Summary
Denna artikel beskriver ett arbetsflöde av tekniker som används för att testa nya kandidatmedlare av melanommetastaser och deras verkningsmekanismer.
Abstract
Metastasering är en komplex process som kräver att celler övervinner barriärer som endast är ofullständigt modellerade av in vitro-analyser . Ett systematiskt arbetsflöde etablerades med hjälp av robusta, reproducerbara in vivo-modeller och standardiserade metoder för att identifiera nya aktörer inom melanommetastasering. Detta tillvägagångssätt möjliggör datainferens vid specifika experimentella stadier för att exakt karakterisera en gens roll i metastasering. Modeller etableras genom att införa genetiskt modifierade melanomceller via intrakardiella, intradermala eller subkutana injektioner i möss, följt av övervakning med seriell in vivo-avbildning . När företablerade effektmått har uppnåtts skördas och bearbetas primära tumörer och/eller metastasbärande organ för olika analyser. Tumörceller kan sorteras och utsättas för någon av flera "omics" -plattformar, inklusive encellig RNA-sekvensering. Organ genomgår avbildning och immunohistopatologiska analyser för att kvantifiera den totala bördan av metastaser och kartlägga deras specifika anatomiska läge. Denna optimerade pipeline, inklusive standardiserade protokoll för engraftment, övervakning, vävnadsskörd, bearbetning och analys, kan antas för patienthärledda, kortsiktiga kulturer och etablerade humana och murina cellinjer av olika fasta cancertyper.
Introduction
Den höga dödligheten i samband med metastaserande melanom i kombination med en ökande förekomst av melanom över hela världen1 (uppskattningsvis 7,86% ökning fram till 2025) kräver nya behandlingsmetoder. Framsteg inom målupptäckt hänger på reproducerbara modeller av metastasering, en mycket komplex process. Under stegen i den metastatiska kaskaden måste melanomceller övervinna otaliga hinder för att uppnå immunsystemets undvikande och kolonisering av avlägsna vävnader2. Melanomcellernas motståndskraft och anpassningsförmåga härrör från en mängd faktorer, inklusive deras höga genetiska mutationsbörda3 och deras neurala crest ursprung, vilket ger avgörande fenotypisk plasticitet 3,4,5. Vid varje steg tillåter transkriptionsprogram metastaserande melanomceller att växla från ett tillstånd till ett annat baserat på signaler från överhörningen med mikromiljön, bestående av immunsystemet6, den extracellulära miljön 7,8 och den cellulära arkitekturen för fysiska barriärer9 som de kommer i kontakt med. Till exempel undgår melanomceller immunövervakning genom att nedreglera uttrycket av viktiga immunprimande tumörutsöndrade faktorer6.
Studier beskriver en "premetastatisk nisch", där melanomceller utsöndrar kemokiner och cytokiner för att prima det avlägsna "mål" -organet för metastasering10. Dessa fynd väcker viktiga frågor om organtropismen hos metastaserande melanomceller och den anatomiska vägen de tar för att komma åt avlägsna vävnader. Efter intravasering är melanomceller kända för att metastasera genom lymfatik (lymfatisk spridning) och blodkärl (hematogen spridning)2,11. Medan de flesta patienter som uppvisar lokaliserad sjukdom, uppvisar en liten delmängd av fallen avlägsen metastatisk sjukdom och ingen lymfatisk spridning (negativ lymfkörtelinvolvering)11, vilket tyder på förekomsten av alternativa metastatiska vägar för melanom.
När de koloniserar ett metastatiskt stället genomgår melanomceller epigenetiska och metaboliska anpassningar12,13. För att komma åt och invadera nya fack använder melanomceller proteaser14 och cytoskelettmodifieringar 11,15, vilket gör det möjligt för dem att korsa till och växa på sin nya plats. Svårigheten att rikta in sig på melanomceller ligger i komplexiteten och antalet sådana anpassningar; Fältet bör därför anstränga sig för att experimentellt återskapa så många steg och anpassningar som möjligt. Trots många framsteg inom in vitro-analyser som organoider och 3D-kulturer 16,17, sammanfattar dessa modeller endast ofullständigt den in vivo metastatiska kaskaden.
Murinmodeller har visat värde genom att hitta en balans mellan reproducerbarhet, teknisk genomförbarhet och simulering av mänsklig sjukdom. Intravaskulärt, ortotopiskt och heterotopiskt implanterade melanomceller från patienthärledda xenotransplantat eller kortvariga kulturer till immunförsvagade eller humaniserade möss utgör ryggraden i målupptäckten vid metastaserat melanom. Dessa system saknar emellertid ofta en avgörande biologisk begränsning av metastasering: immunsystemet. Syngena melanommetastasmodeller som har denna begränsning är relativt knappa inom området. Dessa system, utvecklade i immunkompetenta möss, inklusive B16-F1018, YUMM-familjen av cellinjer19, SM120, D4M321, RIM322 eller mer nyligen, RMS23 och M1 (Mel114433), M3 (HCmel1274), M4 (B2905) 24 melanomcellinjer, underlättar undersökningen av värdimmunsvarets komplexa roll i melanomprogression.
Här presenteras en pipeline för målidentifiering av melanommetastaser. Med ökande och större "omics" -dataset som genereras från melanompatientkohorter postulerar vi att studier som håller det mest kliniska löftet är de som härrör från stor dataintegration, vilket leder till noggrann funktionell och mekanistisk förhör 25,26,27,28. Genom att använda musmodeller för att studera potentiella mål i den metastatiska processen kan man redogöra för in vivo-specifika händelser och vävnadsinteraktioner, vilket ökar sannolikheten för klinisk översättning. Flera metoder för att kvantifiera metastatisk börda beskrivs, vilket ger kompletterande data om resultaten av ett givet experiment. Ett protokoll för encellsisolering från tumörer i olika organ beskrivs för att underlätta opartisk karakterisering av genuttryck i metastatiska celler, vilket kan föregå encells- eller bulk-RNA-sekvensering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Djurprocedurerna som ingår i följande protokoll godkändes av New York University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Alla procedurer utförs i anläggningar som godkänts av Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC). Figur 1 visar det allmänna experimentella tillvägagångssättet.
1. Patient-härledda melanom kortvariga kulturer (STC)
- Placera vävnaden i en 60 mm petriskål med 1 ml fullständig RPMI (RPMI 1640 kompletterad med 10% fetalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 1x MEM icke-essentiell aminosyralösning och penicillin (100 IE / ml) / streptomycin (100 μg / ml)).
OBS: För att öka förhållandet mellan tumörceller, om det behövs, dissekera och ta bort vävnaden som omger tumören i petriskålen, under ett mikroskop, med hjälp av sterila kirurgiska instrument. - Skär den färska vävnaden fint med steriliserade rakblad i 1-2 mm kuber. Tillsätt 4 ml komplett RPMI och pipettera innehållet i plattan upp och ner 5-10 gånger med en 10 ml serologisk pipett.
- Överför cellsuspensionen till ett 15 ml polypropenkoniskt rör och snurra cellerna nedåt (180 × g i 5 min vid 4 °C). Aspirera supernatanten, återsuspendera cellpelleten i 1 ml färskt medium och överför suspensionen till en 25 cm2 vävnadsodlingskolv.
- För att hjälpa vävnadsfragmenten att fästa vid botten, ställ in kolven lutad i 20 ° -30 ° vinkel i en vävnadsodlingsinkubator vid 37 ° C, 5% CO2 i 20 min.
- Lägg kolven platt så att mediet kan täcka vävnaden och kontrollera kulturens status dagligen. Dela cellerna när de når 90-100% sammanflöde. Behåll kortsiktiga kulturer vid ett "lågt" passagenummer.
OBS: STC kommer att fastställas ungefär 2 månader efter cellisolering och odling, även om den faktiska tidslinjen varierar mellan prover och tumörtyper. Efter 10 till 14 passager når cellinjerna 100% renhet, innehållande endast melanomceller29. Tröskeln för passagenummer bestäms empiriskt genom att observera förändringar i cellmorfologi, fördubblingstid och beteende in vivo. För att bevara heterogenitet och andra egenskaper hos modertumören, dela inte cellerna mer än 1:5. - Vid upprättande av en STC och med någon cellinjemodell som ska injiceras i djur enligt beskrivningen i efterföljande steg, transducera celler med en reporter.
OBS: En fluorescerande tagg (t.ex. rött fluorescerande protein (RFP), grönt fluorescerande protein (GFP)), till exempel, möjliggör ex-vivo immunofluorescensavbildning och sortering av tumörceller genom fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). Luciferas möjliggör in vivo bioluminescensavbildning, ett användbart verktyg för övervakning av experimentell progression (avsnitt 4).
Figur 1: Schematiskt som illustrerar det beskrivna arbetsflödet, från integrering av patientdata till generering och analys av in vivo-data från möss. Förkortningar: LOF = förlust av funktion; GOF = förstärkning av funktion. Klicka här för att se en större version av denna figur.
2. Xenograftimplantation
OBS: De experimentella förfaranden som beskrivs här utförs på möss som har nedsatt adaptiva och medfödda immunförsvar, NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl / SzJ (NSG) möss; eller hos möss som endast saknar adaptiv immunitet, såsom T-cellbrist athymiska / nakna (NU / J) möss. Djur är av manligt kön, 8 till 10 veckors ålder. Kvinnor uppvisar ofta en hög förekomst av gonadala metastaser vid intrakardiell injektion av tumörceller, vilket minskar deras överlevnad.
- För subkutana och intradermala injektioner, förbered en 1:1 cellsuspension genom att blanda en del celler suspenderade i 1x Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS) med en del upptinat extracellulärt matrissubstrat (EMS) och håll isen på 4 °C. För intravaskulära (intrakardiella, intrakardiella, intrakardiella, retro-orbitala, svansven eller mjält) injektioner, suspendera cellerna endast i DPBS.
OBS: Lämplig volym för intradermala injektioner ska hållas så låg som möjligt (30 μL). För subkutana injektioner kan den injicerade volymen gå upp till 150 μL och för intravaskulära injektioner upp till 250 μL (baserat på djurets vikt). Lägg till den slutliga cellsuspensionen 10-30% extra volym injekt, baserat på den injicerade mängden och sprutan som används för att ta hänsyn till den döda volymen inuti glidspetsen och nålens (t.ex. en 1 ml tuberkulinspruta med en 30 G, 25 mm nål har en död volym på 100 μL). - Utför en pilot för att karakterisera beteendet hos de cellinjer som används och tidslinjen för tumörprogression in vivo. För intradermala injektioner, börja med att injicera 1 000 upp till 50 000 celler / 30 μL. För subkutana injektioner, börja med att injicera 10 000 upp till 2 × 106 celler/150 μL. För intravaskulära (intrakardiella, intrakardiella, intrakardiella, retroorbitala och mjälta) injektioner, börja med att injicera 50 000 celler / 150 μL.
