En robust upptäcktsplattform för identifiering av nya medlare av melanommetastaser

Detta protokoll beskriver en serie tekniker inom ett kontinuerligt arbetsflöde som kan användas för att bedöma in vivo-effekterna av kandidatregulatorer av melanommetastaser, men också av metastasering av andra fasta maligniteter. Den största fördelen med vårt systematiska arbetsflöde är ökad reproducerbarhet av data tack vare robusta och standardiserade in vivo-modeller och tekniker. Denna pipeline erbjuder en väg för målupptäckt och terapiutveckling genom att testa kandidater som härleds från Omics-data eller in vitro-analyser i en in vivo-miljö.

Inlärningskurvan i samband med de tekniker som presenteras i detta protokoll förkortas genom att använda de material som tillhandahålls och följa den detaljerade beskrivningen när du övar stegen. Till sin hjälp för att demonstrera proceduren kommer Orlando Aristizabal, forskare i The Preclinical Imaging Core och Ran Moubarak, instruktör i mitt labb. För intradermala injektioner, bedöva och raka en åtta till 10 veckor gammal mus inuti ett biosäkerhetsskåp samtidigt som aseptiska förhållanden bibehålls.

Ta sedan tag i och dra tillbaka huden bakåt mot nålens bana och använd en sex millimeter lång, 31 gauge insulinspruta, punktera försiktigt huden i en spetsig vinkel med fasningen uppåt. Injicera 30 mikroliter av tumörcellsupphängningen långsamt tills ett kupolformat hjul observeras. Övervaka utvecklingen av tumörtillväxten, viktminskning och övergripande hälsotillstånd.

Under dessa övervakningssessioner, ta mätningar med bromsok och använd tumörens längd och bredddimensioner för att beräkna volymen. För intrakardiella injektioner, överför en sövd mus till ultraljudsmaskinens uppvärmda plattform. Använd sedan allergivänlig tejp, säkra musen till näskonen.

Raka bröstkorgen med ett rakt rakblad eller ett skalpellblad, lutat i 30 graders vinkel och rengör huden runt procedurområdet med 10% povidonjod. Placera sedan ultraljudssonden i mitten av bröstkorgen på vänster sida av musen för att fånga ett horisontellt fönster orienterat för att få en tvärsnittsvy av vänster kammare. Med sondens långa axel vänd uppåt, fixera sonden i 50 graders vinkel och den uppvärmda plattformen i 20 graders vinkel och lås sedan sonden och stödramen i läget.

När du arbetar inuti säkerhetsskåpet, rita upp cellsuspensionen i en tuberkulin en milliliter spruta med en 30 gauge en tum nål. Ta bort eventuella luftbubblor som finns i sprutan. Lås sprutan i stereotaktisk injektor.

Och sedan under ultraljudsvägledning, avancera nålen genom bröstväggen in i hjärtans vänstra kammare och injicera 100 till 250 mikroliter av tumörcellsuspensionen långsamt. För iscensatt överlevnadskirurgi, placera den bedövade musen på värmedynan och rengör huden runt procedurområdet med en 10% povidonjodlösning. Efter att ha på sig steril personlig skyddsutrustning och handskar lägger du en steril draperi över djurets kropp.

Därefter, med hjälp av Iris sax eller en skalpell, snitta huden och bibehålla en fem till sju millimeter resektionsmarginal från tumörens kant. Vid intradermala tumörer, resektera tumören tillsammans med omkretshuden. För subkutana tumörer, dissekera och ta bort tumören under huden.

Efter tumörresektion, stäng såret med en nio millimeter häftanordning. För in vivo-avbildning, administrera d-luciferinsubstrat till musen genom intraperitoneal injektion med en milliliter insulinspruta och en 28 gauge nål och bedöva sedan musen och placera den i en näskon inuti bioluminescensavbildningsskannern. Starta instrumentet genom att trycka på initialisera och ställ in exponeringstiden på auto.

Om du vill ta en tom bild för bakgrundssubtraktion klickar du på Hämta och spara bilden när förvärvssekvensen är klar. För dataanalys och samma in vivo-bildprogramvara, navigera till mappen där bilderna sparas och öppna bilderna av alla möss från ett experiment. Ställ in enheterna på utstrålning och se till att kryssrutan som anger individ inte är markerad eftersom detta utesluter normalisering av signal mellan grupper.

Därefter, med hjälp av regionen av intresse eller ROI-ritverktyg, rita cirkulära ROI: er för hjärnregionen och rektangulära ROI för kroppen, utesluta öronen och näsan i hjärnan ROI eftersom de tenderar att avge ospecifik luminans. För att minimera bias, rita ROI på fotografierna av mössen utan den självlysande signalen överlagrad, välj sedan mät ROI för att kvantifiera signalen och exportera data till ett kalkylblad. Analysera skillnader mellan grupper genom att plotta totalt självlysande flöde i kroppsregioner av intresse.

Efter en NuMA-färgning med hjälp av programvara, rita en ROI för att inkludera alla NuMA-färgade celler i organvävnaden, förutom andra organparenkym och tomma utrymmen. Justera inställningarna för att kategorisera de NuMA-positiva och NuMA-negativa cellerna samtidigt som du använder lämpliga positiva och negativa kontroller för varje organ. Använd en etablerad mjukvarualgoritm för att kvantifiera det totala antalet procentandel nuMA-positiva celler för varje prov.

Bioluminescens, ljusfält, ex vivo fluorescens och hematoxylin- och eosinfärgningsbilder illustrerar det mångsidiga tillvägagångssättet för analys av kandidatgenernas effekter på melanommetastas. Fukosyltransferas tystnad försämrade den metastatiska spridningen av melanomceller. De NuMA-färgade lungsektionerna av melanomceller infekterade med kontroll Linda-virus och med en metastassuppressor som uttrycker Linda-virus visas här.

De metastaserande melanomcellerna är märkta gröna och organområdet avgränsas av en grön kläckt linje. Att upprätthålla korrekt spänning i huden vid intradermala injektioner, undvika luftemboli vid beredning av sprutor och erhålla tillräckliga resektionsmarginaler som inte bör störa djurets rörelse eller predisponera det för sårkomplikationer, bidra till att förbättra framgångsgraden och reproducerbarheten. Ytterligare användning av multiplexavbildning för att undersöka immunfiltrering, encells-RNA-sekvensering för genuttrycksanalys och rumslig transkriptomik kan alla ge gratis vägar för att undersöka intratumoral heterogenitet.

Kombinationen av tekniker som beskrivs i detta protokoll hjälpte oss att identifiera nya regulatorer i melanom hjärnmetastaser, såsom rollen av melanom utsöndrad amyloid beta för att undertrycka neuroinflammation och främja hjärnmetastaser.