Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Анализы ACT1-CUP1 определяют субстрат-специфическую чувствительность сплайсеосомальных мутантов в почковых дрожжах

Published: June 30, 2022 doi: 10.3791/63232
Automatic Translation
1
1College of Arts and Sciences, Northwest University

Summary

Анализ ACT1-CUP1, анализ роста меди, обеспечивает быстрое считывание сплайсинга РНК-предшественника (пре-мРНК) и влияние мутантных факторов сплайсинга на сплайсеосомную функцию. Это исследование предоставляет протокол и подчеркивает возможность настройки для решения интересующего вопроса сплайсинга.

Abstract

Мутации, введенные в сплайсеосому или ее субстрат, значительно способствовали нашему пониманию тонкостей сплайсеосомальной функции. Независимо от того, связаны ли они с заболеванием или функционально выбраны, многие из этих мутаций были изучены с использованием анализов роста в модельном организме Saccharomyces cerevisiae (дрожжи). Специфический для сращивания анализ роста меди, или ACT1-CUP1, обеспечивает всесторонний анализ мутации на фенотипическом уровне. В анализе ACT1-CUP1 используются репортеры, которые обеспечивают допуск меди при правильном сращивании. Таким образом, в присутствии меди изменения жизнеспособности дрожжей коррелируют с изменениями в производстве мРНК посредством сплайсинга. В типичном эксперименте дрожжевой сплайсеосоме бросают вызов с различными неконсенсусными репортерами сплайсинга и мутацией фактора сплайсинга, представляющей интерес, для обнаружения любого синергетического или антитетического воздействия на сплайсинг. Здесь приведено полное описание подготовки медной пластины, обшивки дрожжевых клеток, а также оценка данных. Описана подборка дополнительных экспериментов, подчеркивающих универсальность репортеров ACT1-CUP1. Анализ ACT1-CUP1 является удобным инструментом в наборе инструментов для сращивания благодаря прямому считыванию мутационного эффекта (эффектов) и сравнительным возможностям от продолжающегося использования в полевых условиях.

Introduction

Сплайсеосома представляет собой большую биологическую машину, которая катализирует удаление интронов, некодирующих областей в РНК-предшественника-мессенджера (пре-мРНК)1,2. Характеристика эффекта мутанта одной точки в 1 из почти 100 белков и 5 некодирующих РНК часто неоднозначна при изучении белка или РНК в изоляции. Изменение функции мутированного компонента лучше всего может быть оценено in vivo в контексте полной, функционирующей сплайсеосомы.

Анализ роста меди, описанный здесь, является быстрым показателем эффективности сращивания в Saccharomyces cerevisiae или почковых дрожжах. Разработанный К.Ф. Лессером и К. Гатри и опубликованный в 1993 году, этот анализ сочетает в себе простоту работы с простым модельным организмом и простое считывание жизнеспособности клеток3. Жизнеспособность коррелирует с тем, насколько хорошо сплайсеосомы в этих клетках могут распознавать и сращивать репортерную расшифровку.

Этот анализ роста меди чаще называют анализом ACT1-CUP1. Название ACT1-CUP1 происходит от двух генов, слитых для создания репортера эффективности сплайсинга. ACT1 - это ген актина дрожжей, который высоко экспрессируется и имеет эффективно сращенный интрон 4,5. Cup1p - это медный хелатор, который изолирует медь в клетке для предотвращения помех регулярным клеточным функциям 6,7,8. Репортер ACT1-CUP1 содержит эти гены в такой последовательности, что CUP1 находится в правильном кадре считывания только в том случае, если происходит сращивание интрона ACT1 до мРНК (рисунок 1). Полученный в результате синтез белка содержит первые 21 аминокислоту актина и полноразмерный белок Cup1p, который повышает жизнеспособность дрожжей в богатой медью среде3. Таким образом, увеличение количества сращивания репортера приводит к более высокой концентрации Cup1p и более высокому сопротивлению меди (рисунок 1). По сравнению с другими генами-репортерами, CUP1 влияет на жизнеспособность клеток даже на низких уровнях, имеет широкий диапазон чувствительности и может быть использован для непосредственного выбора для сплайсинга мутаций 3,6,7. Кроме того, CUP1 не является необходимым для роста стандартных дрожжей, и, таким образом, клеточный гомеостаз не влияет во время установки для этого анализа. В дополнение к анализам делеции или температурного роста, ACT1-CUP1 предоставляет информацию о влиянии на сращивание в оптимальных условиях роста дрожжей.

Сплайсеосома распознает свой субстрат через три интронные последовательности, а именно 5' сращивание (5' SS), ответвление (BS) и 3' место сращивания (3' SS). На этих сайтах были созданы многочисленные репортеры ACT1-CUP1, содержащие неконсенсусные последовательности. Выбор наиболее распространенных репортеров ACT1-CUP1 показан на рисунке 1 и в таблице 1. Поскольку сплайсеосома взаимодействует с каждым местом сращивания уникально в разных точках цикла сплайсинга, надежность сплайсеосомы может быть проверена на разных этапах, на основе которых используется неконсенсусный репортер. Неконсенсусные репортеры названы в честь мутировавшей позиции внутри интрона и базы, на которую она была мутирована. Например, A3c является репортером с мутацией в 5' SS, в частности позицией 3 от консенсусного аденозина к цитозину. Этот репортер будет сильно взаимодействовать со сплайсеосомными мутациями, которые влияют на выбор и использование 5' SS. В своем первоначальном исследовании Лессер и Гатри определили, какие мутации 5' SS ингибируют сплайсинг3. Позже в том же году неконсенсусные репортеры на всех трех сайтах сращивания были опубликованы Берджессом и Гатри в супрессорном скрининге мутаций в ATPase Prp16p9. Сравнивая консенсус с неконсенсусными репортерами, анализ ACT1-CUP1 был важным ключом к пониманию надежности и селективности дрожжевой сплайсеосомы и к выводу о функции сплайсеос других эукариот.

Поскольку неконсенсусные репортеры ACT1-CUP1 сенсибилизируют сплайсеосому к дальнейшему возмущению, влияние мутации одного фактора сплайсинга может быть охарактеризовано через репортеров, на которых она положительно или отрицательно влияет. Это было применено к сращиванию исследовательских вопросов различными способами. Во-первых, анализ ACT1-CUP1 может и использовался в качестве генетического скрининга мутаций в факторах сплайсинга. Например, Prp8p, самый большой сплайсинговый белок, служит платформой, на которой ядро РНК сплайсеосомы катализирует реакцию сплайсинга. Это было выведено, в частности, из того, как мутанты Prp8p улучшили или уменьшили сплайсинг различных репортеров ACT1-CUP1 10,11,12,13,14,15,16,17. Другие белковые компоненты сплайсеосомы также были исследованы с использованием ACT1-CUP1, включая Hsh155p, Cwc2p, Cef1p и Ecm2p 18,19,20,21,22,23,24,25. Энергетические пороги для Prp16p и четырех других АТФаз, участвующих в сплайсеосомальном переходе, также были изучены с помощью этого анализа 9,26,27,28,29,30. Малые ядерные РНК (snRNAs) также были широко изучены с использованием ACT1-CUP1 для идентификации последовательностей пре-мРНК, которые они координируют, и изменений во вторичной структуре, которые snRNAs претерпевают во время сплайсинга 3,31,32,33,34,35,36,37.