OBS: Intravaskulära injektioner predisponerar djuren för emboliska händelser, antingen genom att införa luft i cirkulationssystemet eller genom att använda ett alltför stort antal celler som täcker de små kärlen. Blanda cellsuspensionen väl för att undvika klumpning. Fyll sprutan innan du laddar cellsuspensionen. Ta bort eventuella luftbubblor inuti sprutan. Håll cellsuspensionen/sprutorna på is tills laddnings- och injektionstiden. - Administrera anestesi genom inandning. Ställ in syrenivåregulatorn mellan 1-2 L/min. Placera djuret i induktionskammaren med isofluranförångaren inställd på 2,5-5% för induktion och 1,5-3% för underhåll.
OBS: Övervaka djurets andning och hjärtfrekvens i anestesiinduktionsfasen. Lämna inte djuret obevakat. Övervaka inte mer än ett djur samtidigt. Titer mängden anestesi till djurets vikt. - Flytta djuret från induktionskammaren till näskonen. Applicera steril petrolatum oftalmisk salva på djurets ögon för att förhindra hornhinnans torrhet under proceduren.
- Raka procedurstället med ett rakt rakblad lutat i 30 ° vinkel. Rengör huden på procedurområdet med 70% isopropylalkoholpinnar. Innan några ytterligare steg, bedöma för en tillräcklig nivå av anestesi genom pedalreflex.
- För intradermala injektioner, utför hela proceduren inuti ett biosäkerhetsskåp för att upprätthålla aseptiska förhållanden.
- Bedöva och raka djuret enligt beskrivningen i steg 2.3-2.5.
- Ta tag i och dra tillbaka huden bakåt mot nålstickets bana. Använd en 31 G insulinsprutanål, 6 mm lång, hållen i en spetsig vinkel, punktera försiktigt huden med fasningen uppåt.
- Känn tryckutlösningen vid nålens spets. Avancera försiktigt för att stanna inne i det intradermala facket och inte passera genom hela huddjupet in i subcutis. Avgörande: Om man glider in i det subkutana utrymmet, ta bort nålen, byt injektionsområdet och sätt in nålen igen. Injicera hela volymen (30 μL) cellsuspension långsamt tills en kupolformad wheal observeras.
OBS: Låga injektionsvolymer kommer att inducera mindre dissektion av hudlagren och mindre arkitektonisk snedvridning. - Håll nålen i och räkna till 5.
OBS: EMS blir viskös vid kroppstemperatur, vilket hjälper till att undvika återflöde genom nålpunkteringssåret. - Ta bort nålen och enhus djuret i en bur på en varm kudde för att återhämta sig. Återför djuret till vivariumburet efter att ha återfått medvetandet, när det är sternalt och ambulerande.
OBS: Övervaka djuret kontinuerligt under alla förfaranden som beskrivs i detta protokoll. Lämna inte djuret utan uppsikt eller övervaka mer än ett djur samtidigt. - Övervaka utvecklingen av tumörtillväxt, viktminskning och övergripande hälsotillstånd i samarbete med veterinärpersonal dagligen i den inledande tillväxtfasen och mer intensivt, om det behövs, efter att djur börjar gå ner i vikt. Under dessa övervakningssessioner: väga djuren och plotta ett diagram för att övervaka viktminskning och kontrollera om det finns tecken på tumörsår, neurologiska, rörelse- och / eller beteendemässiga tecken (slöhet, brist på grooming, lågt mat- eller vattenintag).
OBS: Avliva djuren omedelbart efter att ha observerat tecken på avancerad sjukdom (mer än 20% viktminskning, en kroppskonditetspoäng på <2, extremt reducerade aktivitetsnivåer, förlamning eller anfall). Använd den avlivningsmetod som godkänts av institutionens IACUC (t.ex. används en automatiseradCO2-kammare på bordsskivan för att utsätta djuren för CO2 i 15 minuter följt av en sekundär metod för avlivning, antingen cervikal förskjutning, halshuggning eller pneumotorax som induceras bilateralt genom att snitta bröstkorgen). - Ta mätningar med bromsok och använd tumörens längd (L) och bredd (W) dimensioner för att beräkna volymen (V) med formeln:
- För subkutana injektioner:
- Utför hela proceduren inuti ett biosäkerhetsskåp för att upprätthålla aseptiska förhållanden26,27.
- Bedöva och raka djuret enligt beskrivningen i steg 2.3-2.5.
- Använd en 28 G till 31 G insulinsprutanål, 6 mm lång, hållen i en spetsig vinkel, punktera försiktigt huden med fasningen uppåt. Känn tryckfrigöringen vid nålens spets två gånger medan du passerar genom epidermis, dermis och hypodermis.
OBS: Andra gången en tryckavlastning känns vid nålens spets indikerar att det subkutana facket har nåtts. - Injicera hela volymen (30-150 μL) cellsuspension långsamt tills en långsträckt ellipsformad wheal observeras. Håll nålen i och räkna till 5. Räkna till 10 för större volymer (mer än 50 μL).
OBS: EMS blir viskös vid kroppstemperatur, vilket hjälper till att undvika återflöde genom nålpunkteringssåret. - Ta bort nålen och enhus djuret i en bur på en varm kudde för att återhämta sig. Återför djuret till sin vivariumbur efter att ha återfått medvetandet, när det är sternalt och ambulatoriskt.
OBS: Under den postprocedurella övervakningen, observera eventuella tecken på komplikationer (låg andningsfrekvens, blödning, långsam återhämtning) och ta itu med dem på lämpligt sätt. Om ingen förbättring observeras, fortsätt till humana eutanasiprocedurer som beskrivs i NOTE i steg 2.6.6. - Övervaka djuret med information om tumörtillväxt, viktminskning och övergripande hälsotillstånd enligt beskrivningen i steg 2.6.6–2.6.7.
- För intrakardiella injektioner:
- Utför hela proceduren inuti ett biosäkerhetsskåp för att upprätthålla aseptiska förhållanden26,30.
- Bedöva djuret enligt beskrivningen i steg 2.3-2.4.
- Överför djuret till ultraljudsmaskinens uppvärmda plattform och säkra det med allergivänlig tejp till näskonen.
- Raka bröstkorgen med ett rakt rakblad lutat i 30° vinkel. Rengör huden i procedurområdet med 3 applikationer av 10% povidon-jod alternerande med 3 applikationer av isopropylalkohol.
- Innan några ytterligare steg, bedöma för en tillräcklig nivå av anestesi genom pedalreflex. Applicera ultraljudsgel på procedurstället.
- Fånga hjärtfönstret med ultraljudssonden. Placera ultraljudssonden i mitten av bröstkorgen på vänster sida av djuret för att fånga ett horisontellt fönster orienterat för att få en tvärsnittsvy (kort axel) av vänster kammare. Se till att sondens långa axel är vänd uppåt, fixera sonden i 50 ° vinkel och den uppvärmda plattformen i 20 ° vinkel. Lås sonden och stödramen på plats.
- Rita upp cellsuspensionen medan du arbetar inuti biosäkerhetsskåpet i en tuberkulin 1 ml spruta med en 30 G, 25 mm nål. Ta bort eventuella luftbubblor i sprutan.
OBS: Det är viktigt att skapa och underhålla en encellssuspension medan celler bearbetas och injiceras. Att ta bort luftbubblor är ett viktigt steg för att undvika luftemboli. Ett välgrundat sprutnålssystem kommer att förhindra undvikbara dödsfall i experimentgruppen. Dra alltid mer volym i sprutan än vad som kommer att injiceras. Den extra volymen hjälper till att ta bort luften genom att injicera en del av cellsuspensionen tillbaka i ett 1,5 ml rör. - Lås sprutan i stereotaktisk injektor. Under ultraljudsvägledning, för nålen genom bröstväggen in i hjärtans vänstra kammare. Injicera hela volymen (100-250 μL) cellsuspension långsamt.
- Ta bort nålen och enhus djuret i en bur på en varm kudde för att återhämta sig. Återför djuret till sin vivariumbur efter att ha återfått medvetandet, när det är sternalt och ambulatoriskt. Övervaka djuret för tumörtillväxt, viktminskning och övergripande hälsotillstånd enligt beskrivningen i steg 2.6.6.
- För intrarakarotid injektioner:
- Utför hela proceduren på en korrekt desinficerad yta för att upprätthålla aseptiska förhållanden30.
- Bedöva djuret med en ketamin (100 mg/kg) och xylazin (10 mg/kg) cocktail genom intraperitoneal injektion med en insulinspruta, 28 G nål. Applicera steril petrolatum oftalmisk salva på djurets ögon för att förhindra hornhinnans torrhet under proceduren.
- Raka procedurområdet med ett rakt rakblad lutat i 30 ° vinkel. Innan några ytterligare steg, bedöma för en tillräcklig nivå av anestesi genom pedalreflex.
- Placera djuret under ett stereomikroskop på en värmeplatta. Rengör huden i procedurområdet med 3 applikationer av 10% povidon-jod alternerande med 3 applikationer av isopropylalkohol.
- Ta på dig steril personlig skyddsutrustning (PPE) och sterila handskar. Förbered det sterila fältet genom att lägga en steril draperi över djurets kropp.
OBS: Om det sterila draperiet inte har ett hål som är lämpligt för snittets storlek och placering, vik draperiet i hälften och använd Metzenbaum-saxen för att klippa hålet i lämplig storlek i mitten av det sterila draperiet. - Använd en skalpell eller Iris sax för att snitta huden från halva nacken ner till bröstbenet. Med två mikrokirurgiska pincett dissekerar du de 2 submandibulära spottkörtlarna i mittlinjeplanet. Använd en elektrisk cautery för hemostas, om det behövs.
- Dissekera fascian som omger den gemensamma halspulsådern (CCA) från manubriet mot bifurkationen och fortsätt medialt att frigöra den bakre väggen i den yttre halspulsådern. Kläm fast den yttre halspulsådern (ECA) tillfälligt innan du injicerar.
