Summary
ACT1-CUP1测定是一种铜生长测定，可快速读取前体信使RNA（pre-mRNA）剪接以及突变剪接因子对剪接体功能的影响。本研究提供了一个协议，并强调了解决感兴趣的拼接问题的定制可能。
Abstract
剪接体或其底物中引入的突变极大地促进了我们对剪接体功能复杂性的理解。无论是疾病相关还是功能选择，许多这些突变都已使用模式生物酿 酒 酵母（酵母）的生长测定进行了研究。剪接特异性铜生长测定或ACT1-CUP1测定在表型水平上提供了对突变的全面分析。ACT1-CUP1测定利用报告基因在正确拼接时赋予铜公差。因此，在铜存在的情况下，酵母活力的变化与剪接中mRNA产生的变化相关。在典型的实验中，酵母剪接体受到不同的非共识剪接报告基因和感兴趣的剪接因子突变的挑战，以检测对剪接的任何协同或相反影响。这里给出了铜板制备、酵母细胞电镀和数据评估的完整描述。描述了一系列免费的实验，突出了ACT1-CUP1报告基因的多功能性。ACT1-CUP1测定是剪接工具箱中方便的工具，这要归功于直接读取突变效应和在该领域继续使用的比较可能性。
Introduction
剪接体是一种大型生物机器，可催化去除前体信使RNA（pre-mRNA）中的内含子和非编码区域1，2。在单独研究蛋白质或RNA时，表征近100种蛋白质和5种非编码RNA中的1种中的单点突变体的作用通常是模棱两可的。突变组件功能的变化可以在完整的功能剪接体的背景下最好地在体内进行评估。
这里描述的铜生长测定是 酿酒 酵母或出芽酵母剪接效率的快速衡量标准。该测定由C.F. Lesser和C. Guthrie开发并于1993年发表，结合了与简单模式生物的易用性和细胞活力的直接读数3。活力与这些细胞中的剪接体识别和拼接报告转录本的能力相关。
这种铜生长测定通常称为ACT1-CUP1测定。ACT1-CUP1这个名字起源于两个基因融合在一起，创造了剪接效率的报告基因。ACT1是酵母的肌动蛋白基因，其高表达并具有有效的剪接内含子4，5。Cup1p是一种铜螯合剂，可将铜隔离在细胞中，以防止干扰正常的细胞功能6，7，8。ACT1-CUP1报告基因按顺序包含这些基因，使得只有当ACT1内含子发生前mRNA剪接时，CUP1才处于正确的阅读框中（图1）。所得融合蛋白含有肌动蛋白的前 21 个氨基酸和全长 Cup1p 蛋白，可提高酵母在富含铜的环境中的活力3.因此，报告基因拼接量的增加导致更高的Cup1p浓度和更高的铜电阻（图1）。与其他报告基因相比，CUP1即使在低水平下也会影响细胞活力，具有广泛的灵敏度范围，可用于直接选择剪接突变3，6，7。此外，CUP1对于标准酵母生长不是必需的，因此在该测定的设置过程中不会影响细胞稳态。作为缺失或温度生长测定的补充，ACT1-CUP1提供了有关在其他最佳酵母生长条件下对剪接的影响的信息。
剪接体通过三个内含子序列识别其底物，即5'剪接位点（5'SS）、分支位点（BS）和3'剪接位点（3'SS）。已经产生了许多ACT1-CUP1报告基因，其中包含这些位点的非共识序列。 最常见的 ACT1-CUP1报告基因的选择如图1和 表1所示。由于剪接体在剪接周期的不同点与每个剪接位点唯一地相互作用，因此可以根据使用非共识报告基因的不同步骤测试剪接体的稳健性。非共识报告基因以内含子内的突变位置及其突变的碱基命名。例如，A3c是一个在5'SS处发生突变的报告基因，特别是从共识腺苷到胞嘧啶的位置3。该报告将与影响5'SS选择和使用的剪接体突变发生强烈相互作用。在他们最初的研究中，Lesser和Guthrie确定了哪些5'SS突变抑制剪接3。同年晚些时候，Burgess和Guthrie在ATPase Prp16p9突变的抑制筛选中发表了所有三个剪接位点的非共识报告。将共识与非共识报告基因进行比较，ACT1-CUP1测定是了解酵母剪接体的稳健性和选择性以及推断其他真核生物剪接体功能的重要关键。
由于非共识ACT1-CUP1报告基因使剪接体对进一步扰动敏感，因此可以通过报告基因来表征单个剪接因子突变的影响，其积极影响或负面影响。这已被应用于以各种方式拼接研究问题。首先，ACT1-CUP1测定可以并且已经被用作剪接因子突变的遗传筛选。例如，最大的剪接蛋白Prp8p作为剪接体RNA核心催化剪接反应的平台。这部分是通过Prp8p突变体如何改善或减少不同ACT1-CUP1报告基因10，11，12，13，14，15，16，17的剪接来推断的。剪接体的其他蛋白质成分也已使用ACT1-CUP1进行了研究，包括Hsh155p，Cwc2p，Cef1p和Ecm2p18，19，20，21，22，23，24，25。Prp16p和其他四种参与剪接体转化的ATP酶的能量阈值也已通过该测定9，26，27，28，29，30进行了研究。利用ACT1-CUP1对小核RNA（snRNA）进行了广泛的研究，以鉴定它们协调的前mRNA序列以及snRNA在剪接过程中经历的二级结构的变化3，31，32，33，34，35，36，37。
ACT1-CUP1测定需要酵母菌株，其中CUP1基因的所有拷贝都被敲除。由于CUP1可以具有高拷贝数6，38，因此制备完整的敲除菌株可能需要多轮或广泛的筛选。因此，cup1Δ酵母菌株经常在实验室之间共享，记者也是如此。
如果从质粒拷贝评估剪接因子中的突变，则应敲除该因子的野生型基因。此外，酵母背景应允许选择至少两个质粒，一个包含ACT1-CUP1报告基因，历史上在亮氨酸营养选择质粒上，另一个包含将要研究的剪接机制中的突变或扰动（图2）。通常，在一次测定中，多个酵母菌株，每个菌株携带查询剪接扰动（QSP）和不同的报告基因，将测试查询对剪接的影响。
ACT1-CUP1测定中的自变量允许研究人员评估QSP的严重程度。这些自变量是铜的浓度和多个非共识拼接报告基因的选择。首先，由于酵母菌株生长在含有一系列铜浓度的平板上（图2），因此设置测定包括选择所用浓度的梯度。研究可以利用过程铜浓度梯度来获得活性的初始读数，然后以更精细的梯度重复测定以确定细微的活性差异。第二个变量是可以测试的ACT1-CUP1报告基因的广泛范围（图 1和 表1）。如果QSP在非共识报告基因与野生型存在的情况下对酵母活力的影响不同，则可以得出结论，QSP影响剪接步骤或剪接体中在识别或处理内含子该区域期间重要的区域。
酵母工具箱非常广泛，ACT1-CUP1测定是剪接研究的一个组成部分。ACT1-CUP1测定通常与对QSP影响的更深入的遗传，结构和/或生化分析一起进行。由于这些更详细的研究通常具有更长的程序和/或更高的价格标签，因此常见的方法是首先筛选具有ACT1-CUP1的有趣突变体。
这里提供的是ACT1-CUP1测定方案，包括铜板制备。该测定为研究人员提供了QSP对剪接影响的初步答案，以及哪些内含子区域受扰动的影响最大。
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Protocol
1. 酵母菌株构建
- 生成或获得酿 酒酵母 菌株，其背景包括 leu2 和 cup1Δ。要生成此背景，请使用采用乙酸锂和单链DNA39的成熟酵母方法。
注意：单倍体酵母菌株可能包含一个，两个或多个 CUP16，38拷贝。在设计敲除引物以侧翼 CUP1 基因位置时，请参阅所选酵母菌株的基因组信息。 - 进行酵母转化以通过基因组掺入或在质粒上掺入QSP。使用完善的协议，例如先前研究40，41，42中描述的方案。
- 使用步骤1.2中产生的菌株进行酵母转化。添加所需的ACT1-CUP1报告质粒。
注意：细胞必须保留在亮氨酸脱落（-Leu）板和培养基上，以确保在此转化后保留ACT1-CUP1报告质粒。 - 执行步骤 1.2。和 1.3.对于要测试的每个QSP和每个ACT1-CUP1报告质粒，包括对照菌株。
2. 铜板制备
- 选择适合被测报告器的铜浓度范围（常用报告基因致死率见 表1 ）。
注意：综合铜浓度范围的一个例子是 30 种不同的铜浓度，分别为 0 mM、0.025 mM、0.05 mM、0.075 mM、0.1 mM、0.15 mM、0.2 mM、0.25 mM、0.3 mM、0.35 mM、0.4 mM、0.45 mM、0.5 mM、0.6 mM、0.7 mM、0.8 mM、0.9 mM、1.0 mM、1.1 mM、1.2 mM、1.3 mM， 1.4 mM、1.5 mM、1.6 mM、1.7 mM、1.8 mM、1.9 mM、2.0 mM、2.25 mM 和 2.5 mM Cu2+。 - 制作1M CuSO4 的储备溶液，并通过0.22μm PES（聚醚砜）无菌过滤器进行无菌过滤器。
- 根据所需的铜板，在无菌水中制备 2 mL 稀释的 CuSO4 储备液。
注意：由于具有0 mM Cu 2 +的板将始终作为参考进行分析和成像，因此建议制作两个0 mM Cu2 +板，一个在电镀步骤的开始，一个在电镀步骤（步骤3.4）结束时。- 计算板体积的40 mL中最终所需铜浓度的原液量（补充表1）。
- 将计算量的无菌水和 1 M CuSO4 储备液加入无菌 2 mL 管中。
- 倒入用于ACT1-CUP1测定的板。
注意：以下方案的替代方案是首先将培养基和琼脂合并在一个大容器中，并在高压灭菌后等分到较小的容器中，以实现每个板的不同铜浓度。无论采用哪种方法，重要的是要确保所有板之间的介质浓度一致，尽管每个板具有不同的铜浓度。- 在每个要倒入的空盘子上贴上它所含的最终铜浓度。每种要测试的铜浓度至少准备一个方形板。
- 标记每个待测铜浓度的 100 mL 瓶子。
- 向每个瓶子中加入790毫克琼脂（2%w / v琼脂）和搅拌棒。
- 在一个大烧杯中，将-Leu生长培养基混合用于所有要倒入的铜板。每个要制作的板，将 265 mg 酵母氮碱 （YNB） 和 64 mg 减去亮氨酸（以及维持细胞中 QSP 质粒可能需要的任何其他营养素）溶解在 34 mL 去离子水中。
- 将 34 mL 的 -Leu 生长培养基溶液加入每个制备的 100 mL 瓶中，并用铝箔盖盖。用预期的铜浓度标记箔。
- 高压灭菌器，使用推荐的高压灭菌器液体循环对琼脂进行灭菌和溶解。
- 尽快向每个瓶子中加入 4 mL 的 20% w/v 葡萄糖（无菌过滤）。
- 匹配标签并将 CuSO4 的 2 mL 稀释液添加到其预期瓶中。
注意：由于可以同时制作数十块铜板，每块铜板的浓度不同，因此在所有瓶子、管子和板上清楚地标上预期的铜浓度将防止在板浇注过程中出现混淆。 - 使用搅拌板混合~30秒，然后将35 mL倒入或移液到标记的板中，避免气泡。储存或使用前冷却。
注意：通常，板在测定前1天或2天制作，并在4°C下储存，直到使用前几个小时。在电镀开始之前，板应处于室温（RT）（步骤3.4）。
3. ACT1-CUP1测定
- 在-Leu板上划出所需的菌株。
注意：如果使用冷冻原液工作，应注意确保细胞在电镀前从储存中充分复活。推荐的程序是从低温库存中划线，并使其在30°C下生长3-5天。 然后，重新放置一个小样本，让它在30°C下再生长2-3天。 - 在 10 mL 培养基中培养过夜培养物。
- 使用与步骤2.4.2中所述的相同比例制备-Leu生长培养基。每 10 mL 培养基中，将 66 mg 酵母氮基 （YNB） 和 16 mg 减去亮氨酸的脱落混合物加入 9 mL 去离子水中。通过0.22μm PES无菌过滤器。
- 对于酵母菌株，将 9 mL -Leu 生长培养基和 1 mL 20% w/v 葡萄糖（无菌过滤）加入无菌 50 mL 锥形管中。
- 使用无菌棒或移液管吸头，收集一个小（~1毫米圆形）酵母样本并接种培养基。
- 在180rpm和30°C下摇动所有过夜培养物。
注意：如果可用，可以使用旋转器代替振动台。
- 将菌株稀释至OD600 0.5±0.05在10%甘油中。
- 每种菌株，将 100 μL 培养物加入含有 900 μL 水的比色皿中。
- 用分光光度计测量OD600 。
- 计算在 2 mL 的最终体积中 OD600 为 0.5 时所需的稀释度。
- 将每种菌株在10%甘油（无菌）中稀释至OD600 0.5。
- 重新测量OD600 以确认电池密度在0.5±0.05的所需范围内。
- 将应变板镀在铜板上。
注意：可以使用多种方法对菌株进行铺板，包括手动移液 5-10 μL 体积、使用重复或多通道移液器或使用针式复制器进行冲压。下面介绍了最后一种方法，尽管无论使用哪种方法，大多数步骤都是相似的。- 设置无菌工作地点和点燃的本生燃烧器。
- 对于 48 针复制器，将 200 μL 每种稀释菌株移液到 96 孔板的单独孔中。用 200 μL 10% 甘油（无菌）填充 6 x 8 网格中的空白区域。
注意：补充 表2中列出了九种酵母菌株的电镀方案示例。 - 将复制器浸入95%（v / v）乙醇和火焰的浅培养皿中以消毒。火焰熄灭后让它冷却至少 2 分钟，以避免热量冲击细胞。
- 将四个板放在燃烧器附近并取下盖子。
- 将复制器浸入96孔板中，然后快速将其提起。
- 轻轻地放在盘子上，轻轻地来回摇晃，以促进良好的转移。
- 以一个快速的动作提起，并以完全相同的方向放置在96孔板中。
- 对最多三个其他板重复此操作。重复将复制器浸入乙醇中，燃烧以消毒并等待每四个板冷却的过程。
- 板铺好后，以平稳的动作向侧面移动，但仍在火焰的消毒伞内。
注意：建议在火焰附近进行酵母稀释和电镀。板在干燥时很容易被污染。 - 在盖上盖子之前让板完全干燥，通常为3-5分钟。
- 将板在30°C孵育3天。
4. 数据收集和分析
- 从培养箱中取出板并目视检查它们。
- 使用可用的相机或其他数字成像系统记录板的图像。
- 记录（或评分）每个菌株的最后一个铜浓度可见增长。
注意：细胞能够拼接并保持活力，直到该浓度。为了保持一致性，请始终使用相同的方法，无论是通过肉眼还是从板图像中，对最后的活性铜浓度进行评分。肉眼有时可以看到非常小的菌落，但在图像上看不到。直接目视检查或从图像记录之间的差异很小，通常是梯度中的一个步骤。由于出版物中经常使用菌落的图像，因此建议按图像进行评分。 - 结合来自同一菌株的多个ACT1-CUP1测定的数据，得出有关QSP如何影响剪接的结论。
注意：出版物数字通常显示0 mM Cu2+ 浓度的酵母菌落图像，最后一个活铜浓度以及菌落死亡的后续浓度。数据也可以显示为条形图，带有重复之间标准偏差的误差条。数据不需要归一化，但可以通过将WT剪接因子控制的活力设置为1并比较引入的突变的影响来进行归一化。
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Representative Results
生长测定，如ACT1-CUP1，需要对多个菌落进行目视比较评估。在这里，将每种菌株在一夜之间生长至饱和，稀释至OD600 为0.5，并镀在含有0 mM至1.1 mM CuSO4 铜浓度范围的20个板上（图3）。该范围小于协议中列出的范围，因为它允许全面评估下面使用和描述的QSP和ACT1-CUP1报告的影响。对板进行成像和评分（图 3和 补充表3）。
对于这个代表性的实验，酵母背景包括一个被破坏的 ADE2 基因，导致菌落是不同深浅的红色（图3A，B）。腺苷生产途径中的这种常见酵母破坏导致腺苷的红色色素前体积聚。因此，红色是酵母菌落成熟的指标（即存在的细胞的数量和年龄）。对于ACT1-CUP1测定的目的，红色可以作为污染真菌物种的指示剂，如果颜色为白色或黄色。颜色可以是铜耐受性的二次确认，因为更可行的菌落将是更深的红色阴影。
使用引脚复制器电镀时，有几种常见的畸变。首先，如果复制器在向左或向右移动时被抬起，则可以创建椭圆形的菌落（图3B，橙色箭头）。此外，如果针复制器以一定角度引入或在平板上方摇动，细胞溶液的小液滴也可以形成微菌落（图3B，红色箭头）。微菌落通常是无害的，偶尔会与冲压菌落混合，这阻止了对该菌落的解释。其他电镀问题包括灭菌后复制针冷却的等待时间不足，以及板和针之间的接触不足，导致培养基转移不良。在这两种情况下，几乎没有细胞（如果有的话）会在平板上生长，包括含有野生型报告基因的对照菌株。与任何生长测定一样，无论采用何种接种方法，重要的是一式三份进行ACT1-CUP1，以确认结果一致且可重复。理想情况下，这些不同的重复应在不同时间制备的铜板上进行，以确保可重复性。
对于这些具有代表性的实验，选择A3c报告器来强调在没有额外剪接体扰动的情况下非共识序列对铜耐受性的影响。A3c显着减少了 产生的CUP1 mRNA的数量，因为它扰乱了剪接体识别和利用5' SS15的能力。具有A3c报告基因的酵母存活至0.15mM Cu2+，而野生型报告细胞在测试的铜浓度范围结束时保持活力（图3C）。含有细胞的野生型报告基因生长到2.5mM Cu2 + ，而不影响活力（数据未显示）。
U6 snRNA是剪接体中必不可少的催化成分。多项研究使用ACT1-CUP1来研究突变对这种RNA的影响16，32，34。在本研究中重复研究了三个U6 snRNA序列，即野生型序列（WT），从尿苷取代为胞嘧啶的位置57（U57c）和从尿苷取代为腺苷的位置57（U57a）（图3和图4）。结合影响剪接催化步骤的ACT1-CUP1报告基因，确定U57c有利于第一步催化步骤，U57a有利于进展到第二步16，32。
为了建立ACT1-CUP1测定，创建了一个菌株，删除了U6 snRNA的基因组拷贝，并将U6 snRNA野生型或突变序列包含在质粒上。由于U6 snRNA是细胞的重要组成部分，因此使用三次单独的转化首先敲除基因组U6 snRNA，同时保持细胞活力，随后在质粒上引入突变的U6 snRNA，最后添加ACT1-CUP1报告基因。在第一次转化中，使用cup1Δ酵母菌株敲除U6 snRNA的基因组拷贝，同时在URA选择标记质粒上添加WT U6 snRNA以保持活力。随后的转化在TRP选择标记质粒上添加了野生型或突变的U6 snRNA，通过5-FOA选择对URA标记进行选择。因此，产生了三种cup1Δ酵母菌株，每种菌株具有U6 snRNA序列之一，即WT，U57a和U57c。每种菌株的最终酵母转化添加了用于本实验的三种不同的ACT1-CUP1报告质粒之一。选择的记者是野生型报告基因A3c和分支位点腺苷突变为鸟嘌呤（BS-G）。该实验共产生九种菌株，每种菌株包含一个U6 snRNA序列和一个ACT1-CUP1报告基因（补充表4和补充表5）。
结果表明，U6 snRNA 位置 57 处的不同碱基结合 5' SS 或 BS 突变对剪接体有独特的影响（图 4）。A3c和BS-G报告基因主要通过稳定第一催化步骤构象14，15来抑制剪接。因此，U57c是一种加性突变，与这些报告基因中的任何一个相结合，可降低铜耐受性（图4B）。相比之下，U57a增加了铜的容差，因为它促进了第二步的进展（图4B）16，32。与U6 snRNA WT相比，BS-G报告菌株对U57a的铜耐受性降低，突出了BS-G对剪接16的第二步可能的二次影响。
这些结果还突出了该测定的定性性质以及为什么要测试野生型查询和报告序列。虽然与野生型U6 snRNA相比，这些U6 snRNA突变的铜耐受性增加或减少的一般模式是正确的，但细胞存活的铜的确切浓度在研究之间可能有所不同（表1），并且在这些代表性数据和其他已发表的结果之间确实存在差异。这可能是由于含有 CUP1 缺失的菌株的背景，但也可能是由于菌株在接种前的总体健康状况（即，从冷冻中产生菌株或后多久进行测定），板制备方式的差异以及不同培养箱之间的差异。Mayerle等人在文献43中注意到Prp8查询突变的类似方差。因此，可以对不同的ACT1-CUP1测定进行比较铜耐受性趋势，但铜浓度的数值比较应仅在同一实验室内进行，有时应使用同一组铜板。
图 1：ACT1-CUP1 报告基因设计。 拼接报告基因的浓度与酵母铜耐受性直接相关。报告器的示意图包括5'剪接位点（5'SS）、分支位点（BS）和3'剪接位点（3'SS）的三个剪接位点。显示了这些位点的酵母共识序列，其中以粗体表示靶向切割的那些，并根据它们在内含子中的位置进行编号。常用的非共识ACT1-CUP1报告序列在其相应共识序列位置下方的小写字母中显示，并列于 表1中。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：ACT1-CUP1 测定工作流程。对于该测定，酵母菌株必须是cup1Δ leu2，并且含有所需的ACT1-CUP1报告质粒和QSP基因，在图中标记基因。QSP基因必须通过基因组插入或质粒上。使用针复制器的协议涉及四个步骤来制备酵母细胞。步骤1是将细胞生长到饱和。步骤2是测量培养物的OD 600并稀释至OD600为0.5。第 3 步是分布在 96 孔板上。步骤4是在含有增加浓度的铜（用增加的蓝色表示）的板上铺板。步骤1、步骤2和步骤4与手动移液相同。一旦铺板，将板在30°C下孵育3天，然后对活性进行评分。请点击此处查看此图的大图。
图3：ACT1-CUP1数据的代表性视图。对于这个实验，酵母剪接体受到两种不同的U6 snRNA突变的挑战，并在三个非共识报告基因存在的情况下进行测试。为了演示目的，该测定的三个重复品在同一板上呈现。建议该测定在单独的板上和不同的日子进行重复。（A）显示了在20个板上铜梯度为0mM至1.1mM的完整测定。随着铜浓度的增加，熔接较低的菌株显示出汇合度降低，以至于铜浓度变得致命。酵母背景为 ade2，因此，成熟的菌落呈红色。（B）使用手持相机与数字成像系统成像的0 mM和0.1 mM CuSO4 相同板的比较。这是一个例子，说明如何将许多非共识报告者与野生型报告者并排比较。对平板的常见观察包括从针复制器掉落的虚假培养基液滴（红色箭头）和由于针沿板表面滑动或在培养液滴充分干燥之前板移动而导致菌落轻微椭圆形（橙色箭头）。（C）与野生型报告基因相比，A3c报告基因对细胞活力的影响示例。（B）中显示的图像被裁剪并对齐，以突出显示不同铜浓度下的生长差异。与野生型报告菌株在测试范围结束时的生存能力相比，A3c报告菌株的铜耐受性降低到0.15 mM Cu2+ 。 请点击此处查看此图的大图。
图4：具有代表性的ACT1-CUP1结果监测具有剪接成分突变的酵母中的剪接 。 （A）在第一个催化步骤后立即确定活性位点的RNA组分示意图。U2和U6 snRNA是双链的，使内含子的5'SS和BS非常接近。A259（BS）和G1（5' SS）之间的内含子键由橙色点表示。在本实验中测试的ACT1-CUP1报告基因中非共识序列替换的位置以粗体黑色表示。U6 snRNA （U57） 中的突变位置为粗绿色，取代碱基为蓝色或粉红色。（B）在出版物中呈现ACT1-CUP1数据的一种可能性包括来自相关Cu2+ 浓度的几张菌落图像。WT报告员幸存下来，超过了对所有三种U6 snRNA菌株测试的铜浓度。（C）比较每个报告基因和每个U6 snRNA突变体的影响的条形图。通过将U6 snRNA WT的铜耐受性设置为1并计算U57c和U57a突变的比率，对每个ACT1-CUP1报告基因进行归一化。误差线表示三个重复的标准偏差。 请点击此处查看此图的大图。
图5：补充ACT1-CUP1结果的其他方法 。 （A）引物延伸是通过在 3'ACT1 外显子中引物退火然后伸长到内含子中进行的。在该示例中，引物用IR700染料进行末端标记，并按照 20，21中所述进行引物延伸。U6 snRNA的引物延伸在同一反应中进行，以作为上样对照。如van der Feltz等人22中所述，7%19：1双/丙烯酰胺变性凝胶使用近红外凝胶成像装置在引物延伸后分离前mRNA，mRNA和lariat产物。不同条带的强度可用于测量整体剪接效率，并区分第一步或第二步发生的剪接差异，如使用 ImageJ44 或其他凝胶条带定量软件进行量化。拼接效率和拼接步骤效率的计算方法如Query和Konarska14中所述。（B）具有ACT1-CUP1报告基因的突变筛选可以利用铜选择来识别影响剪接的突变体。然后可以在所得菌株中对感兴趣的基因进行测序，以确定突变是否发生在该基因中。（C）可以在剪接位点外对报告基因进行改变，以监测与内含子结构，外显子序列，外显子数量或未剪接RNA的核输出相关的剪接变化。灰色区域是要包含在报告基因上的可选扩展区域，红色区域是可以使用ACT1-CUP1测定测试序列和结构变化对剪接的潜在影响的区域。 请点击此处查看此图的大图。
| 报告者姓名 | 内含子区 | 序列 | 最后活性铜2+ 浓度 （mM） | |
| 文晔 | 5' | 古古 | > 2.5 | |
| G1a | 5ʹ | 一个乌古 | 0.0133 或 0.0532 | |
| A3c | 5ʹ | GUcUGU | 0.15^，18 或 0.216 | |
| G5a | 5ʹ | 瓜乌 | 0.303 或 0.259 | |
| 文晔 | 分支站点 | UACUAAC | > 2.5 | |
| C256a | 分支站点 | UAa UAAC | 0.1526 或 0.1832 | |
| U257c/a | 分支站点 | UACc/aAAC | 0.226 或 0.332 或 0.545 | 0，059，32 |
| A258c/u | 分支站点 | UACUc/uAC | 0.826 | 1.045 或 1.646 |
| BS-C | 分支站点 | UACUAcC | 0.153 或 0.1832，56 或 0.226 | |
| BS-G | 分支站点 | UACUAgC | 0.0516，32 或 0.625 或 0.846 | |
| C260克 | 分支站点 | UACUAAg | 0.826 | |
| 文晔 | 3' | UAG | > 2.5 | |
| U301g | 3ʹ | G银 | 0.1518 | |
| A302g/u | 3' | Ug/uG | 0.0139 | 0.07516 或 0.18 24 |
| G303c | 3ʹ | UAc | 0.0532 | |
表1：常见报告物列表和报告的Cu2+浓度致死率。Lesser和Guthrie3有超过100次引用。虽然这些引文中的一小部分用于创建此表，但它们突出了报告铜活性浓度的研究之间存在轻微至中等差异的总体趋势。在ACT1-CUP1中，重要的是使用公布的浓度作为指导，将野生型蛋白质或RNA与具有相同酵母菌株背景的突变体进行比较，但预计观察到的浓度可能不同。从图3（^）和由以下引文3，9，16，18，24，25，26，32，45，46注释的多个出版物收集的数据。
补充表1：单个铜板的内容以及从1 M CuSO4库存中实现0 mM至2.5 mM铜稀释的计算示例。请按此下载此表格。
补充表2：48引脚复制器的电镀方案示例。请按此下载此表格。
补充表3：在30°C下孵育3天的铜板的活力示例。请按此下载此表格。
补充表4：用于生成代表性数据的酵母菌株列表。 请按此下载此表格。
补充表5：用于生成代表性数据的质粒列表。 U6 snRNA质粒在先前的研究中产生并发表22，47。 请按此下载此表格。
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Discussion
ACT1-CUP1是一种生长测定，必须注意确保观察到的生长差异只能归因于剪接缺陷。所有菌株在铺板前应以类似的方式处理，包括具有相似的长度和类型的生长和储存条件。如果使用温度敏感菌株，ACT1-CUP1测定应仅在这些菌株生长与野生型相当的条件下进行。相关地，对于QSP成分，建议具有相同的酵母背景和QSP基因的表达水平，以免影响结果的解释。在考虑要使用的QSP和报告器数量时，不建议使用针复制器方法一次检测超过30个菌株。随着执行每个步骤的额外时间，细胞将稳定，并且由于细胞活力降低，测定结果将不一致。
除了ACT1-CUP1作为生长测定固有的限制外，QSP可能对剪接产生比该方法可以解决的更复杂的影响。由于剪接是一个多步骤的过程，并且因子被回收，观察到的表型可能导致扰动影响多个剪接步骤。即使对于可以跟踪ACT1-CUP1的后续分析也是如此，其中一些将在下面描述。数据将突出显示过程中最受干扰的步骤，即使其他步骤可能会受到拼接因子功能改变的影响。
ACT1-CUP1报告基因的引物扩展首先用于Lesser和Guthrie的原始论文，如果ACT1-CUP1结果显示生长缺陷3，则经常进行。该测定靶向报告基因，并使用PCR产物的长度来确定存在的未剪接，部分剪接和完全剪接报告基因的相对量（图5A）。通过取PCR产物量14的比率来计算总体剪接效率以及缺陷是否对第一或第二催化步骤的影响更大。例如，与野生型报告基因相比，5' SS 报告基因 G5a 减少了剪接，但其第一步和第二步效率遵循与野生型相似的模式（图 5A）。这指向第一个催化步骤之前的缺陷，可能是在剪接体组装中，因为两个步骤都受到类似的影响31。
已经从规范的ACT1-CUP1测定中开发了新颖的测定，例如筛选在其他剪接因子突变体和/或非共识剪接序列存在下改善剪接的突变体（图5B）。例如，将含有ACT1-CUP1报告基因的酵母暴露于UV下，然后在铜存在下选择产生Prp8和Hsh155突变体，从而改善非共识序列的剪接14，19。
CUP1生长依赖性超越了剪接位点和组成剪接因子的影响研究，已被用于研究多个内含子剪接，核出口控制以及UTR和其他外围序列对剪接的影响（图5C）。其中一些研究已经创造了具有CUP1和其他含内含子的酵母基因的报告，这些基因可以具有更复杂的剪接模式来研究对内含子二级结构和多内含子转录本剪接的影响48，49，50，51，52。通过在帧53，54 中编码 CUP1 的拼接或非拼接转录本来研究剪接和核输出之间的联系。嘧啶磁道长度和拼接选址因特定因素引起的距离依赖性也已测试20，55，56，57。这些例子和许多其他例子突出了ACT1-CUP1和其他CUP1生长测定的多功能性。
ACT1-CUP1测定将扰动与具有简单生长表型和宽灵敏度范围的复杂反应循环联系起来。这种传统检测已被多个实验室用于为理解剪接周期奠定基础。最近，ACT1-CUP1已被用于回答现在可用的大量结构数据引起的问题21，22，25。与非共识序列结合的剪接体的结构研究可以与ACT1-CUP1结果配对，以解释结构改变和功能改变如何相关。ACT1-CUP1是剪接突变的理想第一筛选，可以补充更复杂的分析。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
感谢Aaron Hoskins和威斯康星大学麦迪逊分校的Hoskins实验室成员在生成图3-5时使用酵母菌株和设备。感谢Harpreet Kaur和傅兴阳对手稿的深刻评论。感谢西北大学在撰写、编辑和拍摄本文期间给予的支持。感谢Isabelle Marasigan在拍摄这种方法时提供的帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL sterile microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| 2 mL sterile microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-138 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | Fisher Scientific | 07-201-332 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| 96-well round bottom microplate | Fisher Scientific | 07-200-760 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| 190 proof ethanol | Fisher Scientific | 22-032-600 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| 500 mL Filter System (0.22 µm) | CellTreat Scientific Products | 229707 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | Any molecular grade agar will work. |
| Autoclave | Tuttnauer | 3870EA | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Bunsen burner | Humboldt | PN6200.1 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Cell Density Meter | VWR | 490005-906 | Or other spectral device that can measure absorbance at 595 nm. |
| Copper sulfate Pentahydrate | Fisher Scientific | LC134051 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Digital imaging system | Cytiva | 29399481 | ImageQuant 4000 (used for Figure 3), Amersham ImageQuant 800, or comparable item from a different manufacturer. |
| Dropout mix (-Leu) | USBiological Life Sciences | D9525 | Use the appropriate drop out mix for your experiment. It is possible you will be using a yeast nutrient marker for your query perturbation also. In that case, the drop out mix should be for that marker and Leu |
| D-Glucose | Fisher Scientific | AAA1682836 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Gel band quantifying software | Cytiva | 29-0006-05 | ImageQuant TL v8.1 (used for figure 5A) or comparable item from a different manufacturer. |
| Hand held camera | Nikon | D3500 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Near infra-red gel imaging device | Cytiva | 29238583 | Amersham Typhoon NIR (used for Figure 5a) or comparable item from a different manufacturer. |
| Laboratory grade clamp | Fisher Scientific | 05-769-7Q | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Laboratory grade stand and clamp | Fisher Scientific | 12-000-101 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Magnetic stir bars | Fisher Scientific | 14-513-51 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Pin replicator | VP Scientific | VP 407AH | |
| Semi-micro disposable cuvettes | VWR | 97000-590 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Shaker | JEIO Tech | IST-3075 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Spectrophotometer | Biowave | 80-3000-45 | Or any spectophotometer that can measure the absorbance at 600 nm. |
| Square plates | VWR | 102091-156 | Circular plates may also be used though are more challenging if using a pin replicator. |
| Stir plate | Fisher Scientific | 11-520-16S | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Yeast nitrogen base | USBiological Life Sciences | Y2025 | Or comparable item from a different manufacturer. |
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