Анализ ACT1-CUP1 требует штамма дрожжей, где все копии гена CUP1 были выбиты. Поскольку CUP1 может иметь высокий номер копии 6,38, подготовка полного нокаутирующего штамма может потребовать нескольких раундов или обширного скрининга. В результате штаммы дрожжей cup1Δ часто распределялись между лабораториями, как и репортеры.

Если мутации в факторе сплайсинга оцениваются из плазмидной копии, ген дикого типа для этого фактора должен быть выбит. Кроме того, дрожжевой фон должен позволять выбирать по меньшей мере две плазмиды, одна из которых содержит репортер ACT1-CUP1, исторически на плазмиде для отбора лейкодина питательных веществ, а другая содержит мутацию или возмущение в сплайсинговом механизме, который будет изучен (рисунок 2). Обычно в одном анализе несколько штаммов дрожжей, каждый из которых несет возмущение сплайсинга запроса (QSP) и другого репортера, проверяют влияние запроса на сплайсинг.

Независимые переменные в анализе ACT1-CUP1 позволяют исследователю оценить тяжесть QSP. Этими независимыми переменными являются концентрация меди и выбор нескольких неконсенсусных сращивающих репортеров. Во-первых, поскольку штаммы дрожжей выращиваются на пластинах, содержащих диапазон концентраций меди (рисунок 2), настройка анализа включает выбор градиента используемых концентраций. Исследования могут использовать градиент концентрации меди курса, чтобы получить начальное считывание жизнеспособности, а затем повторить анализ с более тонким градиентом, чтобы определить тонкие различия в жизнеспособности. Второй переменной является широкий диапазон репортеров ACT1-CUP1, которые можно протестировать (рисунок 1 и таблица 1). Если QSP влияет на жизнеспособность дрожжей по-разному в присутствии неконсенсусного репортера по сравнению с диким типом, можно сделать вывод, что QSP влияет на шаг в сплайсинге или область сплайсеосомы, важную во время распознавания или обработки этой области интрона.

Набор инструментов для дрожжей обширен, и анализ ACT1-CUP1 является неотъемлемой частью исследований сращивания. Анализ ACT1-CUP1 часто выполняется вместе с более глубоким генетическим, структурным и / или биохимическим анализом воздействия QSP. Поскольку эти более подробные исследования, как правило, имеют более длительную процедуру и / или более высокую цену, частым подходом является скрининг интересных мутантов с ACT1-CUP1 в первую очередь.

Здесь представлен протокол анализа ACT1-CUP1, включая подготовку медной пластины. Этот анализ дает исследователям первоначальный ответ на влияние QSP на сплайсинг и на какие интронные области больше всего влияет возмущение.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Конструкция штамма дрожжей

  1. Генерировать или получать штамм S. cerevisiae , фон которого включает leu2 и cup1Δ. Чтобы создать этот фон, используйте хорошо зарекомендовавший себя дрожжевой метод, в котором используется ацетат лития и одноцепочечная ДНК39.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Штаммы гаплоидных дрожжей могут содержать одну, две или более копий CUP1 6,38. Обратитесь к геномной информации для выбранного штамма дрожжей при разработке нокаутирующих праймеров для фланкирования местоположения (местоположений) гена CUP1.
  2. Выполните трансформацию дрожжей для включения QSP либо через геномное включение, либо на плазмиду. Используйте хорошо зарекомендовавший себя протокол, подобный описанным в предыдущих исследованиях 40,41,42.
  3. Выполните трансформацию дрожжей с полученным штаммом (штаммами) из шага 1.2. , чтобы добавить желаемую репортерную плазмиду ACT1-CUP1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки должны поддерживаться на пластинах и средах с выпадением лейцина (-Leu) для обеспечения удержания репортерных плазмид ACT1-CUP1 после этой трансформации.
  4. Выполните шаги 1.2. и 1.3. для каждой тестируемой QSP и каждой репортерной плазмиды ACT1-CUP1, включая контрольные штаммы.

2. Подготовка медной пластины

  1. Выберите диапазон концентрации меди, который подходит репортерам для тестирования (см. Таблицу 1 для часто используемой летальности репортеров).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Примером всеобъемлющего диапазона концентраций меди является 30 различных концентраций меди 0 мМ, 0,025 мМ, 0,05 мМ, 0,075 мМ, 0,1 мМ, 0,15 мМ, 0,2 мМ, 0,25 мМ, 0,3 мМ, 0,35 мМ, 0,4 мМ, 0,45 мМ, 0,5 мМ, 0,6 мМ, 0,7 мМ, 0,8 мМ, 0,9 мМ, 1,0 мМ, 1,1 мМ, 1,2 мМ, 1,3 мМ, 1,4 мМ, 1,5 мМ, 1,6 мМ, 1,7 мМ, 1,8 мМ, 1,9 мМ, 2,0 мМ, 2,25 мМ и 2,5 мМ Cu2+.
  2. Сделайте стандартный раствор из 1 M CuSO4 и стерильного фильтра через стерильный фильтр PES (полиэфирсульфон) 0,22 мкм.
  3. На желаемую медную пластину приготовьте разбавление 2 мл запаса CuSO4 в стерильной воде.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку пластина с 0 мМ Cu2+ всегда будет анализироваться и отображаться в качестве эталона, рекомендуется сделать две пластины 0 мМ Cu2+ , одну в начале и одну в конце стадии покрытия (шаг 3.4.).
    1. Рассчитайте количество запасов для конечной желаемой концентрации меди в 40 мл объема пластины (Дополнительная таблица 1).
    2. Добавьте расчетное количество стерильной воды и 1 M CuSO4 бульона в стерильную пробирку объемом 2 мл.
  4. Заливные пластины для анализа ACT1-CUP1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативой приведенному ниже протоколу является первоначальное объединение среды и агара в большом контейнере и аликвоты после автоклавирования в меньшие контейнеры для достижения различных концентраций меди для каждой пластины. Какой бы метод ни был принят, важно убедиться, что концентрация среды согласована между всеми пластинами, несмотря на то, что каждая из них имеет разную концентрацию меди.
    1. Пометьте каждую пустую пластину, которую нужно налить, конечной концентрацией меди, которую она будет содержать. Подготовьте по меньшей мере одну квадратную пластину на каждую концентрацию меди для испытания.
    2. Нанесите этикетку на бутылку объемом 100 мл на каждую концентрацию меди, подлежащую испытанию.
    3. В каждый флакон добавьте 790 мг агара (2% мас./об.агара) и перемешивание.
    4. В большом стакане объедините среду роста -Leu для всех медных пластин, которые будут разливаться. На каждую пластину растворяют 265 мг дрожжевого азотистого основания (YNB) и 64 мг выпадающей смеси без лейцина (и любых других питательных веществ, которые могут потребоваться для поддержания плазмиды QSP в клетках) в 34 мл деионизированной воды.
    5. Добавьте 34 мл раствора среды для роста -Leu в каждый подготовленный флакон объемом 100 мл и крышку с алюминиевой фольгой. Нанесите маркировку на фольгу с предполагаемой концентрацией меди.
    6. Автоклав для стерилизации и растворения агара с использованием рекомендуемого жидкого цикла для автоклава.
    7. Как можно быстрее добавьте в каждый флакон 4 мл 20% мас./об. глюкозы (стерильно отфильтрованной).
    8. Сопоставьте этикетки и добавьте 2 мл разбавления CuSO4 в предполагаемую бутылку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку десятки медных пластин могут быть изготовлены одновременно, каждая с разной концентрацией, маркировка всех бутылок, трубок и пластин четко с предполагаемой концентрацией меди предотвратит путаницу во время заливки пластин.
    9. Используйте перемешиваемую пластину для смешивания в течение ~ 30 с и налейте или пипеткой 35 мл в маркированную тарелку, избегая пузырьков. Дайте остыть перед хранением или использованием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Часто пластины изготавливают за 1 день или 2 дня до анализа и хранят при 4 °C до нескольких часов перед использованием. Пластины должны быть при комнатной температуре (RT) до начала покрытия (шаг 3.4.).