OBS: Vid dissekering runt CCA: s omkrets måste man se till att inte skada vagusnerven (ligger i sidled till artären). - Ladda cellsuspensionen i en 1 ml spruta med en 33 G, 15 mm nål.
- Passera två 7-0 ligaturer under CCA och utför en lös instrumentknut för var och en av de två ligaturerna. Använd en tryckkärlsklämma på 5 mm och kläm fast eca tillfälligt. Bind den proximala ligaturen; Bind sedan den distala ligaturen löst (bredvid CCA: s bifurcation). Använd den distala slingan senare för att kontrollera blödningen efter injektionen.
- Använd sprutan med en 33 G, 15 mm nål, punktera försiktigt CCA med nålens fasning uppåt och i en spetsig vinkel. Injicera hela volymen (50-150 μL) cellsuspension långsamt.
- Ta tag i den distala öglan med tången och lyft den medan du tar bort nålen för att täppa till CCA: s lumen och stoppa blödningen. Byt ut sprutan mot en #7 Jewelers tång och bind fast den distala öglan.
- Kasta ytterligare en instrumentknut på den distala ligaturen och ta bort kärklämman från revisionsrätten. Kontrollera det kirurgiska fältet för blödning och cauterize eventuella blödande kärl före stängning. Använd en 9 mm häftanordning för att stänga djurets hud och placera djuret på en varm kudde för att återhämta sig.
OBS: Ta bort häftklamrarna 7-10 dagar efter operationen. - Administrera smärtstillande läkemedel subkutant buprenorfin (0,3 mg / ml) var 12: e timme i 72 timmar efter operationen i en koncentration av 0,1 mg / kg.
OBS: Alternativt kan du överväga att använda en smärtstillande medicin med förlängd frisättning, vilket kräver 1 dos var 72: e timme. - Återför djuret till sin vivariumbur efter att ha återfått medvetandet, när det är sternalt och ambulatoriskt. Övervaka djuren postoperativt dagligen för tecken på kirurgisk platsinfektion eller smärta, allmän hälsotillstånd och komplikationer.
OBS: Djur som inte återhämtar sig väl från överlevnadskirurgi kan ges ytterligare doser smärtstillande läkemedel och kommer att avlivas humant om de inte återhämtar sig helt 72 timmar efter operationen. - Övervaka djuret för tumörtillväxt, viktminskning och övergripande hälsotillstånd enligt beskrivningen i steg 2.6.6.
- För retro-orbital injektioner:
OBS: Använd denna teknik som ett alternativ till injektioner av svansvener när operatören är utbildad och skicklig i denna teknik och när det finns en stark vetenskaplig motivering. Cellsuspensioner som levereras via denna väg kan inducera tumörtillväxt i retro-orbitalutrymmet; Därför bör noggrann hänsyn tas till riskerna och fördelarna när du väljer denna teknik. Till exempel, för att dra nytta av den direkta cirkulationsanslutningen av retro-orbital venös sinus med de intracerebrala venerna via anastomoser, välj denna metod när hjärntumörbildningen har misslyckats med andra injektionsvägar.- Utför hela proceduren inuti ett biosäkerhetsskåp för att upprätthålla aseptiska förhållanden. Don steril PPE och handskar.
- Bedöva djuret enligt beskrivningen i steg 2.3-2.4.
OBS: För denna procedur, applicera inte steril petrolatum oftalmisk salva på djurets ögon eftersom detta kommer att hindra injektion; applicera endast lokalbedövningsdroppar. - Ladda cellsuspensionen i en insulinspruta med en 28-31 G, 6 mm nål.
- Med djuret i benäget läge, dra tillbaka ögonlocken tills ögat sticker ut. Applicera 1 droppe lokalbedövningsmedel i ögat på den sida som genomgår proceduren.
- Sätt in nålen i 30-45° vinkel mellan ögat och den mediala epikantusen med fasningen vänd nedåt. Injicera cellsuspensionen (10-150 μL) långsamt.
OBS: Långsammare rörelser förhindrar skador på ögat och injektets återflöde. - Utför stegen som beskrivs i 2.7.5-2.7.6.
- För mjältinjektioner:
- Utför hela proceduren inuti ett biosäkerhetsskåp för att upprätthålla aseptiska förhållanden31. Don steril PPE och sterila handskar.
- Bedöva och raka djuret enligt beskrivningen i steg 2.3-2.5.
- Placera djuret i ett rätt lateralt liggande läge. Rengör huden i procedurområdet med 3 applikationer av 10% povidon-jod alternerande med 3 applikationer av isopropylalkohol och förbered det kirurgiska fältet enligt beskrivningen i steg 2.9.5.
- Använd Metzenbaum sax eller en skalpell, gör ett 1 cm snitt i vänster flank av bukväggen följt av ett snitt i bukhinnan.
OBS: Mjälten kommer att ses genom den genomskinliga bukväggen efter att ha gjort hudsnittet. Utför peritonealsnittet exakt på denna webbplats. - Exponera mjälten och mjältfästet genom snittet. Använd en 28-31 G insulinsprutanål, 6 mm lång, punktera försiktigt mjälten med nålens fas uppåt och i en spetsig vinkel.
OBS: Om punkteringssåret blöder, cauterize platsen för att begränsa blödning och återflöde. - Injicera hela volymen (50-100 μL) cellsuspension långsamt. Ta bort nålen. Placera en liten gasbindning på mjälten och applicera tryck med en pincett. Kläm mjälten lätt mellan gasbindan med fina myggtångar och vänta i 15 min.
- Utför en splenektomi genom att binda mjältfästet med en 3-0 eller 4-0 silkessutur, cauterizing kärlen om det behövs. Stäng bukhinnan med en 5-0 polydioxanon (PDS) eller polyglykolsyra absorberbar sutur.
- Utför stegen som beskrivs i steg 2.7.5–2.7.6.
OBS: Djur som uppvisar blödningskomplikationer eller som inte har återhämtat sig helt 72 timmar efter operationen bör avlivas humant. Kom ihåg att mössens välbefinnande alltid är prioriterat.
3. Iscensatt överlevnadskirurgi (SSS)
- Baserat på de experimentella slutsatserna från steg 2.2, bestäm rätt tid till överlevnadskirurgi. Beroende på cellinjen och experimentell hypotes, välj en tidigare tidpunkt för tumörresektion (vid en tumörvolym = 150 mm3) eller en senare tidpunkt (vid en tumörvolym = 500 mm3)26.
OBS: Tumörvolymgränsen är 1 500 mm3 när tumörbördan är tillräckligt hög för att vara skadlig för djurets välbefinnande och predisponerar för komplikationer. - Bedöva och raka djuret enligt beskrivningen i steg 2.3-2.5.
OBS: Hela proceduren utförs inuti ett biosäkerhetsskåp. - Rengör huden i procedurområdet med 3 applikationer av 10% povidon-jod alternerande med 3 applikationer av isopropylalkohol och förbered det kirurgiska fältet enligt beskrivningen i steg 2.9.5.
- Använd Iris sax eller en skalpell, snitta huden, behåll en 5-7 mm resektionsmarginal från tumörens kant.
OBS: Marginalen för resektion beror på tumörens förmåga att sprida sig lokalt. För aggressiva tumörer, öka resektionsmarginalen samtidigt som du ser till att tillräckligt med hud finns kvar för att utföra sårförslutningen. - Vid intradermala tumörer, resektera tumören tillsammans med omkretshuden.
- För subkutana tumörer, dissekera och ta bort tumören under huden.
OBS: Om tumören invaderar bukhinnan och / eller huden, resektera den en block med tumören och stäng bukhinnan med 5-0/4-0 PDS eller polyglykolsyra absorberbara suturer. - Stäng såret med 9 mm häftanordningen.
OBS: Ta bort häftklamrarna 7-10 dagar efter operationen. Administrera smärtstillande läkemedel och placera djuret på en varm kudde för att återhämta sig. Fortsätt att administrera smärtstillande läkemedel i 72 timmar efter operationen, en gång var 12: e timme enligt steg 2.9.13. Djur med blödningskomplikationer eller som inte har återfått fullt medvetande efter operationen bör avlivas humant. - Enhus djuret i en bur, på en varm kudde för att återhämta sig. Återför djuret till vivariumburet efter att ha återfått medvetandet, när det är sternalt och ambulerande.
- Fortsätt att övervaka djuret efter operationen för lokala återfall, viktminskning, neurologiska, lokomotoriska och / eller beteendemässiga tecken (slöhet, brist på grooming, lågt mat- eller vattenintag) och övergripande hälsotillstånd.
4. In vivo-avbildning (figur 2A)
- Administrera D-luciferinsubstrat (150 mg/kg) till djur genom intraperitoneal injektion med en 1 ml insulinspruta, 28 G nål.
OBS: Tumörceller måste transduceras stabilt med luciferas cDNA. - Inducera anestesi enligt beskrivningen i steg 2.3-2.4, 6 min efter injektionen av D-luciferinsubstrat.
- Utföra avbildning med hjälp av en BLI-skanner (bioluminescensavbildning) (in vivo-bildsystem )26.
- Flytta djuret inuti bildkammaren och in i näskonen. Avbilda upp till 5 djur samtidigt, beroende på bildsystemets kapacitet.
- Starta instrumentet genom att trycka på initialisera. Ställ in inställningen för exponeringstid på auto (1–120 s).
- Ta en tom bild för att subtrahera eventuell bakgrund om det behövs. Klicka på Hämta och spara bilden när förvärvssekvensen har slutförts.
- Placera djuret tillbaka i en bur, som sitter med 50% av basytan över en uppvärmningsdyna för att återhämta sig från anestesi. Återför djuret till vivariumburet efter att ha återfått medvetandet, när det är sternalt och ambulerande.
- För dataanalys i samma in vivo-bildprogramvara som bilderna togs med, navigera till mappen där bilderna sparas och öppna bilderna av alla möss som rör experimentet på en gång.
OBS: Analys av en bild i taget tillåter inte normalisering mellan grupper. - Ställ in enheterna på utstrålning (inte antal). Se till att kryssrutan som anger individ är avmarkerad, eftersom detta utesluter normalisering av signal mellan grupper.
- Använd ritverktyget Region of Interest (ROI) och rita cirkulära ROI för hjärnregionen och rektangulära ROI för kroppen. Var försiktig med att utesluta öronen och näsan från hjärnans avkastning, eftersom de tenderar att avge ospecifik luminescens. För att minimera bias i denna process, rita ROI endast på fotografierna av mössen, utan att den självlysande signalen är överlagrad.
