kommer att leda till embryonala dödsfall. - Slipa den skurna nålspetsen för att skapa en skarp avfasning (figur 1C-F).
- Slipa nålen i en vinkel på 20° vid maximal hastighet i minst 30-45 min.
OBS: Ultrarent vatten tillsätts till slipplattan för att fungera som smörjmedel, minska friktion / temperatur och tvätta bort glaspartiklar (figur 1B). Överskott av vätska kan dock sakta ner kvarnen. - Se till att nålspetsen (figur 1C) vidrör slipplattans yta (figur 1D) men inte böjer sig (figur 1E).
OBS: Böjd slipning resulterar i en lång och ömtålig nålspets med fel avfasningsvinkel, som lätt kan gå sönder under injektionen. Brytande nålar kan skada embryot och måste ersättas med en intakt nål. En korrekt jordspets visas i figur 1F,G. Efter slipning förväntas den resulterande nålborrningen ha en innerdiameter (ID) på ~ 15 μm och en ytterdiameter (OD) på ~ 35 μm (figur 1G).
- Slipa nålen i en vinkel på 20° vid maximal hastighet i minst 30-45 min.
- Fyll en 1 ml spruta med mineralolja och fäst en 27 G nål.
- Ta bort nålskyddet och sätt in sprutnålen i den nymalda glaskapillären. Injicera mineralolja tills olja droppar från kapillärspetsen. Fortsätt injicera medan du drar tillbaka 27 G-nålen tills kapillärnålen är fylld med mineralolja, varefter sprutnålen kan tas bort.
- Förvara malda och mineraloljefyllda nålar i en sluten miljö för att förhindra skador och dammansamling. För förvaring, sätt in två rullar modelleringslera i en vanlig petriskål för att fungera som hållare (figur 1H). Sätt försiktigt nålarna på leran och placera dem långt ifrån varandra för enkel hämtning av nålarna.
OBS: Eftersom nålberedning är tidskrävande är det bäst att förbereda nålar minst en dag före injektioner. Kassera nålarna efter högst två kullar eftersom de blir trubbiga. Förbered alltid reservnålar vid nålskador under beredning eller injektion.
Figur 1: Nålförberedelse för E7.5 fosterhålighetsinjektioner. (A) Representativa exempel på en dragen men oskuren glaskapillärnål (vänster), en kapillärnål skuren i optimal längd för E7.5-injektioner (mitten) och en kapillärskuren för kort (höger). (B) Kvarnen med enhetlig täckning av vatten, som är klar för nålslipning. (C-F) Representativa exempel på olika nålspetsar. (C) Skuren men ojordad nålspets monterad i kvarn; (D) idealiskt slipläge med nålspetsen som bara vidrör kvarnen; E) nålen sänks för långt och böjs under malningsprocessen, (F) en idealisk slipad nålspets för E7.5 AC-injektioner. (G) En slipad nålspets som visar borrningen med en innerdiameter på ~ 15 μm och en ytterdiameter på ~ 35 μm, vilket är lämpligt för E7.5 AC-injektion. Nålborrningen visas som streckade linjer. Ytterdiameter betecknad med röda pilspetsar; innerdiameter betecknad med blå pilspetsar. (H) Nålförvaring: Petriskål fylld med dragna och slipade nålar. Två rader modelleringslera fungerar som hållare. OBS: För den okulära mikrometern i C, F, G, 1 cm är uppdelad i 100 platser; målet är 3x; Därför 1 tonhöjd= 10 000 μm/(100 × 3) ≈ 33,4 μm. Förkortningar: AC = fosterhålan; ID = inre diameter; OD = ytterdiameter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
2. Dag före injektion: förbered bänk för ultraljudsverifiering av graviditet
OBS: Allt arbete ska utföras i en ventilerad biosäkerhetsnivå 2 (BSL 2) bänk vid arbete med lentivirus. Ultraljudsverifiering av graviditet kan utföras på en ventilerad bänk.
- Slå på ultraljudsmaskinen, värmebordet och O2-tillförseln för isofluranpumpen (kan variera mellan utrustning).
OBS: Kontrollera isofluransystemet för att säkerställa att inget isofluranläckage i luften. - Placera en tom avfallspåse (tejpad på innerväggen för enkel åtkomst), hårborttagningskräm, sterila packade bomullspinne, vatten, silkespapper och kirurgisk tejp inuti BSL 2-bänken.
- Förbered fyra bitar kirurgisk tejp (~ 7 cm lång) för att säkra musbenen under ultraljudskontrollen av graviditeten.
3. Ultraljudskontroll för att bekräfta graviditeten
OBS: Detta steg kan utföras dagen före E7.5 Injektioner, vid E6.5. Se diskussionen för detaljer om kontrollen av graviditetsålder.
- Placera den tidsparade honmusen i induktionskammaren.
- Slå på gasflödet med ett syreflöde på ~ 2,1 LPM och en initial dos på 3-4% isofluran för att inducera anestesi.
- Kontrollera att honan är helt bedövad genom att kontrollera tassreflexen. Om tassreflexen är frånvarande, sänk isofluran till 1,5-2%.
OBS: Det tar cirka 3 minuter att inducera anestesi. - Byt gasflödet från induktionskammaren till värmebordets näskon.
- Placera den bedövade kvinnan i ryggläge (buken uppåt) på värmebordet och placera nosen i den bifogade näskonen för att säkerställa underhåll av anestesi under ultraljudskontrollen av graviditeten.
- Fäst alla fyra tassarna på bordet med de förberedda bitarna av kirurgisk tejp utan att sträcka kvinnans kropp eller fånga whiskersna.
- Applicera en ärtstor mängd hårborttagningskräm på underlivet. Använd en bomullspinne och fördela krämen över underlivet (en kvadrat på ~ 3 x 3 cm) och massera försiktigt in den genom att rulla bomullspinnen fram och tillbaka.
- När pälsen börjar lossna från huden, fukta ett silkespapper och ta bort grädden och pälsen. Rengör det avpälsade området med fuktigt silkespapper tills all kräm och hår är borta. Torka huden.
- Applicera en plommonstorlek av ultraljudsgel på det rakade området och fortsätt att identifiera livmodern med ultraljud med någon av följande tre metoder.
- För att göra detta manuellt, håll ultraljudssonden i ultraljudsgelén och flytta sonden för att hitta livmodern.
- För halvmanuell inflygning #1, placera ultraljudssonden (fäst vid räckessystemet) ovanför honbuken genom att lossa och flytta en del av skenan längs x-planet. Sänk ultraljudssonden i gelén (z-planet) och skanna genom underlivet (y-planet) (figur 2A).
