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Developmental Biology

भ्रूण दिवस 7.5 पर गर्भाशय नैनो-इंजेक्शन (नेपच्यून) में म्यूरिन न्यूरल प्लेट लक्ष्यीकरण

Published: February 14, 2022 doi: 10.3791/63148
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Cell and Molecular Biology, Karolinska Institutet

Summary

इस प्रोटोकॉल में, हम वर्णन करते हैं कि कैसे लेंटिवायरस के साथ ई 7.5 पर माउस एमनियोटिक गुहा को इंजेक्ट करें, जिससे पूरे तंत्रिका प्लेट का समान पारगमन होता है, जिसमें अस्तित्व या भ्रूण के विकास पर न्यूनतम हानिकारक प्रभाव पड़ता है।

Abstract

गर्भाशय में विकासशील माउस मस्तिष्क में जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर कार्यात्मक आनुवंशिकी अध्ययन के लिए बड़ी क्षमता रखता है। हालांकि, यह पहले काफी हद तक भ्रूण के चरणों के हेरफेर के बाद न्यूरुलेशन तक सीमित रहा है। भ्रूण दिवस (ई) 7.5 पर एमनियोटिक गुहा को इंजेक्ट करने और लेंटिवायरस, एन्कोडिंग सीडीएनए या एसएचआरएनए देने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया गया था, जो तंत्रिका प्लेट और तंत्रिका शिखा कोशिकाओं के >95% को लक्षित करता है, भविष्य के मस्तिष्क, रीढ़ की हड्डी और परिधीय तंत्रिका तंत्र में योगदान देता है। यह प्रोटोकॉल सफल पारगमन प्राप्त करने के लिए आवश्यक चरणों का वर्णन करता है, जिसमें ग्लास केशिका सुइयों को पीसना, गर्भावस्था सत्यापन, अल्ट्रासाउंड इमेजिंग का उपयोग करके विकासात्मक मंचन, और भ्रूण के चरणों से मेल खाने वाले इष्टतम इंजेक्शन वॉल्यूम शामिल हैं।

इस प्रोटोकॉल के बाद, उच्च टिटर लेंटीवायरस के साथ विकासशील मस्तिष्क के >95% के पारगमन को प्राप्त करना संभव है और इस प्रकार पूरे मस्तिष्क आनुवंशिक हेरफेर करना संभव है। इसके विपरीत, कम वायरल टाइटर्स का उपयोग करके मोज़ेक पारगमन प्राप्त करना संभव है, जिससे आनुवंशिक स्क्रीनिंग या वंश अनुरेखण की अनुमति मिलती है। ई 7.5 पर इंजेक्शन आंख, जीभ और परिधीय तंत्रिका तंत्र के अलग-अलग डिब्बों में योगदान देने वाले एक्टोडर्म और तंत्रिका शिखा को भी लक्षित करता है। इस प्रकार यह तकनीक प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले चूहों की संख्या को कम करने के लाभ के साथ, पूर्वनवीकरण चरणों से माउस तंत्रिका-प्लेट- और एक्टोडर्म-व्युत्पन्न ऊतकों में जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर करने की संभावना प्रदान करती है।

Introduction

मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी भ्रूणजनन 1,2 के दौरान गठन शुरू करने वाले पहले अंगों में से हैं। यद्यपि न्यूरोडेवलपमेंटल विकारों से जुड़े जीन की पहचान की जा रही है, आनुवंशिक वेरिएंट की कार्यात्मक पूछताछ 3,4 से पीछे है। चूंकि सशर्त नॉकआउट चूहों की पीढ़ी में महीनों या वर्षों लग सकते हैं, विकासशील मस्तिष्क में जीन फ़ंक्शन की तेजी से जांच करने के लिए एक वैकल्पिक तकनीक ब्याज की है। माउस भ्रूण में, न्यूरुलेशन - मॉर्फोजेनेटिक प्रक्रिया जिसके द्वारा तंत्रिका प्लेट केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) को जन्म देने के लिए तंत्रिका ट्यूब में बदल जाती है - गर्भाधान5 के बाद 8 और 10 दिनों के बीच होती है। न्यूरुलेशन की शुरुआत से पहले, तंत्रिका प्लेट, एक्टोडर्म के हिस्से के रूप में, स्तंभ कोशिकाओं की एक परत होती है जो सीएनएस 6,7 के भीतर कई न्यूरोनल और ग्लियाल सेलप्रकारों में फैल जाएगी और अंतर करेगी। इसलिए, सीएनएस में जीन अभिव्यक्ति के लिए लंबे समय तक चलने वाले परिवर्तनों को प्रयोगात्मक रूप से प्रेरित करने के लिए, तंत्रिका प्लेट को लक्षित करना सभी पूर्वज कोशिकाओं की पहुंच सहित स्पष्ट लाभ प्रदान करता है।

तंत्रिका विज्ञान में, भ्रूण सीएनएस जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर करने के लिए ओवो इलेक्ट्रोपोरेशन 8,9 और माउस भ्रूण के वायरल ट्रांसडक्शन का उपयोग किया गया है। विकासशील लड़की भ्रूण अंडे में चूजे भ्रूण की पहुंच और जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर करने की परिणामी आसानी के कारण रीढ़ की हड्डी के विकास के दौरान जीन फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए पसंद का एक मॉडल रहा है। विशेष रूप से, ओवो प्लास्मिड इलेक्ट्रोपोरेशन में प्रत्येक लड़की रीढ़ की हड्डी में प्रयोगात्मक और नियंत्रण की स्थिति उत्पन्न होती है। इलेक्ट्रोपोरेशन कोशिका झिल्ली पारगम्यता का कारण बनता है और भ्रूण में दो इलेक्ट्रोड के माध्यम से एक विद्युत नाड़ी को लागू करके (नकारात्मक) कैथोड से (सकारात्मक) एनोड की ओर नकारात्मक चार्ज किए गए डीएनए को निर्देशित करता है। चूहों में, गर्भाशय में इलेक्ट्रोपोरेशन आम तौर पर भ्रूण के चरणों तक सीमित होता है जिस पर न्यूरुलेशन पूरा हो गया है, और मस्तिष्क या रीढ़ की हड्डी में पहले से ही कई सेल परतें होती हैं, जिसके परिणामस्वरूप कम इलेक्ट्रोपोरेशन दक्षता10 होती है। प्लास्मिड इलेक्ट्रोपोरेशन के परिणामस्वरूप क्षणिक जीन अभिव्यक्ति होती है और आमतौर पर कुछ कोशिकाओं को लक्षित करती है।

गर्भाशय माइक्रोइंजेक्शन में अल्ट्रासाउंड-निर्देशित का उपयोग विभिन्न भ्रूण संरचनाओं जैसे त्वचा और मस्तिष्क11,12,13,14 में हेरफेर करने के लिए किया गया है। हालांकि, विकासशील म्यूरिन सीएनएस को लक्षित करने वाले इंजेक्शन ने कम प्रभावकारिता दिखाई है या भ्रूण के अस्तित्व को नकारात्मक रूप से प्रभावित किया है 12,13,14। इसलिए, ई 7.5 पर एमनियोटिक गुहा (एसी) में उच्च-टिटर लेंटीवायरस के वितरण के लिए एक बेहतर प्रोटोकॉल विकसित किया गया था, जिसे गर्भाशयएनएनो-इंजईसीशन15 के साथ एनईयूरल पीलेट टीआर्गेटिंग के लिए नेपच्यून करार दिया गया था। इंजेक्शन के परिणामस्वरूप ई 13.5 पर पूरे मस्तिष्क के >95% की लंबे समय तक चलने वाली लक्ष्यीकरण प्रभावकारिता हुई। इसके अलावा, अनुसंधान जानवरों पर अनावश्यक प्रक्रियाओं को कम करने और इंजेक्शन की सफलता को अधिकतम करने के लिए विकासात्मक चरण द्वारा महिलाओं और गर्भधारण को सॉर्ट करने के लिए गर्भावस्था के अल्ट्रासाउंड सत्यापन के दौरान एक स्टेजिंग कदम पेश किया गया था। इंजेक्शन दक्षता और अस्तित्व एसी आकार में वृद्धि से कसकर जुड़े हुए हैं। इसलिए, यह पेपर वर्णन करता है कि एसी को उपयुक्त मात्रा देने के लिए इंजेक्शन से पहले एसी आकार को कैसे मापा जाए जो भ्रूण के पुनरुत्थान का कारण नहीं होगा। नेपच्यून गर्भाशय के दृष्टिकोण में वर्तमान का एक मजबूत विकल्प है और इसे कई उपयोगों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जिसमें फ़ंक्शन अध्ययन, वंश अनुरेखण, या स्क्रीनिंग15,16 के लाभ और हानि शामिल हैं, लेकिन सीमित नहीं हैं। 

Protocol

सीडी 1 जंगली प्रकार के चूहों को यूरोपीय नियमों के अनुसार रखा गया था, भोजन और पानी विज्ञापन लिबिटम के साथ एक मानक दिन और रात चक्र के साथ। सीडी 1 महिलाओं को रात भर सीडी 1 पुरुषों के साथ संभोग किया गया था, और योनि प्लग को सुबह (ई 0.3) में जांचा गया था। इंजेक्शन के लिए केवल गर्भवती महिलाओं का उपयोग किया गया था। यहां वर्णित सभी प्रयोगों के लिए नैतिक अनुमोदन स्वीडिश बोर्ड ऑफ एग्रीकल्चर (जॉर्डब्रुक्सवर्केट) द्वारा प्रदान किया गया था।

1. कांच की सुइयों की तैयारी: सुई खींचना और पीसना

नोट: यद्यपि प्रीग्राउंड सुइयों को खरीदा जा सकता है, घर में सुइयों को खींचने से सुई की लंबाई, बोर और बेवल कोण के आसान समायोजन की अनुमति मिलती है।

