Summary
Il test ACT1-CUP1, un saggio di crescita del rame, fornisce una rapida lettura dello splicing dell'RNA messaggero precursore (pre-mRNA) e dell'impatto che i fattori di splicing mutante hanno sulla funzione spliceosomale. Questo studio fornisce un protocollo ed evidenzia la personalizzazione possibile per affrontare la questione di splicing di interesse.
Abstract
Le mutazioni introdotte nello spliceosoma o nel suo substrato hanno contribuito in modo significativo alla nostra comprensione della complessità della funzione spliceosomiale. Che siano correlate alla malattia o funzionalmente selezionate, molte di queste mutazioni sono state studiate utilizzando saggi di crescita nell'organismo modello Saccharomyces cerevisiae (lievito). Il saggio di crescita del rame specifico per lo splicing, o test ACT1-CUP1, fornisce un'analisi completa della mutazione a livello fenotipico. Il test ACT1-CUP1 utilizza reporter che conferiscono tolleranza al rame quando giuntati correttamente. Pertanto, in presenza di rame, i cambiamenti nella vitalità del lievito sono correlati ai cambiamenti nella produzione di mRNA attraverso lo splicing. In un tipico esperimento, lo spliceosoma del lievito viene sfidato con diversi reporter di splicing non consensuali e la mutazione del fattore di splicing di interesse per rilevare qualsiasi impatto sinergico o antitetico sullo splicing. Qui viene fornita una descrizione completa della preparazione della piastra di rame, della placcatura delle cellule di lievito e della valutazione dei dati. Viene descritta una selezione di esperimenti complementari, evidenziando la versatilità dei reporter ACT1-CUP1. Il test ACT1-CUP1 è uno strumento utile nella cassetta degli attrezzi di splicing grazie alla lettura diretta degli effetti mutazionali e alle possibilità comparative derivanti dall'uso continuo sul campo.
Introduction
Lo spliceosoma è una grande macchina biologica che catalizza la rimozione degli introni, regioni non codificanti nell'RNA messaggero precursore (pre-mRNA)1,2. Caratterizzare l'effetto di un mutante a singolo punto in 1 delle quasi 100 proteine e 5 RNA non codificanti è spesso ambiguo quando si studia la proteina o l'RNA in isolamento. Il cambiamento nella funzione del componente mutato può essere valutato meglio in vivo nel contesto dello spliceosoma completo e funzionante.
Il saggio di crescita del rame qui descritto è un rapido indicatore dell'efficienza di splicing in Saccharomyces cerevisiae o lievito in erba. Sviluppato da C.F. Lesser e C. Guthrie e pubblicato nel 1993, questo test combina la facilità di lavoro con un semplice organismo modello e la lettura diretta della vitalità cellulare3. La vitalità è correlata al modo in cui gli spliceosomi in queste cellule possono riconoscere e unire la trascrizione del reporter.
Questo saggio di crescita del rame è più comunemente chiamato test ACT1-CUP1. Il nome ACT1-CUP1 deriva dai due geni fusi per creare un reporter di efficienza di splicing. ACT1 è il gene dell'actina del lievito, che è altamente espresso e ha unintrone 4,5 efficientemente giuntato. Cup1p è un chelante del rame che sequestra il rame nella cellula per prevenire interferenze con le normali funzioni cellulari 6,7,8. Il reporter ACT1-CUP1 contiene questi geni in sequenza tale che CUP1 è nel frame di lettura corretto solo se si verifica lo splicing pre-mRNA dell'introne di ACT1 (Figura 1). La proteina di fusione risultante contiene i primi 21 aminoacidi di actina e la proteina Cup1p a lunghezza intera, che aumenta la vitalità del lievito in un ambiente ricco di rame3. Pertanto, un aumento della quantità di giunzione del reporter si traduce in una maggiore concentrazione di Cup1p e una maggiore resistenza al rame (Figura 1). Rispetto ad altri geni reporter, CUP1 influisce sulla vitalità cellulare anche a bassi livelli, ha un ampio intervallo di sensibilità e può essere utilizzato per selezionare direttamente le mutazioni di splicing 3,6,7. Inoltre, CUP1 non è essenziale per la crescita standard del lievito, e quindi l'omeostasi cellulare non è influenzata durante la configurazione di questo test. Complementare ai saggi di delezione o crescita della temperatura, ACT1-CUP1 fornisce informazioni sugli effetti sullo splicing in condizioni di crescita del lievito altrimenti ottimali.
Lo spliceosoma riconosce il suo substrato attraverso tre sequenze introniche, vale a dire il sito di giunzione 5' (5' SS), il sito di diramazione (BS) e il sito di giunzione 3' (3' SS). Sono stati generati numerosi reporter ACT1-CUP1 contenenti sequenze non consensuali in questi siti. Una selezione dei reporter ACT1-CUP1 più comuni è mostrata nella Figura 1 e nella Tabella 1. Poiché lo spliceosoma interagisce con ciascun sito di giunzione in modo univoco in diversi punti del ciclo di giunzione, la robustezza dello spliceosoma può essere testata in diversi passaggi in base ai quali viene utilizzato il reporter non consensuale. I giornalisti non di consenso sono chiamati per la posizione mutata all'interno dell'introne e la base in cui è stato mutato. Ad esempio, A3c è un reporter con una mutazione al 5' SS, in particolare posizione 3 dall'adenosina di consenso a una citosina. Questo reporter interagirà fortemente con le mutazioni degli spliceosomi che influenzano la selezione e l'uso di 5' SS. Nel loro studio iniziale, Lesser e Guthrie hanno determinato quali mutazioni 5' SS hanno inibito lo splicing3. Più tardi, nello stesso anno, Burgess e Guthrie pubblicarono rapporti non consensuali in tutti e tre i siti di giunzione in uno schermo soppressore delle mutazioni nell'ATPasi Prp16p9. Confrontando il consenso con i giornalisti non di consenso, il test ACT1-CUP1 è stato una chiave importante per comprendere la robustezza e la selettività dello spliceosoma del lievito e per dedurre la funzione degli spliceosomi di altri eucarioti.