- För halvmanuell tillvägagångssätt #2, sänk ultraljudssonden (fäst vid räckessystemet) i gelén för att avbilda underlivet. Håll ultraljudssonden stillastående under processen och flytta värmebordet med de bifogade hjulen längs x- och / eller y-plan (figur 2B).
OBS: I dessa tidiga embryonala stadier kan inre organ, t.ex. tarmen, se ut som livmodern vid ultraljudsavbildning. Men medan embryon och decidua framträder som en sekvens av sfärer (liknande pärlor längs ett halsband), har tarmen utseendet av ett kontinuerligt rör. Anslutningen av luminala utrymmen (separata sfärer kontra ett kontinuerligt rör) kan bedömas genom att skanna fram och tillbaka genom strukturen av intresse för att avgöra om strukturen är en diskret sfär (embryo / decidua) (figur 2C) eller ett kontinuerligt rör (tarm) (figur 2D). I detta skede är det inte nödvändigt att registrera antalet embryon; det är tillräckligt att bekräfta deras närvaro eller frånvaro.
- När graviditetsstatusen är bestämd, lyft ultraljudssonden bort från buken och torka av underlivet med fuktigt silkespapper för att ta bort ultraljudsgelén.
- Stäng av isofluranpumpen och ta bort operationstejpen för att släppa tassarna.
- Placera honan i utsatt position (magen nedåt) i en ren bur på en 40 °C värmeplatta. Håll kvinnan under noggrann observation tills hon återfår medvetandet, vilket tar 2-6 min.
OBS: Se till att ultraljudskontrollen för en kvinna är <10 min för att minimera exponeringen för isofluran. - Ta bort allt material och avfall och rengör alla ytor med 70% etanol. Torka av eventuell kvarvarande ultraljudsgel från ultraljudssonden med en torr, mjuk och luddfri pappersvävnad. Stäng av ultraljudsmaskinen, ventilerad bänk / BSL2-bänk, värmebord och O2-tillförsel .
4. Ultraljudskontroll för embryo iscensättning
OBS: Detta steg utförs före operationen och tjänar till att stratifiera de gravida kvinnorna enligt deras AC-storlekar. Detta steg är avgörande vid E7.5 när målet är att rikta in sig på det utvecklande CNS. Vid detta tidiga utvecklingsstadium påverkar en skillnad på några timmar i utveckling signifikant storleken på AC och utvecklingen av neurulering.
- Bedöva den första gravida kvinnliga musen som följer stegen i steg 3.1-3.5.
- Placera och fixera honan på bordet enligt beskrivningen i steg 3.6.
- Applicera en plommonstorlek av ultraljudsgel på den rakade buken och sänk ultraljudssonden för att avbilda kvinnans underliv.
OBS: Detta steg förutsätter att honan inspekterades med ultraljud föregående dag för graviditet och redan har tagit bort päls på buken. Om så inte är fallet måste pälsen avlägsnas före tillsats av ultraljudsgel enligt steg 3.7-3.8. Vid E7.5 är livmodern och deciduas större och lättare att skilja från inre organ. Dessutom är AC större och kan särskiljas från det exocelomiska hålrummet (ExC). - Skanna genom vänster och höger livmoderhorn så fullständigt som möjligt.
OBS: Vissa embryon ligger djupare inuti kvinnans kropp och kan missas. - Spela in embryonas antal och stadier. Notera antalet fosterhålor i idealstorlek, acceptabla håligheter och deciduas utan hålighet (figur 2E-G).
- Iscensätt alla graviditeter och rangordna dem därefter.
- Injicera kvinnor med en majoritet av AC i idealstorlek omedelbart efter ultraljudskontrollen (steg 4.4) enligt instruktionerna i steg 4.5-4.7.
- För kvinnor med en majoritet av acceptabla (där de exocelomiska och fosterhålorna ännu inte är tydligt uppdelade i två hålrum) eller frånvarande håligheter, skjut upp injektionen och iscensätt dem igen efter ett par timmar. Om de flesta håligheterna fortfarande är för små, skjut upp injektionerna med 10-12 timmar.
Figur 2: Inspektion och iscensättning av fosterhålor under ultraljudskontroll. (A) Översikt över järnvägssystemet med bifogad ultraljudssond, nanoinjektor och värmebord. Ultraljudssonden kan flyttas i x-, y- och z-plan för att uppnå optimal anpassning till honans buk eller AC. (B) Värmebordet kan flyttas via två hjul i x- och / eller y-plan för att möjliggöra exakt skanning och bedömning av AC: erna, medan ultraljudssonden kan förbli statisk. (C) Representativa ultraljudsbilder av E6.5-deciduas inuti honans buk under ultraljudskontroll för att bekräfta graviditet (vita prickade konturer). Inga håligheter har bildats vid denna tidpunkt; Ibland är emellertid ektoplacentalkonen (vita asterisker) synlig. Deciduas kan kännas igen av sin sfäriska form och särskiljas från tarmen, som framträder som ett kontinuerligt rör. (D) Representativ bildsekvens av tunntarmen (vitnade prickade konturer), som är kontinuerlig vid skanning genom underlivet. (E-G) Representativa ultraljudsbilder under hålrumsuppsättning före E7.5-injektioner. De foster- och exocelomiska håligheterna har bildats och separeras av amnionen. Ectoplacentalkonen fungerar som huvudblodtillförsel och framträder som en ljuspunkt i ultraljudet. AC är mest distal från ectoplacental kon. (E) Idealstora AC verkar större än det exocelomiska hålrummet, medan medelstora håligheter verkar mindre (F). Om inga håligheter är synliga (G) betyder det antingen att embryot är resorberat eller inte har nått E7.5 ännu. Skalstänger = 1 mm. Förkortningar: A = Amnion; AC = fosterhålan; ExC = exocelomisk hålighet; EC = Ectoplacental kon. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
5. Injektionsdag: förbered BSL2-bänken för operation
- Limma ett stycke elastiskt membran på den runda, centrala öppningen av en kommersiellt tillgänglig, modifierad petriskål. Se till att membranet är väl fastsatt på petriskålen för att förhindra läckage.
OBS: Om skålen blir läckande eller inte är vällimmad kan kanterna på det elastiska membranet säkras ytterligare med silvertejp. - Gör ett 1-1,5 cm långt snitt i mitten av det elastiska membranet.
- Slå på ultraljudsmaskinen, BSL2-bänken, värmeplattan,O2-tillförseln för isofluranpumpen och glaspärlsterilisatorn (inställd på 300 °C).