  1. केशिका खींचने वाले में एक ग्लास केशिका माउंट करें। निर्दिष्ट उपकरणों का उपयोग करके निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग करें ( सामग्री की तालिका देखें): गर्मी 580 इकाइयाँ; वेग 140 इकाइयों; समय 200 इकाइयों; दबाव 500-800 इकाइयों।
    नोट: विभिन्न मापदंडों की इकाइयों को केशिका खींचने वाले द्वारा परिभाषित किया गया है। इकाइयाँ विभिन्न उपकरणों के लिए भिन्न हो सकती हैं।
  2. पतला सिरों के साथ दो ग्लास केशिकाओं का उत्पादन करने वाली केशिका को अलग करने के लिए पुल दबाएं।
    नोट: खींचने के बाद, माइक्रोपिपेट खींचने वाले के उच्च तापमान के कारण दो ग्लास केशिकाओं की युक्तियों को बंद कर दिया जाता है।
  3. ~ 7 मिमी की सुई की लंबाई प्राप्त करने के लिए सर्जिकल कैंची के साथ टिप काटें (मापा जाता है जहां से सुई टेपर शुरू होती है) (चित्रा 1 ए)।
    नोट: ई 7.5 इंजेक्शन के लिए, एक लंबी और ठीक सुई महत्वपूर्ण है क्योंकि इंजेक्शन का क्षेत्र बहुत छोटा और नाजुक है। छोटी और चौड़ी बोर सुइयों के परिणामस्वरूप भ्रूण की मृत्यु हो जाएगी।
  4. एक तेज बेवल (चित्रा 1 सी-एफ) बनाने के लिए कट सुई टिप पीस लें।
    1. सुई को कम से कम 30-45 मिनट के लिए अधिकतम गति पर 20 ° के कोण पर पीस लें।
      नोट: अल्ट्राप्योर पानी को स्नेहक के रूप में कार्य करने, घर्षण/तापमान को कम करने और कांच के कणों (चित्रा 1 बी) को धोने के लिए पीसप्लेट में जोड़ा जाता है। हालांकि, अतिरिक्त तरल चक्की को धीमा कर सकता है।
    2. सुनिश्चित करें कि सुई टिप (चित्रा 1 सी) पीसप्लेट सतह (चित्रा 1 डी) को छूती है लेकिन झुकता नहीं है (चित्रा 1 ई)।
      नोट: बेंट पीसने के परिणामस्वरूप एक गलत बेवल कोण की एक लंबी और नाजुक सुई टिप होती है, जो इंजेक्शन के दौरान आसानी से टूट सकती है। ब्रेकिंग सुइयों भ्रूण को नुकसान पहुंचा सकते हैं और इसे एक बरकरार सुई के साथ प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए। एक सही ढंग से जमीन टिप चित्रा 1 एफ, जी में दिखाया गया है। पीसने के बाद, परिणामी सुई बोर ~ 15 μm के एक अंदर व्यास (आईडी) और ~ 35 μm (चित्रा 1 जी) के एक बाहरी व्यास (आयुध डिपो) होने की उम्मीद है।
  5. खनिज तेल के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज भरें और 27 जी सुई संलग्न करें।
  6. सुई टोपी निकालें और सिरिंज सुई को नए ग्राउंड ग्लास केशिका में डालें। केशिका टिप से तेल टपकने तक खनिज तेल इंजेक्ट करें। 27 जी सुई को वापस लेते समय इंजेक्शन लगाते रहें जब तक कि केशिका सुई खनिज तेल से भर न जाए, जिसके बाद सिरिंज सुई को हटाया जा सकता है।
  7. क्षति और धूल संचय को रोकने के लिए एक बंद वातावरण में जमीन और खनिज तेल से भरी सुइयों को स्टोर करें। भंडारण के लिए, धारकों (चित्रा 1 एच) के रूप में सेवा करने के लिए एक नियमित पेट्री डिश में मॉडलिंग मिट्टी के दो रोल डालें। धीरे मिट्टी पर सुइयों पर्च और सुइयों की आसान पुनर्प्राप्ति के लिए उन्हें दूर अंतरिक्ष।
    नोट: चूंकि सुई की तैयारी समय लेने वाली है, इसलिए इंजेक्शन से कम से कम एक दिन पहले सुइयों को तैयार करना सबसे अच्छा है। अधिकतम दो लिटर के बाद सुइयों को त्यागें क्योंकि वे कुंद हो जाएंगे। तैयारी या इंजेक्शन के दौरान सुई क्षति के मामले में हमेशा बैकअप सुई तैयार करें।

Figure 1
चित्रा 1: ई 7.5 एमनियोटिक गुहा इंजेक्शन के लिए सुई की तैयारी ( ए ) खींची गई लेकिन बिना खतना के ग्लास केशिका सुई (बाएं) के प्रतिनिधि उदाहरण, ई 7.5 इंजेक्शन (मध्य) के लिए इष्टतम लंबाई पर एक केशिका सुई काटती है, और एक केशिका बहुत कम (दाएं)। (बी) पानी के समान कवरेज के साथ चक्की, जो सुई पीसने के लिए तैयार है। (सी-एफ) विभिन्न सुई युक्तियों के प्रतिनिधि उदाहरण। (सी) चक्की में घुड़सवार कट लेकिन अनग्राउंड सुई टिप; (डी) सुई टिप के साथ आदर्श पीसने की स्थिति सिर्फ चक्की को छू रही है; (ई) पीसने की प्रक्रिया के दौरान सुई बहुत दूर और झुकने; (एफ) ई 7.5 एसी इंजेक्शन के लिए एक आदर्श जमीन सुई टिप। (जी) एक जमीन सुई टिप ~ 15 μm के अंदर व्यास और ~ 35 μm के एक बाहरी व्यास के साथ बोर दिखा रहा है, जो E7.5 एसी इंजेक्शन के लिए उपयुक्त है। सुई बोर को धराशायी लाइनों के रूप में दिखाया गया है। बाहरी व्यास लाल तीर के साथ निरूपित; आंतरिक व्यास नीले तीरहेड्स के साथ दर्शाया गया है। (एच) सुई भंडारण: खींचे गए और जमीन सुइयों से भरा पेट्री डिश। मॉडलिंग मिट्टी की दो पंक्तियां धारकों के रूप में काम करती हैं। नोट: सी, एफ, जी में ओकुलर माइक्रोमीटर के लिए, 1 सेमी को 100 पिचों में विभाजित किया गया है; उद्देश्य 3x है; इसलिए, 1 पिच = 10,000 μm/(100 × 3) 33.4 μm ≈। संक्षिप्त नाम: एसी = एमनियोटिक गुहा; आईडी = आंतरिक व्यास; आयुध डिपो = बाहरी व्यास। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

2. इंजेक्शन से एक दिन पहले: गर्भावस्था के अल्ट्रासाउंड-सत्यापन के लिए बेंच तैयार करें

नोट: सभी काम एक हवादार जैव सुरक्षा स्तर 2 (बीएसएल 2) बेंच में किया जाना चाहिए जब मसूर के साथ काम करते हैं। गर्भावस्था का अल्ट्रासाउंड-सत्यापन एक हवादार बेंच पर किया जा सकता है।

  1. आइसोफ्लूरेन पंप के लिए अल्ट्रासाउंड मशीन, हीटिंग टेबल और ओ2 आपूर्ति पर स्विच करें (उपकरणों के बीच भिन्न हो सकते हैं)।
    नोट: हवा में कोई आइसोफ्लूरेन रिसाव सुनिश्चित करने के लिए आइसोफ्लूरेन प्रणाली की जांच करें।
  2. बीएसएल 2 बेंच के अंदर एक खाली अपशिष्ट बैग (आसान पहुंच के लिए अंदर की दीवार पर टेप), बालों को हटाने वाली क्रीम, बाँझ पैक कपास झाड़ू, पानी, टिशू पेपर और सर्जिकल टेप रखें।
  3. गर्भावस्था के अल्ट्रासाउंड जांच के दौरान माउस अंगों को सुरक्षित करने के लिए सर्जिकल टेप (~ 7 सेमी लंबा) के चार टुकड़े तैयार करें।

3. गर्भावस्था की पुष्टि करने के लिए अल्ट्रासाउंड जांच

नोट: यह चरण ई 7.5 इंजेक्शन से एक दिन पहले, ई 6.5 पर किया जा सकता है। गर्भकालीन आयु की जांच के बारे में विवरण के लिए चर्चा देखें।

  1. प्रेरण कक्ष में समय संभोग महिला माउस रखें।
  2. संज्ञाहरण को प्रेरित करने के लिए ~ 2.1 एलपीएम के ऑक्सीजन प्रवाह और 3-4% आइसोफ्लूरेन की प्रारंभिक खुराक के साथ गैस प्रवाह पर स्विच करें।
  3. सत्यापित करें कि पंजा पलटा की जांच करके मादा पूरी तरह से संवेदनाहारी है। यदि पंजा पलटा अनुपस्थित है, तो 1.5-2% तक कम आइसोफ्लूरेन।
    नोट: संज्ञाहरण को प्रेरित करने में लगभग 3 मिनट लगते हैं।
  4. प्रेरण कक्ष से हीटिंग टेबल नाक शंकु के लिए गैस प्रवाह स्विच करें।
  5. गर्भावस्था की अल्ट्रासाउंड जांच के दौरान संज्ञाहरण के रखरखाव को सुनिश्चित करने के लिए हीटिंग टेबल पर एक लापरवाह स्थिति (पेट ऊपर) में संवेदनाहारी महिला रखें और थूथन को संलग्न नाक शंकु में रखें।
  6. महिला के शरीर को खींचने या मूंछों को फँसाने के बिना सर्जिकल टेप के तैयार टुकड़ों के साथ मेज पर सभी चार पंजे जकड़ें।
  7. पेट के निचले हिस्से पर मटर के आकार की हेयर रिमूवल क्रीम लगाएं। एक कपास झाड़ू का उपयोग करके, निचले पेट (~ 3 x 3 सेमी वर्ग) पर क्रीम वितरित करें और धीरे-धीरे कपास झाड़ू को आगे और पीछे घुमाकर मालिश करें।
  8. एक बार जब फर त्वचा से अलग होना शुरू हो जाता है, तो एक टिशू पेपर को गीला करें और क्रीम और फर को हटा दें। नम टिशू पेपर के साथ डी-फर्रेड क्षेत्र को साफ करें जब तक कि सभी क्रीम और बाल चले न जाएं। स्किन को ड्राई करें।
  9. मुंडा क्षेत्र में अल्ट्रासाउंड जेल की एक प्लम आकार की मात्रा लागू करें और निम्नलिखित तीन दृष्टिकोणों में से किसी एक द्वारा अल्ट्रासाउंड का उपयोग करके गर्भाशय की पहचान करने के लिए आगे बढ़ें।
    1. मैन्युअल रूप से ऐसा करने के लिए, अल्ट्रासाउंड जेल में अल्ट्रासाउंड जांच पकड़ो और गर्भाशय को खोजने के लिए जांच को स्थानांतरित करें।
    2. अर्ध-मैनुअल दृष्टिकोण # 1 के लिए, एक्स-प्लेन के साथ रेल के हिस्से को ढीला और स्थानांतरित करके महिला पेट के ऊपर अल्ट्रासाउंड जांच (रेलिंग सिस्टम से जुड़ी) की स्थिति। जेल (जेड-प्लेन) में अल्ट्रासाउंड जांच को कम करें और निचले पेट (वाई-प्लेन) (चित्रा 2 ए) के माध्यम से स्कैन करें।
    3. अर्ध-मैनुअल दृष्टिकोण # 2 के लिए, पेट के निचले हिस्से की छवि बनाने के लिए जेल में अल्ट्रासाउंड जांच (रेलिंग सिस्टम से जुड़ी) को कम करें। प्रक्रिया के दौरान अल्ट्रासाउंड जांच स्थिर रखें, और एक्स और / या वाई- विमानों (चित्रा 2 बी) के साथ संलग्न पहियों के साथ हीटिंग टेबल को स्थानांतरित करें।
      नोट: इन शुरुआती भ्रूण चरणों में, आंतरिक अंग, उदाहरण के लिए, आंत, अल्ट्रासाउंड इमेजिंग में गर्भाशय के समान दिखाई दे सकते हैं। हालांकि, जबकि भ्रूण और निर्णायक गोले के अनुक्रम के रूप में दिखाई देते हैं (एक हार के साथ मोतियों के समान), आंत में एक निरंतर ट्यूब की उपस्थिति होती है। ल्यूमिनल रिक्त स्थान (अलग-अलग गोले बनाम एक निरंतर ट्यूब) की कनेक्टिविटी का मूल्यांकन ब्याज की संरचना के माध्यम से आगे और पीछे स्कैन करके किया जा सकता है ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि संरचना एक असतत क्षेत्र (भ्रूण / इस स्तर पर, भ्रूण की संख्या रिकॉर्ड करना आवश्यक नहीं है; यह उनकी उपस्थिति या अनुपस्थिति की पुष्टि करने के लिए पर्याप्त है।
  10. एक बार गर्भावस्था की स्थिति निर्धारित हो जाने के बाद, अल्ट्रासाउंड जांच को पेट से दूर उठाएं और अल्ट्रासाउंड जेल को हटाने के लिए नम टिशू पेपर के साथ निचले पेट को साफ करें।
  11. आइसोफ्लूरेन पंप को बंद करें और पंजे को छोड़ने के लिए सर्जिकल टेप को हटा दें।
  12. मादा को प्रवण स्थिति (पेट नीचे) में 40 डिग्री सेल्सियस हीटिंग प्लेट पर एक साफ पिंजरे में रखें। महिला को होश आने तक करीबी निगरानी में रखें, जिसमें 2-6 मिनट लगते हैं।
    नोट: सुनिश्चित करें कि एक महिला के लिए अल्ट्रासाउंड जांच आइसोफ्लूरेन के संपर्क को कम करने के लिए <10 मिनट है।
  13. सभी सामग्रियों और अपशिष्ट को हटा दें और 70% इथेनॉल के साथ सभी सतहों को साफ करें। एक सूखे, नरम, और लिंट मुक्त कागज ऊतक के साथ अल्ट्रासाउंड जांच से किसी भी बचे हुए अल्ट्रासाउंड जेल को मिटा दें। अल्ट्रासाउंड मशीन, हवादार बेंच / बीएसएल 2 बेंच, हीटिंग टेबल और ओ2 आपूर्ति बंद करें।

4. भ्रूण मंचन के लिए अल्ट्रासाउंड की जाँच करें

नोट: यह कदम सर्जरी से पहले किया जाता है और गर्भवती महिलाओं को उनके एसी आकारों के अनुसार स्तरीकृत करने का कार्य करता है। यह कदम ई 7.5 पर महत्वपूर्ण है जब उद्देश्य विकासशील सीएनएस को लक्षित करना है। विकास के इस प्रारंभिक चरण में, विकास में कुछ घंटों का अंतर एसी के आकार और न्यूरुलेशन की प्रगति को काफी प्रभावित करता है।

  1. चरण 3.1-3.5 में चरणों का पालन करते हुए पहली गर्भवती महिला माउस को संवेदनाहारी करें।
  2. चरण 3.6 में वर्णित तालिका पर महिला को रखें और ठीक करें।
  3. मुंडा पेट के लिए अल्ट्रासाउंड जेल की एक बेर के आकार की राशि लागू करें और महिला के निचले पेट की छवि के लिए अल्ट्रासाउंड जांच को कम करें।
    नोट: यह कदम मानता है कि गर्भावस्था के लिए पिछले दिन अल्ट्रासाउंड द्वारा महिला का निरीक्षण किया गया था और पहले से ही पेट पर फर हटा दिया गया है। यदि ऐसा नहीं है, तो चरण 3.7-3.8 के बाद अल्ट्रासाउंड जेल को जोड़ने से पहले फर को हटा दिया जाना चाहिए। ई 7.5 पर, गर्भाशय और निर्णायक आंतरिक अंगों से अंतर करने के लिए बड़े और आसान होते हैं। इसके अलावा, एसी बड़ा है और इसे एक्सोसेलोमिक गुहा (ईएक्ससी) से अलग किया जा सकता है।
  4. बाएं और दाएं गर्भाशय के सींगों के माध्यम से पूरी तरह से स्कैन करें।
    नोट: कुछ भ्रूण मादा के शरीर के अंदर गहरे झूठ बोलते हैं और उन्हें याद किया जा सकता है।
  5. भ्रूण की संख्या और चरणों को रिकॉर्ड करें। एक गुहा (चित्रा 2 ई-जी) के बिना आदर्श आकार के एमनियोटिक गुहाओं, स्वीकार्य गुहाओं और निर्णायकों की संख्या पर ध्यान दें।
  6. सभी गर्भधारण को स्टेज करें और तदनुसार उन्हें रैंक करें।
  7. अल्ट्रासाउंड जांच (चरण 4.4) के तुरंत बाद आदर्श आकार के एसी के बहुमत के साथ महिलाओं को इंजेक्शन 4.5-4.7 चरणों में निर्देशों का पालन करें।
  8. स्वीकार्य बहुमत वाली महिलाओं के लिए (जिसमें एक्सोसेलोमिक और एमनियोटिक गुहाओं को अभी तक स्पष्ट रूप से दो गुहाओं में विभाजित नहीं किया गया है) या अनुपस्थित गुहाओं के लिए, इंजेक्शन को स्थगित करें और कुछ घंटों के बाद उन्हें फिर से मंचित करें। यदि अधिकांश गुहाएं अभी भी बहुत छोटी हैं, तो इंजेक्शन को 10-12 घंटे तक स्थगित कर दें।

Figure 2
चित्रा 2: अल्ट्रासाउंड-चेक के दौरान एमनियोटिक गुहाओं का निरीक्षण और मंचन( ए) संलग्न अल्ट्रासाउंड जांच, नैनोइंजेक्टर और हीटिंग टेबल के साथ रेल प्रणाली का अवलोकन। अल्ट्रासाउंड जांच को महिला पेट या एसी के साथ इष्टतम संरेखण प्राप्त करने के लिए एक्स, वाई और जेड-प्लेन में स्थानांतरित किया जा सकता है। (बी) हीटिंग टेबल को एसी की सटीक स्कैनिंग और मूल्यांकन की अनुमति देने के लिए एक्स- और / या वाई-प्लेन में दो पहियों के माध्यम से स्थानांतरित किया जा सकता है, जबकि अल्ट्रासाउंड जांच स्थिर रह सकती है। (सी) गर्भावस्था की पुष्टि करने के लिए अल्ट्रासाउंड जांच के दौरान महिला पेट के अंदर ई 6.5 निर्णायक की प्रतिनिधि अल्ट्रासाउंड छवियां (सफेद बिंदीदार रूपरेखा)। इस बिंदु पर कोई गुहा नहीं बनी है; हालाँकि, कभी-कभी, एक्टोप्लासेंटल शंकु (सफेद तारांकन) दिखाई देता है। निर्णायक को उनके गोलाकार आकार से पहचाना जा सकता है और आंत से अलग किया जा सकता है, जो एक निरंतर ट्यूब के रूप में दिखाई देता है। (डी) छोटी आंत का प्रतिनिधि छवि अनुक्रम (सफेद बिंदीदार रूपरेखा), जो पेट के निचले हिस्से के माध्यम से स्कैनिंग में निरंतर है। (ई-जी) ई 7.5 इंजेक्शन से पहले गुहा मंचन के दौरान प्रतिनिधि अल्ट्रासाउंड छवियां। एमनियोटिक और एक्सोसेलोमिक गुहाएं बन गई हैं और एमनियन द्वारा अलग की जाती हैं। एक्टोप्लासेंटल शंकु मुख्य रक्त की आपूर्ति के रूप में कार्य करता है और अल्ट्रासाउंड में एक उज्ज्वल स्थान के रूप में दिखाई देता है। एसी एक्टोप्लासेंटल शंकु से सबसे अधिक डिस्टल है। (ई) आदर्श आकार के एसी एक्सोसेलोमिक गुहा से बड़े दिखाई देते हैं, जबकि मध्यम आकार के गुहा छोटे (एफ) दिखाई देते हैं। यदि कोई गुहा दिखाई नहीं दे रही है (जी), तो इसका मतलब है कि या तो भ्रूण पुनर्जीवित हो गया है या अभी तक ई 7.5 तक नहीं पहुंचा है। स्केल बार = 1 मिमी संक्षिप्त नाम: ए = एमनियन; एसी = एमनियोटिक गुहा; एक्ससी = एक्सोसेलोमिक गुहा; ईसी = एक्टोप्लासेंटल शंकु। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

5. इंजेक्शन का दिन: सर्जरी के लिए बीएसएल 2 बेंच तैयार करें

  1. लोचदार झिल्ली के एक टुकड़े को गोल में गोंद करें, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध, संशोधित पेट्री डिश का केंद्रीय उद्घाटन। सुनिश्चित करें कि झिल्ली रिसाव को रोकने के लिए पेट्री डिश से अच्छी तरह से जुड़ी हुई है।
    नोट: यदि पकवान टपका हुआ हो जाता है या अच्छी तरह से चिपका हुआ नहीं है, तो लोचदार झिल्ली के किनारों को डक्ट टेप के साथ आगे सुरक्षित किया जा सकता है।
  2. लोचदार झिल्ली के केंद्र में 1-1.5 सेमी लंबा चीरा बनाएं।
  3. अल्ट्रासाउंड मशीन, बीएसएल 2 बेंच, हीटिंग प्लेट, आइसोफ्लूरेन पंप के लिए ओ2 आपूर्ति, और ग्लास बीड स्टेरिलाइज़र (300 डिग्री सेल्सियस पर सेट) पर स्विच करें।
  4. बीएसएल 2 बेंच के अंदर, एक खाली अपशिष्ट बैग रखें (आसान पहुंच के लिए अंदर की दीवार पर टेप किया गया); बाँझ पैक कपास झाड़ू (प्रत्येक सर्जरी / प्रत्येक महिला के लिए एक नया उपयोग करें); सर्जिकल उपकरण (कैंची, चिमटी, क्लिप, सिवनी), और सर्जिकल टेप; कमरे के तापमान फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) की एक पूरी बोतल, अपशिष्ट संग्रह के लिए एक खाली बोतल, और एक 25 एमएल पिपेट; सर्जरी के लिए लोचदार झिल्ली के साथ एक पेट्री डिश; पानी की एक बूंद के साथ ढक्कन के लिए सुरक्षित पैराफिल्म के 2 एक्स 2-3 x 3 सेमी टुकड़े के साथ पेट्री डिश का ढक्कन; मॉडलिंग मिट्टी: 4 बड़ी गेंदों या क्यूब्स (~ 3 एक्स 3 एक्स 3 सेमी 3) और एक बेलनाकार टुकड़ा (~ 4 x 1 सेमी); किग्रा शरीर के वजन) और आंखों के जेलनोट के साथ एक सिरिंज: मॉडलिंग मिट्टी की गेंदें (या क्यूब्स) पेट्री डिश के लिए "पैर" या स्टैंड / धारकों के रूप में काम करेंगी एक बार पकवान महिला के पेट के ऊपर रखा जाता है। मिट्टी का बेलनाकार टुकड़ा पकवान के अंदर भ्रूण को सुरक्षित करता है। यदि एक से अधिक समाधान इंजेक्ट किए जाते हैं, या इंजेक्शन के दौरान सुई को फिर से भरने की आवश्यकता होती है, तो पैराफिल्म के एक ही टुकड़े का उपयोग किया जा सकता है यदि समाधान को अलग किया जा सकता है।

6. सुई लोड हो रहा है

  1. बेहतर पकड़ के लिए टिशू पेपर के साथ किसी भी अतिरिक्त खनिज तेल को पोंछ लें।
    नोट: क्षति या चोट को रोकने के लिए हमेशा टिप से दूर साफ करें।
  2. सुनिश्चित करें कि सभी घटकों (एक सीलिंग ओ-रिंग, एक स्पेसर, और एक फ्रंट गैस्केट-सभी कोलेट, चित्रा 3 ए के नीचे रखा गया है) सही अभिविन्यास (चित्रा 3 बी, दृश्य के लिए कोलेट हटा दिया गया) में स्थापित किया गया है ताकि केशिका सुई को जगह में रखा जा सके और एक एयरटाइट कनेक्शन बनाया जा सके, सुई के अंदर धातु सवार को आगे बढ़ाने या वापस लेने पर बुलबुला गठन से परहेज किया जा सके।
  3. सुनिश्चित करें कि नैनोइंजेक्टर का धातु प्लंजर पूरी तरह से वापस ले लिया गया है। भरण दबाकर सत्यापित करें और एक डबल बीप की प्रतीक्षा करें जो इंगित करता है कि प्लंजर पूरी तरह से वापस ले लिया गया है।
  4. कोलेट संलग्न लेकिन थोड़ा ढीला (45-90 डिग्री) के साथ, धातु सवार पर कांच की सुई स्लाइड करें और सामने गैसकेट के माध्यम से धातु सवार के साथ केशिका सुई को धक्का दें जब तक कि यह स्पेसर तक नहीं पहुंच जाता (चित्रा 3 सी, डी, दृश्य के लिए हटा दिया गया कोलेट)।
    नोट: कुछ प्रतिरोध तब दिखाई देता है जब सवार गैस्केट से गुजरता है और स्पेसर तक पहुंचने पर कम हो जाता है। सुनिश्चित करें कि केशिका सुई दृढ़ता से एक एयरटाइट कनेक्शन (चित्रा 3 डी) बनाने के लिए स्पेसर में डाली जाती है।
  5. नैनोइंजेक्टर के कोलेट को कसकर सुई को सुरक्षित करें (सुरक्षित रूप से वापस पेंच करें)।
    नोट: ओवरटाइट न करें क्योंकि यह सुई को कुचल सकता है।
  6. सुई में सवार को धक्का देने के लिए खाली दबाएं और सुई टिप से तेल को निष्कासित करें। यदि ग्लास सुई चलती है, तो सवार को वापस लें, सुई को हटा दें, और फिर से लोड करें। यदि यह हवा के बुलबुले बनाने का कारण बनता है, तो सुई को हटा दें और खनिज तेल के साथ फिर से भरें।
    नोट: एक ठीक से सुरक्षित सुई सवार के साथ स्थानांतरित नहीं करना चाहिए।
  7. पैराफिल्म1 (चित्रा 3 ई) के एक टुकड़े पर वायरस (~ 6 μL) या अन्य इंजेक्शन समाधान की एक बूंद रखें; इवांस ब्लू डाई का उपयोग विज़ुअलाइज़ेशन उद्देश्यों के लिए किया जाता है)।
    नोट: नैनोइंजेक्टर की अधिकतम मात्रा ~ 5 μL है।
  8. तेल और समाधान (चित्रा 3 एफ) के बीच एक विभाजक के रूप में सेवा करने के लिए एक हवा का बुलबुला बनाने के लिए भरें दबाएं।
    नोट: सुई को भरने या खाली करते समय यह एक पोजिशनिंग मार्कर के रूप में भी कार्य करता है।
  9. सुई को कम करें, टिप को समाधान में विसर्जित करें, और भरण (चित्रा 3 एफ, जी) दबाएं।
  10. हवा के बुलबुले के बाद समाधान लोड किया जाता है के रूप में तरल पदार्थ के स्तर को देखो। यदि सुई में प्रवेश करने वाले तरल पदार्थ के बिना हवा का बुलबुला लम्बा हो जाता है तो भरण को दबाकर क्लॉग और पुनः लोड करने के लिए खाली धक्का दें। यदि यह समस्या का समाधान नहीं करता है, तो सुई बदलें।
  11. जब सुई पूरी तरह से लोड हो जाती है (चित्रा 3 एच), जेड-प्लेन में सुई उठाएं, और सुई टिप पर समाधान के वाष्पीकरण और सुई के क्लॉगिंग को रोकने के लिए टिप पर हवा की एक छोटी मात्रा की आकांक्षा करें।
  12. किसी भी आकस्मिक क्षति या चोट को रोकने के लिए, बेंच के पीछे की ओर, ऑपरेटर से दूर संलग्न सुई के साथ नैनोइंजेक्टर को चालू करें।

Figure 3
चित्रा 3: नैनोइंजेक्टर और समाधान लोडिंग के लिए सुई संलग्न करना। (ए) नैनोइंजेक्टर पर सुई लगाए जाने से पहले शुरुआती स्थिति: धातु सवार पूरी तरह से वापस ले लिया गया और कोलेट संलग्न किया गया। (बी) कोलेट के तहत, सुई को पकड़ने और सुरक्षित करने के लिए सभी तीन घटकों को सही क्रम में दिखाया गया है (बाएं से दाएं): ओ-रिंग (पतली और काली), स्पेसर (सफेद), ओ-रिंग (ब्लैक) को बड़े छेद के साथ सील करना (सुई को गुजरना चाहिए)। एक एयरटाइट कनेक्शन सुनिश्चित करने के लिए, ग्लास सुई को धातु प्लंजर (सी) पर फिसल दिया जाता है और सामने ओ-रिंग के उद्घाटन के माध्यम से धक्का दिया जाता है जब तक कि यह स्पेसर (डी) तक नहीं पहुंच जाता। (ई-एच) सुई में समाधान की लोडिंग। (ई) समाधान की एक बूंद प्लेट ढक्कन पर पैराफिल्म के एक टुकड़े पर रखी जाती है। (एफ) समाधान लोड करने से पहले भरें दबाकर एक हवा का बुलबुला बनाएं और समाधान में सुई टिप को विसर्जित करें। (जी) समाधान सुई में लोड हो रहा है। (एच) समाधान सुई में लोड किया जाता है। नोट: कोलेट को विज़ुअलाइज़ेशन के लिए (बी-डी) में हटा दिया गया है लेकिन प्रयोगों के दौरान संलग्न रहना चाहिए। सुई को सुरक्षित करने का अंतिम चरण कोलेट को कस रहा है। इवांस ब्लू डाई का उपयोग ई-एच में विज़ुअलाइज़ेशन के लिए किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

7. इंजेक्शन

नोट: इस प्रक्रिया में उपयोग किए जाने वाले सभी उपकरणों को सर्जरी से पहले और प्रत्येक माउस के बीच निष्फल किया जाता है।

  1. आदर्श आकार के गुहाओं के साथ पहली महिला को संवेदनाहारी करें (अनुभाग 4 देखें)।
  2. टेबल पर महिला को रखें और ठीक करें, जैसा कि चरण 3.1-3.6 में वर्णित है।
  3. कॉर्नियल डिसिकेशन को रोकने के लिए आंखों पर आई जेल लागू करें और दर्द निवारक चमड़े के नीचे इंजेक्ट करें।
    नोट: अनुशंसित एनाल्जेसिक: स्थानीय पशु कल्याण नियमों के अनुसार बुप्रेनोर्फिन (0.05-0.1 मिलीग्राम / किग्रा शरीर का वजन) या फ्लूनिक्सिन (2.5 मिलीग्राम / किग्रा) या इसी तरह। मल्टीमॉडल पेरिऑपरेटिव एनाल्जेसिया को इंजेक्शन एनाल्जेसिक और आइसोफ्लूरेन के साथ बनाए रखा जाता है।
  4. एमएल क्लोरहेक्सिडीन समाधान (या इसी तरह) के साथ भिगोए गए कपड़े से पोंछकर पेट के निचले हिस्से को तैयार करें और त्वचा को सूखा दें। निचले पेट में 1.5-2.0 सेमी ऊर्ध्वाधर मिडलाइन त्वचा चीरा बनाने के लिए सर्जिकल कैंची का उपयोग करें।
    नोट: स्थानीय रूप से अनुमोदित कीटाणुशोधन दिनचर्या के बाद सर्जिकल क्षेत्र तैयार करें।
  5. त्वचा को धीरे से उठाएं और सर्जरी के बाद टांके लगाने की सुविधा के लिए चीरा बिंदु के चारों ओर लगभग 1 सेमी, अंतर्निहित मांसपेशियों की परत से त्वचा को मुक्त करें।
  6. मांसपेशियों की परत में 1 सेमी ऊर्ध्वाधर मिडलाइन चीरा बनाएं।
  7. संदंश की एक जोड़ी के साथ, त्वचा और मांसपेशियों की परत के एक तरफ लिफ्ट और दूसरी जोड़ी के साथ, गर्भाशय सींग के लिए देखो।
    नोट: निर्णायक एक हार पर मोती की तरह व्यवस्थित कर रहे हैं, जबकि आंत एक लंबी, निरंतर ट्यूब (चित्रा 4 ए) है।
  8. संदंश के साथ, ध्यान से पेट से दोनों गर्भाशय सींग बाहर खींचो। भ्रूण के बीच ऊतक पकड़ो; सीधे उन्हें निचोड़ना नहीं है (चित्रा 4 बी)।
    नोट: गर्भाशय गर्भाशय ग्रीवा में शरीर से जुड़ा होता है, और दो अंडाशय / अंडाशय स्नायुबंधन के माध्यम से जुड़े होते हैं। गर्भाशय को इन लंगर बिंदुओं से खींचें /
  9. गिनती करें और बाईं और दाईं ओर भ्रूण की संख्या का एक नोट बनाएं।
  10. भ्रूण को अंडाशय से गर्भाशय ग्रीवा तक या गर्भाशय ग्रीवा से अंडाशय तक की संख्या दें।
    नोट: यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है अगर इंजेक्शन भ्रूण भ्रूण चरणों में एकत्र किया जाएगा।
  11. एक नम कपास झाड़ू के साथ, धीरे-धीरे सभी भ्रूणों को पेट की गुहा में वापस धकेलें, इंजेक्शन लगाने वाले पहले तीन को छोड़कर।
  12. पेट्री डिश में लोचदार पर पीबीएस की एक बूंद रखें और इसे भ्रूण के ठीक ऊपर रखें।
  13. लोचदार के चीरा में बंद संदंश डालें और लोचदार चीरा खोलने के लिए संदंश जारी तो तरल भ्रूण पर गिर जाता है।
    नोट: यह भ्रूण के पुनर्जलीकरण को सुनिश्चित करता है और लोचदार झिल्ली महिला की गीली त्वचा का पालन करती है, अगले चरणों में पीबीएस के रिसाव को रोकती है।
  14. गर्भाशय के एक खंड को खींचें, तीन भ्रूणों के अनुरूप, संदंश के साथ लोचदार के माध्यम से, और धीरे-धीरे मादा के पेट पर पेट्री डिश को पर्च करें।
  15. संदंश और एक नम कपास झाड़ू के साथ, गर्भाशय की स्थिति और लोचदार को समायोजित करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि पीबीएस रिसाव को रोकने के लिए लोचदार महिला की त्वचा पर सील कर दिया गया है।
  16. पेट के ठीक ऊपर पेट्री डिश को सुरक्षित और जकड़ने के लिए चार मिट्टी के पैरों का उपयोग करें, महिला पर दबाव कम करें और महिला की श्वास और दिल की धड़कन के लिए इमेजिंग की संवेदनशीलता को कम करें।
  17. गर्भाशय (चित्रा 4 सी) को ठीक करने के लिए भ्रूण/गर्भाशय के दाईं ओर मॉडलिंग मिट्टी सिलेंडर दबाएं।
    नोट: यह अभिविन्यास निर्देश मानता है कि सुई मादा के बाईं ओर है और यह कि मादा के बाएं गर्भाशय सींग के भ्रूण उजागर होते हैं। गर्भाशय का किनारा (बाएं या दाएं गर्भाशय सींग) महत्वपूर्ण है क्योंकि एसी या तो सुई (बाएं सींग) का सामना करता है; चित्रा 4 डी) या स्थिर मिट्टी सिलेंडर (सही सींग) का सामना करना पड़ता है; चित्रा 4 ई)।
  18. सही गर्भाशय सींग से भ्रूण इंजेक्ट करने के लिए, भ्रूण (चित्रा 4 एफ) के बाईं ओर मिट्टी सिलेंडर जगह और सही अभिविन्यास प्राप्त करने के लिए हीटिंग तालिका 180 ° (चित्रा 4 जी) बारी। यदि सुई को इसके बजाय ले जाया जा सकता है, तो प्रासंगिक सेटअप के लिए उपयुक्त के रूप में अनुकूलित करें।
  19. पेट्री डिश में पीबीएस जोड़ें जब तक कि भ्रूण और गर्भाशय पीबीएस के साथ कवर न हो जाए।
  20. पीबीएस में अल्ट्रासाउंड जांच को कम करें और माउस /सर्जिकल टेबल को समायोजित करें ताकि पहला भ्रूण इंजेक्शन की रिकॉर्डिंग की सुविधा के लिए अल्ट्रासाउंड जांच के साथ गठबंधन किया जा सके।
    नोट: "पहला" अंडाशय से गर्भाशय ग्रीवा तक भ्रूण की संख्या को संदर्भित करता है।
  21. सभी तीन भ्रूणों के माध्यम से स्कैन करें और एसी का निरीक्षण करें। निम्नानुसार इंजेक्शन की मात्रा निर्धारित करें:
    1. अल्ट्रासाउंड मशीन से एसी के व्यास को मापें। एसी व्यास ≤0.2 मिमी है, तो 69 एनएल इंजेक्ट करें; यदि एसी व्यास >0.2 मिमी और ≤0.29 मिमी है, तो 2 एक्स 69 एनएल (= 138 एनएल) इंजेक्ट करें; और 3 x 69 एनएल (= 207 एनएल) इंजेक्ट करें यदि एसी व्यास 0.29 मिमी (चित्रा 4 एच) >।
      नोट: पिछले प्रयोगों से पता चला है कि 207 एनएल इंजेक्शन वॉल्यूम तक ई 7.515 पर अच्छी तरह से सहन किया जाता है। जीवित रहने पर न्यूनतम प्रभाव के साथ सफल इंजेक्शन तब प्राप्त किए जाते हैं जब एसी की सापेक्ष मात्रा में वृद्धि 90% 15 से अधिक नहीं होती है। लिटरमेट्स या माउस उपभेदों के बीच एसी आकार में भिन्नता आम है और आगे अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है।
  22. इंजेक्शन नियंत्रक के साथ इंजेक्शन वॉल्यूम सेट करें।
  23. एस की इंजेक्शन दर के साथ इंजेक्शन की गति को धीमा करने के लिए सेट करें।
    नोट: विभिन्न उपकरण मॉडल विभिन्न इंजेक्शन बलों में परिणाम कर सकते हैं।
  24. रेल प्रणाली (एक्स- और जेड-प्लेन, चित्रा 4 आई) पर मुख्य पहियों का उपयोग करके पीबीएस में सुई को कम करें और नैनोइंजेक्टर नियंत्रक पर खाली दबाएं जब तक कि तरल सुई टिप तक न पहुंच जाए।
    नोट: यदि सुई भरी हुई है, तो खाली दबाने से क्लॉग भंग हो सकता है और /
  25. पीबीएस से सुई को उठाएं और इंजेक्ट दबाएं। सत्यापित करें कि अनुमानित वांछित वॉल्यूम की एक बूंद छुट्टी दे दी गई है।
  26. पीबीएस में सुई को कम करें और माइक्रोमैनिपुलेटर (चित्रा 4 जे) पर वाई-प्लेन व्हील के साथ नैनोइंजेक्टर को स्थानांतरित करके अल्ट्रासाउंड जांच और भ्रूण के साथ संरेखित करें।
    नोट: सुई टिप पूरी तरह से गठबंधन है जब यह अल्ट्रासाउंड छवि (चित्रा 4K, एल) पर एक उज्ज्वल स्थान के रूप में प्रकट होता है। सुई को माइक्रोमैनिपुलेटर के साथ दिशा के सभी तीन विमानों में ले जाया जा सकता है।
  27. गर्भाशय की दीवार के सापेक्ष इंजेक्शन के निकट-लंबवत कोण सुनिश्चित करने के लिए इंजेक्शन कोण पहिया के साथ सुई कोण समायोजित करें। माइक्रोमैनिपुलेटर (चित्रा 4 जे-एम) पर इंजेक्शन व्हील का उपयोग करके एक गति में एसी में सुई डालें। सुई टिप चमक पर नजर रखें। यदि सुई टिप अल्ट्रासाउंड छवि से गायब हो जाती है, तो सुई को फोकस में वापस लाने के लिए अल्ट्रासाउंड जांच को आगे या पीछे ले जाएं।
    नोट: एक बार सुई एसी के अंदर है, सुई की स्थिति और ध्यान केंद्रित करने के लिए मामूली संशोधन भ्रूण (~ 0.3 मिमी के भीतर समायोजन) नुकसान पहुंचाए बिना किया जा सकता है। इससे ज्यादा सुई की स्थिति को समायोजित न करें।
  28. प्रेस इंजेक्ट (207 एनएल के लिए, वॉल्यूम को 69 एनएल पर सेट करें और तीन बार इंजेक्ट करें)। इंजेक्शन के बाद, एक कोमल आंदोलन में सुई को वापस लेने से पहले अतिरिक्त 5-10 एस की प्रतीक्षा करें।

Figure 4
चित्रा 4: सफल इंजेक्शन के लिए एमनियोटिक गुहा का इष्टतम आकार और अभिविन्यास( ए) बड़ी आंत (शीर्ष) की तुलना में गोले (नीचे) की एक स्ट्रिंग के आकार के कई ई 7.5 निर्णायक के साथ गर्भाशय सींग। (बी) निर्णायक के बीच गर्भाशय ऊतक (सफेद बिंदीदार रेखाएं) को समझें। संदंश के साथ सीधे निर्णायक (सफेद तीरहेड्स) को निचोड़ने से बचें क्योंकि निर्णायक और विकासशील भ्रूण इस प्रारंभिक चरण में नाजुक होते हैं और अत्यधिक बाहरी बल पर पुनरुत्थान के लिए प्रवण होते हैं। (सी) पीबीएस से भरे पेट्री डिश में उजागर निर्णायक के साथ लापरवाह स्थिति में महिला और मॉडलिंग मिट्टी के चार फीट पर घुड़सवार। निर्णायकों को मॉडलिंग मिट्टी के एक अतिरिक्त टुकड़े द्वारा स्थिर किया जाता है, जो सिलेंडर के आकार का होता है। (डी, ई) एसी का अभिविन्यास गर्भाशय के सींग के किनारे से प्रभावित होता है जो उजागर होता है। यदि बाएं गर्भाशय सींग से निर्णायक का उपयोग किया जाता है, तो एसी मिट्टी स्टेबलाइजर से दूर का सामना करेगा और बाईं ओर सुई (डी) के लिए आसानी से सुलभ होगा। हालांकि, यदि सही गर्भाशय सींग का उपयोग किया जाता है, तो अस्थाई शंकु इसके बजाय सुई का सामना करेगा, जिससे एसी (ई) तक पहुंचना अधिक कठिन हो जाएगा। इसलिए, जब सही गर्भाशय सींग में इंजेक्शन लगाया जाता है, तो मिट्टी स्टेबलाइज़र को सुई का सामना करने वाली तरफ (एफ) की ओर रखा जाता है, और पूरे हीटिंग टेबल को 180 ° (जी) घुमाया जाता है। (एच) एसी आकार के अनुसार इंजेक्शन की मात्रा की सिफारिश की। सामान्य तौर पर, 0.2 मिमी ≤ व्यास वाले गुहाओं को अधिकतम 69 एनएल के साथ इंजेक्ट किया जा सकता है। व्यास 0.2 मिमी और ≤ 0.29 मिमी सहन मात्रा > 2 x 69 एनएल (138 एनएल) और 0.29 मिमी > गुहाओं को 3 एक्स 69 एनएल (207 एनएल) के साथ इंजेक्ट किया जा सकता है। स्केल बार = 1 मिमी (आई, जे) नैनोइंजेक्टर रेल प्रणाली से जुड़ा हुआ है और इसे एक्स- और / या जेड-प्लेन में ले जाया जा सकता है। सुई के कोण को इंजेक्शन कोण पहिया के साथ समायोजित किया जा सकता है। (के, एल) अल्ट्रासाउंड (एल) में सबसे चमकीले दिखाई देने पर सुई टिप (सफेद तीरहेड) एसी के साथ संरेखित होती है। (एम) अल्ट्रासाउंड छवि इंजेक्शन प्रक्रिया दिखा रही है, जिसमें सुई टिप एसी में है और अच्छी तरह से गठबंधन (सफेद तीरहेड)। संक्षिप्त नाम: ए = एमनियन; एसी = एमनियोटिक गुहा; एक्ससी = एक्सोसेलोमिक गुहा; ईसी = एक्टोप्लासेंटल शंकु। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. अगले भ्रूण के लिए चरण ले जाएँ और अन्य दो भ्रूण के लिए कदम 7.22-7.26 दोहराने अगर वे उपयुक्त एसी आकार है।
  2. माइक्रोमैनिपुलेटर का उपयोग करके पीबीएस से अल्ट्रासाउंड जांच और सुई को उठाएं। क्षति और चोट से बचने के लिए सुई को ऑपरेटर से दूर करें।
  3. संदंश के साथ, धीरे लोचदार के माध्यम से उन्हें धक्का देकर मादा के पेट मेंवापस 1 और 2 भ्रूण निर्देशित। धीरेसे 3 भ्रूण से सटे ऊतक को समझें और गर्भाशय को लोचदार चीरा के ऊपरी छोर की ओर खींचें। धीरे संदंश के साथ 4वें -6 भ्रूण खींचोऔर 3 भ्रूण पेट में फिर से प्रवेश करने के लिए अनुमति देते हैं।
    नोट: यह चरण पीबीएस को बदलने या पेट्री डिश को हटाने के बिना किया जा सकता है।
  4. आवश्यकतानुसार दोहराएं जब तक कि इष्टतम एसी वाले सभी भ्रूणों को इंजेक्शन नहीं दिया जाता है या समय सीमा तक नहीं पहुंच जाता है।
  5. धीरे-धीरे भ्रूण/गर्भाशय को मादा के पेट में वापस धकेलें।
  6. पीबीएस की आकांक्षा करें और पेट्री डिश को हटा दें। यदि किसी वायरस का उपयोग किया गया है, तो संक्रामक अपशिष्ट के रूप में संभालें।
  7. सरल निरंतर या बाधित टांके में विक्रिल (यूएसपी 6-0, सुई की लंबाई 13 मिमी, 3/8 सर्कल) के साथ मांसपेशियों की परत को एक साथ सीवे करें और त्वचा को 1-2 क्लिप के साथ बंद करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  8. आइसोफ्लूरेन पंप बंद करें।
  9. सर्जिकल टेप निकालें और 40 डिग्री सेल्सियस हीटिंग प्लेट पर एक साफ पिंजरे में प्रवण स्थिति (पेट नीचे) में महिला रखें।
    नोट: महिला को चेतना हासिल करने और 10 मिनट के भीतर मोबाइल होने की उम्मीद है। सुनिश्चित करें कि प्रक्रिया 30 मिनट के भीतर पूरी हो गई है। मादा की आनुवंशिक पृष्ठभूमि, आयु और वजन संज्ञाहरण के प्रति संवेदनशीलता को प्रभावित कर सकता है। धीमी गति से सांस लेने के संकेतों के लिए सर्जरी के दौरान चूहों की निगरानी करें (धीमी गति से सांस लेने का मतलब है कि संज्ञाहरण बहुत गहरा है) या आंदोलन (संज्ञाहरण बहुत हल्का है)। किग्रा शरीर का वजन) या फ्लूनिक्सिन (2.5 मिलीग्राम / किग्रा) या स्थानीय पशु कल्याण नियमों के अनुसार इसी तरह, यदि आवश्यक हो तो पहले इंजेक्शन के 8 घंटे बाद प्रदान किया जा सकता है।
  10. यदि किसी अन्य महिला को इंजेक्शन दिया जाना है, तो पहले के जागरण की निगरानी करते हुए सर्जिकल क्षेत्र तैयार करें।
    1. किसी भी अवशिष्ट रक्त या ऊतक को हटाने के लिए 70% इथेनॉल के साथ सर्जिकल उपकरण पोंछें और उन्हें 10 एस के लिए पहले से गरम ग्लास मनका अजीवाणु बनानेवाला पदार्थ में निष्फल करें। कॉटन स्वैब और इस्तेमाल किए गए टिशू पेपर को त्याग दें। पेट्री डिश और मिट्टी के टुकड़ों को टिशू पेपर से सूखा पोंछ लें।
  11. सभी महिलाओं को इंजेक्शन दिए जाने तक चरण 7.1-7.35 दोहराएं।
  12. खाली करें और सुई को त्याग दें।
    1. यदि सुई में वायरस या इंजेक्शन समाधान बचा है, तो नैनोइंजेक्टर पर खाली दबाएं और टिशू पेपर पर सुई की सामग्री को खाली करें।
    2. नियंत्रक से डबल-बीप होने तक फिल दबाकर धातु सवार को पूरी तरह से वापस लें, जो इंगित करता है कि प्लंजर पूरी तरह से वापस ले लिया गया है।
    3. कोलेट को ढीला करें और धातु प्लंजर से सुई को स्लाइड करें। सुई को शार्प अपशिष्ट कंटेनर में त्यागें।
  13. बीएसएल -2 बेंच को साफ करें।
    1. यदि एक वायरस का उपयोग किया गया था, तो पूरे सर्जिकल क्षेत्र को कीटाणुनाशक के साथ स्प्रे करें ( सामग्री की तालिका देखें)। 15 मिनट के बाद, कीटाणुनाशक को मिटा दें और 70% इथेनॉल के साथ पूरे सर्जिकल क्षेत्र को साफ करें। यदि कोई वायरस का उपयोग नहीं किया गया था, तो 70% इथेनॉल के साथ सभी सतहों को साफ करें।
    2. सूखे, मुलायम और लिंट-मुक्त टिशू पेपर के साथ अल्ट्रासाउंड जांच से किसी भी शेष पीबीएस को मिटा दें।
  14. जैव सुरक्षा दिशानिर्देशों के अनुसार अपशिष्ट को त्यागें।
  15. अल्ट्रासाउंड मशीन, हीटिंग टेबल, बीएसएल 2 बेंच और ओ2 आपूर्ति बंद करें।

Representative Results

एचपीजीके-एच 2 बी-जीएफपी लेंटीवायरस11,12 के साथ ई 7.5 पर इंजेक्ट किए गए भ्रूण ई 13.5 पर एकत्र किए गए थे और फ्लोरोसेंट विच्छेदन माइक्रोस्कोप (चित्रा 5 ए) के तहत जांच की गई थी। तंत्रिका प्लेट के सफल पारगमन के परिणामस्वरूप मस्तिष्क में मुख्य रूप से और अन्य एक्टोडर्म-व्युत्पन्न ऊतकों में फ्लोरोसेंट रिपोर्टर की मजबूत अभिव्यक्ति के साथ भ्रूण होते हैं, उदाहरण के लिए, त्वचा (चित्रा 5 ए, बी)। अत्यधिक उच्च मात्रा का इंजेक्शन (यहां अनुशंसित वॉल्यूम से अधिक, उदाहरण के लिए, ≥500 एनएल) एसी में दबाव बढ़ाता है और इसके परिणामस्वरूप या तो पूर्ण अवशोषण (डेटा नहीं दिखाया गया है) या तंत्रिका ट्यूब दोष जैसे एक्सेन्सेफली (चित्रा 5 ए)। ई 7.5 पर सफल इंजेक्शन के परिणामस्वरूप अग्रमस्तिष्क से हिंडब्रेन (चित्रा 5 सी-जे) तक समान पारगमन होता है।

लेंटिवायरल टाइटर्स लगभग 2 ×10 10 संक्रामक इकाइयां (आईएफयू) 95% से अधिक लक्ष्यीकरण प्राप्त करती हैं, जबकि ~ 1 × 10 9 आईएफयूके टाइटर्स 15% लक्ष्यीकरण दक्षता15 प्राप्त करते हैं। इसके अलावा, संरचनाएं जो पहले इलेक्ट्रोपोरेशन का उपयोग करके लक्षित करना मुश्किल रही हैं, जैसे कि कोरॉइड प्लेक्सस17,18, को भी लक्षित किया जाता है (चित्रा 5 ई, एफ)। कम टिटर के इंजेक्शन एकल-कोशिका क्लोन (चित्रा 5 सी, चित्रा 5 ई, और चित्रा 5 जी, एच) के पारगमन में परिणाम देते हैं, जबकि उच्च टिटर वायरस का उपयोग पूरे मस्तिष्क का लगभग 100% ट्रांसड्यूस करता है (चित्रा 5 डी, चित्रा 5 एफ, चित्रा 5 एच, और चित्रा 5 जे) ). इसलिए, नेपच्यून का उपयोग या तो क्लोनल ट्रांसडक्शन, वंश अनुरेखण और आनुवंशिक स्क्रीनिंग दृष्टिकोण या पूरे मस्तिष्क में जीन ओवरएक्सप्रेशन या डाउनरेगुलेशन के वैश्विक प्रभावों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।

स्तनधारी आंखों का विकास भ्रूण एक्टोडर्म के तीन डेरिवेटिव के बीच अच्छी तरह से संगठित संचार का परिणाम है: तंत्रिका रेटिना (एनआर) और रेटिना वर्णक उपकला (आरपीई) उदर अग्रमस्तिष्क के न्यूरोएपिथेलियम से प्राप्त होते हैं, जबकि सतह एक्टोडर्म भविष्य के लेंस और कॉर्नियल उपकला को जन्म देता है। हालांकि, केंद्रीय स्ट्रोमा और पीछे एंडोथेलियम, कॉर्निया की अन्य दो परतें, पेरियोकुलर मेसेनकाइम19,20 की तंत्रिका शिखा कोशिकाओं से प्राप्त होती हैं। ई 13.5 भ्रूण के माध्यम से कोरोनल वर्गों, उच्च टिटर लेंटीवायरस के साथ ई 7.5 पर इंजेक्ट किया गया, मस्तिष्क के समान, आंख के तंत्रिका ऊतक के उच्च और समान पारगमन, साथ ही लेंस, कॉर्निया और मेसेनकाइम (चित्रा 5 के)। जैसे-जैसे न्यूरुलेशन आगे बढ़ता है, ई 8.5 और ई 9.5 पर इंजेक्शन लेंस और कॉर्नियल उपकला (चित्रा 5 एल और चित्रा 5 एन) के निरंतर लक्ष्यीकरण के परिणामस्वरूप होता है, जबकि आंख के न्यूरोक्टोडर्म-व्युत्पन्न ऊतकों का पारगमन ई 8.5 (चित्रा 5 एल, एम) पर कम कुशल होता है या ई 9.5 (चित्रा 5 एन) पर लक्षित नहीं होता है।

जबकि अधिकांश वायरल कण इंजेक्शन पर उजागर ऊतकों को संक्रमित करते हैं, कुछ कण गैर-एक्टोडर्मल व्युत्पन्न ऊतकों को स्थानांतरित करते हैं जो बाद में विकसित होते हैं (चित्रा 6 ए)। लार ग्रंथियां और नलिकाएं मौखिक उपकला21 से ई 11.5 के आसपास विकसित होती हैं और एनईपीटीयूएन (चित्रा 6 बी) के साथ लक्षित होती हैं। ई 9.5 में इंजेक्शन के बाद, जीभ का लिंगुअल उपकला अच्छी तरह से ट्रांसड्यूस किया जाता है; हालांकि, अंतर्निहित मेसेनकाइम नकारात्मक है (चित्रा 6 सी; कोष्ठक ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं को दर्शाते हैं; तारांकन ऑटोफ्लोरेसेंस सिग्नल को दर्शाते हैं न कि ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाएं)। इसके अलावा, लिंगुअल उपकला के भीतर सकारात्मक क्लस्टर हैं, जो नकारात्मक वर्गों (चित्रा 6 सी, सफेद तीरहेड्स) द्वारा अलग किए गए हैं, जो पैपिला सतह के पारगमन का सुझाव देते हैं। तंत्रिका शिखा कोशिकाओं को अंतर्निहित जीभ मेसेनकाइम और लिंगुअल उपकला के भीतर वर्णित किया गया है, जहां वे स्वाद पैपिला और स्वाद कलियों के विकास में शामिल हैं22. दरअसल, ई 7.5 पर इंजेक्शन के परिणामस्वरूप ई 13.5 (चित्रा 6 डी) में जीभ मेसेनकाइम का व्यापक पारगमन होता है, यह सुझाव देते हुए कि शुरुआती इंजेक्शन तंत्रिका शिखा कोशिकाओं को लक्षित करते हैं, जीभ में मेसेनकाइम में योगदान करते हैं।

कशेरुकियों में, पृष्ठीय रूट गैन्ग्लिया (डीआरजी) परिधीय तंत्रिका तंत्र (पीएनएस) का एक केंद्रीय घटक है, क्योंकि शरीर की परिधि (तापमान, दर्द, दबाव) से सभी सोमाटोसेंसरी इनपुट डीआरजी न्यूरॉन्स23 के सक्रियण के माध्यम से मस्तिष्क में प्रेषित होते हैं। डीआरजी के न्यूरॉन्स और ग्लियाल कोशिकाएं दोनों ट्रंक तंत्रिका शिखा कोशिकाओंसे प्राप्त होती हैं 24. लेंटिवायरल इंजेक्शन, जिसमें सर्वव्यापी एचपीजीके प्रमोटर फ्लोरोसेंट रिपोर्टर की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है, केंद्रीय और परिधीय तंत्रिका तंत्र (चित्रा 7 ए) के व्यापक लक्ष्यीकरण की ओर जाता है, रीढ़ की हड्डी (चित्रा 7 बी) में न्यूरॉन्स और पूर्वजों दोनों को स्थानांतरित करता है, साथ ही साथ डीआरजी (चित्रा 7 सी)। डबलकोर्टिन25 के लिए मिनीप्रोटर का उपयोग करने से जीएफपी अभिव्यक्ति को केवल न्यूरॉन्स (15 और चित्रा 7 डी, ई) तक सीमित करना संभव हो जाता है।

Figure 5
चित्रा 5: नेपच्यून के साथ उच्च दक्षता या क्लोनल पारगमन। (ए) मानक प्रकाश (बाएं पैनल) और जीएफपी (दाएं पैनल) के लिए रोशन एक ही भ्रूण के साथ रोशन एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत ई 13.5 भ्रूण। दूर बाईं ओर इंजेक्शन भ्रूण, सफलतापूर्वक दूर दाईं ओर भ्रूण इंजेक्शन, मस्तिष्क (दाएं भ्रूण) में सकारात्मक संकेत उपज। इंजेक्शन (मध्य भ्रूण) अतिरिक्त मात्रा के कारण एक्सेन्सेफेलिक भ्रूण। (बी) ई 7.5 इंजेक्शन के साथ त्वचा और मस्तिष्क लक्ष्यीकरण। स्केल बार = 50 μm. (सी, डी) कम क्लोनल ट्रांसडक्शन (सी) या उच्च दक्षता पारगमन (डी) के साथ अग्रमस्तिष्क की ई 13.5 कंफोकल छवियां। (सी, ई, जी, आई) मस्तिष्क में विभिन्न क्षेत्रों का क्लोनल पारगमन। (डी, एफ, एच, जे) मस्तिष्क में विभिन्न क्षेत्रों की उच्च दक्षता पारगमन। स्केल सलाखों = 200 μm. विभिन्न पारगमन प्रभाव सीएनएस के अन्य क्षेत्रों के प्रतिनिधि हैं। (ई, एफ) कोरॉइड प्लेक्सस लक्ष्यीकरण, क्लोनली (ई) या उच्च दक्षता (एफ) के साथ। स्केल बार = 200 μm. (जी, एच) क्लोनल लक्ष्यीकरण (जी) और उच्च दक्षता (एच) हिंडब्रेन का लक्ष्यीकरण, (आई, जे) में बढ़ाया गया। स्केल सलाखों = 200 μm. (के) ई 7.5 (एल, एम) पर गर्भाशय इंजेक्शन में ई 15.5 पर आंखों में जीएफपी रिपोर्टर अभिव्यक्ति ई 8.5 (एल) पर गर्भाशय इंजेक्शन के बाद ई 13.5 पर आंखों में जीएफपी रिपोर्टर अभिव्यक्ति, बॉक्सिंग क्षेत्र (एम), या ई 9.5 (एन) में बढ़ाया गया। ऑटोफ्लोरोसेंट रक्त वाहिकाओं को सफेद सितारों के साथ चिह्नित किया जाता है। स्केल सलाखों = 100 μm. संक्षिप्त नाम: नेप्च्यून = नेयूरल पी देर से गर्भाशय में आर्गेटिंग एनएनो-इंजईसीशन; सी = कॉर्निया; ले = लेंस उपकला; एलएफ = लेंस फाइबर; एम = मेसेनकाइम; एनआर = तंत्रिका रेटिना; ओएन = ऑप्टिक तंत्रिका; आरपीई = रेटिना वर्णक उपकला; जीएफपी = ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन; सीएनएस = केंद्रीय तंत्रिका तंत्र। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। 

Figure 6
चित्रा 6: गैर-तंत्रिका ऊतकों के गर्भाशय पारगमन में । (ए) ई 15.5 मौखिक गुहा की कॉन्फोकल छवि। भ्रूण को ई 9.5 पर फ्लोरोसेंट रिपोर्टर लेंटिवायरस के साथ इंजेक्ट किया गया था। स्केल बार = 200 μm. (बी, सी) (बी) इनसेट पैनल का आवर्धन; लार वाहिनी उपकला वायरस के साथ ट्रांसड्यूस किया गया। (सी) इनसेट पैनल का आवर्धन; जीएफपी रिपोर्टर वायरस (सफेद ब्रैकेट) के साथ ट्रांसड्यूस किए गए पृष्ठीय भाषाई उपकला। तंत्रिका शिखा कोशिकाओं से प्राप्त अंतर्निहित मेसेनकाइम नकारात्मक है। सफेद तीरहेड्स वायरस-ट्रांसड्यूस्ड उपकला कोशिकाओं से घिरे नकारात्मक तंत्रिका शिखा कोशिकाओं के साथ पैपिला का संकेत देते हैं (ऑटोफ्लोरोसेंट रक्त कोशिकाओं / वाहिकाओं को सफेद सितारों के साथ चिह्नित किया जाता है)। स्केल सलाखों = 50 μm. (डी) ई 7.5 पर फ्लोरोसेंट रिपोर्टर वायरस के साथ इंजेक्शन के बाद E13.5 जीभ मेसेनकाइम की योजनाबद्ध और कॉन्फोकल छवि। स्केल बार = 50 μm. संक्षिप्त नाम: डी = पृष्ठीय; एम = मेसेनकाइम; एन = नासोफेरिंक्स; एसएलडी = सबलिंगुअल डक्ट; एसएमडी = सबमैंडिबुलर डक्ट; टी = जीभ; वी = वेंट्रल; जीएफपी = ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7: तंत्रिका शिखा-व्युत्पन्न पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं का पारगमन( ए) ई 7.5 पर नेपच्यून लक्ष्यीकरण सीएनएस और पीएनएस दोनों को लक्षित करने की अनुमति देता है। (बी) ई 7.5 पर एचपीजीके-एच 2 बी-जीएफपी रिपोर्टर लेंटिवायरस के साथ इंजेक्ट किए गए ई 13.5 रीढ़ की हड्डी और डीआरजी की कॉन्फोकल छवि एसओएक्स 2 + तंत्रिका पूर्वजों और न्यून + न्यूरॉन्स दोनों के पारगमन को दर्शाती है। स्केल बार = 100 μm. (सी) बी का बॉक्सिंग क्षेत्र एसओएक्स 2 + (सफेद तीर) और न्यून + (सफेद तीरहेड्स) सेल आबादी में जीएफपी अभिव्यक्ति के साथ डीआरजी दिखा रहा है। (डी) ई 13.5 रीढ़ की हड्डी और डीआरजी की कॉन्फोकल छवि ई 7.5 पर डीसीएक्स-एच 2 बी-जीएफपी लेंटिवायरस के साथ इंजेक्ट की गई, केवल डीसीएक्स + कोशिकाओं को लक्षित करती है। स्केल बार = 100 μm. (ई) डीसीएक्स + न्यूरॉन्स (सफेद तीरहेड्स) तक सीमित जीएफपी अभिव्यक्ति के साथ डीआरजी दिखा डी का बॉक्सिंग क्षेत्र। डीसीएक्स- कोशिकाएं जीएफपी (सफेद तीर) के लिए नकारात्मक हैं। स्केल बार = 20 μm। संक्षिप्त नाम: नेप्च्यून = नेयूरल पी देर से गर्भाशय में आर्गेटिंग एनएनो-इंजईसीशन; सीएनएस = केंद्रीय तंत्रिका तंत्र; पीएनएस = परिधीय तंत्रिका तंत्र; डीआरजी = पृष्ठीय रूट गैन्ग्लिया; जीएफपी = ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

भ्रूण के अस्तित्व, इंजेक्शन की गुणवत्ता और रीडआउट को प्रभावित करने वाले इस प्रोटोकॉल में कई चरण हैं। भ्रूण की गर्भकालीन आयु को रात भर संभोग के बाद योनि प्लग के दिन दोपहर में ई 0.5 के रूप में परिभाषित किया गया है। देर दोपहर / शाम को ई 6.5 पर गर्भावस्था के लिए अल्ट्रासाउंड जांच करना सुनिश्चित करता है कि भ्रूण अल्ट्रासाउंड द्वारा पहचाने जाने के लिए पर्याप्त विकसित हैं। चेक (1) प्रीस्क्रीनिंग के लिए अनुमति देता है कि कितने प्लग पॉजिटिव चूहे वास्तव में गर्भवती हैं, (2) यह सुनिश्चित करता है कि प्लग पॉजिटिव चूहों के गर्भवती नहीं होने की स्थिति में कोई वायरस अनावश्यक रूप से पिघला हुआ और बर्बाद न हो, और (3) चूहों पर अनावश्यक हस्तक्षेप को कम करता है (गैर-गर्भवती महिलाओं पर सर्जरी से बचा जाता है)।

ई 7.5 पर, भ्रूण बाहरी बलों के प्रति संवेदनशील होते हैं और देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, गर्भाशय के सींगों को खींचने या निर्णायकों को निचोड़ने से भ्रूण पुनरुत्थान हो सकता है। ऊतक को सूखने से रोकने के लिए महिला पेट के बाहर गर्भाशय के ऊतकों को हमेशा नम रखना चाहिए। अधिकांश निर्णायक महिला पेट के अंदर रहना चाहिए, इंजेक्शन के लिए केवल 3-4 उजागर होना चाहिए। सुई तीखापन सफल इंजेक्शन के लिए एक और महत्वपूर्ण निर्धारक है। कुंद या टूटी हुई सुई युक्तियों के परिणामस्वरूप एसी में प्रवेश करने से पहले मॉडलिंग मिट्टी के खिलाफ निर्णायक या संपीड़न की बार-बार पोकिंग होती है, जो अवशोषण दर को बढ़ा सकती है। इसलिए, अच्छी तरह से जमीन और तेज सुइयों को हमेशा सुरक्षित रूप से संग्रहीत किया जाना चाहिए और अधिकतम 2 महिलाओं के बाद प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए।

यह प्रोटोकॉल बताता है कि लेंटिवायरस के एक इंजेक्शन के साथ तंत्रिका प्लेट को कैसे लक्षित किया जाए। इसके अलावा, यह दिखाता है कि पारगमन प्रभावकारिता को एकल-कोशिका क्लोन से पूरे मस्तिष्क में कैसे अनुकूलित किया जा सकता है। हालांकि, त्वचा और मौखिक उपकला सहित अन्य गैर-तंत्रिका ऊतकों को भी लक्षित किया जाता है। इसके अलावा, सभी सेल प्रकार (पूर्वजों और विभेदित कोशिकाओं) को ट्रांसड्यूस किया जाता है, जिससे यह दृष्टिकोण कुशल लेकिन निरर्थक हो जाता है। वायरल निर्माण में मिनीप्रमोटर्स का उपयोग न्यूरॉन्स या एस्ट्रोसाइट्स15 में ट्रांसजीन की विशिष्ट अभिव्यक्ति की ओर जाता है। इसमें समर्पित ट्रांसजेनिक क्रे जानवरों के उपयोग से बचने का लाभ है और इसलिए श्रम की मात्रा (तनाव रखरखाव और जीनोटाइपिंग) और लागत कम हो जाती है।

नेपच्यून की सीमाओं में इसकी तकनीकी कठिनाई, गर्भवती महिलाओं को अनुमानित और सुसंगत दर पर प्राप्त करने में चुनौतियां और विशेष इंस्ट्रूमेंटेशन प्राप्त करने की लागत शामिल है। इसके अलावा, लेंटीवायरस द्वारा कोशिकाओं के गैर-चयनात्मक लक्ष्यीकरण को तकनीक के लाभ और सीमा दोनों के रूप में देखा जा सकता है। एसी में बड़ी मात्रा के इंजेक्शन के परिणामस्वरूप एक्सेन्सेफली13 होता है, हालांकि मस्तिष्क विकृतियों और एक्सेन्सेफली को यहां वर्णित संस्करणों के साथ बचा जाता है15. मस्तिष्क के विकास पर एक नकारात्मक प्रभाव इस प्रकार गर्भाशय नैनो-इंजेक्शन के साथ एक जोखिम है जिसे भ्रूण चरण और एसी आकार के अनुकूल सही मात्रा में इंजेक्शन लगाकर सावधानीपूर्वक बचा जाना चाहिए।

तकनीक के भविष्य के अनुकूलन वायरल ट्रोपिज्म पर ध्यान केंद्रित कर सकते हैं। एडेनो से जुड़े वायरस (एएवी) में अलग-अलग सीरोटाइप होते हैं, जिन्हें सीएनएस17,26 में विभिन्न सेल प्रकारों को मजबूती से लक्षित करने के लिए दिखाया गया है। हालांकि, एएवी मेजबान सेल जीनोम में एकीकृत नहीं होते हैं और इसलिए उच्च विभाजन दर वाली कोशिकाओं में खो सकते हैं। यद्यपि नेपच्यून की विशिष्टता को बढ़ाने के कई तरीके हैं, ट्रांसजेनिक जानवर अभी भी सोने के मानक हैं जब विवो में जीन हेरफेर की बात आती है। कैस 9 चूहों और एसजीआरएनए-एन्कोडिंग लेंटीवायरस का उपयोग भ्रूण एपिडर्मिस27 में आनुवंशिक स्क्रीनिंग के लिए किया गया है और इसे विकासशील सीएनएस के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है।

ई 7.5 पर एसी में इंजेक्शन कुशलतापूर्वक न्यूरुलेशन की दीक्षा से पहले न्यूरोक्टोडर्म की कोशिकाओं को लक्षित करते हैं और गर्भाशय इलेक्ट्रोपोरेशन की तुलना में विकासशील मस्तिष्क को अधिक कुशलता से लक्षित करते हैं। यह पहले के समय बिंदु से मस्तिष्क के विकास के लिए महत्वपूर्ण आनुवंशिक संकेतों के अध्ययन की अनुमति देता है। शास्त्रीय आनुवंशिक माउस मॉडल के विपरीत, नेपच्यून कार्यात्मक जीन विश्लेषण करने के लिए एक लचीला दृष्टिकोण प्रदान करता है। ओवरएक्सप्रेशन या जीन विलोपन के बाद फेनोटाइप का अध्ययन महीनों या वर्षों की तुलना में दिनों से हफ्तों के भीतर किया जा सकता है। कई वायरल निर्माणों के इंजेक्शन एक भ्रूण के भीतर कई जीनों के हेरफेर की अनुमति देते हैं और डबल या ट्रिपल नॉकआउट जानवरों की पीढ़ी से बचते हैं। इसलिए, नेपच्यून न केवल समय बचाता है बल्कि अनुसंधान में उपयोग किए जाने वाले जानवरों की संख्या को भी कम कर सकता है।

Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

हम चूहों की विशेषज्ञ देखभाल के लिए बेटिना सेम्श और जिया सन (इनफिनिजीन) को धन्यवाद देते हैं; छवि अधिग्रहण और परामर्श के साथ सहायता के लिए बायोमेडिकम इमेजिंग कोर (बीआईसी) से फ्लोरियन सैलोमोन और गोरान मानसन। फंडिंग: हम इस परियोजना के समर्थन के लिए निम्नलिखित फंडर्स को धन्यवाद देते हैं: स्वीडिश रिसर्च काउंसिल, कैरोलिंस्का इंस्टीट्यूट (केआई फाउंडेशन, कैरियर डेवलपमेंट ग्रांट, पीएचडी छात्र किड फंडिंग, और एसएफओ स्ट्रैटन्यूरो फंडिंग, सेंटर ऑफ इनोवेटिव मेडिसिन), ओली और एलोफ एरिक्सन फाउंडेशन, टॉर्नस्पिरन फाउंडेशन, जीन्सन फाउंडेशन, स्वेन और एब्बा-क्रिस्टीना हैगबर्ग पुरस्कार और अनुसंधान अनुदान, नट और एलिस वालेनबर्ग प्रोजेक्ट ग्रांट, फ्रेड्रिक और इंग्रिड थुरिंग्स फाउंडेशन, लार्स हायरटास मिने, द चाइल्डहुड कैंसर फाउंडेशन (बार्नकैंसरफोंडेन), द अहलेन फाउंडेशन, एके विबर्ग्स फाउंडेशन, टोर निल्सन फाउंडेशन, और स्वीडिश फाउंडेशन स्टार्टिंग ग्रांट टू ईआरए। चित्रा 4 डी, ई BioRender.com के साथ बनाया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Syringe BD Bioscience 309628
27 G Needle BD Bioscience 300635
3.5 inches capillaries Drummond Scientific 3000203G/X Were used to pull in house needles
70 MHz MS Series transducer Visual Sonics MS700
Aquasonic clear ultrasound gel Parker Laboratories Mar-50
Autoclip Applier 9 mm Angthos 12020-09
CD1 mice Charles River, Germany Crl:CD1(ICR) Females: from age of 8 weeks old
Males: from the age of 12 weeks old
Cotton Swab OneMed Sverige AB 120788
DPBS Gibco 14190094
Dressing forceps delicate straight 13 cm Agnthos 08-032-130
EG-400 Narishige Micropipette Grinder Narishige NA
EZ clips 9 mm Angthos 59027 clips
Iris Scissors, Super Cut, straight, 9 cm Agnthos 307-336-090
Isofluorane Baxter Medical AB EAN: 50085412586613 Purchased from Swedish Pharmacy
Kimwipes Kimberly Clarke 7557
Membrane Tape Visual Sonics SA-11053
Micropipette Puller Sutter Instrument P-97
Modeling Clay Sense AB 10209
Mouse Handling Table Visual Sonics 50249
Nanoject II Auto Injector Kit Drummond 3-000-205A
Parafilm Bemis HS234526C
Petri dish with central opening (low wall) Visual Sonics SA-11620
Petri dish, (ØxH): 92 x 16 mm Sarstedt 82.1472.001
Rely+On Virkon DuPont 130000132037 disinfectant
Silicone membrane Visual Sonics SA-11054
Steri 250, hot bead sterilizer Angthos 31100
Surgical Tape (1.25 cm x 9.14 m) Medicarrier 67034
Vevo Compact Dual (Med. Air & O2) Anesthesia System Visual Sonics VS-12055
Vevo Imaging Station 2 Visual Sonics VS-11983
Vevo2100 Visual Sonics VS-20047
Vicryl 6-0; C-3 needle, 45 cm purple filament Agnthos J384H

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References

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विकासात्मक जीवविज्ञान अंक 180
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Mangold, K., He, J., Stokman, S., Andersson, E. R. Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) at Embryonic Day 7.5. J. Vis. Exp. (180), e63148, doi:10.3791/63148 (2022).

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