- Välj Mät ROI:er för att kvantifiera signalen och exportera data till ett kalkylblad. Analysera skillnader mellan grupper genom att plotta totalt självlysande flöde (p /sek/cm2/sr) i kroppsregioner av intresse.
OBS: För att bedöma skillnader mellan grupper i hjärntropism specifikt, beräkna förhållandet mellan hjärnsignalen och kroppssignalen för varje mus. Detta kontrollerar för intermouse variation i total tumörbörda och skillnader i nivåer av luciferasuttryck mellan experimentella grupper.
5. Ex vivo magnetisk resonanstomografi
- Utför ex vivo MR omedelbart efter eutanasi. Alternativt kan du skörda organen av intresse, fixa dem i formalin i upp till 72 timmar och utföra avbildningen vid en senare tidpunkt.
- Ta bilderna med ett 7-Tesla (7-T) (300 MHz) mikro-MRI-system utrustat med en NMR-konsol och en nollkokningsmagnet, horisontell borrmagnet eller liknande utrustning.
OBS: Behovet av en aktivt skärmad gradientspolinsats med rätt avvägning av prestanda är avgörande. Den ska ha en gradientlinjäritet på minst 50 mm dynamisk sfärisk volym (DSV) för att täcka den uppsättning prover som undersöks samtidigt utan geometrisk förvrängning. Kombinationen av gradientstyrka (från 440 till 750 mT/m) och arbetscykel som möjliggör maximal samtidig likström från 3 x 30 A till 3 x 87 A möjliggör adekvat bildprestanda. Den lutningsspole som används (se materialförteckningen) möjliggör följande prestanda: 660 mT/m, 130 μs stigningstid, 3 x 87 A och en DSV = 80 mm. - Utför skanningarna med en kommersiell sändningsmottagare cirkulärt polariserad radiofrekvensspole för hela muskroppen (OD = 59 mm, ID = 38 mm, L = 40 mm) inställd på 300,16 MHz, 1H proton Larmor-frekvensen.
OBS: Denna rf-sond möjliggör förvärv av 3D-dataset med submillimetrisk isotrop upplösning (<150 μm) under skanningar över natten som sträcker sig över 8-12 timmar. - Upptäck tumörbördan med hjälp av flera sekvenser30.
OBS: Hyperintense-signal detekterad av en T 2-viktad, Rapid Imaging with Refocus Echoes (RARE) -sekvens känner igen ödem som omger tumörer. - Utför 3D RARE-sekvensen med följande förvärvsparametrar: [120 μm]3 isotrop upplösning; förvärvstid 5 h, 27 min; repetitionstid (TR) = 500 ms; ekoavstånd (ES) = 12,7 min; Turbofaktor TFx = 12; effektiv ekotid (TEeff) = 76,2 ms; bandbredd (BW) = 75 KHz; Matrisstorlek = 2843; synfält (FOV) = [4,0 mm]3; antal medelvärden (Nav) = 6.
- Identifiera metastaser med hjälp av följande parametrar.
- För pigmenterade metastaser med signalljusning, använd en T1-vägd 3D Gradient ekosekvens med följande parametrar: [120 μm]3 isotrop upplösning; förvärvstid 2 h, 41 min; TR = 20 ms; ekotid (TE) = 4,0 ms; vänd vinkel (FA) = 18 °; BW = 75 KHz; Matrisstorlek = 2843; FOV = [34,0 mm]3; Nav = 6.
- För opigmenterade och/eller hemorragiska metastaser, använd en hypunktssignal när du förvärvar under en T2*-viktad, multigradient ekosekvens (MGE) (3D MGE, [120 μm]3 isotrop upplösning; förvärvstid 3 h, 35 min; TR = 40 ms; TE = 3,6 ms; ES = 3,2 ms; 4 ekon; FA = 20°; BW = 100 kHz; Matrisstorlek = 2843; FOV = (34,0 mm)3; Nav = 4.
- Använd alla 3 sekvenser för att kvantifiera tumörbördan.
- Korsreferera de tumörområden som identifierats under analysen med histologiska sektioner för att säkerställa noggrannhet. Se avsnitt 7 och 8.
6. Vävnadsbehandling för encells- eller bulk-RNA-sekvensering
- Avliva djuret genom att använda någon metod som godkänts av institutionens IACUC. Se ett av de förfaranden som beskrivs i ANMÄRKNINGen i steg 2.6.6.
- Dissekera de intressanta organen och placera dem i separata brunnar på en platta som innehåller Hanks balanserade saltlösning (HBSS) på is. Arbeta snabbt och håll vävnaden på is hela tiden för att maximera cellens livskraft.
OBS: Följande steg är specifika för hjärnbearbetning. Justera kollagenastypen till den specifika vävnaden, baserat på dina behov. - Förbered en 6-brunnsplatta med 3 ml HBSS i varje brunn.
- För att visualisera och ytterligare hjälpa till att styra dissektionen, använd ett fluorescensmikroskop och identifiera de märkta områdena.
- Dissekera de fluorescerande områdena och placera vävnadsfragmenten i 6-brunnsplattan (1 fragment per brunn om enskilda metastatiska foci ska analyseras eller flera fragment från ett organ om flera metastaser i samma organ ska analyseras). Använd sterila rakblad för att hacka vävnaden i fragment så små som möjligt (utan att spendera mer än 1-2 minuter på detta steg för varje prov).
OBS: Att begränsa tumörernas behandlingstid hjälper till att bevara cellens livskraft. - Aspirera och överför innehållet i varje brunn till ett 15 ml koniskt rör.
OBS: Skär spetsen på en 1000 μL pipettspets för att underlätta överföringen av större fragment. - Tillsätt 1 ml HBSS till brunnen och se till att de återstående vävnadsfragmenten / cellerna överförs till 15 ml-röret, som kommer att innehålla en slutlig volym på 4 ml. Tillsätt 50 μL kollagenas typ I (40 mg/ml) och 12,5 μL DNas I (2 000 enheter/ml) till varje rör.
- Placera de koniska rören i ett vattenbad som värms upp vid 37 ° C i 45 minuter. Virvla kort de koniska rören var 5: e minut.
- Förvät en 70 μm sil med HBSS. Använd den täckta änden av ett steriliserat mikrocentrifugrör eller plastdelen av en sprutkolv och slipa vävnadshomogenaten genom en 70 μm sil till ett nytt 50 ml koniskt rör.
OBS: Förvätning av silarna med HBSS- eller FACS-buffert underlättar töjning. - Tvätta silen med 1 ml HBSS. Förvät en 40 μm sil med HBSS. Filtrera varje prov igen genom en 40μm sil i ett nytt 50 ml koniskt rör. Tillsätt 1 ml FBS till silen på 40 μm för att tvätta den. Håll de koniska rören på is hela tiden.
- Fyll upp det koniska röret till 50 ml med iskall DPBS. Snurra ner cellerna (180 × g i 10 min vid 4 °C). Kassera supernatanten, var försiktig så att du inte tappar cellpelleten.
OBS: För hjärnprover, återsuspendera cellerna i 2,5 ml 38% densitetsseparationslösning (späd i HBSS och förvara vid rumstemperatur (RT)). Överför till 5 ml FACS-rör. Snurra i 20 min vid 800 × g. Skär spetsen på en 1000 μL pipettspets och ta bort det övre fettlagret. Lämna inget fett på rörens väggar. Om något fett finns kvar, snurra ner igen och upprepa processen. Detta är ett kritiskt steg. Ta bort resten av vätskefasen (pelletsen blir genomskinlig och svår att visualisera). - Resuspendera cellerna i 1 ml röda blodkroppar (RBC) lysbuffert och inkubera i 60 s vid RT. Släck lyslösningen genom att tillsätta 20 ml DPBS.
- Snurra ner cellerna vid 180 × g i 10 min vid 4 °C. Ta bort supernatanten och återsuspendera cellerna i 2 ml FACS-buffert (5% FBS i DPBS).
- Fortsätt med sortering av märkta celler och / eller biblioteksberedning för antingen bulk- eller encells-RNA-sekvensering.
OBS: Celler kan snurras ner, snäppfrysas och förvaras vid -80 ° C före RNA-isolering för bulk-RNA-seq.
7. Perfusion av djurvävnad och beredning för immunohistologiska analyser
- Bedöva djuret med en överdos av ketamin (300 mg/kg) och xylazin (30 mg/kg) cocktail genom intraperitoneal injektion med en insulinspruta och en 28 G nål.
- Exponera hjärtat genom grov dissektion och gör ett snitt i höger atrium. Håll hjärtat försiktigt på plats med långa, böjda pincett vända framåt.
OBS: Formalin och paraformaldehyd (PFA) är cancerframkallande. Läs säkerhetsdatabladet (SDS), undvik exponering för rök och använd lämplig personlig skyddsutrustning. - Använd en 10 ml spruta med en 22 G, 22 mm nål, injicera 10 ml DPBS följt av 10 ml 4% PFA i vänster kammare.
- Fortsätt att skörda organen och ladda dem i förmärkta histologiska kassetter. Placera kassetterna i en behållare av lämplig storlek som rymmer tillräckligt med fixeringsmedel (formalin) för att täcka vävnaderna.
OBS: Helst bör den fixerande volymen vara 5-10 gånger vävnadens volym. - Fixa organen inuti de histologiska kassetterna i 10% formalin i 48-72 timmar. Kassera 10% formalin och tvätta kassetterna två gånger med 1x DPBS.
- Börja uttorkningsprocessen genom att nedsänka kassetterna i 70% etanol i 2 timmar. Fortsätt att fördjupa kassetterna successivt i ökande etanolkoncentrationer: 80%, 95%, 100% i 1 timme vardera. Byt 100% lösning två gånger efter 1,5 timmar. Sänk ner kassetterna i xylen i 1,5 timmar och utför tre förändringar av lösningen.
- Bädda in kassetterna i paraffinvax vid 58-60 °C. Avsnitt paraffinblocken. Fortsätt till hematoxylin och eosin (H & E) orimmunohistokemi färgning.
- För att identifiera melanomceller, använd någon av dessa markörer eller en panel: S100, Melan-A, HMB-45, Tyrosinas, MITF. När det är möjligt, använd Nuclear Mitotic Apparatus Protein (NuMA) färgning eftersom det är en mycket specifik mänsklig cellmarkör.
OBS: NuMA-färgning erbjuder en skarp avgränsning mellan värd (mus) och inympade celler (människa) som hjälper till med bildbehandling och efterföljande tumörkvantifieringssteg.