- Inuti BSL2-bänken, placera en tom avfallspåse (tejpad på innerväggen för enkel åtkomst); sterila förpackade bomullspinnar (använd en ny för varje operation / varje kvinna); kirurgiska verktyg (sax, pincett, klämmor, sutur) och kirurgisk tejp; en hel flaska rumstemperatur fosfatbuffrad saltlösning (PBS), en tom flaska för insamling av avfall och en 25 ml pipett; en petriskål med elastiskt membran för operation; locket på petriskålen med en 2 x 2-3 x 3 cm bit parafilm fäst vid locket med en droppe vatten; modelleringslera: 4 större bollar eller kuber (~ 3 x 3 x 3 cm3) och en cylindrisk bit (~ 4 x 1 cm); en spruta med smärtstillande medel (t.ex. buprenorfin, 0,05-0,1 mg/kg kroppsvikt) och ögongelOBS: Bollarna (eller kuberna) av modelleringslera kommer att fungera som "fötter" eller stativ/hållare för petriskålen när skålen har placerats ovanpå kvinnans buk. Den cylindriska biten av lera säkrar embryona inuti skålen. Om mer än en lösning injiceras, eller om nålen behöver fyllas på under injektionerna, kan samma bit parafilm användas om lösningarna kan placeras isär.
6. Nålladdning
- Torka bort överflödig mineralolja med silkespapper för ett bättre grepp.
OBS: Rengör alltid från spetsen för att förhindra skador eller personskador. - Se till att alla komponenter (en tätande O-ring, en distans och en främre packning - alla inrymda under hylsan, figur 3A) är installerade i rätt riktning (figur 3B, hylsa borttagen för visualisering) för att hålla kapillärnålen på plats och skapa en lufttät anslutning, så att bubbelbildning undviks när du går fram eller drar tillbaka metallkolven inuti nålen.
- Se till att nanoinjektorns metallkolv är helt indragen. Kontrollera genom att trycka på Fyll och vänta på ett dubbelt pip som indikerar att kolven är helt indragen.
- Med hylsan fäst men något lossad (skruvad 45-90 grader), skjut glasnålen på metallkolven och tryck kapillärnålen tillsammans med metallkolven genom den främre packningen tills den når distansen (figur 3C, D, hylsa borttagen för visualisering).
OBS: Visst motstånd visas när kolven passerar genom packningen och minskar när den når distansen. Se till att kapillärnålen är ordentligt insatt i distansen för att skapa en lufttät anslutning (figur 3D). - Säkra nålen genom att dra åt hylsan på nanoinjektorn (skruva fast ordentligt).
OBS: Dra inte åt för hårt eftersom det kan krossa nålen. - Tryck på Tom för att trycka in kolven i nålen och släpp ut oljan från nålspetsen. Om glasnålen rör sig, dra tillbaka kolven, ta bort nålen och ladda om. Om detta får luftbubblor att bildas, ta bort nålen och fyll på med mineralolja.
OBS: En ordentligt säkrad nål ska inte röra sig med kolven. - Placera en droppe av viruset (~ 6 μl) eller annan injektionslösning på en bit parafilm1 (figur 3E; Evans blå färgämne används för visualiseringsändamål).
OBS: Den maximala volymen av nanoinjektorn är ~ 5 μL. - Tryck på Fyll för att skapa en luftbubbla som ska fungera som en avdelare mellan oljan och lösningen (figur 3F).
OBS: Detta fungerar också som en positioneringsmarkör när du fyller eller tömmer nålen. - Sänk nålen, sänk ned spetsen i lösningen och tryck på Fyll (bild 3F,G).
- Titta på vätskenivån när lösningen laddas efter luftbubblan. Tryck på Töm för att driva ut täppan och ladda om genom att trycka på Fyll om luftbubblan blir långsträckt utan att vätskan kommer in i nålen. Om detta inte löser problemet, byt nålen.
- När nålen är fullastad (figur 3H), lyft nålen i z-planet och aspirera en liten volym luft vid spetsen för att förhindra avdunstning av lösningen vid nålspetsen och igensättning av nålen.
- Vrid nanoinjektorn med den fästa nålen bort från operatören, mot baksidan av bänken, för att förhindra oavsiktlig skada eller personskada.
Figur 3: Fäst nålen på nanoinjektorn och lösningsbelastningen. A) Startläge innan nålen monteras på nanoinjektorn: metallkolven är helt indragen och spännhylsan fäst. (B) Under hylsan visas alla tre komponenterna för att hålla och säkra nålen i rätt ordning (från vänster till höger): tätning av O-ring (tunn och svart), distans (vit), O-ring (svart) med stort hål (som nålen måste passera genom). För att säkerställa en lufttät anslutning skjuts glasnålen över metallkolven (C) och skjuts genom öppningen på den främre O-ringen tills den når distansen (D). (E-H) Laddning av lösningen i nålen. (E) En droppe lösning placeras på en bit parafilm på ett plattlock. (F) Skapa en luftbubbla genom att trycka på Fyll innan du laddar lösningen och sänk ned nålspetsen i lösningen. (G) Lösningen laddas i nålen. (H) Lösningen laddas i nålen. OBS: Hylsan har tagits bort i (B-D) för visualisering men bör förbli fäst under experiment. Det sista steget att säkra nålen är att dra åt hylsan. Evans blå färgämne används för visualisering i E-H. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
7. Injektioner
OBS: Alla instrument som används i denna procedur steriliseras före operationen och mellan varje mus.
- Bedöva den första honan med håligheter i idealstorlek (se avsnitt 4).
- Placera och fixera honan på bordet, enligt beskrivningen i steg 3.1-3.6.
- Applicera ögongel på ögonen för att förhindra uttorkning av hornhinnan och injicera smärtstillande medel subkutant.
OBS: Rekommenderade smärtstillande medel: Buprenorfin (0,05-0,1 mg/kg kroppsvikt) eller Flunixin (2,5 mg/kg) eller liknande i enlighet med lokala djurskyddsbestämmelser. Multimodal perioperativ analgesi upprätthålls med injicerade analgetika och isofluran. - Förbered underlivet aseptiskt genom att torka av med en trasa indränkt med 0,5 mg/ ml klorhexidinlösning (eller liknande) och torka huden. Använd kirurgisk sax för att göra ett 1,5-2,0 cm vertikalt mittlinjesnitt i underlivet.
OBS: Förbered operationsområdet enligt lokalt godkända desinfektionsrutiner. - Lyft huden försiktigt och frigör huden från det underliggande muskelskiktet, cirka 1 cm runt snittpunkten, för att underlätta suturering efter operationen.
- Gör ett 1 cm vertikalt mittlinjesnitt i muskelskiktet.
- Med ett par pincett, lyft ena sidan av huden och muskelskiktet och med det andra paret, leta efter livmoderhornen.