3. Анализ ACT1-CUP1

  1. Уберите желаемые нагрузки на пластины -Leu.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с криоматериалами следует позаботиться о том, чтобы клетки были достаточно восстановлены после хранения перед нанесением покрытия. Рекомендуемая процедура для этого заключается в том, чтобы удалить криогенный запас и дать ему расти в течение 3-5 дней при 30 ° C. Затем отложите небольшой образец и дайте ему расти еще 2-3 дня при 30 °C.
  2. Выращивайте ночные культуры в 10 мл среды.
    1. Подготовьте среду для роста -Leu, используя те же соотношения, которые описаны в шаге 2.4.2. На 10 мл среды добавляют 66 мг дрожжевого азотистого основания (YNB) и 16 мг выпадающей смеси минус лейцин к 9 мл деионизированной воды. Пропустите через стерильный фильтр PES 0,22 мкм.
    2. На штамм дрожжей добавляют 9 мл ростовой среды лея и 1 мл 20% мас./об. глюкозы (стерильно фильтрованной) в стерильную коническую трубку объемом 50 мл.
    3. Используя стерильную палочку или наконечник пипетки, соберите небольшой (~ 1 мм круглый) образец дрожжей и привите среду.
    4. Встряхните все культуры на ночь при 180 об/мин при 30 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При наличии ротаторы можно использовать вместо шейкера.
  3. Разводят штаммы до ОД600 0,5 ± 0,05 в 10% глицерине.
    1. На штамм добавляют 100 мкл культуры в кювету, содержащую 900 мкл воды.
    2. Измерьте OD600 с помощью спектрофотометра.
    3. Рассчитать необходимое разбавление при ОД600 0,5 в конечном объеме 2 мл.
    4. Развести каждый штамм доОД 600 0,5 в 10% глицерине (стерильном).
    5. Повторное измерение OD600 для подтверждения плотности клеток находится в пределах желаемого диапазона 0,5 ± 0,05.
  4. Нанесите деформации на медные пластины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для покрытия деформаций могут быть использованы различные методы, включая ручную пипетку объемов 5-10 мкл, использование повторного или многоканального пипетки или штамповку с помощью контактного репликатора. Этот последний метод описан ниже, хотя большинство шагов будут одинаковыми независимо от метода.
    1. Установите стерильное рабочее место и зажженную горелку Бунзена.
    2. Для 48-контактного репликатора пипетку 200 мкл каждой разбавленной деформации в отдельную скважину из 96-луночной пластины. Заполните пустые места в сетке 6 x 8 200 мкл 10% глицерина (стерильного).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пример схемы покрытия для девяти штаммов дрожжей приведен в дополнительной таблице 2.
    3. Окуните репликатор в неглубокую посуду с 95% (v/v) этанолом и зажгите для стерилизации. Дайте ему остыть в течение не менее 2 минут после того, как пламя погаснет, чтобы избежать теплового удара по клеткам.
    4. Поместите четыре пластины рядом с горелкой и снимите крышки.
    5. Опустите репликатор в пластину с 96 лунками и поднимите ее одним быстрым движением.
    6. Аккуратно положите на тарелку и слегка покачивайтесь взад и вперед, чтобы облегчить хорошую передачу.
    7. Поднимите вверх одним быстрым движением и поместите в точно такую же ориентацию в 96-луночную плиту.
    8. Повторите для трех других пластин. Повторите процесс погружения репликатора в этанол, пылая для стерилизации и ожидая, чтобы остыть каждые четыре пластины.
    9. После того, как пластина была покрыта, плавно двигайтесь в сторону, но все еще внутри стерилизующего зонтика пламени.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется делать разбавления дрожжами и обшивку возле пламени. Пластины могут легко загрязняться во время сушки.
    10. Дайте пластинам полностью высохнуть, прежде чем надеть крышки, обычно через 3-5 минут.
    11. Инкубировать пластины в течение 3 дней при 30 °C.

4. Сбор и анализ данных

  1. Выньте пластины из инкубатора и визуально осмотрите их.
  2. Записывайте изображения пластин с помощью доступной камеры или другой цифровой системы визуализации.
  3. Регистрируется (или балл) для каждого штамма наблюдается последний наблюдаемый рост концентрации меди.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки способны сращиваться и оставаться жизнеспособными до этой концентрации. Для консистенции всегда используйте один и тот же метод, либо на глаз, либо из изображений пластин, чтобы оценить последнюю жизнеспособную концентрацию меди. Очень маленькие колонии иногда видны глазом, но не на изображении. Разница между непосредственным визуальным осмотром или записью с изображений невелика, обычно это шаг в градиенте. Поскольку изображения колоний часто используются в публикациях, рекомендуется озвучивать изображения.
  4. Объедините данные из нескольких анализов ACT1-CUP1 для одного и того же штамма, чтобы сделать выводы о том, как QSP влияет на сплайсинг.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Данные публикации обычно показывают изображения колоний дрожжей при концентрации 0 мМ Cu2+ , последнюю жизнеспособную концентрацию меди и последующую концентрацию, в которой колония умерла. Данные также могут отображаться в виде гистограммы с полосами ошибок для стандартного отклонения между репликациями. Данные не нуждаются в нормализации, но могут быть установлены путем установки жизнеспособности контроля коэффициента сплайсинга WT равным 1 и сравнения эффекта введенной мутации (мутаций).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Анализы роста, такие как ACT1-CUP1, требуют визуальной, сравнительной оценки нескольких колоний. Здесь каждый штамм выращивали до насыщения в течение ночи, разбавляли до OD600 0,5 и покрывали на 20 пластинах, содержащих диапазон концентраций меди от 0 мМ до 1,1 мМ CuSO4 (рисунок 3). Этот диапазон меньше, чем тот, который указан в протоколе, поскольку он позволяет полностью оценить влияние QSP и репортеров ACT1-CUP1, используемых и описанных ниже. Пластины были сфотографированы и оценены (рисунок 3 и дополнительная таблица 3).