Figur 2: Exempel på BLI-, ljusfälts-, ex vivo-fluorescens - och H&E-färgningsbilder som illustrerar det mångsidiga tillvägagångssättet för analys av kandidatgenernas effekter vid melanommetastas. (A) BLI, (B) BF, (C) ex vivo fluorescens och (D) H&E färgningsbilder. Bilderna som används för illustrationsändamål motsvarar ett experiment där 131/6-4L melanomceller transducerade med ett icke-riktat kontroll-shRNA (shNTC) eller ett shRNA som riktar sig mot FUT8 injicerades i immunbrist (NSG) möss. FUT8-tystnad försämrade den metastatiska spridningen av melanomceller. Skalstänger och färgfält = p/sek/cm2/sr × 106 (A), 100 mm (B, C), 100 μm (D). Förkortningar: BLI = bioluminescensavbildning; H&E = hematoxylin och eosin; shRNA = kort hårnål RNA; shNTC = icke-målinriktad kontroll shRNA; NSG = icke-överviktig diabetiker svår kombinerad immunbrist gamma; FUT8 = fukosyltransferas 8; BF = ljusfält. Klicka här för att se en större version av denna figur.
8. Färgning av nukleär mitotisk apparatprotein (NuMA) (figur 3)
- Använd en anti-NuMA-antikropp som en mycket humanspecifik mitotisk spindelmarkör för identifiering och kvantifiering av metastatisk börda i vävnadssektioner. 8.1 Mycket specifik och känslig identifiering av melanomceller uppnås.
- Om kromogen immunohistokemi för NuMA utförs på ett automatiskt immunfärgningsinstrument, följ dessa steg enligt beskrivningen32:
- Deparaffinisera sektionerna i xylen och rehydrera dem i sekventiellt minskande etanolkoncentrationer. Håll bilderna nedsänkta i 15 min i xylen och överför dem till 100% etanol i ytterligare 15 min.
OBS: Resten av etanolrehydreringsstegen (95%, 80%, 75%) varar i 3 till 5 minuter vardera. - Skölj rutschkanorna i avjoniserat vatten.
- Utför epitophämtning genom att sänka ner bilderna i en behållare (t.ex . Coplin-färgningsburk) i 10 mM natriumcitratbuffert, pH 6,0, i en 1200 Watt mikrovågsugn med 100% effekt i 10 min.
- Använd okonjugerad, polyklonal kanin anti-human NuMA-antikropp för märkning, utspädd 1:7 000 i Tris-Bovine serumalbumin (BSA) (25 mM Tris, 15 mM NaCl, 1% BSA, pH 7,2). Kör lämpliga positiva och negativa kontroller parallellt med studieavsnitten.
- Inkubera bilderna med den primära antikroppen i 12 timmar. Detektera den primära antikroppen med get anti-kanin HRP konjugerad multimer och visualisera komplexet med 3,3-diaminobenzidin och en kopparsulfatförstärkare.
- Tvätta rutschkanorna i destillerat vatten, motfläcka med hematoxylin, torka ut och montera med permanent medium.
OBS: Uttorkningsstegen är motsatsen till de rehydratiseringssteg som beskrivs i steg 8.3. Skanna bilderna med den tillgängliga skannern med 20x eller 40x förstoring och ladda upp dem till en databas. - Använd programvara, rita ROI för att inkludera alla NuMA-färgade celler i organvävnaden, exklusive andra organparenkym och tomma utrymmen.
- Justera inställningarna för att kategorisera de NuMA-positiva och NuMA-negativa cellerna samtidigt som du använder lämpliga positiva och negativa kontroller för varje organ. Använd en etablerad mjukvarualgoritm för att kvantifiera det totala antalet/procentandelen NuMA-positiva celler för varje prov.
9. Vävnadsskiva immunofluorescens
För att identifiera det metastatiska stadiet där en viss genkandidat krävs (t.ex . extravasering kontra överlevnad efter sådd) kan man bestämma vävnadsskivans immunofluorescens vid olika tidpunkter för att spåra tumörcellprogression från injektion till avlägsen organinvasion, sådd och tillväxt. Detta tillvägagångssätt möjliggör tillsats av markörer för angränsande celler för att fånga extravasationshändelsen och den omgivande tumörmikromiljön förändras33.
- Bedöva djuret enligt beskrivningen i steg 7.1.
- Injicera 100 μg fluoroforkonjugerad Lycopersicon Esculentum (Tomat) Lectin i vänster kammare hos varje djur, 3 min före perfusion, för att avgränsa det vaskulära endotelet.
OBS: Tillåt tid för tomatlektin att återcirkulera i hela systemet. - Perfusera djuret enligt beskrivningen i steg 7.2-7.3. Skörda organen av intresse och överför dem till förmärkta behållare fyllda med 4% PFA. Fixa vävnaden i 24 till 48 timmar. Dela vävnaden med en vibratom i 30-50 μm tjocka skivor.
OBS: Tjockleken bör optimeras. Skivor mellan 30 μm och 50 μm tjocklek rekommenderas, särskilt när du utför z-stack-avbildning. - Inkubera skivorna i blockerande buffert (10% Normal Goat Serum, 2% BSA, 0,25% Triton X-100 i DPBS) i 2 timmar vid RT.
- Utför ett färgningsoptimeringsexperiment.
OBS: Eftersom antigenhämtningstid, buffertar som används för antigenhämtning, temperatur, olika antikroppar / olika partier och typen av vävnad påverkar färgningen, är optimeringsexperiment nödvändiga. - Tillsätt primära antikroppar vid en optimerad utspädning och inkubera under en optimerad tid vid en optimerad temperatur (se exempel i tabell 1).
OBS: Använd lämpliga kontroller för primära/sekundära antikroppar och ofärgade vävnadsprover. - Tvätta vävnadsskivorna 3 gånger i 5 min med 0,25% Triton X-100 i DPBS.
- Inkubera vävnadsskivorna i sekundär antikropp utspädd i blockerande lösning under önskad tid (tabell 1).
- Tvätta vävnadsskivorna 3 gånger i 5 min med 0,25% Triton X-100 i DPBS.
- Fläck kärnorna med 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) utspädd 1:1000 i DPBS eller blockera buffert i 5 min.
- Tillsätt 2 droppar antifade fluorescensmonteringsmedium till en täckglas och montera vävnaden på glasskivor, se till att skivorna är helt täckta av monteringsmedium.
OBS: Se till att det inte finns några luftbubblor direkt på skivorna eftersom detta snedvrider mikroskopin. - Ta konfokala bilder med det tillgängliga mikroskopet med ett 60x oljenedsänkningsmål.
OBS: När du hämtar konfokala bilder, använd samma inställningsparametrar (spänning, luftiga enheter och förstärkning) över alla bilder i experimentet. - Ta icke-konfokala bilder med mikroskopet vid 10x, 20x eller 40x.
- Ladda upp bilderna i en bildanalysprogramvara och analysera dem genom att jämföra de parametrar som valts (dvs . område, antal, intensitet av markörer eller kontakt med intilliggande celler).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Följande figurer illustrerar hur det beskrivna arbetsflödet har tillämpats för identifiering av nya drivrutiner för melanommetastasering. Figur 2 sammanfattar resultaten av en publicerad studie där effekterna av att tysta fukosyltransferasEN FUT8 in in vivo melanommetastas studerades26. Kortfattat avslöjade analys av humana patientglykomiska data (erhållna med lektinmatriser) och transkriptomisk profilering ökade nivåer av alfa-1,6-fukos associerad med progression från primärt till metastaserat melanom, i överensstämmelse med en ökning av motsvarande fukosyltransferas (FUT8).
113/6-4L melanomceller transducerade med lentivirus som bär ett FUT8 shRNA eller motsvarande icke-målinriktad kontroll (shNTC) introducerades genom ultraljudsstyrd intrakardiell injektion i immunbristfälliga möss (NSG), som beskrivits ovan (avsnitt 2.9). Mössen övervakades med avseende på metastaserande spridning av in vivo BLI. Mössen avlivades i slutet av experimentet, organen undersöktes för ex vivo fluorescens och bearbetades för histologiska analyser. Förutom H & E utfördes NuMA-färgning för att specifikt identifiera mänskliga celler i murina vävnader. Som illustreras i figur 3 bearbetades NuMA-färgade sektioner genom digital avbildning för att kvantifiera den metastatiska bördan över flera sektioner och experimentella grupper. Ett liknande arbetsflöde kan tillämpas för att bedöma bidraget från andra kandidatgener till melanommetastasering.
Figur 3: NuMA-färgade lungsektioner. (A) Vänster, representativa bilder av NuMA-färgade lungsektioner från grupp I (melanomceller infekterade med kontroll lentivirus) och grupp II (melanomceller infekterade med en metastassuppressor-uttryckande lentivirus). Skalstänger = 1 000 μm. Insets visar metastatiska foci (mitten) som kan kvantifieras med hjälp av programvara. Rätt, metastatiska melanomceller är märkta gröna, och organområdet avgränsas av en grön kläckt linje. NuMA-negativa celler är märkta blå. Skalstänger = 100 μm. (B) Exempel på en mikrometastas i NuMA-färgade lungsektioner illustrerar programvarans känslighet vid detektering av ett litet antal celler. Skalstänger = 100 μm. Förkortning: NuMA = NuKleär mitotisk apparatprotein. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Antikropp | Tillverkare | Katalog nr | Värdarter | Reaktivitet | Fluorofor | Utspädning | Inkubationstid | Inkubationstemperatur |
| anti-GFP | Abcam | 4000.46 | Kanin | Mus | okonjugat | 1:1000 | 24 timmar | 4°C |
| anti-GFAP | Aves Labs | GFAP | Kyckling | Mus | okonjugat | 1:2000 | 24 timmar | 4°C |
| sekundär | Invitrogen | 11041 | Get | Kyckling | A568 | 1:500 | 2 timmar | Rumstemperatur |
| sekundär | Invitrogen | A32731 | Get | Kanin | A488 | 1:500 | 2 timmar | Rumstemperatur |
Tabell 1: Exempel på antikropps- och inkubationsbetingelser för immunofluorescens i hjärnskivan.