OBS: Deciduas är ordnade som pärlor på ett halsband, medan tarmen är ett långt, kontinuerligt rör (figur 4A). - Med pincett, dra försiktigt ut båda livmoderhornen från buken. Håll vävnaden mellan embryon; Pressa dem inte direkt (figur 4B).
OBS: Livmodern är fäst vid kroppen vid livmoderhalsen, och de två äggstockarna/äggledarna fästs via ligament. Dra inte i/lossa livmodern från dessa ankarpunkter. - Räkna och notera antalet embryon på vänster och höger sida.
- Numrera embryona antingen från äggstocken till livmoderhalsen eller från livmoderhalsen till äggstocken.
OBS: Detta är särskilt viktigt om injicerade embryon kommer att samlas in i embryonala stadier. - Tryck försiktigt tillbaka alla embryon i bukhålan med en fuktig bomullspinne, utom de tre första som ska injiceras.
- Placera en droppe PBS på elastiken i petriskålen och håll den omedelbart ovanför embryona.
- Sätt in slutna pincett i resårens snitt och släpp tången för att öppna det elastiska snittet så att vätskan faller på embryona.
OBS: Detta säkerställer rehydrering av embryona och att det elastiska membranet fäster vid kvinnans våta hud, vilket förhindrar läckage av PBS i nästa steg. - Dra en del av livmodern, som motsvarar tre embryon, genom elastiken med pincett och sätt försiktigt petriskålen på kvinnans buk.
- Med pincetten och en fuktig bomullspinne, justera livmoderns positionering och elastiken för att säkerställa att elastiken är förseglad mot kvinnans hud för att förhindra PBS-läckage.
- Använd de fyra lerfötterna för att säkra och fästa petriskålen omedelbart ovanför buken, vilket minskar trycket på honan och känsligheten för avbildning för andning och hjärtslag hos honan.
- Tryck ner modelleringslercylindern till höger om embryona/livmodern för att fixera livmodern (figur 4C).
OBS: Denna orienteringsinstruktion förutsätter att nålen är till vänster om honan och att embryona i kvinnans vänstra livmoderhorn exponeras. Sidan av livmodern (vänster eller höger livmoderhorn) är avgörande eftersom AC antingen vetter mot nålen (vänster horn; Figur 4D) eller vetter mot den stabiliserande lercylindern (höger horn; Figur 4E). - För att injicera embryon från det högra livmoderhornet, placera lercylindern på vänster sida av embryona (figur 4F) och vrid värmebordet 180 ° (figur 4G) för att uppnå rätt orientering. Om nålen kan flyttas istället, anpassa efter behov för relevant installation.
- Tillsätt PBS i petriskålen tills embryon och livmoder är täckta med PBS.
- Sänk ner ultraljudssonden i PBS och justera musen / operationsbordet så att det första embryot är i linje med ultraljudssonden för att underlätta inspelningen av injektionerna.
OBS: "Första" avser numreringen av embryon från äggstocken till livmoderhalsen. - Skanna igenom alla tre embryona och inspektera AC: erna. Bestäm injektionsvolymen enligt följande:
- Mät AC: s diameter med ultraljudsmaskinen. Injicera 69 nL om AC-diametern är ≤0,2 mm; injicera 2 x 69 nL (= 138 nL) om AC-diametern är >0,2 mm och ≤0,29 mm; och injicera 3 x 69 nL (= 207 nL) om växelströmsdiametern > 0,29 mm (figur 4H).
OBS: Tidigare experiment har visat att upp till 207 nL injektionsvolymer tolereras väl vid E7.515. Framgångsrika injektioner med minimal inverkan på överlevnaden uppnås när den relativa volymökningen av AC inte överstiger 90%15. Variation i AC-storlek mellan kullkamrater eller musstammar är vanligt och kan kräva ytterligare optimering.
- Mät AC: s diameter med ultraljudsmaskinen. Injicera 69 nL om AC-diametern är ≤0,2 mm; injicera 2 x 69 nL (= 138 nL) om AC-diametern är >0,2 mm och ≤0,29 mm; och injicera 3 x 69 nL (= 207 nL) om växelströmsdiametern > 0,29 mm (figur 4H).
- Ställ in injektionsvolymerna med injektionsregulatorn.
- Ställ in injektionshastigheten på att sakta ner med en injektionshastighet på 23 nL/s.
OBS: Olika utrustningsmodeller kan resultera i olika injektionskrafter. - Sänk nålen i PBS med hjälp av huvudhjulen på skensystemet (x- och z-plan, figur 4I) och tryck på Töm på nanoinjektorregulatorn tills vätskan når nålspetsen.
OBS: Om nålen har täppts till kan du trycka på Tom för att lösa upp täppan och / eller ta ut täppan. - Lyft ut nålen ur PBS och tryck på Inject. Kontrollera att en droppe av den ungefärliga önskade volymen är urladdad.
- Sänk nålen i PBS och rikta in den med ultraljudssonden och embryot genom att flytta nanoinjektorn med y-planethjulet på mikromanipulatorn (figur 4J).
OBS: Nålspetsen är perfekt inriktad när den visas som en ljuspunkt på ultraljudsbilden (figur 4K, L). Nålen kan flyttas i alla tre riktningsplanen med mikromanipulatorn. - Justera nålvinkeln med insprutningsvinkelhjulet för att säkerställa en nästan vinkelrät injektionsvinkel i förhållande till livmoderväggen. För in nålen i AC i en rörelse med hjälp av injektionshjulet på mikromanipulatorn (figur 4J-M). Håll ett öga på nålspetsens ljusstyrka. Om nålspetsen försvinner från ultraljudsbilden, flytta ultraljudssonden framåt eller bakåt för att få nålen tillbaka i fokus.
OBS: När nålen är inne i AC kan mindre ändringar av nålens position och fokus göras utan att skada embryot (justeringar inom ~ 0,3 mm). Justera inte nålens position mer än så här. - Tryck på Inject (för 207 nL, ställ in volymen på 69 nL och injicera tre gånger). Efter injektion, vänta ytterligare 5-10 s innan du drar tillbaka nålen i en mild rörelse.
Figur 4: Optimal storlek och orientering av fosterhålan för framgångsrika injektioner. (A) Livmoderhorn med flera E7,5 deciduas, formade som en sträng av sfärer (botten) jämfört med tjocktarmen (överst). (B) Ta tag i livmodervävnad (vita prickade linjer) mellan deciduas. Undvik att klämma på deciduas (vita pilspetsar) direkt med pincett eftersom deciduas och utvecklande embryon är bräckliga i detta tidiga skede och benägna att resorption vid överdriven yttre kraft. (C) Hona i liggande position med deciduas exponerade i en petriskål fylld med PBS och monterad på fyra fot modelleringslera. Deceduas stabiliseras av ytterligare en bit modelleringslera, formad som en cylinder. (D, E) Orienteringen av AC påverkas av sidan av livmoderhornet som exponeras. Om deciduas från vänster livmoderhorn används, kommer AC att vända bort från lerstabilisatorn och kommer att vara lättillgänglig för nålen till vänster (D). Men om rätt livmoderhorn används kommer ectoplacentalkonen istället att vända mot nålen, vilket gör det svårare att komma åt AC (E). Därför, när du injicerar i rätt livmoderhorn, placeras lerstabilisatorn mot den nålvända sidan (F) och hela värmebordet roteras 180 ° (G). (H) Rekommenderade injektionsvolymer enligt AC-storlekar. I allmänhet kan hålrum med en diameter ≤ 0,2 mm injiceras med högst 69 nL. Diametrar > 0,2 mm och ≤ 0,29 mm tolererar volymer upp till 2 x 69 nL (138 nL) och håligheter > 0,29 mm kan injiceras med 3 x 69 nL (207 nL). Skalstänger = 1 mm. (I, J) Nanoinjektor är fäst vid skensystemet och kan flyttas i x- och/eller z-plan. Nålens vinkel kan justeras med insprutningsvinkelhjulet . (K, L) Nålspetsen (vit pilspets) är i linje med AC när den ser ljusast ut i ultraljudet (L). (M) Ultraljudsbild som visar injektionsprocessen, där nålspetsen är i AC och väl inriktad (vit pilspets). Förkortningar: A = Amnion; AC = fosterhålan; ExC = exocelomisk hålighet; EC = Ectoplacental kon. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Flytta scenen till nästa embryo och upprepa steg 7.22-7.26 för de andra två embryona om de har lämpliga AC-storlekar.
- Lyft ultraljudssonden och nålen ur PBS med hjälp av mikromanipulatorn. Vrid nålen bort från operatören för att undvika skador och personskador.
- Med pincett, rikta 1: a och 2:a embryon tillbaka i kvinnans buk genom att försiktigt trycka dem genom elastiken. Ta försiktigt tag i vävnaden intill det 3: e embryot och dra livmodern mot den övre änden av det elastiska snittet. Dra försiktigt upp de 4: e-6: e embryona med pincett och låt det 3:e embryot komma in i buken igen.
OBS: Detta steg kan göras utan att ändra PBS eller ta bort petriskålen. - Upprepa vid behov tills alla embryon med optimala AC har injicerats eller tidsgränsen har uppnåtts.
- Tryck försiktigt tillbaka embryona/livmodern i buken på honan.
- Aspirera PBS och ta bort petriskålen. Om ett virus har använts, hantera som smittsamt avfall.
- Sy ihop det muskulösa skiktet med Vicryl (USP 6-0, nållängd 13 mm, 3/8 cirkel) i enkla kontinuerliga eller avbrutna suturer och stäng huden med 1-2 klämmor (se materialtabellen).
- Stäng av isofluranpumpen.
- Ta bort operationstejpen och placera honan i utsatt läge (magen nedåt) i en ren bur på en 40 °C värmeplatta.
OBS: Honan förväntas återfå medvetandet och vara rörlig inom 10 minuter. Se till att proceduren är klar inom 30 minuter. Den genetiska bakgrunden, åldern och vikten hos honan kan påverka känsligheten för anestesi. Övervaka mössen under operationen för tecken på långsam andning (långsam andning betyder att anestesi är för djup) eller rörelse (anestesi är för lätt). Buprenorfin (0,05-0,1 mg/kg kroppsvikt) eller Flunixin (2,5 mg/kg) eller liknande i enlighet med lokala djurskyddsbestämmelser, kan tillhandahållas 8 timmar efter den första injektionen vid behov. - Om en annan kvinna ska injiceras, förbered det kirurgiska området medan du övervakar uppvaknandet av den första.
- Torka av de kirurgiska verktygen med 70% etanol för att ta bort kvarvarande blod eller vävnad och sterilisera dem i den förvärmda glaspärlsterilisatorn i 10 s. Kassera bomullspinnarna och använt silkespapper. Torka av petriskålen och lerbitarna torra med silkespapper.
- Upprepa steg 7.1-7.35 tills alla honor har injicerats.
- Töm och kassera nålen.
- Om det finns ett virus eller en injektionslösning kvar i nålen, tryck på Töm på nanoinjektorn och töm nålens innehåll på silkespapper.
- Dra tillbaka metallkolven helt genom att trycka på Fyll tills det kommer ett dubbelt pip från regulatorn, vilket indikerar att kolven är helt indragen.
- Lossa hylsan och skjut nålen av metallkolven. Kasta nålen i avfallsbehållaren för vassa föremål.
- Rengör BSL-2-bänken.
- Om ett virus användes, spraya hela operationsfältet med desinfektionsmedel (se materialtabellen). Torka av desinfektionsmedlet efter 15 minuter och rengör hela operationsfältet med 70% etanol. Om inget virus användes, rengör alla ytor med 70% etanol.
- Torka av eventuell återstående PBS från ultraljudssonden med torrt, mjukt och luddfritt silkespapper.
- Kassera avfall enligt riktlinjerna för biosäkerhet.
- Stäng av ultraljudsmaskinen, värmebordet, BSL2-bänken ochO2-tillförseln .
Representative Results
Embryon injicerade vid E7.5 med hPGK-H2B-GFP lentivirus11,12 samlades in vid E13.5 och undersöktes under det fluorescerande dissektionsmikroskopet (figur 5A). Framgångsrik transduktion av nervplattan resulterar i embryon med starkt uttryck av en fluorescerande reporter i hjärnan huvudsakligen och i andra ektoderm-härledda vävnader, t.ex. huden (figur 5A,B). Injektion av en alltför hög volym (större än de volymer som rekommenderas här, t.ex. ≥500 nL) ökar trycket i AC och kan resultera i antingen fullständig resorption (data visas inte) eller neuralrörsdefekter som exencefali (figur 5A). Framgångsrika injektioner vid E7.5 resulterar i enhetlig transduktion från framhjärnan till bakhjärnan (figur 5C-J).
Lentivirala titrar runt 2 × 10 10 infektiösa enheter (IFU) uppnår över 95% inriktning, medan titrar på ~ 1 ×10 9 IFU uppnår 15% måleffektivitet15. Dessutom riktas också strukturer som tidigare har varit svåra att rikta in sig på med hjälp av elektroporation, såsom choroid plexus17,18, (figur 5 E,F). Transduktionseffekten kan modifieras genom att justera virustitern som levereras till AC. Injektioner av lågtiter resulterar i transduktion av encelliga kloner (figur 5C, figur 5E och figur 5G,H) medan användning av högtitervirus transducerar nästan 100% av hela hjärnan (figur 5D, figur 5F, figur 5H och figur 5J ). Därför kan NEPTUNUS användas för antingen klonal transduktion, spårning av härstamning och genetisk screening eller för att studera de globala effekterna av genöveruttryck eller nedreglering i hela hjärnan.
Däggdjursögonutveckling är resultatet av välorganiserad kommunikation mellan tre derivat av den embryonala ektodermen: neural näthinna (NR) och retinal pigmentepitel (RPE) härrör från neuroepitelet i den ventrala framhjärnan, medan ytektodermen ger upphov till framtida lins och hornhinneepitel. Den centrala stroma och det bakre endotelet, de andra två skikten i hornhinnan, härrör emellertid från neurala vapenceller i det periokulära mesenkymet19,20. Koronala sektioner genom E13.5-embryon, injicerade vid E7.5 med högtiter lentivirus visade, liknande hjärnan, hög och enhetlig transduktion av ögats nervvävnad, liksom linsen, hornhinnan och mesenkymet (figur 5K). När neuruleringen fortskrider resulterar injektioner vid E8.5 och E9.5 i fortsatt inriktning av linsen och hornhinnans epitel (figur 5L och figur 5N), medan transduktion av ögonvävnaderna som härrör från neuroektodermer är mindre effektiv vid E8.5 (figur 5L,M) eller inte riktad mot E9.5 (figur 5N).
Medan de flesta viruspartiklar infekterar de exponerade vävnaderna vid injektion, transducerar vissa partiklar icke-ektodermala härledda vävnader som utvecklas senare (figur 6A). Spottkörtlar och kanaler utvecklas runt E11.5 från det orala epitelet21 och är riktade mot NEPTUNUS (figur 6B). Efter injektioner vid E9.5 är tungans linguala epitel väl transducerat; Det underliggande mesenkymet är dock negativt (figur 6C; parenteser betecknar transducerade celler; asterisker betecknar autofluorescenssignal som inte är transducerade celler). Dessutom finns det positiva kluster inom det linguala epitelet, åtskilda av negativa sektioner (figur 6C, vita pilspetsar), vilket tyder på transduktion av papillytan. Neurala vapenceller har beskrivits i det underliggande tungmesenkymet och inom det linguala epitelet, där de är involverade i utvecklingen av smakpapiller och smaklökar22. Faktum är att injektioner vid E7.5 resulterar i utbredd transduktion av tungans mesenkym vid E13.5 (figur 6D), vilket tyder på att tidiga injektioner riktar sig mot neurala vapenceller, vilket bidrar till mesenkym i tungan.
Hos ryggradsdjur är dorsalrotganglierna (DRG) en central komponent i det perifera nervsystemet (PNS), eftersom all somatosensorisk input från kroppens periferi (temperatur, smärta, tryck) överförs till hjärnan via aktivering av DRG-neuronerna23. Både neuroner och gliaceller i DRG härrör från stammens neurala vapenceller24. Lentiviral injektion, där den allestädes närvarande hPGK-promotorn kontrollerar uttrycket av den fluorescerande reportern, leder till utbredd inriktning av centrala och perifera nervsystemet (figur 7A), vilket transducerar både neuroner och förfäder i ryggmärgen (figur 7B), liksom DRG (figur 7C). Att använda en MiniPromoter för doublecortin25 gör det möjligt att begränsa GFP-uttryck till endast neuroner (15 och figur 7D,E).
Figur 5: Hög effektivitet eller klontransduktion med NEPTUNUS. A) E13.5-embryon under ett dissektionsmikroskop belysta med standardbelysning (vänster panel) och samma embryon som belyses för GFP (höger panel). Oinjicerat embryo längst till vänster, framgångsrikt injicerat embryo längst till höger, vilket ger positiv signal i hjärnan (höger embryo). Exencefaliskt embryo på grund av överskott av injicerad volym (mellanembryo). (B) Hud- och hjärninriktning med E7.5-injektion. Skalstreck = 50 μm. (C, D) E13.5 konfokala bilder av framhjärnan med låg klonal transduktion (C) eller högeffektiv transduktion (D). (C, E, G, I) Klonal transduktion av olika regioner i hjärnan. (D, F, H, J) Högeffektiv transduktion av olika regioner i hjärnan. Skalstänger = 200 μm. Olika transduktionseffektiviteter är representativa för andra områden i CNS. (E, F) Choroid Plexus-inriktning, klonalt (E) eller med hög effektivitet (F). Skalstänger = 200 μm. (G, H) Klonal inriktning (G) och högeffektiv (H) inriktning av bakhjärnan, förstorad i (I, J). Skalstänger = 200 μm. (K) GFP-reporteruttryck i ögat vid E13.5 efter i uteroinjektion vid E7.5 (L, M) GFP-reporteruttryck i ögat vid E15.5 efter i uteroinjektion vid E8.5 (L), boxad region förstorad i (M) eller vid E9.5 (N). Autofluorescerande blodkärl är markerade med vita stjärnor. Skalstänger = 100 μm. Förkortningar: NEPTUNUS = neural plate targeting med in uteronano-injection; C = Hornhinna; LE = Linsepitel; LF = Linsfibrer; M = mesenkym; NR = Neural näthinna; ON = Optisk nerv; RPE = retinal pigmentepitel; GFP = grönt fluorescerande protein; CNS = centrala nervsystemet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: In utero transduktion av icke-neurala vävnader. (A) Konfokal bild av E15.5 munhålan. Embryot injicerades med fluorescerande reporter lentivirus vid E9.5. Skalstreck = 200 μm. (B, C) (B) Förstoring av infälld panel; salivkanalepitel transducerat med virus. C) Förstoring av infälld panel. dorsalt språkligt epitel transducerat med GFP-reportervirus (vit konsol). Det underliggande mesenkymet som härrör från neurala vapenceller är negativt. Vita pilspetsar indikerar papiller med negativa neurala vapenceller omgivna av virustransducerade epitelceller (autofluorescerande blodkroppar / kärl är markerade med vita stjärnor). Skalstänger = 50 μm. (D) Schematisk och konfokal bild av E13.5 tungmesenkym efter injektioner med fluorescerande reportervirus vid E7.5. Skalstreck = 50 μm. Förkortningar: D = Dorsal; M = mesenkym; N = Nasofarynx; SLD = Sublingual kanal; SMD = submandibulär kanal; T = Tunga; V = Ventral; GFP = grönt fluorescerande protein. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Transduktion av neurala crest-härledda dorsalrot ganglionceller. (A) NEPTUN-inriktning vid E7.5 möjliggör inriktning av både CNS och PNS. (B) Konfokal bild av E13.5 ryggmärg och DRG injicerade med hPGK-H2B-GFP reporter lentivirus vid E7.5 visar transduktion av både SOX2 + neurala stamfäder och NeuN + neuroner. Skalstreck = 100 μm. (C) Boxat område av B som visar DRG med GFP-uttryck i SOX2+ (vita pilar) och NeuN+ (vita pilspetsar) cellpopulationer. Skalstreck = 20 μm. (D) Konfokal bild av E13.5 ryggmärg och DRG injicerad med DCX-H2B-GFP lentivirus vid E7.5, endast inriktad på DCX + -celler. Skalstreck = 100 μm. (E) Boxat område av D som visar DRG med GFP-uttryck begränsat till DCX + -neuroner (vita pilspetsar). DCX-celler är negativa för GFP (vita pilar). Skalstreck = 20 μm. Förkortningar: NEPTUNUS = neural plate targeting med in utero nano-injection; CNS = centrala nervsystemet; PNS = perifert nervsystem; DRG = dorsalrotganglier; GFP = grönt fluorescerande protein. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Det finns flera steg i detta protokoll som påverkar embryonal överlevnad, kvaliteten på injektionerna och avläsningen. Embryonas graviditetsålder definieras som E0.5 vid middagstid dagen för vaginalpluggen efter parning över natten. Genom att utföra ultraljudskontrollen för graviditet vid E6.5 sent på eftermiddagen/kvällen säkerställs att embryona utvecklas tillräckligt för att identifieras med ultraljud. Kontrollen (1) möjliggör förscreening av hur många pluggpositiva möss som faktiskt är gravida, (2) säkerställer att inget virus tinas upp i onödan och slösas bort i händelse av att pluggpositiva möss inte är gravida, och (3) minskar onödiga ingrepp på möss (undviker kirurgi på icke-gravida kvinnor).