Для этого репрезентативного эксперимента дрожжевой фон включает нарушенный ген ADE2 , в результате чего колонии имеют различные оттенки красного (рисунок 3A, B). Это распространенное нарушение дрожжей в пути производства аденозина вызывает накопление красного пигментированного предшественника аденозина. Таким образом, красный цвет является показателем зрелости колонии дрожжей (то есть количества и возраста присутствующих клеток). Для целей анализа ACT1-CUP1 красный цвет может служить индикатором загрязнения грибковых видов, если они белого или желтого цвета. Цвет может быть вторичным подтверждением толерантности к меди, так как более жизнеспособными колониями будет более глубокий красный оттенок.

При обшивке с помощью штифтового репликатора существует несколько распространенных аберраций. Во-первых, можно создавать колонии овальной формы, если репликатор поднимается вверх при движении влево или вправо (рисунок 3B, оранжевая стрелка). Кроме того, микроколонии могут также образовываться из небольших капель клеточного раствора, если репликатор штифта вводится под углом или если встряхнуться над пластиной (рисунок 3B, красная стрелка). Часто безобидные, иногда, микроколонии могут смешиваться с штампованной колонией, и это препятствует интерпретации этой колонии. Дополнительные проблемы с покрытием включают недостаточное время ожидания после стерилизации для охлаждения штифтов репликатора и недостаточный контакт между пластиной и штифтами, что приводит к плохой передаче питательных сред. В обоих случаях на пластине будет расти несколько клеток, если таковые имеются, в том числе для контрольных штаммов, содержащих репортер дикого типа. Как и в случае с любым анализом роста, независимо от метода покрытия, важно выполнить ACT1-CUP1 в трех экземплярах, чтобы подтвердить, что результаты являются последовательными и повторяемыми. В идеале эти различные реплики должны быть выполнены на медных пластинах, подготовленных в разное время, чтобы обеспечить воспроизводимость.

Для этих репрезентативных экспериментов был выбран репортер A3c, чтобы подчеркнуть влияние неконсенсусной последовательности на толерантность меди при отсутствии дополнительных возмущений сплайсеосом. A3c значительно уменьшает количество производимой мРНК CUP1 , поскольку он нарушает способность сплайсеосомы распознавать и использовать 5' SS15. Дрожжи с репортером A3c сохранились до 0,15 мМ Cu2+, в то время как репортерные клетки дикого типа сохраняли жизнеспособность до конца диапазона протестированных концентраций меди (рисунок 3C). Репортер дикого типа, содержащий клетки, вырастает до 2,5 мМ Cu2+ без влияния на жизнеспособность (данные не показаны).

U6 snRNA является существенным каталитическим компонентом сплайсеосомы. Многочисленные исследования использовали ACT1-CUP1 для изучения влияния мутаций на эту РНК 16,32,34. Для этого исследования были изучены три последовательности snRNA U6, а именно последовательность дикого типа (WT), позиция 57, замещенная из уридина в цитозин (U57c), и позиция 57, замещенная из уридина в аденозин (U57a) (рисунок 3 и рисунок 4). В сочетании с репортерами ACT1-CUP1, которые влияют на каталитические шаги в сплайсинге, было определено, что U57c поддерживает первую каталитическую стадию, а U57a выступает за прогрессию ко второй стадии16,32.

Для настройки анализа ACT1-CUP1 был создан штамм с удаленной геномной копией snRNA U6 и включенными на плазмидах последовательностями дикого типа или мутировавшими последовательностями snRNA U6. Поскольку U6 snRNA является важным компонентом клетки, три отдельных преобразования были использованы для того, чтобы сначала нокаутировать геномную snRNA U6 при сохранении жизнеспособности клеток, впоследствии ввести мутировавшие U6 snRNAs на плазмиды и, наконец, добавить репортеров ACT1-CUP1. Для первой трансформации штамм дрожжей cup1Δ был использован в нокауте геномной копии snRNA U6 при одновременном добавлении snRNA WT U6 на плазмиду маркера отбора URA для поддержания жизнеспособности. Последующее преобразование добавило либо дикую, либо мутировавшую snRNA U6 на плазмиду маркера отбора TRP, выбирая по маркеру URA через выбор 5-FOA. Таким образом, были получены три штамма дрожжей cup1Δ , каждый из которых имеет одну из последовательностей snRNA U6, а именно WT, U57a и U57c. Окончательная трансформация дрожжей для каждого штамма добавила одну из трех различных репортерных плазмид ACT1-CUP1, которые будут использоваться в этом эксперименте. Выбранными репортерами были репортер дикого типа A3c и мутация аденозина в гуанин (BS-G). В общей сложности для этого эксперимента было сгенерировано девять штаммов, каждый из которых содержал одну последовательность snRNA U6 и один репортер ACT1-CUP1 (Дополнительная таблица 4 и Дополнительная таблица 5).

Результаты показали, что различные основания в позиции U6 snRNA 57 оказывают уникальное воздействие на сплайсеосому в сочетании с мутацией 5' SS или BS (рисунок 4). Репортеры A3c и BS-G в основном ингибируют сплайсинг, стабилизируя конформацию первого каталитического шага14,15. Таким образом, U57c является аддитивной мутацией, снижающей толерантность к меди в сочетании с любым из этих репортеров (рисунок 4B). Напротив, U57a увеличивает толерантность к меди, поскольку способствует переходу ко второй стадии (рисунок 4B)16,32. Снижение толерантности к меди с U57a репортерного штамма BS-G по сравнению с U6 snRNA WT подчеркивает вероятное вторичное влияние BS-G на второй шаг сплайсинга16.

Эти результаты также подчеркивают качественный характер этого анализа и почему следует тестировать последовательности запросов и репортеров дикого типа. В то время как общая картина повышенной или пониженной толерантности к меди справедлива для этих мутаций snRNA U6 по сравнению с snRNA дикого типа U6, точная концентрация меди, до которой выживают клетки, может различаться между исследованиями (таблица 1) и различалась между этими репрезентативными данными и другими опубликованными результатами. Это, вероятно, связано с фоном штамма, содержащего удаление CUP1 , но также может быть связано с общим состоянием штаммов перед покрытием (т. Е. Как скоро после генерации штамма или восстановления из криоанализа был выполнен анализ), различиями в том, как готовятся пластины, и изменчивостью между различными инкубаторами. Аналогичная дисперсия была отмечена у Mayerle et al. для мутаций запроса Prp8 в литературе43. Таким образом, сравнение тенденций толерантности меди может быть выполнено для различных анализов ACT1-CUP1, но числовое сравнение концентраций меди должно проводиться только в одной лаборатории и, иногда, с одним и тем же набором медных пластин.