Poiché i giornalisti ACT1-CUP1 non consensuali sensibilizzano lo spliceosoma a ulteriori perturbazioni, l'impatto di una singola mutazione del fattore di splicing può essere caratterizzato attraverso i reporter che ha un impatto positivo o negativo. Questo è stato applicato allo splicing delle domande di ricerca in vari modi. In primo luogo, il test ACT1-CUP1 può ed è stato utilizzato come screening genetico per le mutazioni nei fattori di splicing. Ad esempio, Prp8p, la più grande proteina di splicing, funge da piattaforma su cui il nucleo di RNA dello spliceosoma catalizza la reazione di splicing. Ciò è stato dedotto, in parte, attraverso il modo in cui i mutanti Prp8p hanno migliorato o ridotto lo splicing di diversi reporter ACT1-CUP1 10,11,12,13,14,15,16,17. Altri componenti proteici dello spliceosoma sono stati studiati utilizzando ACT1-CUP1, tra cui Hsh155p, Cwc2p, Cef1p ed Ecm2p 18,19,20,21,22,23,24,25. Le soglie energetiche per Prp16p e altre quattro ATPasi coinvolte nella transizione spliceosomiale sono state studiate anche con questo test 9,26,27,28,29,30. I piccoli RNA nucleari (snRNA) sono stati anche ampiamente studiati utilizzando ACT1-CUP1 per identificare le sequenze di pre-mRNA che coordinano e i cambiamenti nella struttura secondaria che gli snRNA subiscono durante lo splicing 3,31,32,33,34,35,36,37.
Il test ACT1-CUP1 richiede un ceppo di lievito in cui tutte le copie del gene CUP1 sono state eliminate. Poiché CUP1 può avere un numero di copie elevato 6,38, la preparazione di un ceppo knock-out completo può richiedere più round o uno screening approfondito. Di conseguenza, i ceppi di lievito cup1Δ sono stati spesso condivisi tra i laboratori, così come i giornalisti.
Se le mutazioni in un fattore di splicing vengono valutate da una copia plasmide, il gene wild-type per questo fattore dovrebbe essere eliminato. Inoltre, il background del lievito dovrebbe consentire la selezione di almeno due plasmidi, uno contenente un reporter ACT1-CUP1, storicamente su un plasmide di selezione dei nutrienti leucina, e uno contenente una mutazione o perturbazione nel meccanismo di splicing che verrà studiato (Figura 2). Di solito, in un singolo test, più ceppi di lievito, ciascuno con la perturbazione dello splicing della query (QSP) e un reporter diverso, testeranno l'impatto della query sullo splicing.
Le variabili indipendenti nel test ACT1-CUP1 consentono a un ricercatore di valutare la gravità di un QSP. Queste variabili indipendenti sono la concentrazione di rame e la selezione di più reporter di giunzione non consensuali. In primo luogo, poiché i ceppi di lievito vengono coltivati su piastre contenenti una gamma di concentrazioni di rame (Figura 2), l'impostazione del saggio include la selezione del gradiente di concentrazioni utilizzate. Gli studi possono utilizzare un gradiente di concentrazione di rame del corso per ottenere una lettura iniziale della vitalità e quindi ripetere il test con un gradiente più fine per identificare sottili differenze di vitalità. La seconda variabile è l'ampia gamma di reporter ACT1-CUP1 che possono essere testati (Figura 1 e Tabella 1). Se il QSP influisce sulla vitalità del lievito in modo diverso in presenza di un reporter non di consenso rispetto al wild-type, si può concludere che il QSP influisce su una fase dello splicing o su una regione dello spliceosoma importante durante il riconoscimento o l'elaborazione di quella regione dell'introne.
La cassetta degli attrezzi del lievito è ampia e il test ACT1-CUP1 è parte integrante della ricerca sullo splicing. Il test ACT1-CUP1 viene spesso eseguito insieme a un'analisi genetica, strutturale e/o biochimica più approfondita sull'impatto di un QSP. Poiché questi studi più dettagliati hanno generalmente una procedura più lunga e / o un prezzo più alto, un approccio frequente è lo screening di mutanti interessanti con ACT1-CUP1 prima.
A condizione che qui sia presente un protocollo di analisi ACT1-CUP1, inclusa la preparazione della piastra di rame. Questo test fornisce ai ricercatori una risposta iniziale all'effetto di un QSP sullo splicing e quali regioni introniche sono maggiormente influenzate dalla perturbazione.
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Protocol
1. Costruzione del ceppo di lievito
- Generare o ottenere un ceppo di S. cerevisiae il cui background include leu2 e cup1Δ. Per generare questo background, utilizzare il metodo del lievito ben consolidato che impiega acetato di litio e DNA a singolo filamento39.
NOTA: I ceppi di lievito aploidi possono contenere una, due o più copie di CUP1 6,38. Fare riferimento alle informazioni genomiche per il ceppo di lievito selezionato quando si progettano primer knock-out per affiancare la posizione del gene CUP1. - Eseguire una trasformazione del lievito per incorporare il QSP tramite incorporazione genomica o su un plasmide. Utilizzare un protocollo consolidato come quelli descritti nella ricerca precedente40,41,42.
- Eseguire una trasformazione del lievito con i ceppi risultanti dal punto 1.2. per aggiungere il plasmide reporter ACT1-CUP1 desiderato.
NOTA: Le cellule devono essere mantenute su piastre e terreni di abbandono della leucina (-Leu) per garantire la ritenzione dei plasmidi reporter ACT1-CUP1 dopo questa trasformazione. - Eseguire i passaggi 1.2. e 1.3. per ogni QSP e ogni plasmide reporter ACT1-CUP1 da testare, compresi i ceppi di controllo.
2. Preparazione della piastra di rame
- Selezionare un intervallo di concentrazione di rame adatto ai reporter da testare (vedere la Tabella 1 per la letalità dei reporter usati frequentemente).
NOTA: un esempio di intervallo di concentrazione di rame completo è costituito da 30 diverse concentrazioni di rame di 0 mM, 0,025 mM, 0,05 mM, 0,075 mM, 0,1 mM, 0,15 mM, 0,2 mM, 0,25 mM, 0,3 mM, 0,35 mM, 0,4 mM, 0,45 mM, 0,5 mM, 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM e 2,5 mM Cu2+. - Preparare una soluzione madre di 1 M CuSO4 e filtrare sterile attraverso un filtro sterile in PES (polietersolfone) da 0,22 μm.
- Per la piastra di rame desiderata, preparare una diluizione di 2 ml del brodo CuSO4 in acqua sterile.
NOTA: Poiché la lastra con 0 mM Cu 2+ verrà sempre analizzata e ripresa come riferimento, si consiglia di realizzare due lastre 0 mM Cu2+, una all'inizio e una alla fine della fase galvanica (passaggio 3.4.).- Calcolare la quantità di scorte per la concentrazione finale di rame desiderata in 40 mL del volume della piastra (Tabella supplementare 1).
- Aggiungere la quantità calcolata di acqua sterile e 1 M CuSO4 stock in un tubo sterile da 2 ml.
- Versare le piastre per il test ACT1-CUP1.
NOTA: Un'alternativa al protocollo riportato di seguito consiste nel combinare inizialmente il mezzo e l'agar in un grande contenitore e aliquota dopo l'autoclave in contenitori più piccoli per ottenere diverse concentrazioni di rame per ciascuna piastra. Qualunque sia il metodo adottato, è importante assicurarsi che la concentrazione del fluido sia coerente tra tutte le piastre, nonostante ciascuna abbia una diversa concentrazione di rame.- Etichettare ogni piatto vuoto da versare con la concentrazione finale di rame che conterrà. Preparare almeno una piastra quadrata per ogni concentrazione di rame da testare.
- Etichettare una bottiglia da 100 ml per concentrazione di rame da testare.
- Ad ogni flacone, aggiungere 790 mg di agar (2% p/v di agar) e un mescolatore.
- In un becher grande, unire il mezzo di crescita -Leu per tutte le lastre di rame da versare. Per ogni piastra da produrre, sciogliere 265 mg di lievito azotato base (YNB) e 64 mg di miscela drop-out meno leucina (e qualsiasi altro nutriente che possa essere necessario per mantenere il plasmide QSP nelle cellule) in 34 ml di acqua deionizzata.
- Aggiungere 34 ml della soluzione di terreno di coltura -Leu a ciascuna bottiglia da 100 ml preparata e tappo con foglio di alluminio. Etichettare il foglio con la concentrazione di rame prevista.
- Autoclave per sterilizzare e sciogliere l'agar utilizzando il ciclo liquido consigliato per l'autoclave.
- Aggiungere il più rapidamente possibile, 4 ml di glucosio al 20% p/v (filtrato sterile) in ciascuna bottiglia.
- Abbinare le etichette e aggiungere le diluizioni da 2 ml di CuSO4 al flacone previsto.
NOTA: Poiché decine di lastre di rame possono essere prodotte contemporaneamente, ognuna con una concentrazione diversa, etichettare chiaramente tutte le bottiglie, i tubi e le piastre con la concentrazione di rame prevista eviterà confusione durante il versamento delle lastre. - Utilizzare una piastra mescolare per mescolare per ~ 30 s e versare o pipettare 35 ml nella piastra etichettata, evitando bolle. Lasciare raffreddare prima di riporlo o utilizzarlo.
NOTA: Spesso, le piastre vengono fatte 1 giorno o 2 giorni prima del test e conservate a 4 °C fino a poche ore prima dell'uso. Le piastre devono essere a temperatura ambiente (RT) prima di iniziare la placcatura (fase 3.4.).
3. Saggio ACT1-CUP1
- Striare i ceppi desiderati su piastre -Leu.
NOTA: Se si lavora da scorte criogeniche, è necessario prestare attenzione per garantire che le cellule siano sufficientemente rianimate dallo stoccaggio prima della placcatura. Una procedura raccomandata per questo è quella di striare dal ceppo criogenico e lasciarlo crescere per 3-5 giorni a 30 ° C. Quindi, riporre un piccolo campione e lasciarlo crescere per altri 2-3 giorni a 30 ° C. - Coltiva colture durante la notte in 10 ml di media.
- Preparare i substrati di crescita -Leu utilizzando gli stessi rapporti descritti al punto 2.4.2. Per 10 ml di terreno, aggiungere 66 mg di base azoto di lievito (YNB) e 16 mg di miscela drop-out meno leucina a 9 ml di acqua deionizzata. Passare attraverso un filtro sterile PES da 0,22 μm.
- Per ogni ceppo di lievito, aggiungere 9 ml di terreno di crescita -Leu e 1 mL di glucosio al 20% p/v (filtrato sterile) in un tubo conico sterile da 50 ml.
- Utilizzando un bastoncino sterile o una punta di pipet, raccogliere un piccolo campione di lievito (~ 1 mm rotondo) e inoculare il supporto.
- Agitare tutte le colture notturne a 180 giri/min e 30 °C.
NOTA: Se disponibili, i rotatori possono essere utilizzati al posto di uno shaker.
- Diluire i ceppi a un OD600 0,5 ± 0,05 in glicerolo al 10%.
- Per ceppo, aggiungere 100 μL di coltura in una cuvetta contenente 900 μL di acqua.
- Misurare l'OD600 con uno spettrofotometro.
- Calcolare la diluizione richiesta per essere a un OD600 di 0,5 in un volume finale di 2 ml.
- Diluire ogni ceppo a OD600 0,5 in glicerolo al 10% (sterile).
- Rimisurare l'OD600 per verificare che la densità cellulare rientri nell'intervallo desiderato compreso tra 0,5 ± 0,05.
- Placcare i ceppi sulle piastre di rame.
NOTA: è possibile utilizzare una varietà di metodi per placcare i ceppi, tra cui pipettaggio manuale di volumi da 5-10 μL, utilizzando un pipettatore a ripetizione o multicanale o stampaggio con un replicatore di pin. Quest'ultimo metodo è descritto di seguito, anche se la maggior parte dei passaggi sarà simile indipendentemente dal metodo.- Impostare un luogo di lavoro sterile e un bruciatore Bunsen acceso.
- Per un replicatore a 48 pin, pipettare 200 μL di ciascun ceppo diluito in un pozzetto separato di una piastra a 96 pozzetti. Riempire gli spazi vuoti nella griglia 6 x 8 con 200 μL di glicerolo al 10% (sterile).
NOTA: Un esempio di schema galvanico per nove ceppi di lievito è riportato nella tabella supplementare 2. - Immergere il replicatore in un piatto poco profondo di etanolo al 95% (v / v) e fiammare per sterilizzare. Lasciare raffreddare per almeno 2 minuti dopo che la fiamma si è spenta per evitare che il calore urti le cellule.
- Posizionare quattro piastre vicino al bruciatore e rimuovere i coperchi.
- Immergere il replicatore nella piastra a 96 pozzetti e sollevarlo con un movimento rapido.
- Posizionare delicatamente sul piatto e dondolare leggermente avanti e indietro per facilitare un buon trasferimento.
- Solleva con un movimento rapido e posizionalo esattamente nello stesso orientamento nella piastra a 96 pozzetti.
- Ripetere l'operazione per un massimo di altri tre piatti. Ripetere il processo di immersione del replicatore in etanolo, fiammeggiante per sterilizzare e attendere di raffreddare ogni quattro piastre.
- Dopo che una piastra è stata placcata, spostati con un movimento graduale verso il lato ma sempre all'interno dell'ombrello di sterilizzazione della fiamma.
NOTA: Si consiglia di eseguire le diluizioni del lievito e la placcatura vicino a una fiamma. Le piastre possono facilmente essere contaminate durante l'essiccazione. - Lasciare asciugare completamente i piatti prima di posizionare i coperchi, di solito 3-5 min.
- Incubare le piastre per 3 giorni a 30 °C.
4. Raccolta e analisi dei dati
- Rimuovere le piastre dall'incubatore e ispezionarle visivamente.
- Registrare le immagini delle lastre con una fotocamera disponibile o un altro sistema di imaging digitale.
- Registrare (o punteggio) per ogni ceppo si osserva l'ultima crescita visibile della concentrazione di rame.
NOTA: Le cellule sono in grado di giuntare e rimanere vitali fino a quella concentrazione. Per coerenza, utilizzare sempre lo stesso metodo, ad occhio o dalle immagini della lastra, per ottenere l'ultima concentrazione di rame vitale. Colonie molto piccole sono talvolta visibili dall'occhio ma non sull'immagine. La differenza tra l'ispezione visiva diretta o la registrazione dalle immagini è piccola, di solito un passo nel gradiente. Poiché le immagini delle colonie sono spesso utilizzate nelle pubblicazioni, si raccomanda di segnare in base alle immagini. - Combinare i dati di più saggi ACT1-CUP1 per lo stesso ceppo per trarre conclusioni su come il QSP influisce sullo splicing.
NOTA: I dati di pubblicazione mostrano abitualmente immagini delle colonie di lievito a 0 mM Cu2+ concentrazione, l'ultima concentrazione di rame vitale e la successiva concentrazione in cui la colonia è morta. I dati possono anche essere visualizzati come grafico a barre con barre di errore per la deviazione standard tra le repliche. I dati non devono essere normalizzati, ma possono esserlo impostando la vitalità del controllo del fattore di splicing WT su 1 e confrontando l'effetto delle mutazioni introdotte.
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Representative Results
I saggi di crescita, come ACT1-CUP1, richiedono la valutazione visiva e comparativa di più colonie. Qui, ogni ceppo è stato coltivato fino alla saturazione durante la notte, diluito a un OD600 di 0,5 e placcato su 20 piastre contenenti un intervallo di concentrazioni di rame da 0 mM a 1,1 mM CuSO4 (Figura 3). Questo intervallo è inferiore a quello elencato nel protocollo in quanto ha consentito la valutazione completa dell'impatto dei QSP e dei reporter ACT1-CUP1 utilizzati e descritti di seguito. Le lastre sono state fotografate e valutate (Figura 3 e Tabella supplementare 3).
Per questo esperimento rappresentativo, lo sfondo del lievito include un gene ADE2 interrotto, con il risultato che le colonie sono di varie tonalità di rosso (Figura 3A, B). Questa comune interruzione del lievito nella via di produzione dell'adenosina provoca un accumulo di un precursore pigmentato rosso per l'adenosina. Pertanto, il colore rosso è un indicatore della maturità della colonia di lievito (cioè la quantità e l'età delle cellule presenti). Ai fini di un test ACT1-CUP1, il colore rosso può servire come indicatore di contaminazione delle specie fungine se di colore bianco o giallo. Il colore può essere una conferma secondaria della tolleranza al rame poiché le colonie più vitali saranno una tonalità rossa più profonda.
Quando si placca con un replicatore di pin, ci sono diverse aberrazioni comuni. In primo luogo, è possibile creare colonie di forma ovale se il replicatore viene sollevato mentre si muove a sinistra o a destra (Figura 3B, freccia arancione). Inoltre, le microcolonie possono anche formarsi da piccole goccioline di soluzione cellulare se il replicatore di pin viene portato ad angolo o se agitato sopra la piastra (Figura 3B, freccia rossa). Spesso innocue, occasionalmente, le microcolonie possono mescolarsi con una colonia stampata, e questo impedisce l'interpretazione di quella colonia. Ulteriori problemi di placcatura includono tempi di attesa insufficienti dopo la sterilizzazione affinché i pin del replicatore si raffreddino e un contatto insufficiente tra la piastra e i perni in modo tale che si verifichi uno scarso trasferimento dei terreni di coltura. In entrambi i casi, poche, se non nessuna, cellule cresceranno sulla piastra, anche per i ceppi di controllo contenenti il reporter wild-type. Come per qualsiasi test di crescita, indipendentemente dal metodo di placcatura, è importante eseguire l'ACT1-CUP1 in triplice copia per confermare che i risultati siano coerenti e ripetibili. Idealmente, queste diverse repliche dovrebbero essere eseguite su lastre di rame preparate in momenti diversi per garantire la riproducibilità.
Per questi esperimenti rappresentativi, il reporter A3c è stato selezionato per evidenziare l'impatto di una sequenza non consensuale sulla tolleranza del rame in assenza di ulteriori perturbazioni dello spliceosoma. A3c riduce significativamente la quantità di mRNA CUP1 prodotto in quanto perturba la capacità dello spliceosoma di riconoscere e utilizzare il 5' SS15. Il lievito con il reporter A3c è sopravvissuto a 0,15 mM Cu2+, mentre le cellule reporter wild-type hanno mantenuto la vitalità fino alla fine dell'intervallo di concentrazioni di rame testate (Figura 3C). Il reporter wild-type contenente cellule cresce fino a 2,5 mM Cu2+ senza un impatto sulla vitalità (dati non mostrati).
L'snRNA U6 è un componente catalitico essenziale dello spliceosoma. Diversi studi hanno utilizzato ACT1-CUP1 per studiare l'effetto che le mutazioni possono avere su questo RNA 16,32,34. Duplicati per questo studio, sono state studiate tre sequenze di snRNA U6, vale a dire la sequenza wild-type (WT), la posizione 57 sostituita da uridina a una citosina (U57c) e la posizione 57 sostituita da uridina a adenosina (U57a) (Figura 3 e Figura 4). In combinazione con i reporter ACT1-CUP1 che impattano le fasi catalitiche nello splicing, è stato determinato che U57c favorisce il primo passo catalitico e U57a favorisce la progressione al secondo stadio16,32.
Per impostare il test ACT1-CUP1, è stato creato un ceppo con la copia genomica di U6 snRNA cancellata e le sequenze U6 snRNA wild-type o mutate incluse nei plasmidi. Poiché l'SnRNA U6 è un componente essenziale della cellula, sono state utilizzate tre trasformazioni separate per eliminare prima lo snRNA U6 genomico mantenendo la vitalità cellulare, successivamente introdurre snRNA U6 mutati sui plasmidi e, infine, aggiungere i reporter ACT1-CUP1. Per la prima trasformazione, è stato utilizzato un ceppo di lievito cup1Δ nel knock-out della copia genomica dello snRNA U6 e contemporaneamente aggiungendo snRNA WT U6 su un plasmide marcatore di selezione URA per mantenere la vitalità. Una successiva trasformazione ha aggiunto snRNA U6 wild-type o mutato su un plasmide marcatore di selezione TRP, selezionando contro il marcatore URA tramite selezione 5-FOA. Pertanto, sono stati generati tre ceppi di lievito cup1Δ, ciascuno con una delle sequenze di snRNA U6, vale a dire WT, U57a e U57c. Una trasformazione finale del lievito per ogni ceppo ha aggiunto uno dei tre diversi plasmidi reporter ACT1-CUP1 da utilizzare in questo esperimento. I reporter selezionati sono stati il reporter wild-type, A3c, e una mutazione dell'adenosina del sito di ramificazione in guanina (BS-G). Un totale di nove ceppi sono stati generati per questo esperimento, ciascuno contenente una sequenza di snRNA U6 e un reporter ACT1-CUP1 (Tabella supplementare 4 e Tabella supplementare 5).
I risultati hanno mostrato che le diverse basi nella posizione 57 dell'nRNA U6 hanno impatti unici sullo spliceosoma in combinazione con una mutazione 5' SS o BS (Figura 4). Sia i reporter A3c che BS-G inibiscono principalmente lo splicing stabilizzando la prima conformazione catalitica del passo14,15. Pertanto, U57c è una mutazione additiva che riduce la tolleranza al rame in combinazione con uno di questi reporter (Figura 4B). Al contrario, U57a aumenta la tolleranza al rame perché promuove la progressione al secondo stadio (Figura 4B)16,32. La ridotta tolleranza al rame del ceppo BS-G reporter con U57a rispetto allo snRNA U6 WT evidenzia un probabile impatto secondario di BS-G sulla seconda fase dello splicing16.
Questi risultati evidenziano anche la natura qualitativa di questo test e il motivo per cui le sequenze di query e reporter wild-type dovrebbero essere testate. Mentre il modello generale di aumento o diminuzione della tolleranza al rame è vero per queste mutazioni dello snRNA U6 rispetto allo snRNA U6 wild-type, l'esatta concentrazione di rame a cui sopravvivono le cellule può differire tra gli studi (Tabella 1) e differiva tra questi dati rappresentativi e altri risultati pubblicati. Ciò è probabilmente dovuto al background del ceppo contenente la delezione di CUP1 , ma può anche essere dovuto alla salute generale dei ceppi prima della placcatura (cioè, quanto tempo dopo la generazione del ceppo o del residuo dalla crio è stato eseguito il test), differenze nel modo in cui le piastre sono preparate e variabilità tra i diversi incubatori. Una varianza simile è stata osservata in Mayerle et al. per le mutazioni di query Prp8 nella letteratura43. Pertanto, il confronto delle tendenze di tolleranza del rame può essere eseguito per diversi saggi ACT1-CUP1, ma il confronto numerico delle concentrazioni di rame dovrebbe essere fatto solo all'interno dello stesso laboratorio e, a volte, con lo stesso set di lastre di rame.
