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Genetics

ACT1-CUP1 परख नवोदित खमीर में स्प्लिसोसोमल उत्परिवर्ती की सब्सट्रेट-विशिष्ट संवेदनशीलता निर्धारित करता है

Published: June 30, 2022 doi: 10.3791/63232
Automatic Translation
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1College of Arts and Sciences, Northwest University

Summary

एसीटी 1-सीयूपी 1 परख, एक तांबा विकास परख, अग्रदूत मैसेंजर आरएनए (प्री-एमआरएनए) स्प्लिसिंग और स्प्लिसोसोमल फ़ंक्शन पर उत्परिवर्ती स्प्लिसिंग कारकों के प्रभाव का त्वरित रीडआउट प्रदान करता है। यह अध्ययन एक प्रोटोकॉल प्रदान करता है और रुचि के स्प्लिसिंग प्रश्न को संबोधित करने के लिए संभव अनुकूलन पर प्रकाश डालता है।

Abstract

स्प्लिसोसोम या इसके सब्सट्रेट में पेश किए गए उत्परिवर्तन ने स्प्लिसोसोमल फ़ंक्शन की पेचीदगियों की हमारी समझ में महत्वपूर्ण योगदान दिया है। चाहे रोग से संबंधित या कार्यात्मक रूप से चयनित, इनमें से कई उत्परिवर्तनों का अध्ययन मॉडल जीव सैकरोमाइसेस सेरेविसिया (खमीर) में विकास परख का उपयोग करके किया गया है। स्प्लिसिंग-विशिष्ट तांबा विकास परख, या एसीटी 1-सीयूपी 1 परख, फेनोटाइपिक स्तर पर उत्परिवर्तन का व्यापक विश्लेषण प्रदान करता है। एसीटी 1-सीयूपी 1 परख उन पत्रकारों का उपयोग करती है जो सही ढंग से विभाजित होने पर तांबे की सहिष्णुता प्रदान करते हैं। इस प्रकार, तांबे की उपस्थिति में, खमीर व्यवहार्यता में परिवर्तन स्प्लिसिंग के माध्यम से एमआरएनए उत्पादन में परिवर्तन से संबंधित है। एक विशिष्ट प्रयोग में, खमीर स्प्लिसोसोम को अलग-अलग गैर-आम सहमति वाले स्प्लिसिंग रिपोर्टरों और स्प्लिसिंग पर किसी भी सिनर्जेटिक या एंटीथेटिक प्रभाव का पता लगाने के लिए ब्याज के स्प्लिसिंग कारक उत्परिवर्तन के साथ चुनौती दी जाती है। यहां कॉपर प्लेट तैयार करने, खमीर कोशिकाओं की चढ़ाना और डेटा मूल्यांकन का पूरा विवरण दिया गया है। मानार्थ प्रयोगों का एक चयन वर्णित है, जो एसीटी 1-सीयूपी 1 संवाददाताओं की बहुमुखी प्रतिभा को उजागर करता है। एसीटी 1-सीयूपी 1 परख स्प्लिसिंग टूलबॉक्स में एक आसान उपकरण है, जो उत्परिवर्तन प्रभाव (ओं) के प्रत्यक्ष रीड-आउट और क्षेत्र में निरंतर उपयोग से तुलनात्मक संभावनाओं के लिए धन्यवाद है।

Introduction

स्प्लिसोसोम एक बड़ी, जैविक मशीन है जो अग्रदूत मैसेंजर आरएनए (प्री-एमआरएनए) 1,2 में इंट्रोन्स, गैर-कोडिंग क्षेत्रों को हटाने के लिए उत्प्रेरित करती है। लगभग 100 प्रोटीनों और 5 गैर-कोडिंग आरएनए में से 1 में एकल बिंदु उत्परिवर्ती के प्रभाव को चिह्नित करना अक्सर अलगाव में प्रोटीन या आरएनए का अध्ययन करते समय अस्पष्ट होता है। उत्परिवर्तित घटक के कार्य में परिवर्तन का मूल्यांकन विवो में पूर्ण, कार्यशील स्प्लिसोसोम के संदर्भ में किया जा सकता है।

यहां वर्णित तांबा विकास परख सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया या नवोदित खमीर में स्प्लिसिंग दक्षता का एक त्वरित गेज है। सी.एफ. लेसर और सी. गुथरी द्वारा विकसित और 1993 में प्रकाशित, यह परख एक साधारण मॉडल जीव के साथ काम करने में आसानी और सेल व्यवहार्यता के सीधे रीडआउट को जोड़तीहै। व्यवहार्यता इस बात से संबंधित है कि इन कोशिकाओं में स्प्लिसोसोम रिपोर्टर प्रतिलेख को कितनी अच्छी तरह पहचान और जोड़ सकते हैं।

इस तांबा विकास परख को आमतौर पर एसीटी 1-सीयूपी 1 परख कहा जाता है। ACT1-CUP1 नाम दो जीनों से उत्पन्न होता है जो स्प्लिसिंग दक्षता का एक रिपोर्टर बनाने के लिए जुड़े होते हैं। एसीटी 1 खमीर का एक्टिन जीन है, जो अत्यधिक व्यक्त किया जाता है और इसमें कुशलतापूर्वक विभाजित इंट्रॉन 4,5 होता है। कप 1 पी एक कॉपर चेलेटर है जो नियमित सेलुलर कार्यों 6,7,8 के साथ हस्तक्षेप को रोकने के लिए सेल में तांबे को अनुक्रमित करता है। ACT1-CUP1 रिपोर्टर में इन जीनों को अनुक्रम में शामिल किया गया है जैसे कि CUP1 उचित रीडिंग फ्रेम में केवल तभी होता है जब ACT1 के इंट्रोन का प्री-एमआरएनए स्प्लिसिंग होता है (चित्रा 1)। परिणामस्वरूप संलयन प्रोटीन में एक्टिन के पहले 21 अमीनो एसिड और पूर्ण लंबाई कप 1 पी प्रोटीन होते हैं, जो तांबे से भरपूरवातावरण में खमीर व्यवहार्यता को बढ़ाता है। इस प्रकार, रिपोर्टर के स्प्लिसिंग की मात्रा में वृद्धि के परिणामस्वरूप कप 1 पी की उच्च सांद्रता और उच्च तांबा प्रतिरोध होता है (चित्रा 1)। अन्य रिपोर्टर जीनों की तुलना में, CUP1 निम्न स्तर पर भी सेल व्यवहार्यता को प्रभावित करता है, इसकी एक विस्तृत संवेदनशीलता सीमा है, और इसका उपयोग सीधे स्प्लिसिंग म्यूटेशन 3,6,7 के लिए चयन करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, सीयूपी 1 मानक खमीर विकास के लिए गैर-आवश्यक है, और इस प्रकार इस परख के लिए सेटअप के दौरान सेलुलर होमियोस्टैसिस प्रभावित नहीं होता है। विलोपन या तापमान वृद्धि परख के पूरक, एसीटी 1-सीयूपी 1 अन्यथा इष्टतम खमीर विकास स्थितियों के तहत स्प्लिसिंग पर प्रभावों के बारे में जानकारी प्रदान करता है।

स्प्लिसोसोम तीन इनट्रोनिक अनुक्रमों के माध्यम से अपने सब्सट्रेट को पहचानता है, अर्थात् 5 'स्प्लिस साइट (5'एसएस), शाखा-साइट (बीएस), और 3'स्प्लिस साइट (3'एसएस)। इन साइटों पर गैर-आम सहमति अनुक्रमों वाले कई एसीटी 1-सीयूपी 1 रिपोर्टर उत्पन्न किए गए हैं। सबसे आम ACT1-CUP1 संवाददाताओं का चयन चित्र 1 और तालिका 1 में दिखाया गया है। चूंकि स्प्लिसोसोम स्प्लिसिंग चक्र में अलग-अलग बिंदुओं पर प्रत्येक स्प्लिस साइट के साथ विशिष्ट रूप से बातचीत करता है, इसलिए स्प्लिसोसोम की मजबूती का परीक्षण विभिन्न चरणों में किया जा सकता है जिसके आधार पर गैर-आम सहमति रिपोर्टर का उपयोग किया जाता है। गैर-आम सहमति वाले संवाददाताओं को इंट्रॉन के भीतर उत्परिवर्तित स्थिति और उस आधार के लिए नामित किया गया है जिसे इसे उत्परिवर्तित किया गया था। उदाहरण के लिए, ए 3 सी 5 'एसएस में उत्परिवर्तन के साथ एक रिपोर्टर है, विशेष रूप से आम सहमति एडेनोसिन से साइटोसिन तक 3 की स्थिति। यह रिपोर्टर स्प्लिसोसोम म्यूटेशन के साथ दृढ़ता से बातचीत करेगा जो 5 'एसएस चयन और उपयोग को प्रभावित करता है। अपने प्रारंभिक अध्ययन में, लेसर और गुथरी ने निर्धारित किया कि कौन से 5 'एसएस उत्परिवर्तन स्प्लिसिंग3 को रोकते हैं। बाद में उसी वर्ष, सभी तीन स्प्लिस साइटों पर गैर-आम सहमति वाले संवाददाताओं को बर्गेस और गुथरी द्वारा एटीपीस पीआरपी 16 पी9 में उत्परिवर्तन की एक शमन स्क्रीन में प्रकाशित किया गया था। गैर-आम सहमति वाले संवाददाताओं के लिए आम सहमति की तुलना करते हुए, एसीटी 1-सीयूपी 1 परख खमीर स्प्लिसोसोम की मजबूती और चयनात्मकता को समझने और अन्य यूकेरियोट्स के स्प्लिसोसोम के कार्य का अनुमान लगाने के लिए एक महत्वपूर्ण कुंजी रही है।