Figure 1
Рисунок 1: Конструкция репортера ACT1-CUP1. Концентрация сращенного репортера напрямую коррелирует с толерантностью дрожжевой меди. Диаграмма репортера включает в себя три участка сращивания 5' сращивания (5' SS), филиала (BS) и 3' сращивания (3' SS). Показаны последовательности консенсуса дрожжей для этих участков, причем те, которые предназначены для расщепления, выделены жирным шрифтом и пронумерованы в зависимости от их местоположения в интроне. Обычно используемые неконсенсусные репортерные последовательности ACT1-CUP1 показаны в нижнем регистре под соответствующими консенсусными последовательностями и перечислены в таблице 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Рабочий процесс анализа ACT1-CUP1. Для этого анализа штамм дрожжей должен быть cup1Δ leu2 и содержать желаемую репортерную плазмиду ACT1-CUP1 и ген QSP, помеченный gene на рисунке. Ген QSP должен быть либо геномно вставлен, либо на плазмиде. Протокол с использованием пин-репликатора включает в себя четыре шага для подготовки дрожжевых клеток. Шаг 1 заключается в том, чтобы вырастить клетки до насыщения. Этап 2 заключается в измерении OD600 культуры и разбавлении до OD600 0,5. Шаг 3 заключается в распределении по 96-луночной плите. Этап 4 заключается в нанесении пластин на пластины, содержащие возрастающие концентрации меди (указывается с увеличением синего цвета). Шаг 1, шаг 2 и шаг 4 будут идентичны для ручной пипетки. После покрытия пластины инкубируют в течение 3 дней при 30 °C, а затем оценивают на жизнеспособность. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Репрезентативные представления данных ACT1-CUP1. Для этого эксперимента дрожжевые сплайсеосомы оспариваются двумя различными мутациями snRNA U6 и тестируются в присутствии трех неконсенсусных репортеров. Три копии этого анализа представлены на одних и тех же пластинах в демонстрационных целях. Рекомендуется для этого анализа делать реплики на отдельных пластинах и в отдельные дни. (A) Показан завершенный анализ с градиентом меди от 0 мМ до 1,1 мМ на 20 пластинах. По мере увеличения концентрации меди штаммы с более низким сращиванием показывают снижение слияния до такой степени, что концентрация меди становится смертельной. Дрожжевой фон был ade2, и, таким образом, зрелые колонии имеют красный цвет. (B) Сравнение одних и тех же пластин при 0 мМ и 0,1 мМ CuSO4 , изображенных с помощью портативной камеры, с цифровой системой визуализации. Это пример того, как ряд неконсенсусных репортеров можно сравнить бок о бок и с репортером дикого типа. Общие наблюдения на пластинах включают ложное падение питательных сред, которые упали с репликатора штифта (красная стрелка) и небольшое овальство колоний из-за скольжения штифта по поверхности пластины или движения пластины до того, как капля культуры достаточно высохнет (оранжевая стрелка). (C) Пример влияния репортера A3c на жизнеспособность клеток по сравнению с репортером дикого типа. Изображения, подобные тем, которые показаны в пункте (B), обрезаются и выравниваются, чтобы подчеркнуть различия в росте при различных концентрациях меди. Допуск на медь репортерной деформации A3c снижается до 0,15 мМ Cu2+ по сравнению с жизнеспособностью репортерного штамма дикого типа до конца тестируемого диапазона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Репрезентативные результаты мониторинга ACT1-CUP1 мониторинга сплайсинга в дрожжах с мутациями компонентов сплайсинга. (A) Схема РНК-компонентов активного сайта сразу после первой каталитической стадии. SnRNAs U2 и U6 дуплексированы, в результате чего 5' SS и BS интрона находятся в непосредственной близости. Интронная связь между A259 (BS) и G1 (5' SS) обозначена оранжевой точкой. Места замен неконсенсусных последовательностей в репортере ACT1-CUP1, протестированном в этом эксперименте, выделены жирным черным шрифтом. Мутированное положение в U6 snRNA (U57) выделено жирным зеленым цветом, а замещенные основания — синим или розовым. (B) Одна из возможностей представления данных ACT1-CUP1 в публикации включает несколько изображений колоний из соответствующих концентраций Cu2+ . Репортер WT пережил концентрацию меди, протестированную для всех трех штаммов snRNA U6. (C) Гистограмма, сравнивающая эффекты на репортера и на мутанта u6 snRNA. Нормализация выполняется для каждого репортера ACT1-CUP1 путем установки медного допуска snRNA U6 WT к 1 и расчета соотношения для мутаций U57c и U57a. Полосы ошибок представляют стандартное отклонение от трех реплик. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Дополнительные методы для дополнения результатов ACT1-CUP1. (A) Удлинение грунтовки выполняется с помощью отжига грунтовки в экзоне 3' ACT1 и последующего удлинения в интрон. В этом примере грунтовка помечена красителем IR700, а расширение грунтовки выполнено так, как описано в 20,21. Праймерное удлинение snRNA U6 выполняется в той же реакции, чтобы служить в качестве контроля нагрузки. 7% денатурирующий гель 19:1 бис/акриламид разрешает продукты пре-мРНК, мРНК и лариата после растяжения праймера с использованием устройства визуализации почти инфракрасного геля, как описано в van der Feltz et al.22. Интенсивность различных полос может быть использована для измерения общей эффективности сращивания, а также для различения различий в сплайсинге, которые происходят на первом или втором этапе, как количественно определено с помощью ImageJ44 или другого программного обеспечения для количественной оценки гелевых полос. Как эффективность сращивания, так и эффективность шага сращивания рассчитываются, как описано в Query и Konarska14. (B) Мутационные экраны с репортерами ACT1-CUP1 могут использовать отбор меди для идентификации мутантов, которые влияют на сплайсинг. Затем интересующий ген (гены) может быть секвенирован в полученных штаммах, чтобы определить, произошла ли мутация в этом гене. (C) Изменения могут быть внесены в репортера за пределами мест сращивания для мониторинга изменений сплайсинга в отношении структуры интрона, экзонных последовательностей, количества экзонов или ядерного экспорта несплакированной РНК. Области серого цвета — это необязательные области расширения для включения в репортер, а области красного цвета — это области, в которых последовательность и структурные изменения могут быть проверены на предмет их потенциального влияния на сплайсинг с использованием анализа ACT1-CUP1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Имя репортера Регион интроника Последовательность Последняя жизнеспособная концентрация Cu2+ (мМ)
ВТ 5' ГУАУГУ > 2.5
Г1а 5ʹ a УАУГУ 0,0133 или 0,0532
А3с 5ʹ ГУcУГУ 0,15^,18 или 0,216
Г5а 5ʹ ГУАУАУ 0,303 или 0,259
ВТ Филиал-сайт ОАКУААК > 2.5
Ц256а Филиал-сайт UAаУААК 0,1526 или 0,1832
U257c/a Филиал-сайт Контрольучетных записей c/aAAC 0,226 или 0,332 или 0,545 0,059,32
А258с/у Филиал-сайт УАКУк/уАС 0,826 1,045 или 1,646
БС-С Филиал-сайт ОАКУАcC 0,153 или 0,1832,56 или 0,226
БС-Г Филиал-сайт ОАКУАгС 0,0516,32 или 0,625 или 0,846
Ц260г Филиал-сайт УАКУААг 0,826
ВТ 3' УАГ > 2.5
У301г 3ʹ г АГ 0.1518
А302г/у 3' Уг/уг 0,0139 0,07516 или 0,1824
G303c 3ʹ UAc 0,0532

Таблица 1: Список распространенных репортеров и летальность концентрации Cu2+. Есть более 100 цитат Лессера и Гатри3. Хотя небольшая подборка этих цитат была использована для создания этой таблицы, они подчеркивают общую тенденцию незначительных и умеренных различий между исследованиями в зарегистрированных концентрациях жизнеспособности меди. В ACT1-CUP1 важно сравнить белок или РНК дикого типа с мутантами с одинаковым фоном штамма дрожжей, используя опубликованные концентрации в качестве руководства, но ожидая, что наблюдаемые концентрации могут отличаться. Данные, собранные из рисунка 3 (^) и нескольких публикаций, аннотированных следующими цитатами 3,9,16,18,24,25,26,32,45,46.