Figura 1: Il design del reporter ACT1-CUP1. La concentrazione di spliced reporter è direttamente correlata con la tolleranza al rame del lievito. Il diagramma del reporter include i tre siti di giunzione del sito di giunzione 5' (5' SS), del sito di diramazione (BS) e del sito di giunzione 3' (3' SS). Vengono mostrate le sequenze di consenso del lievito per questi siti, con quelle mirate per la scissione indicate in grassetto e numerate in base alla loro posizione nell'introne. Le sequenze di reporter ACT1-CUP1 non di consenso comunemente usate sono mostrate in minuscolo sotto le rispettive posizioni della sequenza di consenso e sono elencate nella Tabella 1. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Flusso di lavoro del saggio ACT1-CUP1. Per questo test, un ceppo di lievito deve essere cup1Δ leu2 e contenere il plasmide reporter ACT1-CUP1 desiderato e il gene QSP, etichettato come gene nella figura. Il gene QSP deve essere inserito genomicamente o su un plasmide. Il protocollo che utilizza un replicatore di pin prevede quattro passaggi per preparare le cellule di lievito. Il passo 1 è quello di far crescere le cellule fino alla saturazione. Il passo 2 consiste nel misurare l'OD 600 della coltura e diluirlo in un OD600 di 0,5. Il passaggio 3 consiste nel distribuire su una piastra da 96 pozzetti. Il passo 4 consiste nel placcare su piastre contenenti concentrazioni crescenti di rame (indicato con l'aumento del colore blu). I passaggi 1, 2 e 4 sarebbero identici per il pipettaggio manuale. Una volta placcate, le piastre vengono incubate per 3 giorni a 30 °C e quindi valutate per la vitalità. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Viste rappresentative dei dati ACT1-CUP1. Per questo esperimento, gli spliceosomi di lievito vengono sfidati con due diverse mutazioni di snRNA U6 e testati in presenza di tre reporter non consensuali. Tre repliche di questo test sono presentate sulle stesse lastre a scopo dimostrativo. Si raccomanda per questo test di eseguire repliche su piastre separate e in giorni separati. (A) Viene mostrato un saggio completato con un gradiente di rame compreso tra 0 mM e 1,1 mM su 20 piastre. All'aumentare della concentrazione di rame, i ceppi con giunzione inferiore mostrano una confluenza ridotta fino al punto in cui la concentrazione di rame diventa letale. Lo sfondo del lievito era ade2 e, quindi, le colonie mature sono di colore rosso. (B) Confronto delle stesse lastre a 0 mM e 0,1 mM CuSO4 ripresi con una fotocamera palmare rispetto a un sistema di imaging digitale. Questo è un esempio di come un certo numero di reporter non di consenso possono essere confrontati fianco a fianco e con il reporter wild-type. Le osservazioni comuni sulle piastre includono una goccia spuria di terreno di coltura che è caduta dal replicatore di spilli (freccia rossa) e una leggera ovalizzazione delle colonie a causa dello scorrimento del perno lungo la superficie della piastra o del movimento della piastra prima che la goccia di coltura si sia asciugata sufficientemente (freccia arancione). (C) Esempio dell'effetto del reporter A3c sulla vitalità cellulare rispetto al reporter wild-type. Immagini come quelle mostrate in (B) sono ritagliate e allineate per evidenziare le differenze di crescita a diverse concentrazioni di rame. La tolleranza al rame del ceppo reporter A3c diminuisce a 0,15 mM Cu2+ rispetto alla vitalità del ceppo reporter wild-type alla fine dell'intervallo testato. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Risultati rappresentativi di ACT1-CUP1 che monitorano lo splicing nel lievito con mutazioni dei componenti di splicing . (A) Schema delle componenti dell'RNA del sito attivo immediatamente dopo la prima fase catalitica. Gli snRNA U2 e U6 sono duplexed, portando i 5' SS e BS dell'introne nelle immediate vicinanze. Il legame intronico tra A259 (BS) e G1 (5' SS) è indicato dal punto arancione. Le posizioni delle sostituzioni di sequenze non consensuali nel reporter ACT1-CUP1 testato in questo esperimento sono indicate in grassetto nero. La posizione mutata nello snRNA U6 (U57) è in grassetto verde, e le basi sostituite sono in blu o rosa. (B) Una possibilità per la presentazione dei dati di ACT1-CUP1 in una pubblicazione include diverse immagini di colonie da concentrazioni rilevanti di Cu2+ . Il reporter di WT è sopravvissuto oltre la concentrazione di rame testata per tutti e tre i ceppi di snRNA U6 interrogati. (C) Un grafico a barre che confronta gli effetti per reporter e per mutante di snRNA U6. La normalizzazione viene eseguita per ciascun reporter ACT1-CUP1 impostando la tolleranza al rame dello snRNA U6 WT su 1 e calcolando il rapporto per le mutazioni U57c e U57a. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard da tre repliche. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Metodi aggiuntivi per completare i risultati ACT1-CUP1. (A) L'estensione del primer viene eseguita tramite una ricottura primer nell'esone 3' ACT1 e quindi allungata nell'introne. In questo esempio, il primer è etichettato con colorante IR700 e l'estensione del primer è stata eseguita come descritto in 20,21. L'estensione del primer dell'snRNA U6 viene eseguita nella stessa reazione per fungere da controllo del carico. Il gel denaturante 19:1 bis/acrilammide al 7% risolve i prodotti pre-mRNA, mRNA e lariat dopo l'estensione del primer utilizzando un dispositivo di imaging gel nel vicino infrarosso come descritto in van der Feltz et al.22. L'intensità delle diverse bande può essere utilizzata per misurare complessivamente l'efficienza di splicing e distinguere le differenze di splicing che si verificano nella prima o nella seconda fase, come quantificato con ImageJ44 o altri software di quantificazione della banda gel. Sia l'efficienza di giunzione che l'efficienza della fase di giunzione vengono calcolate come descritto in Query e Konarska14. (B) Gli screening mutazionali con i reporter ACT1-CUP1 possono utilizzare la selezione del rame per identificare i mutanti che influenzano lo splicing. I geni di interesse possono quindi essere sequenziati nei ceppi risultanti per determinare se la mutazione si è verificata in quel gene. (C) Le modifiche possono essere apportate al reporter al di fuori dei siti di giunzione per monitorare i cambiamenti di splicing in relazione alla struttura dell'introne, alle sequenze esoniche, al numero di esoni o all'esportazione nucleare di RNA non giuntato. Le regioni in grigio sono regioni di espansione facoltative da includere in un reporter e le aree in rosso sono regioni in cui la sequenza e le modifiche strutturali potrebbero essere testate per il loro potenziale impatto sullo splicing utilizzando il test ACT1-CUP1. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Nome del reporter | Regione intronica | Sequenza | Ultima concentrazione vitale di Cu2+ (mM) | |
| WT | 5' | GUAUGU | > 2.5 | |
| G1a | 5ʹ | un UAUGU | 0,0133 o 0,0532 | |
| A3c | 5ʹ | GUcUGU | 0,15^,18 o 0,216 | |
| G5a | 5ʹ | GUAUaU | 0,303 o 0,259 | |
| WT | Succursale-sito | UACUAAC | > 2.5 | |
| C256a | Succursale-sito | UAaUAAC | 0,1526 o 0,1832 | |
| U257c/a | Succursale-sito | Controllo dell'account utentec/aAAC | 0,226 o 0,332 o 0,545 | 0,059,32 |
| A258c/u | Succursale-sito | UACUc/uAC | 0,826 | 1,045 o 1,646 |
| BS-C | Succursale-sito | UACUAcC | 0,153 o 0,1832,56 o 0,2 26 | |
| BS-G | Succursale-sito | UACUAgC | 0,0516,32 o 0,625 o 0,846 | |
| C260g | Succursale-sito | UACUAAg | 0,826 | |
| WT | 3' | UAG | > 2.5 | |
| U301g | 3ʹ | g ARGENTUM | 0,1518 | |
| A302g/u | 3' | Ug/uG | 0,0139 | 0,07516 o 0,1824 |
| G303c | 3ʹ | UAc | 0,0532 | |
Tabella 1: Elenco dei segnalatori comuni e della letalità della concentrazione di Cu2+ riportata. Ci sono oltre 100 citazioni di Lesser e Guthrie3. Mentre una piccola selezione di queste citazioni è stata utilizzata per creare questa tabella, evidenziano la tendenza generale di differenze da lievi a moderate tra gli studi nelle concentrazioni di vitalità del rame riportate. In ACT1-CUP1, è importante confrontare le proteine o l'RNA wild-type con i mutanti tutti con lo stesso background di ceppo di lievito usando le concentrazioni pubblicate come guida, ma anticipando che le concentrazioni osservate possono differire. Dati raccolti dalla Figura 3 (^) e da molteplici pubblicazioni annotate dalle seguenti citazioni 3,9,16,18,24,25,26,32,45,46.
Tabella supplementare 1: Contenuto di una singola lastra di rame e un esempio di calcoli effettuati per ottenere diluizioni di rame da 0 mM a 2,5 mM da uno stock CuSO 4 da 1 M. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella supplementare 2: Esempio di schema di placcatura per il replicatore a 48 pin. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella supplementare 3: Esempio di vitalità valutato da lastre di rame incubate per 3 giorni a 30°C. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella supplementare 4: Elenco dei ceppi di lievito utilizzati per generare i dati rappresentativi. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella supplementare 5: Elenco dei plasmidi utilizzati per generare i dati rappresentativi. Plasmidi di snRNA U6 generati e pubblicati in precedenti ricerche22,47. Clicca qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
ACT1-CUP1 è un test di crescita e occorre prestare attenzione per garantire che le differenze di crescita osservate possano essere attribuite solo a difetti di splicing. Tutti i ceppi devono essere manipolati in modo simile prima della placcatura, compresa la lunghezza e il tipo di crescita e condizioni di conservazione simili. Se si utilizzano ceppi sensibili alla temperatura, i saggi ACT1-CUP1 devono essere eseguiti solo in condizioni in cui tali ceppi crescono in modo comparabile al tipo selvatico. In relazione a ciò, per il componente QSP, si consiglia di avere background di lievito identici e livelli di espressione dei geni QSP in modo da non offuscare l'interpretazione dei risultati. Quando si considera il numero di QSP e reporter da utilizzare, non è consigliabile dosare più di 30 ceppi alla volta con il metodo del replicatore di pin. Con il tempo aggiuntivo per eseguire ogni passaggio, le cellule si sistemeranno e i risultati del test saranno incoerenti a causa della ridotta vitalità cellulare.
Oltre alle limitazioni che ACT1-CUP1 ha intrinsecamente come test di crescita, un QSP può avere un impatto più complesso sullo splicing di quanto possa essere risolto con questo metodo. Poiché lo splicing è un processo a più fasi e i fattori vengono riciclati, il fenotipo osservato può causare perturbazioni che interessano più di una fase di giunzione. Questo vale anche per le analisi successive che possono seguire ACT1-CUP1, alcune delle quali sono descritte di seguito. I dati evidenzieranno la fase più perturbata del processo, anche se altre fasi possono essere influenzate dalla funzione alterata del fattore di giunzione.