| Cellinje | Typ | Dags för dödshjälp | Kön av möss | Genetisk bakgrund av möss | Injektionsväg | # Celler injicerade | Platser för metastasering | |
| 12-273 BM+ | Humant melanom STC | 4-5 veckor | M | NSG | Intrakardiell | 100K visningar | Hjärnparenkym, leptomening, lever, njure, binjurar | |
| 131/4-5B1* | Mänskligt melanom | 4-6 veckor | M | Athymisk naken eller NSG | Intrakardiell | 50-200K | Hjärnparenkym, lever, lunga | |
| 113/6-4L* | Mänskligt melanom | 5-7 veckor | M | Athymisk naken eller NSG | Intrakardiell | 50-100K | Hjärnparenkym (få), lever, lunga | |
| WM 4265-2** | Humant melanom STC | 11 veckor | M | Athymisk naken eller NSG | Intrakardiell | 200K visningar | Hjärnans parenkym | |
| WM 4257-1** | Humant melanom STC | 10-13 veckor | M | Athymisk naken | Intrakardiell | 100K visningar | Hjärnparenkym (få) | |
| WM 4257-2** | Humant melanom STC | 10-13 veckor | M | Athymisk naken | Intrakardiell | 100K visningar | Hjärnans parenkym | |
| 10-230 BM+ | Humant melanom STC | 8-9 veckor | M | Athymisk naken | Intrakardiell | 100K visningar | Hjärnparenkym, leptomeninges, lever (få) | |
Tabell 2: Uppdelning av resultat från representativa in vivo-experiment av olika humana melanomcellinjer och korttidskulturer enligt det beskrivna protokollet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Syftet med denna tekniska rapport är att erbjuda ett standardiserat, top-to-bottom arbetsflöde för undersökning av potentiella aktörer inom melanommetastasering. Eftersom in vivo-experiment kan vara kostsamma och tidskrävande är strategier för att maximera effektiviteten och öka värdet av den erhållna informationen av största vikt.
Det är absolut nödvändigt att använda kompletterande metoder hela tiden för att korsvalidera fynd inom samma experiment. Till exempel är både NuMA immunohistokemisk färgning och BLI kompletterande metoder för att kvantitera metastatisk börda eftersom ingen av dem är omfattande. Medan BLI är en ovärderlig, icke-invasiv metod för att spåra tumörprogression in vivo, är dessa data i sig av låg upplösning. NuMA-färgning möjliggör noggrann analys av metastatisk börda i fasta organ; emellertid är omfattande sektionering genom hela vävnadstjockleken opraktisk. Som sådan kan endast ett prov av varje organ färgas. Enligt författarnas erfarenhet är BLI-resultaten inte alltid direkt proportionella mot tumörbördan som framgår av histopatologisk analys. Detta beror delvis på den begränsade känsligheten hos denna metod, särskilt i hjärnan, på grund av transkraniell dämpning34. Dessutom kan dessa data påverkas av ofullständigt luciferinupptag och/eller variabelt luciferasuttryck. Därför bör BLI tolkas i samband med ex vivo-avbildning och histopatologiska studier.
Histologisk utvärdering av vävnadsprover behandlade med generiska fläckar, såsom H & E, kräver specialiserad anatomopatologisk utbildning, är ofta låg genomströmning och är benägen för interobservervariationer. Författarna arbetar för närvarande med bioinformatikkollegor för att standardisera och påskynda experimentell dataanalys genom att utveckla en maskininlärningsalgoritm för automatiserad och tillförlitlig kvantitation av metastatisk börda i procent av organvävnadssektionen i histopatologiska bilder. Dessa och andra verktyg kommer att vara kritiska för fältet, särskilt när den metastatiska mikromiljöns roll kommer i fokus med en finare upplösning (t.ex. rumslig transkriptomik). Ändå är expert histopatologisk utvärdering av vävnaden avgörande, särskilt i subtyper av hjärnmetastaser såsom leptomeningeal, en biologiskt distinkt subtyp, som lätt misstolkas som parenkymal hjärnmetastas via BLI ensam. NuMA-färgning (avsnitt 8) påskyndar den histopatologiska bedömningen av metastatisk börda, vilket möjliggör opartisk identifiering och kvantitation av mänskliga celler i musorgan. Skillnaden mellan anatomiska fack på NuMA-färgade sektioner, såsom hjärnparenkym kontra leptomeningerna, är dock avgörande för att få ytterligare biologiska insikter.
De tekniker som beskrivs här kan användas för att undersöka den funktionella relevansen av gener av intresse för melanommetastatisk kaskad. Det är viktigt att välja en modell med en reproducerbar fenotyp som är lämplig för studien i fråga. Till exempel kan en gen som är uppreglerad i mänskliga patientprover av metastaser "slås ner" för att bedöma om detta minskar metastatisk börda jämfört med en kontrollgrupp. Detta tillvägagångssätt utförs bäst i en modellcellinje eller kortvarig kultur som innehåller både a) högt uttryck för genen av intresse och b) genererar betydande metastatisk börda med tillförlitlig kinetik när den injiceras i möss, så att en minskning av metastatisk kapacitet kommer att vara märkbar och tilldelas den genetiska störning som testas.
Också avgörande i experimentell design är det valda injektionssättet som är mest lämpligt för metastaseringsstadiet som undersöks. Varje steg i den metastatiska kaskaden presenterar distinkta biologiska och fysiska hinder för melanomceller. Prövare som vill besvara frågor om de inledande stadierna av metastasering, nämligen invasion och intravasering, bör använda de tekniker som beskrivs i avsnitt 2 för intradermala respektive subkutana injektioner, följt av överlevnadskirurgi (avsnitt 3). Viktigt är att dessa förfaranden efterliknar processen genom vilken primära melanom resekeras hos människor, varefter en patient kan eller inte kan uppvisa metastasering. Även om det är tekniskt mer känsligt än subkutan injektion, planterar den intradermala vägen tumörceller i det anatomiska facket där melanom utvecklas hos mänskliga patienter. Detta är särskilt viktigt i studier av immunövervakning av melanom, eftersom huden har ett unikt ekosystem av patrullerande immunpopulationer35.
Men om hypotesen som testas centrerar på senare stadier av metastasering, såsom extravasering från artärcirkulationen, är metoder som intrakardiell, intrakardiell, intratracarotid och retro-orbital injektion fördelaktiga. Dessa tekniker ger metastaser i större skala på mycket kortare tid än de som involverar en "primär" tumör. För studier av hjärnmetastaser kan i synnerhet modeller som på ett tillförlitligt sätt producerar tumörer i hjärnparenkymet vara svåra att fastställa. I dessa fall representerar intrakaroti och retro-orbital injektion metoder för att kringgå organ med lägre "inträdesbarriärer", såsom lever och njurar, vilket kan orsaka för tidig dödlighet hos möss som injiceras via intrakardiell väg.
Den musgenetiska bakgrunden som valts för xeno- eller allografttransplantation beror på källan till celler (människa, mus) och ibland på genetiska modifieringar av de implanterade cellerna som kan framkalla immunavstötning. Experiment med humana xenograftmodeller utförs vanligtvis på möss med nedsatt adaptivt och medfött immunförsvar, NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl / SzJ (NSG) möss; eller möss som saknar adaptiv immunitet, såsom T-cellbrist athymiska / nakna (NU / J) möss. En annan immunbristmodell som ofta används är RAG2 knockout (KO) -modellen, som saknar B- och T-celler och behåller en funktionell naturlig mördarcellpopulation. Dessa immunbristfälliga musmodeller måste användas strategiskt, eftersom var och en har fördelar på bekostnad av vissa nackdelar relaterade till deras inneboende immunbrister. Enligt författarnas erfarenhet uppvisar samma cellinje- eller patienthärledda STC olika organtropism baserat på injektionsvägen (t.ex. subkutan kontra intrakardiell) och / eller mottagarens musstam (t.ex. NSG kontra athymisk / naken) (se tabell 2).
För att mildra den experimentella variationen avseende värden i vilken melanomceller implanteras (t.ex. immunsvar, mikrobiota) och maximera "på mål" och reproducerbara fynd rekommenderas följande: i) öka antalet försöksdjur per grupp (med hjälp av effektberäkningar för att nå ett optimalt antal baserat på effektstorleken), ii) använda ortogonala metoder för att manipulera genkandidater (dvs. CRISPR / Cas9, CRISPRi, shRNA) och "add-back" -experiment (dvs samtidig ektopisk uttryck av ett Cas9- eller shRNA-resistent cDNA av genen av intresse). Dessa kompletterande tekniker minskar möjligheten till off-target-effekter och/eller biologisk och experimentell variation.
Även om detta protokoll säkert kan tillämpas för hypotesdriven validering av kandidatdrivrutiner eller suppressorer av metastasering, kan dessa metoder också vara användbara för opartiska, explorativa studier. Till exempel möjliggör poolade CRISPR / cas9, CRISPR-KRAB-dCas9 (CRISPRi) och shRNA-baserade skärmar en process av darwinistiskt urval att spela ut in vivo36. Den konceptuella grunden för sådana studier är följande: en cell med en gen utslagen som är väsentlig för fenotypen av intresse (t.ex. tumörtillväxt) kommer att dö eller misslyckas med att föröka sig, så att dess representation i det sekvenserade biblioteket minskar vid experimentets slut i förhållande till baslinjen. De förfaranden som beskrivs här kan tillämpas för ett sådant tillvägagångssätt, med lämplig optimering37,38.
När det gäller kandidatgenval kan flera källor brytas. Melanom patienttranskriptomik och proteomik dataset är offentligt tillgängliga via NCBI Gene Expression Omnibus (GEO)39, European Genome-Phenome Archive40, cBioPortal41 (som är värd för The Cancer Genome Atlas, eller TCGA42) och andra värdwebbplatser. Omanalys av rådata rekommenderas eftersom kvalitetskontrollåtgärder kan variera kraftigt mellan offentliga databaser, vilket påverkar resultaten. Vid förhör av råa dataset inkluderar frågor som är lämpliga för kandidatgenval som är lämpliga för tillämpning på arbetsflödet som beskrivs här: vilka gener är dysreglerade i metastatiska prover jämfört med primära melanomprover eller melanocytisk nevi?; vilka gener är dysreglerade på specifika platser för metastasering?; är det dysreglerade uttrycket av kandidatgenen associerat med förbättrad patientöverlevnad?; är denna gen en del av ett större genuttrycksprogram som i allmänhet är dysreglerat?; är genproduktens interaktorer väl karakteriserade eller okända?; är genprodukten läkemedelsbar, och i så fall finns inriktningsverktyg tillgängliga?; och mycket viktigt, är genen väsentlig för alla mänskliga celler, eller för många vävnader, så att störningar i dess aktivitet i en klinisk miljö kan visa sig vara giftiga?