Дополнительная таблица 1: Содержание одной медной пластины и пример расчетов, выполненных для достижения разбавления меди от 0 мМ до 2,5 мМ из запаса CuSO4 1 М. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительная таблица 2: Пример схемы покрытия для 48-контактного репликатора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительная таблица 3: Пример жизнеспособности, полученной из медных пластин, инкубированных в течение 3 дней при 30°C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительная таблица 4: Список штаммов дрожжей, используемых для получения репрезентативных данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительная таблица 5: Список плазмид, используемых для генерации репрезентативных данных. U6 snRNA плазмиды сгенерированы и опубликованы в предыдущих исследованиях22,47. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ACT1-CUP1 является анализом роста, и необходимо позаботиться о том, чтобы наблюдаемые различия в росте можно было отнести только к дефектам сращивания. Все штаммы должны обрабатываться аналогичным образом перед нанесением покрытия, в том числе иметь одинаковую длину и тип роста и условий хранения. При использовании чувствительных к температуре штаммов анализы ACT1-CUP1 следует проводить только в условиях, когда эти штаммы растут сопоставимо с диким типом. Соответственно, для компонента QSP рекомендуется иметь идентичные дрожжевые фоны и уровни экспрессии гена (генов) QSP, чтобы не затуманивать интерпретацию результатов. При рассмотрении количества QSP и репортеров для использования не рекомендуется анализировать более 30 штаммов одновременно с помощью метода пин-репликатора. С дополнительным временем для выполнения каждого шага клетки осядут, и результаты анализа будут непоследовательными из-за снижения жизнеспособности клеток.

В дополнение к ограничениям, которые ACT1-CUP1 по своей сути имеет в качестве анализа роста, QSP может оказывать более сложное влияние на сплайсинг, чем может быть решено с помощью этого метода. Поскольку сплайсинг является многоступенчатым процессом и факторы рециркулируются, наблюдаемый фенотип может привести к возмущению, влияющему на более чем одну стадию сплайсинга. Это справедливо даже для последующих анализов, которые могут следовать act1-CUP1, некоторые из которых описаны ниже. Данные будут выделять наиболее нарушенный этап процесса, даже если на другие этапы может влиять измененная функция фактора сплайсинга.

Расширение праймера репортеров ACT1-CUP1 было впервые использовано в оригинальной статье Лессера и Гатри и часто выполняется, если результаты ACT1-CUP1 показывают дефект роста3. Этот анализ нацелен на репортера и использует длину продуктов ПЦР для определения относительных количеств присутствующих несращенных, частично сращенных и полностью сращенных репортеров (рисунок 5A). Общая эффективность сращивания и то, влияет ли дефект сильнее на первую или вторую каталитическую стадию, рассчитываются путем взятия соотношений количества продукта ПЦР14. Например, 5- дюймовый репортер SS G5a сократил сплайсинг по сравнению с репортером дикого типа, но его эффективность первого и второго шага аналогична схеме с диким типом (рисунок 5A). Это указывает на дефект до первой каталитической стадии, возможно, в сборке сплайсеосом, потому что обе стадии затрагиваются аналогично31.

Новые анализы были разработаны на основе канонического анализа ACT1-CUP1, такого как скрининг мутантов, которые улучшают сплайсинг в присутствии других мутантов фактора сплайсинга и / или неконсенсусных последовательностей сплайсинга (рисунок 5B). Например, воздействие дрожжей, содержащих репортер ACT1-CUP1, на УФ-излучение, а затем выбор в присутствии меди дали мутанты Prp8 и Hsh155, которые улучшили сращивание неконсенсусных последовательностей14,19.

Расширяя изучение влияния участков сращивания и конститутивных факторов сплайсинга, зависимость роста CUP1 была использована для изучения множественного сплайсинга интронов, контроля ядерного экспорта и влияния UTR и других периферийных последовательностей на сплайсинг (рисунок 5C). Некоторые из этих исследований создали репортеров с CUP1 и другими интрон-содержащими дрожжевыми генами, которые могут иметь более сложные схемы сращивания для изучения влияния на интронную вторичную структуру и сращивание мультиинтронных транскриптов 48,49,50,51,52. Связь между сплайсингом и ядерным экспортом изучалась путем наличия либо сращенных, либо несращенных транскриптов, кодирующих CUP1 в кадре53,54. Длина пиримидинового пути и зависимость выбора места сращивания из-за определенных факторов также была проверенана 20,55,56,57. Эти и многие другие примеры подчеркивают универсальность ACT1-CUP1 и других анализов роста CUP1.

Анализ ACT1-CUP1 связывает возмущения со сложным циклом реакции с простым фенотипом роста с широким диапазоном чувствительности. Этот анализ наследия был использован несколькими лабораториями, чтобы заложить основу понимания цикла сплайсинга. Совсем недавно ACT1-CUP1 использовался для ответа на вопросы, которые возникают из-за богатства структурных данных, доступных в настоящее время 21,22,25. Структурные исследования сплайсеосом, связанных с неконсенсусными последовательностями, могут быть сопряжены с результатами ACT1-CUP1, чтобы интерпретировать, как коррелируют измененная структура и измененная функция. ACT1-CUP1 является идеальным первым экраном для сращивания мутаций, который может дополнять более сложный анализ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Автору нечего раскрывать.