जैसा कि गैर-आम सहमति एसीटी 1-सीयूपी 1 रिपोर्टर स्प्लिसोसोम को आगे की गड़बड़ी के लिए संवेदनशील बनाते हैं, एकल स्प्लिसिंग कारक उत्परिवर्तन के प्रभाव को पत्रकारों के माध्यम से सकारात्मक या नकारात्मक प्रभाव ों की विशेषता हो सकती है। यह विभिन्न तरीकों से स्प्लिसिंग अनुसंधान प्रश्नों पर लागू किया गया है। सबसे पहले, एसीटी 1-सीयूपी 1 परख का उपयोग स्प्लिसिंग कारकों में उत्परिवर्तन के लिए आनुवंशिक स्क्रीन के रूप में किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, पीआरपी 8 पी, सबसे बड़ा स्प्लिसिंग प्रोटीन, एक मंच के रूप में कार्य करता है जिस पर स्प्लिसोसोम का आरएनए कोर स्प्लिसिंग प्रतिक्रिया को उत्प्रेरित करता है। यह आंशिक रूप से अनुमान लगाया गया था कि कैसे पीआरपी 8 पी उत्परिवर्ती ने विभिन्न एसीटी 1-सीयूपी 1रिपोर्टरों 10,11,12,13,14,15,16,17 के स्प्लिसिंग में सुधार या कमी की। स्प्लिसोसोम के अन्य प्रोटीन घटकों की भी एसीटी 1-सीयूपी 1 का उपयोग करके जांच की गई है, जिसमें एचएसएच 155 पी, सीडब्ल्यूसी 2 पी, सीईएफ 1 पी और ईसीएम 2 पी 18,19,20,21,22,23,24,25 शामिल हैं। स्प्लिसोसोमल संक्रमण में शामिल पीआरपी 16 पी और चार अन्य एटीपीस के लिए ऊर्जावान थ्रेसहोल्ड का भी इस परख 9,26,27,28,29,30 के साथ अध्ययन किया गया है। छोटे परमाणु आरएनए (एसएनआरएनए) का भी बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है, जिसमें एसीटी 1-सीयूपी 1 का उपयोग करके पूर्व-एमआरएनए अनुक्रमों की पहचान की जा सके जो वे समन्वयित करते हैं और 3,31,32,33,34,35,36,37 स्प्लिसिंग के दौरान एसएनआरएनए माध्यमिक संरचना में परिवर्तन से गुजरते हैं।

एसीटी 1-सीयूपी 1 परख को एक खमीर तनाव की आवश्यकता होती है जहां सीयूपी 1 जीन की सभी प्रतियां नॉक-आउट हो गई हैं। चूंकि सीयूपी 1 में उच्च कॉपी संख्या 6,38 हो सकती है, इसलिए पूर्ण नॉक-आउट स्ट्रेन की तैयारी के लिए कई राउंड या व्यापक स्क्रीनिंग की आवश्यकता हो सकती है। नतीजतन, कप 1 खमीर उपभेदों को अक्सर प्रयोगशालाओं के बीच साझा किया गया है, जैसा कि संवाददाताओं ने किया है।

यदि एक स्प्लिसिंग कारक में उत्परिवर्तन (ओं) का मूल्यांकन प्लास्मिड कॉपी से किया जा रहा है, तो इस कारक के लिए जंगली प्रकार के जीन को नॉक-आउट किया जाना चाहिए। इसके अलावा, खमीर पृष्ठभूमि को कम से कम दो प्लास्मिड के चयन की अनुमति देनी चाहिए, एक में एक एसीटी 1-सीयूपी 1 रिपोर्टर होता है, ऐतिहासिक रूप से ल्यूसीन पोषक तत्व-चयन प्लास्मिड पर, और एक में स्प्लिसिंग मशीनरी में उत्परिवर्तन या गड़बड़ी होती है जिसका अध्ययन किया जाएगा (चित्रा 2)। आमतौर पर, एक ही परख में, कई खमीर उपभेद, जिनमें से प्रत्येक में क्वेरी स्प्लिसिंग गड़बड़ी (क्यूएसपी) और एक अलग रिपोर्टर होता है, स्प्लिसिंग पर क्वेरी के प्रभाव का परीक्षण करेगा।

ACT1-CUP1 परख में स्वतंत्र चर एक शोधकर्ता को QSP की गंभीरता का आकलन करने की अनुमति देते हैं। ये स्वतंत्र चर तांबे की एकाग्रता और कई गैर-आम सहमति स्प्लिसिंग संवाददाताओं का चयन हैं। सबसे पहले, जैसा कि खमीर उपभेदों को तांबे की सांद्रता (चित्रा 2) की एक श्रृंखला वाली प्लेटों पर उगाया जाता है, परख स्थापित करने में उपयोग की जाने वाली सांद्रता की ढाल का चयन करना शामिल है। अध्ययन व्यवहार्यता का प्रारंभिक रीडआउट प्राप्त करने के लिए एक कोर्स कॉपर एकाग्रता ढाल का उपयोग कर सकते हैं और फिर सूक्ष्म व्यवहार्यता अंतर की पहचान करने के लिए परख को बेहतर ढाल के साथ दोहरा सकते हैं। दूसरा चर ACT1-CUP1 संवाददाताओं की विस्तृत श्रृंखला है जिसका परीक्षण करना संभव है (चित्रा 1 और तालिका 1)। यदि क्यूएसपी एक गैर-आम सहमति रिपोर्टर बनाम जंगली-प्रकार की उपस्थिति में खमीर व्यवहार्यता को अलग-अलग प्रभावित करता है, तो एक निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि क्यूएसपी इंट्रोन के उस क्षेत्र की पहचान या प्रसंस्करण के दौरान महत्वपूर्ण स्प्लिसोसोम के एक क्षेत्र को स्प्लिसिंग में एक कदम प्रभावित करता है।

खमीर टूलबॉक्स व्यापक है, और एसीटी 1-सीयूपी 1 परख स्प्लिसिंग अनुसंधान का एक अभिन्न अंग है। ACT1-CUP1 परख अक्सर QSP के प्रभाव पर अधिक गहन आनुवंशिक, संरचनात्मक और / या जैव रासायनिक विश्लेषण के साथ किया जाता है। चूंकि इन अधिक विस्तृत अध्ययनों में आम तौर पर एक लंबी प्रक्रिया और / या उच्च मूल्य टैग होता है, इसलिए एक लगातार दृष्टिकोण पहले एसीटी 1-सीयूपी 1 के साथ दिलचस्प उत्परिवर्ती के लिए स्क्रीनिंग है।

यहां एक एसीटी 1-सीयूपी 1 परख प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है, जिसमें कॉपर प्लेट तैयार करना भी शामिल है। यह परख शोधकर्ताओं को स्प्लिसिंग पर क्यूएसपी के प्रभाव का प्रारंभिक उत्तर प्रदान करती है और कौन से इंट्रोनिक क्षेत्र गड़बड़ी से सबसे अधिक प्रभावित होते हैं।

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Protocol

1. खमीर तनाव निर्माण

  1. एक S. Cerevisiae तनाव उत्पन्न करें या प्राप्त करें जिसकी पृष्ठभूमि में Leu2 और cup1E शामिल हैं। इस पृष्ठभूमि को उत्पन्न करने के लिए, अच्छी तरह से स्थापित खमीर विधि का उपयोग करें जो लिथियम एसीटेट और एकल-फंसे डीएनए39 को नियोजित करता है।
    नोट: अगुणित खमीर उपभेदों में CUP1 6,38 की एक, दो या अधिक प्रतियां हो सकती हैं। सीयूपी 1 जीन स्थान (ओं) को फ्लैंक करने के लिए नॉक-आउट प्राइमर डिजाइन करते समय चयनित खमीर तनाव के लिए जीनोमिक जानकारी देखें।
  2. क्यूएसपी को जीनोमिक निगमन के माध्यम से या प्लास्मिड पर शामिल करने के लिए एक खमीर परिवर्तन करें। एक अच्छी तरह से स्थापित प्रोटोकॉल का उपयोग करें जैसे कि पिछले शोध 40,41,42 में वर्णित।
  3. चरण 1.2 से परिणामी तनाव (ओं) के साथ एक खमीर परिवर्तन करें। वांछित ACT1-CUP1 रिपोर्टर प्लास्मिड जोड़ने के लिए।
    नोट: इस परिवर्तन के बाद एसीटी 1-सीयूपी 1 रिपोर्टर प्लास्मिड के प्रतिधारण को सुनिश्चित करने के लिए ल्यूसीन ड्रॉप-आउट (-ल्यू) प्लेटों और मीडिया पर कोशिकाओं को बनाए रखा जाना चाहिए।
  4. चरण 1.2 निष्पादित करें। और 1.3. प्रत्येक क्यूएसपी और प्रत्येक एसीटी 1-सीयूपी 1 रिपोर्टर प्लास्मिड के लिए परीक्षण किया जाना है, जिसमें नियंत्रण उपभेद भी शामिल हैं।

2. कॉपर प्लेट तैयार करना

  1. एक तांबे की एकाग्रता सीमा का चयन करें जो परीक्षण किए जाने वाले संवाददाताओं के अनुरूप हो (अक्सर उपयोग किए जाने वाले संवाददाताओं की घातकता के लिए तालिका 1 देखें)।
    नोट: एक व्यापक तांबा एकाग्रता सीमा का एक उदाहरण 0 mM, 0.025 mM, 0.05 mM, 0.075 mM, 0.1 mM, 0.15 mM, 0.2 mM, 0.25 mM, 0.3 mM, 0.35 mM, 0.4 mM, 0.45 mM, 0.5 mM, 0.2 mM, 0.2 mM, 0.0 mM, 0.2 mM, 0.2 mM, 0.2 mM, 0.2 mM, 0.2 mM, 0.2 mM, 0.2 mM, 0.2 mM, 0.2 mM, 0.2 mM, 0.2 mM, 0.2 mM, 0.2 mM, 0.2 mM, 0.2 mM, 0.2 mM, 0.2 mM, 0.2 mM, 0.2 mM, 0.2 mM, 0.2 mM, 0.2 mM, 0.2 mM, 0.2 mM, 0.2 mM, 0.2 mM, 0.2 mM, 0.2 mM, 0.2 mM, 0.45 mM, 0.45 mM, 0.45 mM, 0.5 mM, 0.2 mM, 0.2 mM, 0.2 mM, 0.2 mM, 0.2 mM, 0.2 mM, 0.2 mM, 0.2 mM, 0.2 mM, 0.2 mM, 0.2 mM, 0.2 mM, 0.2 mM, 0.2 mM, 0.2 mM, 0.2 mM, 0.2 mM, 0.2 mM, 0.2 mM, 0.45 mM, 0.4 1.4 mM, 1.5 mM, 1.6 mM, 1.7 mM, 1.8 mM, 1.9 mM, 2.0 mM, 2.25 mM, और 2.5 mM Cu2+।
  2. 0.22 μm PES (पॉलीएथरसल्फोन) बाँझ फ़िल्टर के माध्यम से 1 M CuSO4 और बाँझ फ़िल्टर का स्टॉक समाधान बनाएं।
  3. प्रति वांछित तांबे की प्लेट, बाँझ पानी में CuSO4 स्टॉक का 2 एमएल कमजोर पड़ने तैयार करें।
    नोट: चूंकि 0 mM Cu2+ वाली प्लेट का हमेशा विश्लेषण किया जाएगा और संदर्भ के रूप में चित्रित किया जाएगा, इसलिए दो 0 mM Cu2+ प्लेटें बनाने की सिफारिश की जाती है, एक शुरुआत में और एक प्लेटिंग चरण के अंत में (चरण 3.4.)।
    1. प्लेट वॉल्यूम के 40 एमएल में अंतिम वांछित तांबा एकाग्रता के लिए स्टॉक की मात्रा की गणना करें (पूरक तालिका 1)।
    2. बाँझ पानी की गणना की गई मात्रा और 1 एम क्यूएसओ4 स्टॉक को बाँझ, 2 एमएल ट्यूब में जोड़ें।
  4. ACT1-CUP1 परख के लिए प्लेटें डालें।
    नोट: नीचे दिए गए प्रोटोकॉल का एक विकल्प शुरू में मीडिया और एगर को एक बड़े कंटेनर में जोड़ना है और प्रत्येक प्लेट के लिए अलग-अलग तांबा सांद्रता प्राप्त करने के लिए छोटे कंटेनरों में ऑटोक्लेविंग के बाद एलिकोट करना है। जो भी विधि ली जाती है, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि प्रत्येक में एक अलग तांबे की एकाग्रता होने के बावजूद मीडिया एकाग्रता सभी प्लेटों के बीच सुसंगत है।
    1. प्रत्येक खाली प्लेट को अंतिम तांबे की एकाग्रता के साथ डाला जाना चाहिए। परीक्षण के लिए प्रति तांबे की एकाग्रता में कम से कम एक वर्ग प्लेट तैयार करें।
    2. परीक्षण किए जाने के लिए प्रति तांबे की एकाग्रता में 100 एमएल बोतल लेबल करें।
    3. प्रत्येक बोतल में, 790 मिलीग्राम आगर (2% डब्ल्यू / वी एगर) और एक हलचल बार जोड़ें।
    4. एक बड़े बीकर में, सभी तांबे की प्लेटों को डालने के लिए -ल्यू विकास मीडिया को मिलाएं। प्रति प्लेट, 34 एमएल विआयनीकृत पानी में 265 मिलीग्राम खमीर नाइट्रोजन बेस (वाईएनबी) और 64 मिलीग्राम ड्रॉप-आउट मिश्रण माइनस ल्यूसीन (और कोई अन्य पोषक तत्व जो कोशिकाओं में क्यूएसपी प्लास्मिड को बनाए रखने के लिए आवश्यक हो सकते हैं) को भंग करें।
    5. प्रत्येक तैयार 100 एमएल बोतल में -ल्यू ग्रोथ मीडिया समाधान के 34 एमएल जोड़ें और एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कैप करें। पन्नी को इच्छित तांबे की एकाग्रता के साथ लेबल करें।
    6. आटोक्लेव के लिए अनुशंसित तरल चक्र का उपयोग करके आगर को निष्फल और भंग करने के लिए ऑटोक्लेव।
    7. जितनी जल्दी हो सके, प्रत्येक बोतल में 20% डब्ल्यू / वी ग्लूकोज (बाँझ फ़िल्टर) के 4 एमएल जोड़ें।
    8. लेबल का मिलान करें और अपनी इच्छित बोतल में CuSO4 के 2 एमएल कमजोर पड़ने जोड़ें।
      नोट: चूंकि दसियों तांबे की प्लेटें एक ही समय में बनाई जा सकती हैं, प्रत्येक को एक अलग एकाग्रता के साथ, सभी बोतलों, ट्यूबों और प्लेटों को स्पष्ट रूप से इच्छित तांबे की एकाग्रता के साथ लेबल करने से प्लेट डालने के दौरान भ्रम को रोका जा सकेगा।
    9. ~ 30 सेकंड के लिए मिश्रण करने के लिए एक हलचल प्लेट का उपयोग करें और बुलबुले से बचने के लिए लेबल प्लेट में 35 एमएल डालें या पाइप करें। भंडारण या उपयोग करने से पहले ठंडा होने दें।
      नोट: अक्सर, प्लेटों को परख से 1 दिन या 2 दिन पहले बनाया जाता है और उपयोग से कुछ घंटे पहले तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है। प्लेटिंग शुरू होने से पहले प्लेटों को कमरे के तापमान (आरटी) पर होना चाहिए (चरण 3.4.)।

3. ACT1-CUP1 परख

  1. -ल्यू प्लेटों पर वांछित उपभेदों को बाहर निकालें।
    नोट: यदि क्रायो स्टॉक से काम कर रहे हैं, तो यह सुनिश्चित करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए कि प्लेटिंग से पहले कोशिकाओं को भंडारण से पर्याप्त रूप से पुनर्जीवित किया जाए। इसके लिए एक अनुशंसित प्रक्रिया क्रायोजेनिक स्टॉक से लकीर करना है और इसे 30 डिग्री सेल्सियस पर 3-5 दिनों तक बढ़ने की अनुमति देना है। फिर, एक छोटी सी घड़ी को फिर से बनाएं और इसे 30 डिग्री सेल्सियस पर 2-3 दिनों तक बढ़ने दें।
  2. 10 एमएल मीडिया में रातोंरात संस्कृतियों को बढ़ाएं।
    1. चरण 2.4.2 में वर्णित समान अनुपात का उपयोग करके -ल्यू विकास मीडिया तैयार करें। प्रति 10 एमएल मीडिया, 66 मिलीग्राम खमीर नाइट्रोजन बेस (वाईएनबी) और 16 मिलीग्राम ड्रॉप-आउट मिश्रण माइनस ल्यूसीन को 9 एमएल विआयनीकृत पानी में जोड़ें। 0.22 μm PES बाँझ फ़िल्टर के माध्यम से पास करें।
    2. प्रति खमीर तनाव, एक बाँझ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 9 एमएल -ल्यू ग्रोथ मीडिया और 20% डब्ल्यू / वी ग्लूकोज (बाँझ फ़िल्टर) का 1 एमएल जोड़ें।
    3. एक बाँझ छड़ी या पिपेट टिप का उपयोग करके, खमीर की एक छोटी (~ 1 मिमी गोल) घड़ी इकट्ठा करें और मीडिया को टीका लगाएं।
    4. 180 आरपीएम और 30 डिग्री सेल्सियस पर सभी रातोंरात संस्कृतियों को हिलाएं।
      नोट: यदि उपलब्ध हो, तो शेकर के बजाय रोटेटर का उपयोग किया जा सकता है।
  3. 10% ग्लिसरॉल मेंओडी 600 0.5 ± 0.05 के लिए उपभेदों को पतला करें।
    1. प्रति स्ट्रेन, 900 μL पानी वाले एक कुवेट में 100 μL कल्चर जोड़ें।
    2. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ ओडी600 को मापें।
    3. 2 एमएल के अंतिम आयतन में 0.5 के ओडी600 पर होने के लिए आवश्यक कमजोर पड़ने की गणना करें।
    4. 10% ग्लिसरॉल (बाँझ) में प्रत्येक तनाव को ओडी600 0.5 तक पतला करें।
    5. सेल घनत्व की पुष्टि करने के लिए ओडी600 को फिर से मापें कि सेल घनत्व 0.5 ± 0.05 की वांछित सीमा के भीतर है।
  4. तांबे की प्लेटों पर उपभेदों को प्लेट करें।
    नोट: उपभेदों को प्लेट करने के लिए विभिन्न तरीकों का उपयोग किया जा सकता है, जिसमें हाथ से 5-10 μL वॉल्यूम, रिपीट या मल्टी-चैनल पाइपेटर का उपयोग करना या पिन प्रतिलिपिकार के साथ स्टैम्पिंग करना शामिल है। इस अंतिम विधि को नीचे वर्णित किया गया है, हालांकि विधि की परवाह किए बिना अधिकांश चरण समान होंगे।
    1. एक बाँझ कार्य स्थान और एक जलाया हुआ बन्सन बर्नर स्थापित करें।
    2. 48-पिन प्रतिलिपिकार के लिए, प्रत्येक पतला तनाव के 200 μL को 96-वेल प्लेट के एक अलग कुएं में बदल दिया जाता है। 6 x 8 ग्रिड में खाली स्थानों को 10% ग्लिसरॉल (बाँझ) के 200 μL के साथ भरें।
      नोट: नौ खमीर उपभेदों के लिए एक चढ़ाना योजना का एक उदाहरण पूरक तालिका 2 में है।
    3. प्रतिलिपिकार को 95% (v/v) इथेनॉल और लौ के उथले पकवान में स्टरलाइज़ करने के लिए डुबोएं। कोशिकाओं को चौंकाने वाली गर्मी से बचने के लिए लौ बुझने के बाद इसे कम से कम 2 मिनट के लिए ठंडा होने दें।
    4. बर्नर के पास चार प्लेटें रखें और ढक्कन हटा दें।
    5. प्रतिलिपिकार को 96-वेल प्लेट में डुबोएं और इसे एक त्वरित गति में उठाएं।
    6. एक अच्छा स्थानांतरण की सुविधा के लिए प्लेट और चट्टान पर धीरे से आगे और पीछे रखें।
    7. एक तेज गति में उठाएं और 96-वेल प्लेट में ठीक उसी अभिविन्यास में रखें।
    8. तीन अन्य प्लेटों के लिए दोहराएं। प्रतिकृति को इथेनॉल में डुबोने की प्रक्रिया को दोहराएं, निष्फल करने के लिए जलते हैं, और हर चार प्लेटों को ठंडा करने की प्रतीक्षा करते हैं।
    9. एक प्लेट चढ़ाए जाने के बाद, एक चिकनी गति के साथ साइड में जाएं लेकिन फिर भी लौ की नसबंदी छतरी के भीतर।
      नोट: खमीर तनुकरण और लौ के पास चढ़ाना करने की सिफारिश की जाती है। सूखने के दौरान प्लेटें आसानी से दूषित हो सकती हैं।
    10. ढक्कन रखने से पहले प्लेटों को पूरी तरह से सूखने दें, आमतौर पर 3-5 मिनट।
    11. प्लेटों को 30 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिनों के लिए इनक्यूबेट करें।

4. डेटा संग्रह और विश्लेषण

  1. इनक्यूबेटर से प्लेटों को हटा दें और उनका निरीक्षण करें।
  2. उपलब्ध कैमरे या अन्य डिजिटल इमेजिंग सिस्टम के साथ प्लेटों की छवियों को रिकॉर्ड करें।
  3. प्रत्येक तनाव के लिए रिकॉर्ड (या स्कोर) अंतिम तांबा एकाग्रता दिखाई देने वाली वृद्धि देखी जाती है।
    नोट: कोशिकाएं उस एकाग्रता तक अलग होने और व्यवहार्य रहने में सक्षम हैं। स्थिरता के लिए, अंतिम व्यवहार्य तांबा एकाग्रता स्कोर करने के लिए हमेशा आंखों से या प्लेट छवियों से एक ही विधि का उपयोग करें। बहुत छोटी कॉलोनियां कभी-कभी आंख से दिखाई देती हैं लेकिन छवि पर नहीं। प्रत्यक्ष दृश्य निरीक्षण या छवियों से रिकॉर्डिंग के बीच का अंतर छोटा है, आमतौर पर ढाल में एक कदम। जैसा कि उपनिवेशों की छवियों का उपयोग अक्सर प्रकाशनों में किया जाता है, छवियों द्वारा स्कोरिंग की सिफारिश की जाती है।
  4. क्यूएसपी स्प्लिसिंग को कैसे प्रभावित करता है, इसके बारे में निष्कर्ष निकालने के लिए एक ही तनाव के लिए कई एसीटी 1-सीयूपी 1 परखों से डेटा को संयोजित करें।
    नोट: प्रकाशन के आंकड़े कस्टम रूप से 0 mM Cu2+ एकाग्रता, अंतिम व्यवहार्य तांबा एकाग्रता, और बाद की एकाग्रता पर खमीर कॉलोनियों की छवियों को दिखाते हैं जहां कॉलोनी मर गई है। प्रतिकृतियों के बीच मानक विचलन के लिए त्रुटि पट्टियों के साथ डेटा को बार ग्राफ के रूप में भी प्रदर्शित किया जा सकता है। डेटा को सामान्यीकृत करने की आवश्यकता नहीं है, लेकिन डब्ल्यूटी स्प्लिसिंग फैक्टर कंट्रोल की व्यवहार्यता को 1 पर सेट करके और पेश किए गए उत्परिवर्तन (ओं) के प्रभाव की तुलना करके किया जा सकता है।

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Representative Results

एसीटी 1-सीयूपी 1 जैसे विकास परखों को कई कॉलोनियों के दृश्य, तुलनात्मक मूल्यांकन की आवश्यकता होती है। यहां, प्रत्येक तनाव को रात भर संतृप्ति में बढ़ाया गया था, 0.5 के ओडी600 तक पतला किया गया था, और 20 प्लेटों पर चढ़ाया गया था जिसमें 0 एमएम से 1.1 एमएम क्यूएसओ4 (चित्रा 3) तक तांबे की सांद्रता की सीमा थी। यह सीमा प्रोटोकॉल में सूचीबद्ध की तुलना में छोटी है क्योंकि इसने क्यूएसपी और एसीटी 1-सीयूपी 1 संवाददाताओं के प्रभाव के पूर्ण मूल्यांकन के लिए अनुमति दी है। प्लेटों को चित्रित और स्कोर किया गया था (चित्रा 3 और पूरक तालिका 3)।

इस प्रतिनिधि प्रयोग के लिए, खमीर पृष्ठभूमि में एक बाधित एडीई 2 जीन शामिल है, जिसके परिणामस्वरूप कॉलोनियां लाल रंग के अलग-अलग रंग हैं (चित्रा 3 ए, बी)। एडेनोसिन उत्पादन मार्ग में यह सामान्य खमीर व्यवधान एडेनोसिन के लिए लाल-रंजित अग्रदूत के निर्माण का कारण बनता है। इस प्रकार, लाल रंग खमीर कॉलोनी परिपक्वता (यानी, मौजूद कोशिकाओं की मात्रा और आयु) का एक संकेतक है। एक ACT1-CUP1 परख के प्रयोजनों के लिए, लाल रंग रंग में सफेद या पीला होने पर फंगल प्रजातियों को दूषित करने के संकेतक के रूप में काम कर सकता है। रंग तांबे की सहिष्णुता की एक द्वितीयक पुष्टि हो सकती है क्योंकि अधिक व्यवहार्य उपनिवेश एक गहरी लाल छाया होगी।

पिन प्रतिलिपिकार के साथ चढ़ाना करते समय, कई सामान्य विचलन होते हैं। सबसे पहले, ऐसी कॉलोनियों का निर्माण करना संभव है जो अंडाकार आकार की हैं यदि प्रतिलिपिकार को बाएं या दाएं चलते हुए ऊपर उठाया जाता है (चित्रा 3 बी, नारंगी तीर)। इसके अलावा, माइक्रोकॉलोनियां सेल समाधान की छोटी बूंदों से भी बन सकती हैं यदि पिन प्रतिलिपिकार को एक कोण पर लाया जाता है या यदि प्लेट के ऊपर हिलाया जाता है (चित्रा 3 बी, लाल तीर)। अक्सर निर्दोष, कभी-कभी, माइक्रोकॉलोनियां एक मुद्रित कॉलोनी के साथ मिश्रण कर सकती हैं, और यह उस कॉलोनी की व्याख्या को रोकती है। अतिरिक्त चढ़ाना मुद्दों में प्रतिलिपिकार पिन को ठंडा करने के लिए नसबंदी के बाद अपर्याप्त प्रतीक्षा समय और प्लेट और पिन के बीच अपर्याप्त संपर्क शामिल है जैसे कि संस्कृति मीडिया का खराब हस्तांतरण होता है। दोनों मामलों में, कुछ, यदि कोई हो, तो प्लेट पर कोशिकाएं बढ़ेंगी, जिसमें जंगली प्रकार के रिपोर्टर वाले नियंत्रण उपभेद भी शामिल हैं। किसी भी विकास परख के साथ, चढ़ाना की विधि की परवाह किए बिना, परिणामों के सुसंगत और दोहराने योग्य होने की पुष्टि करने के लिए तीन प्रतियों में एसीटी 1-सीयूपी 1 करना महत्वपूर्ण है। आदर्श रूप से, प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए अलग-अलग समय पर तैयार तांबे की प्लेटों पर इन अलग-अलग प्रतिकृतियों का प्रदर्शन किया जाना चाहिए।

इन प्रतिनिधि प्रयोगों के लिए, अतिरिक्त स्प्लिसोसोम गड़बड़ी की अनुपस्थिति में तांबा सहिष्णुता पर एक गैर-आम सहमति अनुक्रम के प्रभाव को उजागर करने के लिए ए 3 सी रिपोर्टर का चयन किया गया था। ए 3 सी उत्पादित सीयूपी 1 एमआरएनए की मात्रा को काफी कम कर देता है क्योंकि यह 5 'एसएस15 को पहचानने और उपयोग करने के लिए स्प्लिसोसोम की क्षमता को परेशान करता है। ए 3 सी रिपोर्टर के साथ खमीर 0.15 एमएम क्यू2 + तक जीवित रहा, जबकि जंगली प्रकार की रिपोर्टर कोशिकाओं ने परीक्षण किए गए तांबे की सांद्रता की सीमा के अंत तक व्यवहार्यता बनाए रखी (चित्रा 3सी)। कोशिकाओं वाले जंगली प्रकार के रिपोर्टर व्यवहार्यता (डेटा नहीं दिखाए गए) पर प्रभाव के बिना 2.5 एमएम क्यू2 + तक बढ़ते हैं।

यू 6 एसएनआरएनए स्प्लिसोसोम का एक आवश्यक उत्प्रेरक घटक है। कई अध्ययनों ने इस आरएनए 16,32,34 पर उत्परिवर्तन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एसीटी1-सीयूपी 1 का उपयोग किया है। इस अध्ययन के लिए डुप्लिकेट किए गए, तीन यू 6 एसएनआरएनए अनुक्रमों का अध्ययन किया गया, अर्थात् जंगली-प्रकार अनुक्रम (डब्ल्यूटी), स्थिति 57 को यूरिडीन से साइटोसिन (यू 57 सी) में प्रतिस्थापित किया गया, और स्थिति 57 को यूरिडाइन से एडेनोसिन (यू 57 ए) में प्रतिस्थापित किया गया (चित्रा 3 और चित्रा 4)। एसीटी 1-सीयूपी 1 संवाददाताओं के साथ संयुक्त जो स्प्लिसिंग में उत्प्रेरक चरणों को प्रभावित करते हैं, यह निर्धारित किया गया था कि यू 57 सी पहले उत्प्रेरक कदम का पक्ष लेता है, और यू 57 ए दूसरे चरण16,32 की प्रगति का पक्ष लेता है।

एसीटी 1-सीयूपी 1 परख के लिए स्थापित करने के लिए, यू 6 एसएनआरएनए की जीनोमिक कॉपी को हटा दिया गया था और प्लास्मिड पर यू 6 एसएनआरएनए जंगली-प्रकार या उत्परिवर्तित अनुक्रमों को शामिल किया गया था। चूंकि यू 6 एसएनआरएनए सेल का एक आवश्यक घटक है, इसलिए सेल व्यवहार्यता को बनाए रखते हुए जीनोमिक यू 6 एसएनआरएनए को पहले नॉक-आउट करने के लिए तीन अलग-अलग परिवर्तनों का उपयोग किया गया था, बाद में प्लास्मिड पर उत्परिवर्तित यू 6 एसएनआरएनए पेश किया गया था, और अंत में, एसीटी 1-सीयूपी 1 संवाददाताओं को जोड़ा गया था। पहले परिवर्तन के लिए, व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए यूआरए चयन मार्कर प्लास्मिड पर डब्ल्यूटी यू 6 एसएनआरएनए को जोड़ते हुए यू 6 एसएनआरएनए की जीनोमिक कॉपी के नॉक-आउट में एक कप 1 खमीर तनाव का उपयोग किया गया था। बाद में एक परिवर्तन ने टीआरपी चयन मार्कर प्लास्मिड पर वाइल्ड-टाइप या उत्परिवर्तित यू 6 एसएनआरएनए को जोड़ा, 5-एफओए चयन के माध्यम से यूआरए मार्कर के खिलाफ चयन किया। इस प्रकार, तीन कप 1 खमीर उपभेद उत्पन्न हुए, जिनमें से प्रत्येक में यू 6 एसएनआरएनए अनुक्रमों में से एक था, अर्थात् डब्ल्यूटी, यू 57 ए और यू 57 सी। प्रत्येक तनाव के लिए एक अंतिम खमीर परिवर्तन ने इस प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले तीन अलग-अलग एसीटी 1-सीयूपी 1 रिपोर्टर प्लास्मिड में से एक को जोड़ा। चुने गए पत्रकार जंगली प्रकार के रिपोर्टर, ए 3 सी, और शाखा-साइट एडेनोसिन से गुआनिन (बीएस-जी) में उत्परिवर्तन थे। इस प्रयोग के लिए कुल नौ उपभेद उत्पन्न किए गए थे, जिनमें से प्रत्येक में एक यू 6 एसएनआरएनए अनुक्रम और एक एसीटी 1-सीयूपी 1 रिपोर्टर (पूरक तालिका 4 और पूरक तालिका 5) शामिल थे।

परिणामों से पता चला है कि यू 6 एसएनआरएनए स्थिति 57 पर विभिन्न आधारों का 5 'एसएस या बीएस उत्परिवर्तन (चित्रा 4) के साथ संयोजन में स्प्लिसोसोम पर अद्वितीय प्रभाव पड़ता है। ए 3 सी और बीएस-जी दोनों रिपोर्टर मुख्य रूप से पहले उत्प्रेरक चरण रचना14,15 को स्थिर करके स्प्लिसिंग को रोकते हैं। इस प्रकार, U57c एक योजक उत्परिवर्तन है जो इन संवाददाताओं में से किसी के साथ संयोजन में तांबा सहिष्णुता को कम करता है (चित्रा 4 बी)। इसके विपरीत, U57a तांबे की सहनशीलता को बढ़ाता है क्योंकि यह दूसरे चरण (चित्रा 4 बी) 16,32 में प्रगति को बढ़ावा देता है। यू 6 एसएनआरएनए डब्ल्यूटी की तुलना में यू 57 ए के साथ बीएस-जी रिपोर्टर स्ट्रेन की कम तांबा सहिष्णुता स्प्लिसिंग16 के दूसरे चरण पर बीएस-जी के संभावित द्वितीयक प्रभाव पर प्रकाश डालती है।

ये परिणाम इस परख की गुणात्मक प्रकृति को भी उजागर करते हैं और जंगली प्रकार के क्वेरी और रिपोर्टर अनुक्रमों का परीक्षण क्यों किया जाना चाहिए। जबकि जंगली-प्रकार यू 6 एसएनआरएनए की तुलना में इन यू 6 एसएनआरएनए उत्परिवर्तनों के लिए बढ़ी हुई या घटी हुई तांबा सहिष्णुता का सामान्य पैटर्न सही है, तांबे की सटीक एकाग्रता जिसमें कोशिकाएं जीवित रहती हैं, अध्ययनों के बीच भिन्न हो सकती है (तालिका 1) और इन प्रतिनिधि डेटा और अन्य प्रकाशित परिणामों के बीच भिन्न होती है। यह संभवतः सीयूपी 1 विलोपन वाले तनाव की पृष्ठभूमि के कारण है, लेकिन प्लेटिंग से पहले उपभेदों के सामान्य स्वास्थ्य के कारण भी हो सकता है (यानी, क्रायो से तनाव या रेस्ट्रेक की उत्पत्ति के कितनी जल्दी बाद परख की गई थी), प्लेटों को कैसे तैयार किया जाता है, और विभिन्न इनक्यूबेटरों के बीच परिवर्तनशीलता में अंतर। साहित्य43 में पीआरपी 8 क्वेरी उत्परिवर्तन के लिए मेयरले एट अल में एक समान भिन्नता नोट की गई थी। इस प्रकार, कॉपर टॉलरेंस ट्रेंड्स की तुलना अलग-अलग एसीटी 1-सीयूपी 1 परखों के लिए की जा सकती है, लेकिन तांबे की सांद्रता की संख्यात्मक तुलना केवल एक ही प्रयोगशाला के भीतर और कई बार, तांबे की प्लेटों के एक ही सेट के साथ की जानी चाहिए।

Figure 1
चित्रा 1: एसीटी 1-सीयूपी 1 रिपोर्टर डिजाइन। स्प्लिस्ड रिपोर्टर की एकाग्रता सीधे खमीर तांबा सहिष्णुता के साथ संबंधित है। रिपोर्टर के आरेख में 5'स्प्लिस साइट (5'एसएस), ब्रांच-साइट (बीएस), और 3'स्प्लिस साइट (3' एसएस) के तीन स्प्लिस साइट शामिल हैं। इन साइटों के लिए खमीर आम सहमति अनुक्रम दिखाए गए हैं, जिसमें दरार के लिए लक्षित लोग बोल्ड में इंगित किए गए हैं और इंट्रोन में उनके स्थान के आधार पर क्रमांकित हैं। आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले गैर-आम सहमति एसीटी 1-सीयूपी 1 रिपोर्टर अनुक्रमों को उनके संबंधित आम सहमति अनुक्रम स्थानों के नीचे निचले मामले में दिखाया जाता है और तालिका 1 में सूचीबद्ध किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: एसीटी 1-सीयूपी 1 परख वर्कफ़्लो। इस परख के लिए, एक खमीर तनाव कप 1- ल्यू 2 होना चाहिए और इसमें वांछित एसीटी 1-सीयूपी 1 रिपोर्टर प्लास्मिड और क्यूएसपी जीन होना चाहिए, जिसे आंकड़े में जीन लेबल किया गया है। क्यूएसपी जीन को या तो जीनोमिक रूप से डाला जाना चाहिए या प्लास्मिड पर। पिन प्रतिलिपिकार का उपयोग करने वाले प्रोटोकॉल में खमीर कोशिकाओं को तैयार करने के लिए चार चरण शामिल हैं। चरण 1 कोशिकाओं को संतृप्ति तक विकसित करना है। चरण 2 संस्कृति के ओडी600 को मापना और 0.5 के ओडी600 को पतला करना है। चरण 3 एक 96-वेल प्लेट पर वितरित करना है। चरण 4 तांबे की बढ़ती सांद्रता वाली प्लेटों पर प्लेट करना है (बढ़ते नीले रंग के साथ संकेत दिया गया है)। चरण 1, चरण 2, और चरण 4 हाथ पाइपिंग के लिए समान होंगे। एक बार चढ़ाए जाने के बाद, प्लेटों को 30 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिनों के लिए इनक्यूबेट किया जाता है और फिर व्यवहार्यता के लिए स्कोर किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: ACT1-CUP1 डेटा के प्रतिनिधि विचार। इस प्रयोग के लिए, खमीर स्प्लिसोसोम को दो अलग-अलग यू 6 एसएनआरएनए उत्परिवर्तन के साथ चुनौती दी जाती है और तीन गैर-आम सहमति संवाददाताओं की उपस्थिति में परीक्षण किया जाता है। प्रदर्शन उद्देश्यों के लिए इस परख की तीन प्रतिकृतियां एक ही प्लेटों पर प्रस्तुत की जाती हैं। इस परख के लिए अलग-अलग प्लेटों पर और अलग-अलग दिनों में प्रतिकृति करने की सिफारिश की जाती है। (ए) 20 प्लेटों पर 0 एमएम से 1.1 एमएम के कॉपर ग्रेडिएंट के साथ एक पूर्ण परख दिखाई गई है। जैसे-जैसे तांबे की एकाग्रता बढ़ती है, कम स्प्लिसिंग वाले उपभेदों में उस बिंदु तक कम वृद्धि दिखाई देती है जहां तांबे की एकाग्रता घातक हो जाती है। खमीर पृष्ठभूमि एडीई 2 थी, और, इस प्रकार, परिपक्व उपनिवेश लाल रंग के होते हैं। (बी) 0 mM और 0.1 mM CuSO4 पर समान प्लेटों की तुलना एक हैंडहेल्ड कैमरा बनाम डिजिटल इमेजिंग सिस्टम के साथ चित्रित। यह इस बात का एक उदाहरण है कि कैसे कई गैर-आम सहमति वाले संवाददाताओं की तुलना साथ-साथ और जंगली-प्रकार के रिपोर्टर के साथ की जा सकती है। प्लेटों पर सामान्य अवलोकनों में पिन प्रतिलिपिकार (लाल तीर) से गिरने वाले कल्चर मीडिया की एक नकली बूंद और प्लेट की सतह के साथ पिन के फिसलने या संस्कृति की बूंद के पर्याप्त रूप से सूखने से पहले प्लेट की गति के कारण कॉलोनियों का थोड़ा अंडाकार होना शामिल है (नारंगी तीर)। (सी) जंगली प्रकार के रिपोर्टर की तुलना में सेल व्यवहार्यता पर ए 3 सी रिपोर्टर के प्रभाव का उदाहरण। (बी) में दिखाए गए चित्रों को विभिन्न तांबा सांद्रता पर विकास अंतर को उजागर करने के लिए क्रॉप और संरेखित किया जाता है। परीक्षण की गई सीमा के अंत तक जंगली प्रकार के रिपोर्टर स्ट्रेन की व्यवहार्यता की तुलना में ए 3 सी रिपोर्टर स्ट्रेन की तांबा सहिष्णुता 0.15 एमएम क्यू2 + तक कम हो जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: प्रतिनिधि एसीटी 1-सीयूपी 1 परिणाम स्प्लिसिंग घटक उत्परिवर्तन के साथ खमीर में स्प्लिसिंग की निगरानी करते हैं। (ए) पहले उत्प्रेरक चरण के तुरंत बाद सक्रिय साइट के आरएनए घटकों का योजनाबद्ध। यू 2 और यू 6 एसएनआरएनए डुप्लेक्स हैं, जो इंट्रॉन के 5 'एसएस और बीएस को निकटता में लाते हैं। ए 259 (बीएस) और जी 1 (5' एसएस) के बीच इनट्रोनिक बंधन नारंगी बिंदु द्वारा इंगित किया जाता है। इस प्रयोग में परीक्षण किए गए ACT1-CUP1 रिपोर्टर में गैर-आम सहमति अनुक्रम प्रतिस्थापन के स्थानों को बोल्ड ब्लैक में इंगित किया गया है। यू 6 एसएनआरएनए (यू 57) में उत्परिवर्तित स्थिति बोल्ड हरे रंग में है, और प्रतिस्थापित आधार नीले या गुलाबी रंग में हैं। (बी) एक प्रकाशन में एसीटी 1-सीयूपी 1 डेटा की प्रस्तुति के लिए एक संभावना में प्रासंगिक क्यू2 + सांद्रता से कॉलोनियों की कई छवियां शामिल हैं। डब्ल्यूटी रिपोर्टर सभी तीन यू 6 एसएनआरएनए उपभेदों के लिए परीक्षण किए गए तांबे की एकाग्रता से बच गया। (सी) प्रति रिपोर्टर और प्रति यू 6 एसएनआरएनए उत्परिवर्ती के प्रभावों की तुलना करने वाला एक बार ग्राफ। यू 6 एसएनआरएनए डब्ल्यूटी की तांबा सहिष्णुता को 1 पर सेट करके और यू 57 सी और यू 57 ए उत्परिवर्तन के अनुपात की गणना करके प्रत्येक एसीटी 1-सीयूपी 1 रिपोर्टर के लिए सामान्यीकरण किया जाता है। त्रुटि पट्टियाँ तीन प्रतिकृतियों से मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5: ACT1-CUP1 परिणामों की प्रशंसा करने के लिए अतिरिक्त तरीके। (A) प्राइमर एक्सटेंशन 3'ACT1 एक्सॉन में प्राइमर एनीलिंग के माध्यम से किया जाता है और फिर इंट्रॉन में एलॉन्गिंग किया जाता है। इस उदाहरण में, प्राइमर को आईआर 700 डाई के साथ अंत-लेबल किया गया है, और प्राइमर एक्सटेंशन 20,21 में वर्णित के रूप में किया गया था। यू 6 एसएनआरएनए का प्राइमर एक्सटेंशन लोडिंग नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए एक ही प्रतिक्रिया में किया जाता है। एक्रिलामाइड, डिनेचरिंग जेल वैन डेर फेल्ट्ज़ एट अल.22 में वर्णित इन्फ्रा-रेड जेल इमेजिंग डिवाइस का उपयोग करके प्राइमर एक्सटेंशन के बाद प्री-एमआरएनए, एमआरएनए और लारियाट उत्पादों को हल करता है। विभिन्न बैंडों की तीव्रता का उपयोग समग्र स्प्लिसिंग दक्षता को मापने के साथ-साथ पहले या दूसरे चरण में होने वाले स्प्लिसिंग मतभेदों को अलग करने के लिए किया जा सकता है, जैसा कि इमेजजे44 या अन्य जेल बैंड मात्रात्मक सॉफ्टवेयर के साथ निर्धारित किया गया है। स्प्लिसिंग दक्षता और स्प्लिसिंग चरण दक्षता दोनों की गणना क्वेरी और कोनारस्का14 में वर्णित के रूप में की जाती है। (बी) एसीटी 1-सीयूपी 1 रिपोर्टरों के साथ म्यूटेशनल स्क्रीन स्प्लिसिंग को प्रभावित करने वाले उत्परिवर्ती की पहचान करने के लिए तांबे के चयन का उपयोग कर सकते हैं। रुचि के जीन (ओं) को तब परिणामी उपभेदों में अनुक्रमित किया जा सकता है ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि उस जीन में उत्परिवर्तन हुआ है या नहीं। (सी) इंट्रोन संरचना, एक्सोनिक अनुक्रमों, एक्सॉन की संख्या, या अनस्प्लिस्ड आरएनए के परमाणु निर्यात के संबंध में स्प्लिसिंग परिवर्तनों की निगरानी के लिए स्प्लिसिंग साइटों के बाहर रिपोर्टर को परिवर्तन किए जा सकते हैं। ग्रे में क्षेत्र एक रिपोर्टर पर शामिल करने के लिए वैकल्पिक विस्तार क्षेत्र हैं, और लाल रंग के क्षेत्र ऐसे क्षेत्र हैं जिनमें अनुक्रम और संरचनात्मक परिवर्तनों को एसीटी 1-सीयूपी 1 परख का उपयोग करके स्प्लिसिंग पर उनके संभावित प्रभाव के लिए परीक्षण किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

रिपोर्टर का नाम इंट्रोनिक क्षेत्र अनुक्रम अंतिम व्यवहार्य Cu2+ एकाग्रता (mM)
WT 5' GUAUGU > 2.5
G1a 5ʹ एक UAUGU 0.0133 या 0.0532
A3c 5ʹ जीयूसीयूजीयू 0.15^,18 या 0.216
G5a 5ʹ GUAUAU 0.303 या 0.259
WT शाखा-साइट UACUAAC > 2.5
C256a शाखा-साइट UAaUAAC 0.1526 या 0.1832
U257c/a शाखा-साइट UACc/aAAC 0.226 या 0.332 या 0.545 0.059,32
A258c/u शाखा-साइट यूएसीयूसी/यूएसी 0.826 1.045 या 1.646
बीएस-सी शाखा-साइट UACUAcC 0.153 या 0.1832,56 या 0.226
बीएस-जी शाखा-साइट UACUAgC 0.0516,32 या 0.625 या 0.846
C260g शाखा-साइट UACUAAg 0.826
WT 3' UAG > 2.5
U301g 3ʹ g एजी 0.1518
A302g/ 3' Ug/uG 0.0139 0.07516 या 0.1824
G303c 3ʹ UAc 0.0532

तालिका 1: आम संवाददाताओं की सूची और क्यू2 + एकाग्रता घातकता की सूचना दी गई। लेसर और गुथरी3 के 100 से अधिक उद्धरण हैं। जबकि इस तालिका को बनाने के लिए इन उद्धरणों के एक छोटे से चयन का उपयोग किया गया था, वे रिपोर्ट किए गए तांबा व्यवहार्यता सांद्रता में अध्ययन के बीच मामूली से मध्यम अंतर की सामान्य प्रवृत्ति को उजागर करते हैं। एसीटी 1-सीयूपी 1 में, एक गाइड के रूप में प्रकाशित सांद्रता का उपयोग करके एक ही खमीर तनाव पृष्ठभूमि वाले उत्परिवर्ती के लिए जंगली प्रकार के प्रोटीन या आरएनए की तुलना करना महत्वपूर्ण है, लेकिन यह अनुमान लगाते हुए कि देखी गई सांद्रता भिन्न हो सकती है। चित्रा 3 (^) और निम्नलिखित उद्धरणों द्वारा एनोटेट किए गए कई प्रकाशनोंसे एकत्र किए गए डेटा 3,9,16,18,24,25,26,32,45,46.

पूरक तालिका 1: एक एकल तांबे की प्लेट की सामग्री और 1 एम क्यूएसओ 4 स्टॉक से 0 एमएम से 2.5 एमएम तक तांबा कमजोर पड़ने को प्राप्त करने के लिए की गई गणनाका एक उदाहरण। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 2: 48-पिन प्रतिलिपिकार के लिए एक प्लेटिंग योजना का उदाहरण। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 3: 30 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिनों के लिए इनक्यूबेट की गई तांबे की प्लेटों से प्राप्त व्यवहार्यता का उदाहरण। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 4: प्रतिनिधि डेटा उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जाने वाले खमीर उपभेदों की सूची। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 5: प्रतिनिधि डेटा उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्लास्मिड की सूची। यू 6 एसएनआरएनए प्लास्मिड उत्पन्न और पिछले शोध22,47 में प्रकाशित हुए। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

ACT1-CUP1 एक विकास परख है, और यह सुनिश्चित करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए कि देखे गए विकास मतभेदों को केवल स्प्लिसिंग दोषों के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। सभी उपभेदों को चढ़ाना से पहले एक समान तरीके से संभाला जाना चाहिए, जिसमें समान लंबाई और विकास और भंडारण की स्थिति का प्रकार शामिल है। यदि तापमान-संवेदनशील उपभेदों का उपयोग किया जाता है, तो एसीटी 1-सीयूपी 1 परख केवल उन परिस्थितियों में की जानी चाहिए जहां वे उपभेद जंगली प्रकार के तुलनात्मक रूप से बढ़ते हैं। संबंधित रूप से, क्यूएसपी घटक के लिए, क्यूएसपी जीन (ओं) के समान खमीर पृष्ठभूमि और अभिव्यक्ति स्तर रखने की सलाह दी जाती है ताकि परिणामों की व्याख्या को क्लाउड न किया जा सके। उपयोग करने के लिए क्यूएसपी और संवाददाताओं की संख्या पर विचार करते समय, पिन प्रतिलिपिकार विधि के साथ एक समय में 30 से अधिक उपभेदों की परख करने की सलाह नहीं दी जाती है। प्रत्येक चरण को करने के लिए अतिरिक्त समय के साथ, कोशिकाएं बस जाएंगी, और सेल व्यवहार्यता में कमी के कारण परख के परिणाम असंगत होंगे।

एसीटी 1-सीयूपी 1 स्वाभाविक रूप से विकास परख के रूप में सीमाओं के अलावा, एक क्यूएसपी का स्प्लिसिंग पर अधिक जटिल प्रभाव हो सकता है जिसे इस विधि के साथ हल किया जा सकता है। चूंकि स्प्लिसिंग एक बहु-चरण प्रक्रिया है और कारकों को पुनर्नवीनीकरण किया जाता है, देखे गए फेनोटाइप के परिणामस्वरूप एक से अधिक स्प्लिसिंग चरण प्रभावित हो सकते हैं। यह बाद के विश्लेषणों के लिए भी सच है जो ACT1-CUP1 का पालन कर सकते हैं, जिनमें से कुछ नीचे वर्णित हैं। डेटा प्रक्रिया के सबसे परेशान कदम को उजागर करेगा, भले ही अन्य चरण स्प्लिसिंग कारक के परिवर्तित कार्य से प्रभावित हो सकते हैं।

ACT1-CUP1 संवाददाताओं के प्राइमर विस्तार का उपयोग पहली बार लेसर और गुथरी के मूल पेपर में किया गया था और अक्सर प्रदर्शन किया जाता है यदि ACT1-CUP1 के परिणाम विकास दोष3 दिखाते हैं। यह परख रिपोर्टर को लक्षित करती है और पीसीआर उत्पादों की लंबाई का उपयोग करके अनस्प्लिस्ड, आंशिक रूप से स्प्लिस्ड और पूरी तरह से स्प्लिस्ड रिपोर्टर की सापेक्ष मात्रा निर्धारित करती है (चित्रा 5 ए)। कुल मिलाकर स्प्लिसिंग दक्षता और क्या दोष पहले या दूसरे उत्प्रेरक चरण को अधिक दृढ़ता से प्रभावित करता है, पीसीआर उत्पाद मात्रा14 के अनुपात लेकर गणना की जाती है। उदाहरण के लिए, 5 'एसएस रिपोर्टर जी 5 ए ने जंगली प्रकार के रिपोर्टर की तुलना में स्प्लिसिंग को कम कर दिया है, लेकिन इसकी पहली और दूसरी चरण क्षमता जंगली-प्रकार (चित्रा 5 ए) के समान पैटर्न का पालन करती है। यह पहले उत्प्रेरक चरण से पहले एक दोष की ओर इशारा करता है, संभवतः स्प्लिसोसोम असेंबली में, क्योंकि दोनों चरण समान रूप से प्रभावितहोते हैं।

कैननिकल एसीटी 1-सीयूपी 1 परख से नए परख विकसित किए गए हैं, जैसे कि उत्परिवर्ती के लिए स्क्रीनिंग जो अन्य स्प्लिसिंग कारक उत्परिवर्ती और / या गैर-सहमति स्प्लिसिंग अनुक्रमों की उपस्थिति में स्प्लिसिंग में सुधार करती है (चित्रा 5 बी)। उदाहरण के लिए, एसीटी 1-सीयूपी 1 रिपोर्टर वाले खमीर को यूवी में उजागर करना और फिर तांबे की उपस्थिति में चयन करने से पीआरपी 8 और एचएसएच 155 उत्परिवर्ती उत्पन्न हुए, जिसने गैर-आम सहमतिअनुक्रमों 14,19 के स्प्लिसिंग में सुधार किया।

स्प्लिस साइटों और संवैधानिक स्प्लिसिंग कारकों के प्रभाव के अध्ययन का विस्तार करते हुए, सीयूपी 1 विकास निर्भरता का उपयोग कई इंट्रॉन स्प्लिसिंग, परमाणु निर्यात नियंत्रण और स्प्लिसिंग पर यूटीआर और अन्य परिधीय अनुक्रमों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए किया गया है (चित्रा 5 सी)। इनमें से कुछ अध्ययनों ने सीयूपी 1 और अन्य इंट्रोन युक्त खमीर जीन के साथ संवाददाताओं का निर्माण किया है, जिसमें इंट्रोनिक माध्यमिक संरचना और मल्टी-इंट्रॉन ट्रांसक्रिप्ट स्प्लिसिंग48,49,50,51,52 पर प्रभाव का अध्ययन करने के लिए अधिक जटिल स्प्लिसिंग पैटर्न हो सकते हैं। स्प्लिसिंग और परमाणु निर्यात के बीच की कड़ी का अध्ययन फ्रेम53,54 में सीयूपी 1 को एन्कोडिंग करके या तो स्प्लिस्ड या अनस्प्लिस्ड ट्रांसक्रिप्ट्स द्वारा किया गया था। विशिष्ट कारकों के कारण पाइरिमिडीन ट्रैक और स्प्लिस साइट चयन की दूरी निर्भरता की लंबाई का भीपरीक्षण 20,55,56,57 किया गया है। ये उदाहरण और कई अन्य एसीटी 1-सीयूपी 1 और अन्य सीयूपी 1 विकास परख की बहुमुखी प्रतिभा को उजागर करते हैं।

एसीटी 1-सीयूपी 1 परख एक व्यापक संवेदनशीलता सीमा के साथ एक सरल विकास फेनोटाइप के साथ एक जटिल प्रतिक्रिया चक्र से गड़बड़ी को जोड़ती है। इस विरासत परख का उपयोग कई प्रयोगशालाओं द्वारा स्प्लिसिंग चक्र की समझ की नींव रखने के लिए किया गया है। हाल ही में, ACT1-CUP1 का उपयोग उन सवालों के जवाब देने के लिए किया गया है जो अब उपलब्ध संरचनात्मक डेटा के धन से उत्पन्न होते हैं 21,22,25. गैर-आम सहमति अनुक्रमों से बंधे स्प्लिसोसोम के संरचनात्मक अध्ययन को एसीटी 1-सीयूपी 1 परिणामों के साथ जोड़ा जा सकता है ताकि यह व्याख्या की जा सके कि परिवर्तित संरचना और परिवर्तित कार्य कैसे सहसंबंधित हैं। ACT1-CUP1 स्प्लिसिंग म्यूटेशन के लिए एक आदर्श पहली स्क्रीन है जो अधिक जटिल विश्लेषण का पूरक हो सकती है।

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Disclosures

लेखक के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

विस्कॉन्सिन-मैडिसन विश्वविद्यालय में हारून होस्किन्स और होस्किन्स लैब के सदस्यों को 3-5 के आंकड़े की पीढ़ी में खमीर उपभेदों और उपकरणों के उपयोग के लिए धन्यवाद। पांडुलिपि पर उनकी व्यावहारिक टिप्पणियों के लिए हरप्रीत कौर और शिंगयांग फू को धन्यवाद। इस पेपर के लेखन, संपादन और फिल्मांकन के दौरान नॉर्थवेस्ट विश्वविद्यालय में सहायक छात्रों, कर्मचारियों और संकाय के लिए धन्यवाद। इस विधि को फिल्माने में मदद के लिए इसाबेल मारासिगन को धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL sterile microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-129 Or comparable item from a different manufacturer.
2 mL sterile microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-138 Or comparable item from a different manufacturer.
50 mL sterile centrifuge tubes Fisher Scientific 07-201-332 Or comparable item from a different manufacturer.
96-well round bottom microplate Fisher Scientific 07-200-760 Or comparable item from a different manufacturer.
190 proof ethanol Fisher Scientific 22-032-600 Or comparable item from a different manufacturer.
500 mL Filter System (0.22 µm) CellTreat Scientific Products 229707 Or comparable item from a different manufacturer.
Agar Fisher Scientific BP1423-500 Any molecular grade agar will work.
Autoclave Tuttnauer 3870EA Or comparable item from a different manufacturer.
Bunsen burner Humboldt PN6200.1 Or comparable item from a different manufacturer.
Cell Density Meter VWR 490005-906 Or other spectral device that can measure absorbance at 595 nm.
Copper sulfate Pentahydrate Fisher Scientific LC134051 Or comparable item from a different manufacturer.
Digital imaging system Cytiva 29399481 ImageQuant 4000 (used for Figure 3),  Amersham ImageQuant 800, or comparable item from a different manufacturer.
Dropout mix (-Leu) USBiological Life Sciences D9525 Use the appropriate drop out mix for your experiment. It is possible you will be using a yeast nutrient marker for your query perturbation also. In that case, the drop out mix should be for that marker and Leu
D-Glucose Fisher Scientific AAA1682836 Or comparable item from a different manufacturer.
Gel band quantifying software Cytiva 29-0006-05 ImageQuant TL v8.1 (used for figure 5A) or comparable item from a different manufacturer.
Hand held camera Nikon D3500 Or comparable item from a different manufacturer.
Near infra-red gel imaging device Cytiva 29238583 Amersham Typhoon NIR (used for Figure 5a) or comparable item from a different manufacturer.
Laboratory grade clamp Fisher Scientific 05-769-7Q Or comparable item from a different manufacturer.
Laboratory grade stand and clamp Fisher Scientific 12-000-101 Or comparable item from a different manufacturer.
Magnetic stir bars Fisher Scientific 14-513-51 Or comparable item from a different manufacturer.
Pin replicator VP Scientific VP 407AH
Semi-micro disposable cuvettes VWR 97000-590 Or comparable item from a different manufacturer.
Shaker JEIO Tech IST-3075 Or comparable item from a different manufacturer.
Spectrophotometer Biowave 80-3000-45 Or any spectophotometer that can measure the absorbance at 600 nm.
Square plates VWR 102091-156 Circular plates may also be used though are more challenging if using a pin replicator.
Stir plate Fisher Scientific 11-520-16S Or comparable item from a different manufacturer.
Yeast nitrogen base USBiological Life Sciences Y2025 Or comparable item from a different manufacturer.

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जेनेटिक्स अंक 184 प्री-एमआरएनए स्प्लिसिंग सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया स्प्लिसोसोम एसीटी 1-सीयूपी 1 विकास परख आनुवंशिक स्क्रीन उत्परिवर्ती स्क्रीन गैर-सहमति अनुक्रम
ACT1-CUP1 परख नवोदित खमीर में स्प्लिसोसोमल उत्परिवर्ती की सब्सट्रेट-विशिष्ट संवेदनशीलता निर्धारित करता है
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van der Feltz, C. ACT1-CUP1 Assays… More

van der Feltz, C. ACT1-CUP1 Assays Determine the Substrate-Specific Sensitivities of Spliceosomal Mutants in Budding Yeast. J. Vis. Exp. (184), e63232, doi:10.3791/63232 (2022).

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