Den lämpliga strategin för manipulation av generna av intresse beror på de hypoteser som ska testas. Till exempel kan en gen uppreglerad i metastaser slås ner för att bedöma om motsvarande möss skulle visa minskad metastatisk börda jämfört med en kontrollgrupp. Detta tillvägagångssätt utförs bäst i en modellcellinje eller kortvarig kultur, som har både: a) högt uttryck av genen av intresse och b) genererar märkbar metastatisk börda när den injiceras i möss med reproducerbar kinetik. Knockdown-metoder inkluderar shRNA- och CRISPR / Cas9-baserade metoder, som båda kan konstrueras via lentiviral infektion av melanomceller och distribueras på ett inducerbart eller konstitutivt sätt. En av fördelarna med inducerbart uttryck (se pLKO Tet-On i materialförteckningen) är den tidsmässiga regleringen av knockdown, som kan utnyttjas i ett in vivo-experiment . Således kan inducerbara shRNA / sgRNA användas för att modellera en "terapeutisk inställning" där etablerade tumörceller utsätts för en kandidatgenknockdown. Exponering för det inducerande medlet, t.ex. doxycyklin, kan emellertid få konsekvenser för beteendet hos vissa melanomceller; som sådan är införandet av kontrollceller transducerade med ett krypterat shRNA som också upplever denna behandling kritisk.
Medan shRNA ofta ger en partiell knockdown av genuttryck, redigerar CRISPR / Cas9-baserade system en gen på DNA-nivå, vilket teoretiskt framkallar en fullständig "knockout" (KO). Deras användning presenterar både fördelar och nackdelar. Om en gen är väsentlig för melanomcellens livskraft, kommer celler med en fullständig KO att väljas negativt in vitro och senare in vivo. Även om denna fråga delvis kan mildras genom att välja encellskloner, kämpar melanomceller för att växa från enskilda celler, vilket resulterar i oförutsägbara och ofta olika anpassningar. Således måste flera KO-kloner testas för att kontrollera för interklonala fenotypiska variationer. Dessutom, i synnerhet när det gäller patient-härledda STC, kan antalet lentivirala infektioner som melanomceller utsätts för i hög grad påverka in vitro-proliferation och in vivo metastatiskt beteende. Därför rekommenderas en metod med en vektor, enstaka infektioner som innehåller Cas9 och ett sgRNA (se lentiCRISPRv2 i materialförteckningen). Andra system använder sig av en "rekombinas död" Cas9 för att framkalla transkriptionsundertryck (dCas9-KRAB i materialförteckningen).
En gain-of-function-metod kan vara lämplig om en gen av intresse antas vara en metastasfrämjande gen. I detta fall är valet av en melanomlinje som ger få metastaser vid injektion hos möss och med lågt basalt uttryck av genen av intresse nyckeln. Överuttryckskonstruktioner (särskilt de som drivs av CMV-promotorer) leder ofta till suprafysiologiska uttrycksnivåer, vilket orsakar proteotoxisk stress. Därför rekommenderas att välja lentivirala vektorer som möjliggör det fysiologiska uttrycket av genen av intresse.
När ett tillvägagångssätt har valts är det viktigt att utföra följande experiment före engraftment av celler. Lentiviral infektionsprocedurer varierar mellan laboratorier och kommer att kräva optimering för varje cellinje och knockdown-system. Universella överväganden inkluderar emellertid ett fullständigt positivt eller negativt urval av celler med genknockdown (t.ex. FACS/cellsortering för fluorescerande rapportörer eller urval av antibiotikaresistens, om tillämpligt), följt av RT-qPCR och western blot med lämpliga kontroller för att visa reproducerbar och robust knockdown eller överuttryck av genen av intresse. En in vitro-proliferationsanalys bör genomföras för att avgöra om interferens med genen av intresse påverkar cellviabiliteten. Detta steg är viktigt för tillförlitlig cellkarakterisering och för korrekt tolkning av in vivo-resultat . Här är ett exempel på en fallgrop om de beskrivna experimenten inte utförs: om en genknockdown resulterar i en drastisk spridningsdefekt in vitro, kommer detta att förvirra tolkningen av minskad metastatisk börda, eftersom det specifika bidraget från denna gen till den metastatiska kaskaden inte kan bedömas exakt. Olika modaliteter för proliferationsanalyser inkluderar kommersiellt tillgängliga kit, levande cellavbildningssystem eller traditionella cellodlingsbaserade analyser, t.ex. kristallviolett, trypanblå uteslutning.
Bland de stora begränsningarna för denna plattform för att upptäcka mediatorer i melanom är att det föreslagna arbetsflödet endast undersöker tumörcell-inneboende genkandidater, inte gener som uttrycks av cellerna i den omgivande mikromiljön vid olika metastatiska stadier, vilka är viktiga modulatorer för tumörcellanpassning och sådd av distala organ. En annan viktig faktor att tänka på är differentiellt metastatiskt beteende baserat på engraftmentvägen. Den interlaboratoriska och interoperatoriska variationen som är inneboende i några av de presenterade teknikerna kan hanteras genom standardisering över metastasforskningsområdet. För närvarande är det mest lämpliga protokollet för standardisering den intrakardiella injektionen på grund av ultraljudsvägledningen och statiska injektionsanordningar, vilket minskar interoperatorvariabiliteten. Detta protokoll representerar ett av de många stegen i riktning mot enhetlighet, reproducerbarhet och grundlig dokumentation av metoder som används i laboratorier som arbetar med identifiering av nya mediatorer av melanommetastas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Vi tackar avdelningen för avancerad forskningsteknik (DART) vid NYU Langone Health, och i synnerhet Experimental Pathology Research Laboratory, Genome Technology Center, Cytometry and Cell Sorting Laboratory, Pre-Clinical Imaging Core, som delvis stöds av Perlmutter Cancer Center Support Grant NIH / NCI 5P30CA016087. Vi tackar NYU Interdisciplinary Melanoma Cooperative Group (PI: Dr. Iman Osman) för att ge tillgång till patient-härledda melanom kortvariga kulturer + (10-230BM och 12-273BM), som erhölls genom IRB-godkända protokoll (Universal Consent-studie #s16-00122 och Interdisciplinary Melanoma Cooperative Group study #10362). Vi tackar Dr. Robert Kerbel (University of Toronto) för att ha tillhandahållit 113/6-4L och 131/4-5B1 melanomcellinjer* och Dr. Meenhard Herlyn (Wistar Institute) för att tillhandahålla WM 4265-2, WM 4257s-1, WM 4257-2 melanom kortsiktiga kulturer**. E.H. stöds av NIH/NCI R01CA243446, P01CA206980, ett American Cancer Society-Melanoma Research Alliance Team Science Award och ett NIH Melanoma SPORE (NCI P50 CA225450; PI: I.O.). Figur 1 skapades med Biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #15 Scapel Blade | WPI | 500242 | For surgical procedures |
| #3 Scapel Handle | WPI | 500236 | For surgical procedures |
| 1 mL Tuberculin syringe, slip tip | BD | 309626 | Injections |
| 10 mL syringe, slip tip | BD | 301029 | Perfusion |
| 10% Formalin Sodium Buffered | EK Industries | 4499-20L | For perfusion/tissue fixative |
| 15 mL Conical | Corning | 430052 | Cell culture |
| 15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes | Falcon | 352196 | Cell culture |
| 200 Proof Ethanol | Deacon Labs | 04-355-223 | Histology |
| 22G – 22mm needle | BD | 305156 | Perfusion |
| 4-0 Vicryl Suture | Ethicon | J464G | Suture |
| 4% Carson's phosphate buffered paraformaldehyde | EMS | 15733-10 | For perfusion/tissue fixative |
| 40µm | Corning | 431750 | Tissue processing |
| 5-0 Absorbable Suture | Ethicon | 6542000 | Closure |
| 50 mL Conical | Corning | 430828 | Cell culture |
| 50mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | Cell culture |
| 7-0 Silk suture | FST | 18020-70 | Ligature |
| 70µm | Corning | 431751 | Tissue processing |
| Anti-fade mounting media | Vector Labs | H-1000-10 | Immunofluorescence |
| Approximator applying Forceps, 10cm | WPI | 14189 | For microsurgical procedures |
| Avance | Bruker | 3 HD | NMR Console |
| Biospec 7030 | Bruker | 7030 | Micro MRI |
| BSA | Bioreg | A941 | NuMA Staining |
| Castroviejo suturing forceps, straight tips 5.5mm tying platform, 11cm | WPI | WP5025501 | For microsurgical procedures |
| Coplin Staining Jar | Bel-Art | F44208-1000 | Histology |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Immunofluorescence |
| dCas9-KRAB | Addgene | 110820 | Genetic manipulation |
| DNase I | NEB | M0303L | Tissue processing |
| DPBS | Corning | 21-030-CM | Tissue processing |
| Extra Sharp Uncoated Single Edge Blade | GEM | 62-0167 | Tissue processing |
| Extracellular Matrix Substrate | Corning | 354234 | Consider the Growth Factor Reduced ( as alternative |
| FBS | Cytiva | SH30910.03 | Cell culture |
| Fiji Image J | Fiji Image J | Software | Immunofluorescence |
| Goat anti-rabbit HRP conjugated multimer | Thermo Fisher | A16104 | NuMA Staining |
| Goat Serum | Gibco | PCN5000 | Immunofluorescence |
| HBSS | Corning | 21-020-CV | Tissue processing |
| Hematoxylin | Richard-Allan Scientific | 7231 | Histology |
| Illumina III | PerkinElmer | CLS136334 | BLI Instrument |
| Insulin syringe 28G - 8mm needle | BD | 329424 | Injections |
| Insulin syringe 31G - 6mm needle | BD | 326730 | Injections |
| Iris Forceps, 10.2cm, Full Curve, serrated | WPI | 504478 | For perfusion and surgical procedures |
| Isoflurane USP | Covetrus | 11695067772 | Anesthesia |
| Jewelers #7 Forceps Titanium 11 cm 0.07 x 0.01 mm Tip | WPI | WP6570 | For microsurgical procedures |
| Ketamine HCl 100mg/mL | Mylan Ind. | 1049007 | Anesthesia |
| lentiCRISPRv2 | Addgene | 98290 | Genetic manipulation |
| Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin, DyLight 649 | Invitrogen | L32472 | Vascular endothelial cells marker |
| MEM non-essential amino acids X 100 | Corning | 25-025-CI | Cell culture |
| Metzenbaum Scissors | WPI | 503269 | For surgical procedures |
| Microinjection Unit | KOPF | 5000 | Intracardiac injections |
| NaCl | Fisher | S25877 | NuMA Staining |
| Needle 30G x 25mm | BD | 305128 | Intracardiac Injection |
| Needle 33G x 15mm | Hamilton | 7747-01 | Intracarotid Injection |
| Needle holder, Castroviejo, 14cm, with lock, 1.2mm Serrated Jaws | WPI | 14137-G | For microsurgical procedures |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice | The Jackson Laboratory | 005557 | Murine model |
| NU/J mice | The Jackson Laboratory | 002019 | Murine model |
| Nuclear Mitotic Apparatus Protein polyclonal rabbit anti-human | Abcam | 97585 | NuMA Staining |
| Penicillin-Streptomycin 10000U/mL | Gibco | 15140122 | Cell culture |
| Percoll | GE | 0891-01 | density separation solution |
| PI Classic Surgical Gloves | Cardinal Health | 2D72PT75X | Surgery |
| pLKO Tet-On | Addgene | 21915 | Genetic manipulation |
| Povidone-Iodine 10% Solution | Medline | MDS093943 | Surgery |
| Proparacaine Drops 0.5% | Akorn Pharma | AX0501 | Opthalmic local anesthetic |
| Puralube Petrolatum Opthalmic Ointment | Dechra | 83592 | Anesthesia |
| Razor Blade Double Edge Blades | EMS | 72000 | Shaving and Vibrotome Brain Slicing |
| Reflex 9mm EZ Clip | Braintree | EZC- KIT | Wound closure |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CM | Cell culture |
| Scissors, Spring 10.5cm Str, 8mm Blades | WPI | 501235 | For microsurgical procedures |
| Semi-Automatic Vibrating Blade Microtome | Leica | VT1200 | Brain Slice Immunofluorescence |
| Single Channel Anesthesia Vaporizer System | Kent Scientific | VetFlo-1210S | Anesthesia |
| Smartbox Tabletop Chamber System and Exhaust Blower | EZ Systems | TT4000 | CO2 Euthanasia |
| Sterile Fenestrated Disposable Drape | Medline | NON21002 | Surgery |
| Sterile Non-Reinforced Aurora Surgical Gowns with Set-In Sleeves | Medline | DYNJP2715 | Surgery |
| T25 Flask | Corning | 430639 | Cell culture |
| Tris | Corning | 46-031-CM | NuMA Staining |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | Immunofluorescence |
| Troutman tying forceps, 10cm, Curved G pattern, 0.52mm tip with tying platform | WPI | WP505210 | For microsurgical procedures |
| Vessel clips 10G Pressure 5x 0.8mm Jaws, 5/pkg | WPI | 15911 | For microsurgical procedures |
| Visiopharm | Visiopharm | Visiopharm | NuMA Staining Quantification Software |
| Xylasine 100mg/mL | Akorn Pharma | 59399-111-50 | Anesthesia |
| Xylene | Fisher | X3P-1GAL | Histology |
References
- Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Adler, N. R., Haydon, A., McLean, C. A., Kelly, J. W., Mar, V. J. Metastatic pathways in patients with cutaneous melanoma. Pigment Cell Melanoma Research. 30 (1), 13-27 (2017).
- Platz, A., Egyhazi, S., Ringborg, U., Hansson, J. Human cutaneous melanoma; a review of NRAS and BRAF mutation frequencies in relation to histogenetic subclass and body site. Molecular Oncology. 1 (4), 395-405 (2008).
- Alonso, S. R., et al. A high-throughput study in melanoma identifies epithelial-mesenchymal transition as a major determinant of metastasis. Cancer Research. 67 (7), 3450-3460 (2007).
- Rowe, C. J., Khosrotehrani, K. Clinical and biological determinants of melanoma progression: Should all be considered for clinical management. Australasian Journal of Dermatology. 57 (3), 175-181 (2016).
- Plebanek, M. P., et al. Pre-metastatic cancer exosomes induce immune surveillance by patrolling monocytes at the metastatic niche. Nature Communications. 8 (1), 1319 (2017).
- Orgaz, J. L., et al. Loss of pigment epithelium-derived factor enables migration, invasion and metastatic spread of human melanoma. Oncogene. 28 (47), 4147-4161 (2009).
- Ladhani, O., Sanchez-Martinez, C., Orgaz, J. L., Jimenez, B., Volpert, O. V. Pigment epithelium-derived factor blocks tumor extravasation by suppressing amoeboid morphology and mesenchymal proteolysis. Neoplasia. 13 (7), 633-642 (2011).
- Ju, R. J., Stehbens, S. J., Haass, N. K. The role of melanoma cell-stroma interaction in cell motility, invasion, and metastasis. Frontiers in Medicine - Dermatology. 5, 307 (2018).
- Wiley, H. E., Gonzalez, E. B., Maki, W., Wu, M. T., Hwang, S. T. Expression of CC chemokine receptor-7 and regional lymph node metastasis of B16 murine melanoma. Journal of the National Cancer Institute. 93 (21), 1638-1643 (2001).
- Meier, F., et al. Metastatic pathways and time courses in the orderly progression of cutaneous melanoma. British Journal of Dermatology. 147 (1), 62-70 (2002).
- Turner, N., Ware, O., Bosenberg, M. Genetics of metastasis: melanoma and other cancers. Clinical & Experimental Metastasis. 35 (5-6), 379-391 (2018).
- Ubellacker, J. M., et al. Lymph protects metastasizing melanoma cells from ferroptosis. Nature. 585 (7823), 113-118 (2020).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
- Cunningham, C. C., et al. Actin-binding protein requirement for cortical stability and efficient locomotion. Science. 255 (5042), 325-327 (1992).
- Unger, C., et al. Modeling human carcinomas: physiologically relevant 3D models to improve anti-cancer drug development. Advanced Drug Delivery Reviews. 79-80, 50-67 (2014).
- Fong, E. L., Harrington, D. A., Farach-Carson, M. C., Yu, H. Heralding a new paradigm in 3D tumor modeling. Biomaterials. 108, 197-213 (2016).
- Nakamura, K., et al. Characterization of mouse melanoma cell lines by their mortal malignancy using an experimental metastatic model. Life Science. 70 (7), 791-798 (2002).
- Meeth, K., Wang, J. X., Micevic, G., Damsky, W., Bosenberg, M. W. The YUMM lines: a series of congenic mouse melanoma cell lines with defined genetic alterations. Pigment Cell Melanoma Research. 29 (5), 590-597 (2016).
- Koya, R. C., et al. BRAF inhibitor vemurafenib improves the antitumor activity of adoptive cell immunotherapy. Cancer Research. 72 (16), 3928-3937 (2012).
- Jenkins, M. H. Multiple murine BRaf(V600E) melanoma cell lines with sensitivity to PLX4032. Pigment Cell Melanoma Research. 27 (3), 495-501 (2014).
- Tuncer, E., et al. SMAD signaling promotes melanoma metastasis independently of phenotype switching. The Journal of Clinical Investigation. 129 (7), 2702-2716 (2019).
- Schwartz, H., et al. Incipient Melanoma Brain Metastases Instigate Astrogliosis and Neuroinflammation. Cancer Research. 76 (15), 4359-4371 (2016).
- Perez-Guijarro, E., et al. Multimodel preclinical platform predicts clinical response of melanoma to immunotherapy. Nature Medicine. 26 (5), 781-791 (2020).
- Krepler, C., et al. A Comprehensive Patient-Derived Xenograft Collection Representing the Heterogeneity of Melanoma. Cell Reports. 21 (7), 1953-1967 (2017).
- Agrawal, P., et al. A systems biology approach identifies FUT8 as a driver of melanoma metastasis. Cell. 31 (6), 804-819 (2017).
- Hanniford, D., et al. Epigenetic silencing of CDR1as drives IGF2BP3-mediated melanoma invasion and metastasis. Cancer Cell. 37 (1), 55-70 (2020).
- Kim, H., et al. PRMT5 control of cGAS/STING and NLRC5 pathways defines melanoma response to antitumor immunity. Science Translational Medicine. 12 (551), (2020).
- de Miera, E. V., Friedman, E. B., Greenwald, H. S., Perle, M. A., Osman, I. Development of five new melanoma low passage cell lines representing the clinical and genetic profile of their tumors of origin. Pigment Cell Melanoma Research. 25 (3), 395-397 (2012).
- Morsi, A., et al. Development and characterization of a clinically relevant mouse model of melanoma brain metastasis. Pigment Cell Melanoma Research. 26 (5), 743-745 (2013).
- Huynh, C., et al. Efficient in vivo microRNA targeting of liver metastasis. Oncogene. 30 (12), 1481-1488 (2011).
- Zou, C., et al. Experimental variables that affect human hepatocyte AAV transduction in liver chimeric mice. Molecular Therapy Methods and Clinical Development. 18, 189-198 (2020).
- Kleffman, K., et al. Melanoma-secreted Amyloid Beta Suppresses Neuroinflammation and Promotes Brain Metastasis. bioRxiv. , 854885 (2019).
- Curtis, A., Calabro, K., Galarneau, J. R., Bigio, I. J., Krucker, T. Temporal variations of skin pigmentation in C57BL/6 mice affect optical bioluminescence quantitation. Molecular Imaging and Biology. 13 (6), 1114-1123 (2011).
- Sil, P., Wong, S. W., Martinez, J. More than skin deep: autophagy is vital for skin barrier function. Frontiers in Immunology. 9, 1376 (2018).
- Chen, S., et al. Genome-wide CRISPR screen in a mouse model of tumor growth and metastasis. Cell. 160 (6), 1246-1260 (2015).
- Hart, T., et al. High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities. Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).
- Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
- Edgar, R., Domrachev, M., Lash, A. E. Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository. Nucleic Acids Research. 30 (1), 207-210 (2002).
- Lappalainen, I., et al. The European Genome-phenome Archive of human data consented for biomedical research. Nature Genetics. 47 (7), 692-695 (2015).
- Cerami, E., et al. The cBio cancer genomics portal: an open platform for exploring multidimensional cancer genomics data. Cancer Discovery. 2 (5), 401-404 (2012).
- Grossman, R. L., et al. Toward a shared vision for cancer genomic data. New England Journal of Medicine. 375 (12), 1109-1112 (2016).