Acknowledgments

Спасибо Аарону Хоскинсу и членам лаборатории Хоскинса в Университете Висконсин-Мэдисон за использование штаммов дрожжей и оборудования в генерации фигур 3-5. Спасибо Харприту Кауру и Синъян Фу за их проницательные комментарии к рукописи. Спасибо поддерживающим студентам, сотрудникам и преподавателям Северо-Западного университета во время написания, редактирования и съемок этой статьи. Спасибо Изабель Марасиган за помощь в съемках этого метода.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL sterile microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-129 Or comparable item from a different manufacturer.
2 mL sterile microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-138 Or comparable item from a different manufacturer.
50 mL sterile centrifuge tubes Fisher Scientific 07-201-332 Or comparable item from a different manufacturer.
96-well round bottom microplate Fisher Scientific 07-200-760 Or comparable item from a different manufacturer.
190 proof ethanol Fisher Scientific 22-032-600 Or comparable item from a different manufacturer.
500 mL Filter System (0.22 µm) CellTreat Scientific Products 229707 Or comparable item from a different manufacturer.
Agar Fisher Scientific BP1423-500 Any molecular grade agar will work.
Autoclave Tuttnauer 3870EA Or comparable item from a different manufacturer.
Bunsen burner Humboldt PN6200.1 Or comparable item from a different manufacturer.
Cell Density Meter VWR 490005-906 Or other spectral device that can measure absorbance at 595 nm.
Copper sulfate Pentahydrate Fisher Scientific LC134051 Or comparable item from a different manufacturer.
Digital imaging system Cytiva 29399481 ImageQuant 4000 (used for Figure 3),  Amersham ImageQuant 800, or comparable item from a different manufacturer.
Dropout mix (-Leu) USBiological Life Sciences D9525 Use the appropriate drop out mix for your experiment. It is possible you will be using a yeast nutrient marker for your query perturbation also. In that case, the drop out mix should be for that marker and Leu
D-Glucose Fisher Scientific AAA1682836 Or comparable item from a different manufacturer.
Gel band quantifying software Cytiva 29-0006-05 ImageQuant TL v8.1 (used for figure 5A) or comparable item from a different manufacturer.
Hand held camera Nikon D3500 Or comparable item from a different manufacturer.
Near infra-red gel imaging device Cytiva 29238583 Amersham Typhoon NIR (used for Figure 5a) or comparable item from a different manufacturer.
Laboratory grade clamp Fisher Scientific 05-769-7Q Or comparable item from a different manufacturer.
Laboratory grade stand and clamp Fisher Scientific 12-000-101 Or comparable item from a different manufacturer.
Magnetic stir bars Fisher Scientific 14-513-51 Or comparable item from a different manufacturer.
Pin replicator VP Scientific VP 407AH
Semi-micro disposable cuvettes VWR 97000-590 Or comparable item from a different manufacturer.
Shaker JEIO Tech IST-3075 Or comparable item from a different manufacturer.
Spectrophotometer Biowave 80-3000-45 Or any spectophotometer that can measure the absorbance at 600 nm.
Square plates VWR 102091-156 Circular plates may also be used though are more challenging if using a pin replicator.
Stir plate Fisher Scientific 11-520-16S Or comparable item from a different manufacturer.
Yeast nitrogen base USBiological Life Sciences Y2025 Or comparable item from a different manufacturer.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wahl, M. C., Will, C. L., Luhrmann, R. The spliceosome: Design principles of a dynamic RNP machine. Cell. 136 (4), 701-718 (2009).
  2. Wilkinson, M. E., Charenton, C., Nagai, K. RNA splicing by the spliceosome. Annual Review of Biochemistry. 89, 359-388 (2020).
  3. Lesser, C. F., Guthrie, C. Mutational analysis of pre-mRNA splicing in Saccharomyces cerevisiae using a sensitive new reporter gene, CUP1. Genetics. 133 (4), 851-863 (1993).
  4. Ng, R., Abelson, J. Isolation and sequence of the gene for actin in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (7), 3912-3916 (1980).
  5. Gallwitz, D., Sures, I. Structure of a split yeast gene: Complete nucleotide sequence of the actin gene in I. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (5), 2546-2550 (1980).
  6. Fogel, S., Welch, J. W., Cathala, G., Karin, M. Gene amplification in yeast: CUP1 copy number regulates copper resistance. Current Genetics. 7 (5), 347-355 (1983).
  7. Hamer, D. H., Thiele, D. J., Lemontt, J. E. Function and autoregulation of yeast copperthionein. Science. 228 (4700), 685-690 (1985).
  8. Winge, D. R., Nielson, K. B., Gray, W. R., Hamer, D. H. Yeast metallothionein. Sequence and metal-binding properties. Journal of Biological Chemistry. 260 (27), 14464-14470 (1985).
  9. Burgess, S. M., Guthrie, C. A mechanism to enhance mRNA splicing fidelity: The RNA-dependent ATPase Prp16 governs usage of a discard pathway for aberrant lariat intermediates. Cell. 73 (7), 1377-1391 (1993).
  10. Collins, C. A., Guthrie, C. Allele-specific genetic interactions between Prp8 and RNA active site residues suggest a function for Prp8 at the catalytic core of the spliceosome. Genes & Development. 13 (15), 1970-1982 (1999).
  11. Siatecka, M., Reyes, J. L., Konarska, M. M. Functional interactions of Prp8 with both splice sites at the spliceosomal catalytic center. Genes & Development. 13 (15), 1983-1993 (1999).
  12. Umen, J. G., Guthrie, C. Mutagenesis of the yeast gene PRP8 reveals domains governing the specificity and fidelity of 3' splice site selection. Genetics. 143 (2), 723-739 (1996).
  13. Grainger, R. J., Beggs, J. D. Prp8 protein: At the heart of the spliceosome. RNA. 11 (5), 533-557 (2005).
  14. Query, C. C., Konarska, M. M. Suppression of multiple substrate mutations by spliceosomal prp8 alleles suggests functional correlations with ribosomal ambiguity mutants. Molecular Cell. 14 (3), 343-354 (2004).
  15. Konarska, M. M., Vilardell, J., Query, C. C. Repositioning of the reaction intermediate within the catalytic center of the spliceosome. Molecular Cell. 21 (4), 543-553 (2006).
  16. Liu, L., Query, C. C., Konarska, M. M. Opposing classes of prp8 alleles modulate the transition between the catalytic steps of pre-mRNA splicing. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (6), 519-526 (2007).
  17. MacRae, A. J., et al. Prp8 positioning of U5 snRNA is linked to 5' splice site recognition. RNA. 24 (6), 769-777 (2018).
  18. Query, C. C., Konarska, M. M. CEF1/CDC5 alleles modulate transitions between catalytic conformations of the spliceosome. RNA. 18 (5), 1001-1013 (2012).
  19. Tang, Q., et al. SF3B1/Hsh155 HEAT motif mutations affect interaction with the spliceosomal ATPase Prp5, resulting in altered branch site selectivity in pre-mRNA splicing. Genes & Development. 30 (24), 2710-2723 (2016).
  20. Carrocci, T. J., Zoerner, D. M., Paulson, J. C., Hoskins, A. A. SF3b1 mutations associated with myelodysplastic syndromes alter the fidelity of branchsite selection in yeast. Nucleic Acids Research. 45 (8), 4837-4852 (2017).