Vid E7.5 är embryon känsliga för yttre krafter och bör hanteras varsamt. Att dra i livmoderhornen eller klämma på deciduas kan till exempel leda till embryoresorption. Livmodervävnaden ska alltid hållas fuktig när den är utanför honans buk för att förhindra att vävnaden torkar. Majoriteten av deciduas bör förbli inuti den kvinnliga buken, med endast 3-4 utsatta för injektioner. Nålskärpa är en annan avgörande faktor för framgångsrika injektioner. Trubbiga eller trasiga nålspetsar resulterar i upprepad petning av deciduas eller kompression mot modelleringsleran innan den kommer in i AC, vilket kan öka resorptionshastigheten. Därför bör välmalda och skarpa nålar alltid förvaras säkert och bytas ut efter högst 2 honor.
Detta protokoll beskriver hur man riktar in sig på neuralplattan med en enda injektion av lentivirus. Dessutom visar den hur transduktionseffekt kan anpassas från encelliga kloner till hela hjärnan. Men andra icke-neurala vävnader, inklusive hud och oralt epitel, är också riktade. Dessutom transduceras alla celltyper (förfäder och differentierade celler), vilket gör detta tillvägagångssätt effektivt men ospecifikt. Användningen av MiniPromoters i den virala konstruktionen leder till det specifika uttrycket av transgenen i neuroner eller astrocyter15. Detta har fördelen att man undviker användning av dedikerade transgena Cre-djur och minskar därför mängden arbete (stamunderhåll och genotypning) och kostnader.
Neptuns begränsningar inkluderar dess tekniska svårigheter, utmaningar med att få gravida kvinnor i en förutsägbar och konsekvent takt och kostnaderna för att förvärva specialiserad instrumentering. Dessutom kan icke-selektiv inriktning av celler med lentivirus ses som både en fördel och en begränsning av tekniken. Injektion av större volymer i AC resulterar i exencefali13, även om hjärnmissbildningar och exencefali undviks med de volymer som beskrivs här15. En negativ inverkan på hjärnans utveckling är således en risk med in utero nano-injektioner som noggrant måste undvikas genom att injicera korrekta volymer anpassade till embryonalstadiet och AC-storlek.
Framtida anpassningar av tekniken kan fokusera på viral tropism. Adenoassocierade virus (AAV) har olika serotyper, som har visat sig vara robusta mot olika celltyper i CNS17,26. AAV integreras dock inte i värdcellsgenomet och kan därför gå förlorade i celler med hög delningshastighet. Även om det finns flera sätt att öka specificiteten hos NEPTUNUS, är transgena djur fortfarande guldstandarden när det gäller genmanipulation in vivo. Cas9-möss och sgRNA-kodande lentivirus har använts för genetisk screening i embryonal epidermis27 och kan också anpassas till det utvecklande CNS.
Injektioner i AC vid E7.5 riktar sig effektivt mot celler i neuroektodermen innan neurulering initieras och riktar sig mot den utvecklande hjärnan mer effektivt än vid utero-elektroporering . Detta gör det möjligt att studera genetiska ledtrådar som är viktiga för hjärnans utveckling från en tidigare tidpunkt. Till skillnad från klassiska genetiska musmodeller erbjuder NEPTUNUS ett flexibelt tillvägagångssätt för att utföra funktionell genanalys. Fenotyper efter överuttryck eller genradering kan studeras inom dagar till veckor jämfört med månader eller år. Injektioner av flera virala konstruktioner möjliggör manipulering av flera gener inom ett embryo och undviker generering av dubbla eller tredubbla knockoutdjur. Därför sparar NEPTUNUS inte bara tid utan kan också minska antalet djur som används i forskning.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Bettina Semsch och Jia Sun (Infinigene) för expertvård av möss; Florian Salomons och Göran Månsson från Biomedicum Imaging Core (BIC) för hjälp med bildförvärv och konsultation. Finansiering: Vi tackar följande finansiärer för deras stöd till detta projekt: Vetenskapsrådet, Karolinska Institutet (KI-stiftelser, Karriärutvecklingsbidrag, doktorand KID-finansiering och SFO StratNeuro-finansiering, Centrum för innovativ medicin), Ollie och Elof Ericssons stiftelse, Tornspirans stiftelse, Jeansssons stiftelse, Sven och Ebba-Christina Hagbergs pris och forskningsanslag, Knut och Alice Wallenbergs projektbidrag, Fredrik och Ingrid Thurings Stiftelse, Lars Hiertas Minne, Barncancerfonden, Åhlenstiftelsen, Åke Wibergs Stiftelse, Tore Nilssons Stiftelse och Stiftelsernas startbidrag till ERA. Figur 4D,E skapades med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Syringe | BD Bioscience | 309628 | |
| 27 G Needle | BD Bioscience | 300635 | |
| 3.5 inches capillaries | Drummond Scientific | 3000203G/X | Were used to pull in house needles |
| 70 MHz MS Series transducer | Visual Sonics | MS700 | |
| Aquasonic clear ultrasound gel | Parker Laboratories | Mar-50 | |
| Autoclip Applier 9 mm | Angthos | 12020-09 | |
| CD1 mice | Charles River, Germany | Crl:CD1(ICR) | Females: from age of 8 weeks old Males: from the age of 12 weeks old |
| Cotton Swab | OneMed Sverige AB | 120788 | |
| DPBS | Gibco | 14190094 | |
| Dressing forceps delicate straight 13 cm | Agnthos | 08-032-130 | |
| EG-400 Narishige Micropipette Grinder | Narishige | NA | |
| EZ clips 9 mm | Angthos | 59027 | clips |
| Iris Scissors, Super Cut, straight, 9 cm | Agnthos | 307-336-090 | |
| Isofluorane | Baxter Medical AB | EAN: 50085412586613 | Purchased from Swedish Pharmacy |
| Kimwipes | Kimberly Clarke | 7557 | |
| Membrane Tape | Visual Sonics | SA-11053 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Modeling Clay | Sense AB | 10209 | |
| Mouse Handling Table | Visual Sonics | 50249 | |
| Nanoject II Auto Injector Kit | Drummond | 3-000-205A | |
| Parafilm | Bemis | HS234526C | |
| Petri dish with central opening (low wall) | Visual Sonics | SA-11620 | |
| Petri dish, (ØxH): 92 x 16 mm | Sarstedt | 82.1472.001 | |
| Rely+On Virkon | DuPont | 130000132037 | disinfectant |
| Silicone membrane | Visual Sonics | SA-11054 | |
| Steri 250, hot bead sterilizer | Angthos | 31100 | |
| Surgical Tape (1.25 cm x 9.14 m) | Medicarrier | 67034 | |
| Vevo Compact Dual (Med. Air & O2) Anesthesia System | Visual Sonics | VS-12055 | |
| Vevo Imaging Station 2 | Visual Sonics | VS-11983 | |
| Vevo2100 | Visual Sonics | VS-20047 | |
| Vicryl 6-0; C-3 needle, 45 cm purple filament | Agnthos | J384H |
References
- Theiler, K. The House mouse. Atlas of embryonic development. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (1989).
- Barresi, M. J. F., Gilbert, S. F. Developmental biology. , Sinauer Associates Inc. Publishers. Sunderland, Massachusetts. (2016).
- Taylor, J. C., et al. Factors influencing success of clinical genome sequencing across a broad spectrum of disorders. Nature Genetics. 47 (7), 717-726 (2015).
- Pizzo, L., et al. Rare variants in the genetic background modulate cognitive and developmental phenotypes in individuals carrying disease-associated variants. Genetics in Medicine. 21 (4), 816-825 (2019).
- Sakai, Y. Neurulation in the mouse: Manner and timing of neural tube closure. The Anatomical Record. 223 (2), 194-203 (1989).
- Schoenwolf, G. C. Shaping and bending of the avian neuroepithelium: Morphometric analyses. Developmental Biology. 109 (1), 127-139 (1985).
- Smith, J. L., Schoenwolf, G. C., Quan, J. Quantitative analyses of neuroepithelial cell shapes during bending of the mouse neural plate. Journal of Comparative Neurology. 342 (1), 144-151 (1994).
- Katahira, T., Nakamura, H. Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system. Development Growth and Differentiation. 45 (4), 361-367 (2003).
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. I. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochemical and Biophysical Research Communications. 230 (2), 376-380 (1997).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
- Beronja, S., Livshits, G., Williams, S., Fuchs, E. Rapid functional dissection of genetic networks via tissue-specific transduction and RNAi in mouse embryos. Nature Medicine. 16 (7), 821-827 (2010).
- Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5. Journal of Visualized Experiments JoVE. (45), e2047 (2010).
- Gaiano, N., Kohtz, J. D., Turnbull, D. H., Fishell, G. A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system. Nature Neuroscience. 2 (9), 812-819 (1999).
- Slevin, J. C., et al. High resolution ultrasound-guided microinjection for interventional studies of early embryonic and placental development in vivo in mice. BMC Developmental Biology. 6, 10 (2006).
- Mangold, K., et al. Highly efficient manipulation of nervous system gene expression with NEPTUNE. Cell Reports Methods. 1, 100043 (2021).
- Kameneva, P., et al. Single-cell transcriptomics of human embryos identifies multiple sympathoblast lineages with potential implications for neuroblastoma origin. Nature Genetics. 53 (5), 694-706 (2021).
- Kaiser, K., et al. MEIS-WNT5A axis regulates development of fourth ventricle choroid plexus. Development. 148 (10), (2021).
- Haddad, M. R., Donsante, A., Zerfas, P., Kaler, S. G. Fetal brain-directed AAV gene therapy results in rapid, robust, and persistent transduction of mouse choroid plexus epithelia. Molecular Therapy. Nucleic Acids. 2 (6), 101 (2013).
- Heavner, W., Pevny, L. Eye development and retinogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (12), 008391 (2012).
- Swamynathan, S. K. Ocular surface development and gene expression. Journal of Ophthalmology. 2013, 103947 (2013).
- Amano, O., Mizobe, K., Bando, Y., Sakiyama, K. Anatomy and histology of rodent and human major salivary glands: -overview of the Japan Salivary Gland Society-sponsored workshop. Acta Histochemica et Cytochemica. 45 (5), 241-250 (2012).
- Liu, H. X., Komatsu, Y., Mishina, Y., Mistretta, C. M. Neural crest contribution to lingual mesenchyme, epithelium and developing taste papillae and taste buds. Developmental Biology. 368 (2), 294-303 (2012).
- Marmigère, F., Ernfors, P. Specification and connectivity of neuronal subtypes in the sensory lineage. Nature Reviews. Neuroscience. 8 (2), 114-127 (2007).
- Zirlinger, M., Lo, L., McMahon, J., McMahon, A. P., Anderson, D. J. Transient expression of the bHLH factor neurogenin-2 marks a subpopulation of neural crest cells biased for a sensory but not a neuronal fate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (12), 8084-8089 (2002).
- Portales-Casamar, E., et al. A regulatory toolbox of MiniPromoters to drive selective expression in the brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (38), 16589-16594 (2010).
- Tervo, D. G. R., et al. A designer AAV variant permits efficient retrograde access to projection neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
- Loganathan, S. K., et al. Rare driver mutations in head and neck squamous cell carcinomas converge on NOTCH signaling. Science. 367 (6483), 1264-1269 (2020).