L'estensione del primer dei reporter ACT1-CUP1 è stata utilizzata per la prima volta nell'articolo originale di Lesser e Guthrie e viene spesso eseguita se i risultati di ACT1-CUP1 mostrano un difetto di crescita3. Questo test si rivolge al reporter e utilizza la lunghezza dei prodotti PCR per determinare la quantità relativa di reporter non giuntato, parzialmente giuntato e completamente giuntato presente (Figura 5A). L'efficienza complessiva dello splicing e se il difetto influisce più fortemente sulla prima o sulla seconda fase catalitica sono calcolate prendendo i rapporti delle quantità di prodotto PCR14. Ad esempio, il reporter 5' SS G5a ha ridotto lo splicing rispetto al reporter wild-type, ma le sue efficienze di primo e secondo passo seguono un modello simile a quello wild-type (Figura 5A). Ciò indica un difetto prima della prima fase catalitica, possibilmente nell'assemblaggio dello spliceosoma, perché entrambe le fasi sono influenzate in modo simile31.
Sono stati sviluppati nuovi saggi dal saggio canonico ACT1-CUP1, come lo screening per i mutanti che migliorano lo splicing in presenza di altri mutanti del fattore di splicing e/o sequenze di splicing non consensuali (Figura 5B). Ad esempio, l'esposizione del lievito contenente il reporter ACT1-CUP1 ai raggi UV e quindi la selezione in presenza di rame ha prodotto mutanti Prp8 e Hsh155 che hanno migliorato lo splicing delle sequenze non consensuali14,19.
Espandendosi oltre lo studio dell'effetto dei siti di splicing e dei fattori costitutivi di splicing, la dipendenza dalla crescita di CUP1 è stata utilizzata per studiare lo splicing multiplo degli introni, il controllo delle esportazioni nucleari e l'impatto dell'UTR e di altre sequenze periferiche sullo splicing (Figura 5C). Alcuni di questi studi hanno creato reporter con CUP1 e altri geni di lievito contenenti introni che possono avere schemi di splicing più complessi per studiare l'effetto sulla struttura secondaria intronica e sullo splicing della trascrizione multi-introne 48,49,50,51,52. Il legame tra splicing ed esportazione nucleare è stato studiato avendo trascritti spliced o unspliced che codificano CUP1 nel frame53,54. Anche la lunghezza della traccia pirimidina e la dipendenza dalla distanza della selezione del sito di giunzione dovuta a fattori specifici sono state testate 20,55,56,57. Questi esempi e molti altri evidenziano la versatilità di ACT1-CUP1 e di altri saggi di crescita CUP1.
Il test ACT1-CUP1 collega le perturbazioni a un ciclo di reazione complesso con un fenotipo di crescita semplice con un ampio intervallo di sensibilità. Questo saggio legacy è stato utilizzato da più laboratori per gettare le basi della comprensione del ciclo di giunzione. Più recentemente, ACT1-CUP1 è stato utilizzato per rispondere alle domande che sorgono dalla ricchezza di dati strutturali ora disponibili21,22,25. Studi strutturali di spliceosomi legati a sequenze non consensuali potrebbero essere abbinati ai risultati di ACT1-CUP1 per interpretare come la struttura alterata e la funzione alterata sono correlate. ACT1-CUP1 è un primo schermo ideale per mutazioni di splicing che possono integrare analisi più complesse.
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Disclosures
L'autore non ha nulla da rivelare.
Acknowledgments
Grazie ad Aaron Hoskins e ai membri del laboratorio Hoskins dell'Università del Wisconsin-Madison per l'uso di ceppi di lievito e attrezzature nella generazione delle figure 3-5. Grazie a Harpreet Kaur e Xingyang Fu per i loro commenti penetranti sul manoscritto. Grazie agli studenti, al personale e ai docenti della Northwest University durante la scrittura, l'editing e le riprese di questo documento. Grazie a Isabelle Marasigan per l'aiuto nelle riprese di questo metodo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL sterile microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| 2 mL sterile microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-138 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | Fisher Scientific | 07-201-332 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| 96-well round bottom microplate | Fisher Scientific | 07-200-760 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| 190 proof ethanol | Fisher Scientific | 22-032-600 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| 500 mL Filter System (0.22 µm) | CellTreat Scientific Products | 229707 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | Any molecular grade agar will work. |
| Autoclave | Tuttnauer | 3870EA | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Bunsen burner | Humboldt | PN6200.1 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Cell Density Meter | VWR | 490005-906 | Or other spectral device that can measure absorbance at 595 nm. |
| Copper sulfate Pentahydrate | Fisher Scientific | LC134051 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Digital imaging system | Cytiva | 29399481 | ImageQuant 4000 (used for Figure 3), Amersham ImageQuant 800, or comparable item from a different manufacturer. |
| Dropout mix (-Leu) | USBiological Life Sciences | D9525 | Use the appropriate drop out mix for your experiment. It is possible you will be using a yeast nutrient marker for your query perturbation also. In that case, the drop out mix should be for that marker and Leu |
| D-Glucose | Fisher Scientific | AAA1682836 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Gel band quantifying software | Cytiva | 29-0006-05 | ImageQuant TL v8.1 (used for figure 5A) or comparable item from a different manufacturer. |
| Hand held camera | Nikon | D3500 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Near infra-red gel imaging device | Cytiva | 29238583 | Amersham Typhoon NIR (used for Figure 5a) or comparable item from a different manufacturer. |
| Laboratory grade clamp | Fisher Scientific | 05-769-7Q | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Laboratory grade stand and clamp | Fisher Scientific | 12-000-101 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Magnetic stir bars | Fisher Scientific | 14-513-51 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Pin replicator | VP Scientific | VP 407AH | |
| Semi-micro disposable cuvettes | VWR | 97000-590 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Shaker | JEIO Tech | IST-3075 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Spectrophotometer | Biowave | 80-3000-45 | Or any spectophotometer that can measure the absorbance at 600 nm. |
| Square plates | VWR | 102091-156 | Circular plates may also be used though are more challenging if using a pin replicator. |
| Stir plate | Fisher Scientific | 11-520-16S | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Yeast nitrogen base | USBiological Life Sciences | Y2025 | Or comparable item from a different manufacturer. |
References
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