  21. Kaur, H., Groubert, B., Paulson, J. C., McMillan, S., Hoskins, A. A. Impact of cancer-associated mutations in Hsh155/SF3b1 HEAT repeats 9-12 on pre-mRNA splicing in Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 15 (4), 0229315 (2020).
  22. vander Feltz, C., et al. Saccharomyces cerevisiae Ecm2 modulates the catalytic steps of pre-mRNA splicing. RNA. 27 (5), 591-603 (2021).
  23. Carrocci, T. J., Paulson, J. C., Hoskins, A. A. Functional analysis of Hsh155/SF3b1 interactions with the U2 snRNA/branch site duplex. RNA. 24 (8), 1028-1040 (2018).
  24. Hogg, R., de Almeida, R. A., Ruckshanthi, J. P., O'Keefe, R. T. Remodeling of U2-U6 snRNA helix I during pre-mRNA splicing by Prp16 and the NineTeen Complex protein Cwc2. Nucleic Acids Research. 42 (12), 8008-8023 (2014).
  25. Hansen, S. R., Nikolai, B. J., Spreacker, P. J., Carrocci, T. J., Hoskins, A. A. Chemical inhibition of pre-mRNA splicing in living Saccharomyces cerevisiae. Cell Chemical Biology. 26 (3), 443-448 (2019).
  26. Xu, Y. Z., Query, C. C. Competition between the ATPase Prp5 and branch region-U2 snRNA pairing modulates the fidelity of spliceosome assembly. Molecular Cell. 28 (5), 838-849 (2007).
  27. Staley, J. P., Guthrie, C. An RNA switch at the 5' splice site requires ATP and the DEAD box protein Prp28p. Molecular Cell. 3 (1), 55-64 (1999).
  28. Bousquet-Antonelli, C., Presutti, C., Tollervey, D. Identification of a regulated pathway for nuclear pre-mRNA turnover. Cell. 102 (6), 765-775 (2000).
  29. Villa, T., Guthrie, C. The Isy1p component of the NineTeen complex interacts with the ATPase Prp16p to regulate the fidelity of pre-mRNA splicing. Genes & Development. 19 (16), 1894-1904 (2005).
  30. Mayas, R. M., Maita, H., Staley, J. P. Exon ligation is proofread by the DExD/H-box ATPase Prp22p. Nature Structure and Molecular Biology. 13 (6), 482-490 (2006).
  31. Lesser, C. F., Guthrie, C. Mutations in U6 snRNA that alter splice site specificity: Implications for the active site. Science. 262 (5142), 1982-1988 (1993).
  32. McPheeters, D. S. Interactions of the yeast U6 RNA with the pre-mRNA branch site. RNA. 2 (11), 1110-1123 (1996).
  33. Perriman, R. J., Ares, M. Rearrangement of competing U2 RNA helices within the spliceosome promotes multiple steps in splicing. Genes & Development. 21 (7), 811-820 (2007).
  34. Mefford, M. A., Staley, J. P. Evidence that U2/U6 helix I promotes both catalytic steps of pre-mRNA splicing and rearranges in between these steps. RNA. 15 (7), 1386-1397 (2009).
  35. Hilliker, A. K., Mefford, M. A., Staley, J. P. U2 toggles iteratively between the stem IIa and stem IIc conformations to promote pre-mRNA splicing. Genes & Development. 21 (7), 821-834 (2007).
  36. Wu, G., et al. Pseudouridines in U2 snRNA stimulate the ATPase activity of Prp5 during spliceosome assembly. EMBO Journal. 35 (6), 654-667 (2016).
  37. Crotti, L. B., Bacikova, D., Horowitz, D. S. The Prp18 protein stabilizes the interaction of both exons with the U5 snRNA during the second step of pre-mRNA splicing. Genes & Development. 21 (10), 1204-1216 (2007).
  38. Fogel, S., Welch, J. W. Tandem gene amplification mediates copper resistance in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (17), 5342-5346 (1982).
  39. Gardner, J. M., Jaspersen, S. L. Manipulating the yeast genome: Deletion, mutation, and tagging by PCR. Methods Molecular Biology. 1205, 45-78 (2014).
  40. JoVE. Yeast Transformation and Cloning. In Biology I: yeast, Drosophila and C. Elegant. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2021).
  41. Gietz, R. D., Woods, R. A. Yeast transformation by the LiAc/SS Carrier DNA/PEG method. Methods Molecular Biology. 313, 107-120 (2006).
  42. Gietz, R. D., Woods, R. A. Genetic transformation of yeast. Biotechniques. 30 (4), 816 (2001).
  43. Mayerle, M., et al. Structural toggle in the RNaseH domain of Prp8 helps balance splicing fidelity and catalytic efficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 4739-4744 (2017).
  44. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  45. Beier, D. H., et al. Dynamics of the DEAD-box ATPase Prp5 RecA-like domains provide a conformational switch during spliceosome assembly. Nucleic Acids Research. 47 (20), 10842-10851 (2019).
  46. vander Feltz, C., DeHaven, A. C., Hoskins, A. A. Stress-induced pseudouridylation alters the structural equilibrium of yeast U2 snRNA Stem II. Journal of Molecular Biology. 430 (4), 524-536 (2018).
  47. Rodgers, M. L., Didychuk, A. L., Butcher, S. E., Brow, D. A., Hoskins, A. A. A multi-step model for facilitated unwinding of the yeast U4/U6 RNA duplex. Nucleic Acids Research. 44 (22), 10912-10928 (2016).
  48. Stutz, F., Rosbash, M. A functional interaction between Rev and yeast pre-mRNA is related to splicing complex formation. EMBO Journal. 13 (17), 4096-4104 (1994).
  49. Libri, D., Lescure, A., Rosbash, M. Splicing enhancement in the yeast rp51b intron. RNA. 6 (3), 352-368 (2000).
  50. Libri, D., Stutz, F., McCarthy, T., Rosbash, M. RNA structural patterns and splicing: Molecular basis for an RNA-based enhancer. RNA. 1 (4), 425-436 (1995).
  51. Howe, K. J., Kane, C. M., Ares, M. Perturbation of transcription elongation influences the fidelity of internal exon inclusion in Saccharomyces cerevisiae. RNA. 9 (8), 993-1006 (2003).
  52. Cuenca-Bono, B., et al. SUS1 introns are required for efficient mRNA nuclear export in yeast. Nucleic Acids Research. 39 (19), 8599-8611 (2011).
  53. Scherrer, F. W., Spingola, M. A subset of Mer1p-dependent introns requires Bud13p for splicing activation and nuclear retention. RNA. 12 (7), 1361-1372 (2006).
  54. Hálová, M., et al. Nineteen complex-related factor Prp45 is required for the early stages of cotranscriptional spliceosome assembly. RNA. 23 (10), 1512-1524 (2017).
  55. Umen, J. G., Guthrie, C. A novel role for a U5 snRNP protein in 3' splice site selection. Genes & Development. 9 (7), 855-868 (1995).
  56. Crotti, L. B., Horowitz, D. S. Exon sequences at the splice junctions affect splicing fidelity and alternative splicing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 18954-18959 (2009).
  57. Perriman, R., Ares, M. Invariant U2 snRNA nucleotides form a stem loop to recognize the intron early in splicing. Molecular Cell. 38 (3), 416-427 (2010).

Tags

Генетика выпуск 184 сплайсинг премрнК Saccharomyces cerevisiae сплайсеосома ACT1-CUP1 анализ роста генетический скрининг мутантный экран неконсенсусная последовательность
Анализы ACT1-CUP1 определяют субстрат-специфическую чувствительность сплайсеосомальных мутантов в почковых дрожжах
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

van der Feltz, C. ACT1-CUP1 Assays… More

van der Feltz, C. ACT1-CUP1 Assays Determine the Substrate-Specific Sensitivities of Spliceosomal Mutants in Budding Yeast. J. Vis. Exp. (184), e63232, doi:10.3791/63232 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter