Summary
De ACT1-CUP1-test, een kopergroeitest, biedt een snelle uitlezing van precursor messenger RNA (pre-mRNA) splicing en de impact die mutante splicingfactoren hebben op de spliceosomale functie. Deze studie biedt een protocol en benadrukt het maatwerk dat mogelijk is om de splicingvraag van belang aan te pakken.
Abstract
Mutaties geïntroduceerd in het spliceosoom of zijn substraat hebben aanzienlijk bijgedragen aan ons begrip van de fijne kneepjes van de spliceosomale functie. Of het nu gaat om ziektegerelateerde of functioneel geselecteerde mutaties, veel van deze mutaties zijn bestudeerd met behulp van groeitests in het modelorganisme Saccharomyces cerevisiae (gist). De splicing-specifieke kopergroeitest, of ACT1-CUP1-assay, biedt een uitgebreide analyse van mutatie op fenotypisch niveau. De ACT1-CUP1-test maakt gebruik van verslaggevers die kopertolerantie verlenen wanneer deze correct worden gesplitst. Dus, in aanwezigheid van koper, correleren veranderingen in de levensvatbaarheid van gist met veranderingen in mRNA-productie door splicing. In een typisch experiment wordt het gistspliceosoom uitgedaagd met verschillende niet-consensus splicing-verslaggevers en de splicingfactormutatie van belang om een synergetische of antithetische impact op splicing te detecteren. Hier wordt een volledige beschrijving gegeven van koperplaatbereiding, plating van gistcellen en gegevensevaluatie. Een selectie van complementaire experimenten wordt beschreven, waarbij de veelzijdigheid van de ACT1-CUP1-verslaggevers wordt benadrukt. De ACT1-CUP1 assay is een handig hulpmiddel in de splicing toolbox dankzij de directe uitlezing van mutatie-effect(en) en de vergelijkende mogelijkheden van het voortdurende gebruik in het veld.
Introduction
Het spliceosoom is een grote, biologische machine die de verwijdering van introns katalyseert, niet-coderende gebieden in precursor messenger RNA (pre-mRNA)1,2. Het karakteriseren van het effect van een single point mutant in 1 van de bijna 100 eiwitten en 5 niet-coderende RNA's is vaak dubbelzinnig bij het bestuderen van het eiwit of RNA in isolatie. De verandering in de functie van de gemuteerde component kan het best in vivo worden geëvalueerd in de context van het volledige, functionerende spliceosoom.
De hier beschreven kopergroeitest is een snelle graadmeter voor de splicing-efficiëntie in Saccharomyces cerevisiae of ontluikende gist. Ontwikkeld door C.F. Lesser en C. Guthrie en gepubliceerd in 1993, combineert deze test het gemak van het werken met een eenvoudig modelorganisme en de eenvoudige uitlezing van de levensvatbaarheid van cellen3. De levensvatbaarheid correleert met hoe goed de spliceosomen in deze cellen het transcript van de verslaggever kunnen herkennen en splitsen.
Deze kopergroeitest wordt vaker de ACT1-CUP1-test genoemd. De naam ACT1-CUP1 is afkomstig van de twee genen die zijn gefuseerd om een verslaggever van splicing-efficiëntie te creëren. ACT1 is het actinegen van gist, dat sterk tot expressie komt en een efficiënt gesplitst intron 4,5 heeft. Cup1p is een koperchelator die koper in de cel vastlegt om interferentie met reguliere cellulaire functies te voorkomen 6,7,8. De ACT1-CUP1-reporter bevat deze genen in volgorde, zodat CUP1 alleen in het juiste leesframe is als pre-mRNA-splicing van ACT1's intron optreedt (figuur 1). Het resulterende fusie-eiwit bevat de eerste 21 aminozuren van actine en het Cup1p-eiwit over de volledige lengte, wat de levensvatbaarheid van gist in een koperrijke omgeving verhoogt3. Een toename van de hoeveelheid splicing van de reporter resulteert dus in een hogere concentratie Cup1p en een hogere koperweerstand (figuur 1). In vergelijking met andere reportergenen beïnvloedt CUP1 de levensvatbaarheid van cellen, zelfs op lage niveaus, heeft het een breed gevoeligheidsbereik en kan het worden gebruikt om direct te selecteren op splicingmutaties 3,6,7. Bovendien is CUP1 niet essentieel voor standaard gistgroei, en dus wordt cellulaire homeostase niet beïnvloed tijdens het opzetten van deze test. Aanvullend op deletie- of temperatuurgroeitests biedt ACT1-CUP1 informatie over de effecten op splicing onder verder optimale gistgroeiomstandigheden.
Het spliceosoom herkent zijn substraat door middel van drie intronische sequenties, namelijk de 5' splice site (5' SS), branch-site (BS) en 3' splice site (3' SS). Er zijn talloze ACT1-CUP1-verslaggevers gegenereerd met niet-consensussequenties op deze sites. Een selectie van de meest voorkomende ACT1-CUP1-verslaggevers is weergegeven in figuur 1 en tabel 1. Aangezien het spliceosoom op unieke wijze op verschillende punten in de splicingcyclus met elke splicelocatie interageert, kan de robuustheid van het spliceosoom in verschillende stappen worden getest op basis van welke niet-consensusrapporteur wordt gebruikt. Niet-consensusverslaggevers worden genoemd naar de gemuteerde positie binnen het intron en de basis waarop het was gemuteerd. A3c is bijvoorbeeld een verslaggever met een mutatie op de 5' SS, specifiek positie 3 van de consensus adenosine naar een cytosine. Deze reporter zal sterk interageren met spliceosoommutaties die van invloed zijn op de 5's SS-selectie en -gebruik. In hun eerste studie bepaalden Lesser en Guthrie welke 5' SS-mutaties splicingremden 3. Later datzelfde jaar werden niet-consensusverslaggevers op alle drie de splice-sites gepubliceerd door Burgess en Guthrie in een suppressorscreening van mutaties in de ATPase Prp16p9. Door consensus te vergelijken met niet-consensusverslaggevers, is de ACT1-CUP1-test een belangrijke sleutel geweest om de robuustheid en selectiviteit van het gistspliceosoom te begrijpen en om de functie van de spliceosomen van andere eukaryoten af te leiden.
Aangezien niet-consensus ACT1-CUP1-verslaggevers het spliceosoom sensibiliseren voor verdere verstoring, kan de impact van een enkele splicingfactormutatie worden gekarakteriseerd door de verslaggevers die het positief of negatief beïnvloedt. Dit is op verschillende manieren toegepast op het splitsen van onderzoeksvragen. Ten eerste kan en is de ACT1-CUP1-test gebruikt als een genetische screening voor mutaties in splicingfactoren. Prp8p, het grootste splicing-eiwit, dient bijvoorbeeld als een platform waarop de RNA-kern van het spliceosoom de splicingreactie katalyseert. Dit werd gedeeltelijk afgeleid door hoe Prp8p-mutanten de splicing van verschillende ACT1-CUP1-verslaggeversverbeterden of verminderden 10,11,12,13,14,15,16,17. Andere eiwitcomponenten van het spliceosoom zijn ook onderzocht met ACT1-CUP1, waaronder Hsh155p, Cwc2p, Cef1p en Ecm2p 18,19,20,21,22,23,24,25. De energetische drempels voor Prp16p en vier andere ATPasen die betrokken zijn bij spliceosomale overgang zijn ook bestudeerd met deze assay 9,26,27,28,29,30. De kleine nucleaire RNA's (snRNA's) zijn ook uitgebreid bestudeerd met behulp van ACT1-CUP1 om de pre-mRNA-sequenties te identificeren die ze coördineren en de veranderingen in secundaire structuur die de snRNA's ondergaan tijdens splicing 3,31,32,33,34,35,36,37.
De ACT1-CUP1-test vereist een giststam waarbij alle kopieën van het CUP1-gen zijn uitgeschakeld. Omdat CUP1 een hoog kopienummer 6,38 kan hebben, kan de voorbereiding van een volledige knock-out stam meerdere rondes of uitgebreide screening vereisen. Als gevolg hiervan zijn cup1Δ-giststammen vaak gedeeld tussen laboratoria, net als de verslaggevers.
Als mutatie(s) in een splicingfactor worden beoordeeld op basis van een plasmidekopie, moet het wild-type gen voor deze factor worden uitgeschakeld. Bovendien moet de gistachtergrond de selectie van ten minste twee plasmiden mogelijk maken, één met een ACT1-CUP1-verslaggever, historisch gezien op een leucine-nutriëntenselectieplasmide, en één met een mutatie of verstoring in de splicingmachinerie die zal worden bestudeerd (figuur 2). Meestal zullen in een enkele test meerdere giststammen, elk met de query splicing perturbation (QSP) en een andere reporter, de impact van de query op splicing testen.
De onafhankelijke variabelen in de ACT1-CUP1-test stellen een onderzoeker in staat om de ernst van een QSP te beoordelen. Deze onafhankelijke variabelen zijn de concentratie van koper en de selectie van meerdere niet-consensus splicing reporters. Ten eerste, aangezien de giststammen worden gekweekt op platen die een reeks koperconcentraties bevatten (figuur 2), omvat het opzetten van de test het selecteren van de gradiënt van de gebruikte concentraties. Studies kunnen een cursus koperconcentratiegradiënt gebruiken om een eerste uitlezing van levensvatbaarheid te krijgen en vervolgens de test herhalen met een fijnere gradiënt om subtiele levensvatbaarheidsverschillen te identificeren. De tweede variabele is het brede scala aan ACT1-CUP1-melders dat kan worden getest (figuur 1 en tabel 1). Als de QSP de levensvatbaarheid van gist anders beïnvloedt in de aanwezigheid van een niet-consensusrapporteur versus wild-type, kan een conclusie worden getrokken dat de QSP een stap in splicing of een gebied van het spliceosoom beïnvloedt dat belangrijk is tijdens de herkenning of verwerking van dat gebied van het intron.
De gistenkist is uitgebreid en de ACT1-CUP1-test is een integraal onderdeel van splicing-onderzoek. De ACT1-CUP1-test wordt vaak uitgevoerd naast een meer diepgaande genetische, structurele en / of biochemische analyse van de impact van een QSP. Aangezien deze meer gedetailleerde studies over het algemeen een langere procedure en/of een hoger prijskaartje hebben, is een frequente aanpak het eerst screenen op interessante mutanten met ACT1-CUP1.
Hier wordt een ACT1-CUP1-testprotocol verstrekt, inclusief koperplaatvoorbereiding. Deze test biedt onderzoekers een eerste antwoord op het effect van een QSP op splicing en welke intronische regio's het meest worden beïnvloed door de verstoring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Giststamconstructie
- Genereer of verkrijg een S. cerevisiae-stam waarvan de achtergrond leu2 en cup1Δ omvat. Om deze achtergrond te genereren, gebruikt u de gevestigde gistmethode die lithiumacetaat en enkelstrengs DNA39 gebruikt.
OPMERKING: Haploïde giststammen kunnen één, twee of meer exemplaren van CUP1 6,38 bevatten. Raadpleeg genomische informatie voor de geselecteerde giststam bij het ontwerpen van knock-out primers om de cup1-genlocatie(s) te flankeren. - Voer een gisttransformatie uit om de QSP op te nemen via genomische opname of op een plasmide. Gebruik een goed ingeburgerd protocol zoals beschreven in eerder onderzoek 40,41,42.
- Voer een gisttransformatie uit met de resulterende stam(en) uit stap 1.2. om het gewenste ACT1-CUP1 reporter plasmide toe te voegen.
OPMERKING: Cellen moeten worden onderhouden op leucine drop-out (-Leu) platen en media om ervoor te zorgen dat de ACT1-CUP1 reporter plasmiden na deze transformatie behouden blijven. - Voer stappen 1.2 uit. en 1.3. voor elke te testen QSP en elk TE testen ACT1-CUP1 reporterplasmide, inclusief controlestammen.
2. Koperen plaatvoorbereiding
- Selecteer een koperconcentratiebereik dat past bij de te testen verslaggevers (zie tabel 1 voor de letaliteit van vaak gebruikte verslaggevers).
OPMERKING: Een voorbeeld van een uitgebreid koperconcentratiebereik is 30 verschillende koperconcentraties van 0 mM, 0,025 mM, 0,05 mM, 0,075 mM, 0,1 mM, 0,15 mM, 0,2 mM, 0,25 mM, 0,3 mM, 0,35 mM, 0,4 mM, 0,45 mM, 0,5 mM, 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM en 2,5 mM Cu2+. - Maak een stockoplossing van 1 M CuSO4 en steriel filter door een steriel filter van 0,22 μm PES (polyethersulfon).
- Bereid per gewenste koperplaat een verdunning van 2 ml van de CuSO4-kolf in steriel water.
OPMERKING: Aangezien de plaat met 0 mM Cu2+ altijd als referentie wordt geanalyseerd en afgebeeld, wordt aanbevolen om twee 0 mM Cu2+ platen te maken, één aan het begin en één aan het einde van de beplatingsstap (stap 3.4.).- Bereken de hoeveelheid voorraad voor de uiteindelijke gewenste koperconcentratie in 40 ml van het plaatvolume (aanvullende tabel 1).
- Voeg de berekende hoeveelheid steriel water en 1 M CuSO4-voorraad toe aan een steriele buis van 2 ml.
- Giet platen voor de ACT1-CUP1 assay.
OPMERKING: Een alternatief voor het onderstaande protocol is om in eerste instantie de media en agar in een grote container en aliquot te combineren na autoclaveren in kleinere containers om verschillende koperconcentraties voor elke plaat te bereiken. Welke methode ook wordt gevolgd, het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de mediaconcentratie consistent is tussen alle platen, ondanks dat ze elk een andere koperconcentratie hebben.- Label elke lege plaat die moet worden gegoten met de uiteindelijke koperconcentratie die het zal bevatten. Bereid ten minste één vierkante plaat per te testen koperconcentratie voor.
- Label een te testen fles van 100 ml per koperconcentratie.
- Voeg aan elke fles 790 mg agar (2% w/v agar) en een roerstaaf toe.
- Combineer in een groot bekerglas de -Leu groeimedia voor alle te gieten koperen platen. Los per te maken plaat 265 mg giststikstofbase (YNB) en 64 mg drop-out mix minus leucine (en alle andere voedingsstoffen die nodig kunnen zijn om het QSP-plasmide in de cellen te behouden) op in 34 ml gedeïoniseerd water.
- Voeg 34 ml van de -Leu groeimedia-oplossing toe aan elke bereide fles van 100 ml en dop met aluminiumfolie. Label de folie met de beoogde koperconcentratie.
- Autoclaaf om de agar te steriliseren en op te lossen met behulp van de aanbevolen vloeistofcyclus voor de autoclaaf.
- Voeg zo snel mogelijk 4 ml 20% w/v glucose (steriel gefilterd) toe aan elke fles.
- Match de etiketten en voeg de 2 ml verdunningen van CuSO4 toe aan de beoogde fles.
OPMERKING: Omdat tientallen koperen platen tegelijkertijd kunnen worden gemaakt, elk met een andere concentratie, zal het duidelijk labelen van alle flessen, buizen en platen met de beoogde koperconcentratie verwarring tijdens het gieten van de plaat voorkomen. - Gebruik een roerplaat om ~ 30 s te mengen en giet of pipetteer 35 ml in de gelabelde plaat, vermijd bubbels. Laat afkoelen voordat u het opbergt of gebruikt.
OPMERKING: Vaak worden de platen 1 dag of 2 dagen voor de test gemaakt en bewaard bij 4 °C tot enkele uren voor gebruik. De platen moeten op kamertemperatuur (RT) zijn voordat de beplating begint (stap 3.4.).
3. ACT1-CUP1-test
- Streep de gewenste stammen uit op -Leu platen.
OPMERKING: Als u vanuit cryovoorraden werkt, moet ervoor worden gezorgd dat de cellen voldoende uit de opslag worden gereanimeerd voordat ze worden plating. Een aanbevolen procedure hiervoor is om uit de cryogene voorraad te strepen en deze gedurende 3-5 dagen bij 30 °C te laten groeien. Herstel vervolgens een klein staal en laat het nog 2-3 dagen groeien bij 30 °C. - Kweek overnight culturen in 10 ml media.
- Bereid -Leu groeimedia met dezelfde verhoudingen als beschreven in stap 2.4.2. Voeg per 10 ml media 66 mg giststikstofbase (YNB) en 16 mg drop-out mix minus leucine toe aan 9 ml gedeïoniseerd water. Ga door een steriel filter van 0,22 μm PES.
- Voeg per giststam 9 ml -Leu groeimedia en 1 ml 20% w/v glucose (steriel gefilterd) toe aan een steriele conische buis van 50 ml.
- Verzamel met behulp van een steriele stok of pipetpunt een klein (~ 1 mm rond) staal van gist en ent de media in.
- Schud alle nachtculturen op 180 rpm en 30 °C.
OPMERKING: Indien beschikbaar, kunnen rotatoren worden gebruikt in plaats van een shaker.
- Verdun de stammen tot een OD600 0,5 ± 0,05 in 10% glycerol.
- Voeg per stam 100 μL cultuur toe aan een cuvette met 900 μL water.
- Meet de OD600 met een spectrofotometer.
- Bereken de verdunning die nodig is bij een OD600 van 0,5 in een eindvolume van 2 ml.
- Verdun elke stam tot OD600 0,5 in 10% glycerol (steriel).
- Meet de OD600 opnieuw om te bevestigen dat de celdichtheid binnen het gewenste bereik van 0,5 ± 0,05 ligt.
- Plaats de spanningen op de koperen platen.
OPMERKING: Er kunnen verschillende methoden worden gebruikt om de stammen te platen, waaronder het met de hand pipetteren van volumes van 5-10 μL, met behulp van een herhaalde of meerkanaals pipettor of stempelen met een pinreplicator. Deze laatste methode wordt hieronder beschreven, hoewel de meeste stappen vergelijkbaar zullen zijn, ongeacht de methode.- Stel een steriele werklocatie en een brandende Bunsenbrander in.
- Voor een 48-pins replicator pipetteer je 200 μL van elke verdunde stam in een aparte put van een 96-well plaat. Vul de lege plekken in het rooster van 6 x 8 met 200 μL 10% glycerol (steriel).
OPMERKING: Een voorbeeld van een platingschema voor negen giststammen staat in aanvullende tabel 2. - Dompel de replicator in een ondiepe schaal van 95% (v/v) ethanol en vlam om te steriliseren. Laat het minstens 2 minuten afkoelen nadat de vlam is gedoofd om te voorkomen dat de cellen door hitte worden geschokt.
- Plaats vier platen in de buurt van de brander en verwijder de deksels.
- Dompel de replicator in de 96-well plaat en til hem in één snelle beweging op.
- Leg zachtjes op de plaat en schommel licht heen en weer om een goede overdracht mogelijk te maken.
- Til op in één snelle beweging en plaats in exact dezelfde richting in de 96-well plaat.
- Herhaal dit voor maximaal drie andere borden. Herhaal het proces van het onderdompelen van de replicator in ethanol, vlammen om te steriliseren en wachten om elke vier platen af te koelen.
- Nadat een plaat is verguld, beweegt u met een soepele beweging naar de zijkant, maar nog steeds binnen de sterilisatieparaplu van de vlam.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de gistverdunningen en plating in de buurt van een vlam te doen. De platen kunnen gemakkelijk besmet raken tijdens het drogen. - Laat de borden volledig drogen voordat u de deksels erop plaatst, meestal 3-5 min.
- Incubeer de platen gedurende 3 dagen bij 30 °C.
4. Gegevensverzameling en -analyse
- Verwijder de platen uit de couveuse en inspecteer ze visueel.
- Neem de beelden van de platen op met een beschikbare camera of ander digitaal beeldvormingssysteem.
- Noteer (of score) voor elke stam de laatste zichtbare koperconcentratie die zichtbaar is.
OPMERKING: De cellen kunnen splitsen en levensvatbaar blijven tot die concentratie. Gebruik voor consistentie altijd dezelfde methode, hetzij met het oog of van de plaatafbeeldingen, om de laatste levensvatbare koperconcentratie te scoren. Zeer kleine kolonies zijn soms zichtbaar door het oog, maar niet op het beeld. Het verschil tussen directe visuele inspectie of opname van beelden is klein, meestal een stap in het verloop. Omdat afbeeldingen van de kolonies vaak worden gebruikt in publicaties, wordt scoren op basis van de afbeeldingen aanbevolen. - Combineer gegevens van meerdere ACT1-CUP1-testen voor dezelfde stam om conclusies te trekken over hoe de QSP splicing beïnvloedt.
OPMERKING: Publicatiecijfers tonen gewoonlijk afbeeldingen van de gistkolonies bij 0 mM Cu2+ concentratie, de laatste levensvatbare koperconcentratie en de daaropvolgende concentratie waar de kolonie is gestorven. Gegevens kunnen ook worden weergegeven als een staafdiagram met foutbalken voor de standaardafwijking tussen replicaties. Gegevens hoeven niet te worden genormaliseerd, maar kunnen worden door de levensvatbaarheid van de WT-splicingfactorcontrole op 1 te zetten en het effect van de geïntroduceerde mutatie(s) te vergelijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Groeitests, zoals ACT1-CUP1, vereisen de visuele, vergelijkende beoordeling van meerdere kolonies. Hier werd elke stam 's nachts tot verzadiging gekweekt, verdund tot een OD600 van 0,5 en verguld op 20 platen met een bereik van koperconcentraties van 0 mM tot 1,1 mM CuSO4 (figuur 3). Dit bereik is kleiner dan het bereik dat in het protocol wordt vermeld, omdat het de volledige beoordeling van de impact van de QSP's en ACT1-CUP1-verslaggevers mogelijk maakte die hieronder worden gebruikt en beschreven. De platen werden in beeld gebracht en gescoord (figuur 3 en aanvullende tabel 3).
Voor dit representatieve experiment bevat de gistachtergrond een verstoord ADE2-gen , waardoor de kolonies verschillende tinten rood zijn (figuur 3A, B). Deze veel voorkomende gistverstoring in de adenosineproductieroute veroorzaakt een opeenhoping van een rood gepigmenteerde voorloper voor adenosine. De rode kleur is dus een indicator van de volwassenheid van de gistkolonie (d.w.z. de hoeveelheid en leeftijd van de aanwezige cellen). Voor de doeleinden van een ACT1-CUP1-test kan de rode kleur dienen als een indicator voor het besmetten van schimmelsoorten als ze wit of geel van kleur zijn. De kleur kan een secundaire bevestiging zijn van kopertolerantie, omdat meer levensvatbare kolonies een diepere rode tint zullen zijn.
Bij het plateren met een pin replicator zijn er verschillende veel voorkomende aberraties. Ten eerste is het mogelijk om kolonies te maken die ovaalvormig zijn als de replicator wordt opgetild terwijl hij naar links of rechts beweegt (figuur 3B, oranje pijl). Bovendien kunnen microkolonies zich ook vormen uit kleine druppeltjes celoplossing als de pinreplicator onder een hoek wordt binnengebracht of als deze boven de plaat wordt geschud (figuur 3B, rode pijl). Vaak onschuldig, af en toe, kunnen de microkolonies zich mengen met een gestempelde kolonie, en dit voorkomt interpretatie van die kolonie. Bijkomende platingsproblemen zijn onder meer onvoldoende wachttijd na sterilisatie voor de replicatorpennen om af te koelen en onvoldoende contact tussen de plaat en de pinnen, zodat een slechte overdracht van de kweekmedia optreedt. In beide gevallen zullen er weinig of geen cellen op de plaat groeien, ook voor de controlestammen die de wild-type reporter bevatten. Zoals bij elke groeitest, ongeacht de methode van plating, is het belangrijk om de ACT1-CUP1 in drievoud uit te voeren om te bevestigen dat de resultaten consistent en herhaalbaar zijn. Idealiter moeten deze verschillende replicaties worden uitgevoerd op koperen platen die op verschillende tijdstippen zijn bereid om de reproduceerbaarheid te garanderen.
Voor deze representatieve experimenten werd de A3c-verslaggever geselecteerd om de impact van een niet-consensussequentie op kopertolerantie te benadrukken in afwezigheid van extra spliceosoomverstoringen. A3c vermindert de hoeveelheid geproduceerd CUP1-mRNA aanzienlijk omdat het het vermogen van het spliceosoom om de 5 ' SS15 te herkennen en te gebruiken verstoort. Gist met de A3c-reporter overleefde tot 0,15 mM Cu2+, terwijl de wild-type reportercellen levensvatbaar bleven tot het einde van het geteste bereik van koperconcentraties (figuur 3C). De wild-type reporter met cellen groeit tot 2,5 mM Cu2+ zonder een impact op de levensvatbaarheid (gegevens niet getoond).
U6-snRNA is een essentiële katalytische component van het spliceosoom. Meerdere studies hebben ACT1-CUP1 gebruikt om het effect te bestuderen dat mutaties kunnen hebben op dit RNA 16,32,34. Gedupliceerd voor deze studie werden drie U6 snRNA-sequenties bestudeerd, namelijk de wild-type sequentie (WT), positie 57 gesubstitueerd van een uridine naar een cytosine (U57c), en positie 57 gesubstitueerd van een uridine naar een adenosine (U57a) (figuur 3 en figuur 4). In combinatie met ACT1-CUP1-verslaggevers die van invloed zijn op de katalytische stappen in splicing, werd vastgesteld dat U57c de voorkeur geeft aan de eerste katalytische stap en U57a de progressie naar de tweede stap16,32.
Om de ACT1-CUP1-test op te zetten, werd een stam gemaakt met de genomische kopie van U6-snRNA verwijderd en de U6 snRNA wild-type of gemuteerde sequenties opgenomen op plasmiden. Omdat U6-snRNA een essentieel onderdeel van de cel is, werden drie afzonderlijke transformaties gebruikt om eerst het genomische U6-snRNA uit te schakelen met behoud van de levensvatbaarheid van de cel, vervolgens gemuteerde U6-snRNA's op plasmiden te introduceren en ten slotte de ACT1-CUP1-verslaggevers toe te voegen. Voor de eerste transformatie werd een cup1Δ giststam gebruikt bij het uitschakelen van de genomische kopie van U6-snRNA, terwijl tegelijkertijd WT U6-snRNA werd toegevoegd aan een URA-selectiemarkerplasmide om de levensvatbaarheid te behouden. Een daaropvolgende transformatie voegde wild-type of gemuteerd U6-snRNA toe aan een TRP-selectiemarkerplasmide, waarbij via 5-FOA-selectie werd geselecteerd tegen de URA-marker. Zo werden drie cup1Δ-giststammen gegenereerd, elk met een van de U6-snRNA-sequenties, namelijk WT, U57a en U57c. Een laatste gisttransformatie voor elke stam voegde een van de drie verschillende ACT1-CUP1 reporterplasmiden toe die in dit experiment worden gebruikt. De geselecteerde verslaggevers waren de wild-type reporter, A3c, en een mutatie van de branch-site adenosine naar guanine (BS-G). Voor dit experiment werden in totaal negen stammen gegenereerd, die elk één U6-snRNA-sequentie en één ACT1-CUP1-reporter bevatten (aanvullende tabel 4 en aanvullende tabel 5).
De resultaten toonden aan dat de verschillende basen op U6 snRNA-positie 57 unieke effecten hebben op het spliceosoom in combinatie met een 5' SS- of BS-mutatie (figuur 4). Zowel de A3c- als bs-g-verslaggevers remmen voornamelijk splicing door de eerste katalytische stapconformatiete stabiliseren 14,15. U57c is dus een additieve mutatie die de kopertolerantie verlaagt in combinatie met een van deze verslaggevers (figuur 4B). U57a daarentegen verhoogt de kopertolerantie omdat het de progressie naar de tweede stap bevordert (figuur 4B)16,32. De verminderde kopertolerantie van de BS-G-reporterstam met U57a in vergelijking met U6 snRNA WT benadrukt een waarschijnlijke secundaire impact van BS-G op de tweede stap van splicing16.
Deze resultaten benadrukken ook de kwalitatieve aard van deze test en waarom wild-type query- en reportersequenties moeten worden getest. Hoewel het algemene patroon van verhoogde of verlaagde kopertolerantie geldt voor deze U6-snRNA-mutaties in vergelijking met wild-type U6-snRNA, kan de exacte concentratie koper waaraan de cellen overleven verschillen tussen studies (tabel 1) en verschilde tussen deze representatieve gegevens en andere gepubliceerde resultaten. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de achtergrond van de stam die de CUP1-deletie bevat, maar kan ook te wijten zijn aan de algemene gezondheid van de stammen vóór het plateren (d.w.z. hoe snel na het genereren van de stam of restreak van cryo de test werd uitgevoerd), verschillen in hoe de platen worden bereid en variabiliteit tussen verschillende incubatoren. Een vergelijkbare variantie werd opgemerkt in Mayerle et al. voor Prp8-querymutaties in de literatuur43. Het vergelijken van kopertolerantietrends kan dus worden uitgevoerd voor verschillende ACT1-CUP1-assays, maar de numerieke vergelijking van de koperconcentraties moet alleen binnen hetzelfde laboratorium en soms met dezelfde set koperplaten worden gedaan.
Figuur 1: Het ACT1-CUP1 reporter ontwerp. De concentratie van gesplitste reporter correleert direct met de tolerantie van gistkoper. Het diagram van de verslaggever bevat de drie splice-sites van de 5'-splice-site (5' SS), branch-site (BS) en 3' splice-site (3' SS). De gistconsensussequenties voor deze locaties worden weergegeven, waarbij die gericht op splitsing vetgedrukt en genummerd zijn op basis van hun locatie in het intron. Veelgebruikte niet-consensus ACT1-CUP1 reportersequenties worden weergegeven in de kleine letters onder hun overeenkomstige consensussequentielocaties en worden vermeld in tabel 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: ACT1-CUP1 assay workflow. Voor deze test moet een giststam cup1Δ leu2 zijn en het gewenste ACT1-CUP1 reporterplasmide en het QSP-gen bevatten, gelabeld Gen in de figuur. Het QSP-gen moet genomisch worden ingebracht of op een plasmide. Het protocol met behulp van een pin replicator omvat vier stappen om de gistcellen voor te bereiden. Stap 1 is om de cellen te laten groeien tot verzadiging. Stap 2 is om de OD600 van de cultuur te meten en te verdunnen tot een OD600 van 0,5. Stap 3 is om te verdelen over een 96-well plaat. Stap 4 is om te platen met toenemende concentraties koper (aangegeven met toenemende blauwe kleur). Stap 1, stap 2 en stap 4 zouden identiek zijn voor handpipetteren. Eenmaal verguld, worden de platen gedurende 3 dagen geïncubeerd bij 30 °C en vervolgens gescoord op levensvatbaarheid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve weergaven van ACT1-CUP1-gegevens. Voor dit experiment worden gistspliceosomen uitgedaagd met twee verschillende U6-snRNA-mutaties en getest in aanwezigheid van drie niet-consensusrapporteurs. Drie replica's van deze test worden op dezelfde platen gepresenteerd voor demonstratiedoeleinden. Het wordt aanbevolen voor deze test om replicaties uit te voeren op afzonderlijke platen en op afzonderlijke dagen. (A) Een voltooide test met een kopergradiënt van 0 mM tot 1,1 mM over 20 platen wordt getoond. Naarmate de koperconcentratie toeneemt, vertonen spanningen met lagere splicing verminderde samenvloeiing tot het punt waarop de koperconcentratie dodelijk wordt. De gistachtergrond was ade2 en dus zijn volwassen kolonies rood van kleur. (B) Vergelijking van dezelfde platen op 0 mM en 0,1 mM CuSO4 gebeeldeerd met een handheld camera versus een digitaal beeldvormingssysteem. Dit is een voorbeeld van hoe een aantal niet-consensusverslaggevers naast elkaar en met de wild-type verslaggever kunnen worden vergeleken. Veel voorkomende waarnemingen op platen zijn een onechte druppel cultuurmedia die van de pinreplicator viel (rode pijl) en lichte ovaling van de kolonies als gevolg van het glijden van de pin langs het oppervlak van de plaat of beweging van de plaat voordat de druppel cultuur voldoende is opgedroogd (oranje pijl). (C) Voorbeeld van het effect van de A3c-verslaggever op de levensvatbaarheid van cellen in vergelijking met de wild-type reporter. Afbeeldingen zoals die in (B) worden bijgesneden en uitgelijnd om de groeiverschillen bij verschillende koperconcentraties te benadrukken. De kopertolerantie van de A3c reporter stam neemt af tot 0,15 mM Cu2+ in vergelijking met de levensvatbaarheid van de wild-type reporter stam tot het einde van het geteste bereik. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatieve ACT1-CUP1 resultaten monitoring splicing in gist met splicing component mutaties. (A) Schematische van de RNA componenten van de actieve site onmiddellijk na de eerste katalytische stap. De U2 en U6 snRNA's zijn duplexed, waardoor de 5' SS en BS van de intron dicht bij elkaar liggen. De intronische binding tussen A259 (BS) en G1 (5' SS) wordt aangegeven door de oranje stip. De locaties van de niet-consensussequentievervangingen in de ACT1-CUP1-reporter die in dit experiment is getest, zijn vetgedrukt zwart aangegeven. De gemuteerde positie in U6 snRNA (U57) is vetgedrukt groen en de gesubstitueerde basen zijn in blauw of roze. (B) Een mogelijkheid voor de presentatie van ACT1-CUP1-gegevens in een publicatie omvat verschillende afbeeldingen van kolonies uit relevante Cu2+ concentraties. De WT-verslaggever overleefde voorbij de koperconcentratie die werd getest voor alle drie de onderzochte U6-snRNA-stammen. (C) Een staafdiagram waarin de effecten per reporter en per U6 snRNA-mutant worden vergeleken. Normalisatie wordt uitgevoerd voor elke ACT1-CUP1-reporter door de kopertolerantie van het U6 snRNA WT op 1 in te stellen en de verhouding voor de U57c- en U57a-mutaties te berekenen. Foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie van drie replicaties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Aanvullende methoden om ACT1-CUP1-resultaten aan te vullen. (A) Primer-extensie wordt uitgevoerd via een primergloeiing in het 3' ACT1-exon en vervolgens langwerpig in de intron. In dit voorbeeld is de primer end-labeled met IR700-kleurstof en is de primer-extensie uitgevoerd zoals beschreven in 20,21. Primer-uitbreiding van U6-snRNA wordt in dezelfde reactie uitgevoerd om als belastingscontrole te dienen. De 7% 19:1 bis/acrylamide, denaturerende gel lost de pre-mRNA, mRNA en lariat producten op na primer extensie met behulp van een bijna infrarood gel beeldvormingsapparaat zoals beschreven in van der Feltz et al.22. De intensiteit van de verschillende banden kan worden gebruikt om de algehele efficiëntie van de splicing te meten en om de splicingverschillen te onderscheiden die optreden bij de eerste of tweede stap, zoals gekwantificeerd met ImageJ44 of andere gelbandkwantificerende software. Zowel de efficiëntie van de splicing als de efficiëntie van de splicingstap worden berekend zoals beschreven in Query en Konarska14. (B) Mutatieschermen met ACT1-CUP1-verslaggevers kunnen koperselectie gebruiken om mutanten te identificeren die van invloed zijn op splicing. De genen van belang kunnen vervolgens worden gesequenced in de resulterende stammen om te bepalen of de mutatie in dat gen is opgetreden. (C) Wijzigingen kunnen worden aangebracht aan de verslaggever buiten de splice-sites om splicingveranderingen te volgen met betrekking tot intronstructuur, exonische sequenties, aantal exonen of nucleaire export van niet-gesplitst RNA. Grijsgebieden zijn optionele uitbreidingsgebieden om op te nemen in een reporter, en gebieden in rood zijn regio's waarin de volgorde en structurele veranderingen kunnen worden getest op hun potentiële impact op splicing met behulp van de ACT1-CUP1-test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Naam verslaggever | Intronische regio | Volgorde | Laatst haalbare Cu2+ concentratie (mM) | |
| WT | 5' | Guaugu | > 2,5 | |
| G1a | 5ʹ | een UAUGU | 0,0133 of 0,0532 | |
| A3c | 5ʹ | GUcUGU | 0.15^,18 of 0.216 | |
| G5a | 5ʹ | Guauau | 0,303 of 0,259 | |
| WT | Filiaal-site | UACUAAC | > 2,5 | |
| C256a | Filiaal-site | UAeenVAAC | 0,1526 of 0,1832 | |
| U257c/a | Filiaal-site | OCc/aOC | 0,226 of 0,332 of 0,545 | 0.059,32 |
| A258c/u | Filiaal-site | UACUc / uAC | 0,826 | 1,045 of 1,646 |
| Bs-C | Filiaal-site | UACUAcC | 0,153 of 0,1832,56 of 0,226 | |
| Bs-G | Filiaal-site | UACUAgC | 0,0516,32 of 0,625 of 0,846 | |
| C260g | Filiaal-site | UACUAAg | 0,826 | |
| WT | 3' | UAG | > 2,5 | |
| U301g | 3ʹ | g AG | 0,1518 | |
| A302g/u | 3' | Ug/uG | 0,0139 | 0,07516 of 0,1824 |
| G303c | 3ʹ | UAc | 0,0532 | |
Tabel 1: Lijst van veel voorkomende verslaggevers en de cu2+ concentratie letaliteit gerapporteerd. Er zijn meer dan 100 citaten van Lesser en Guthrie3. Hoewel een kleine selectie van deze citaten werd gebruikt om deze tabel te maken, benadrukken ze de algemene trend van lichte tot matige verschillen tussen studies in gerapporteerde koper levensvatbaarheidsconcentraties. In ACT1-CUP1 is het belangrijk om wild-type eiwit of RNA te vergelijken met de mutanten met dezelfde giststamachtergrond met behulp van de gepubliceerde concentraties als leidraad, maar anticiperend dat de waargenomen concentraties kunnen verschillen. Gegevens verzameld uit figuur 3 (^) en meerdere publicaties geannoteerd door de volgende citaten 3,9,16,18,24,25,26,32,45,46.
Aanvullende tabel 1: Inhoud van een enkele koperplaat en een voorbeeld van berekeningen die zijn uitgevoerd om koperverdunningen van 0 mM tot 2,5 mM te bereiken uit een 1 M CuSO4-voorraad . Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullende tabel 2: Voorbeeld van een platingschema voor de 48-pins replicator. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullende tabel 3: Voorbeeld van levensvatbaarheid gescoord uit koperen platen die gedurende 3 dagen bij 30 °C zijn geïncubeerd. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullende tabel 4: Lijst van giststammen die zijn gebruikt om de representatieve gegevens te genereren. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullende tabel 5: Lijst van plasmiden die worden gebruikt om de representatieve gegevens te genereren. U6 snRNA-plasmiden gegenereerd en gepubliceerd in eerder onderzoek22,47. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ACT1-CUP1 is een groeitest en er moet voor worden gezorgd dat waargenomen groeiverschillen alleen kunnen worden toegeschreven aan splicingdefecten. Alle stammen moeten op dezelfde manier worden behandeld voorafgaand aan het beplateren, inclusief een vergelijkbare lengte en type groei- en opslagomstandigheden. Bij gebruik van temperatuurgevoelige stammen mogen ACT1-CUP1-testen alleen worden uitgevoerd onder omstandigheden waarin die stammen vergelijkbaar zijn met wild type. In verband hiermee wordt voor de QSP-component geadviseerd om identieke gistachtergronden en expressieniveaus van QSP-gen(en) te hebben om de interpretatie van de resultaten niet te vertroebelen. Bij het overwegen van het aantal QSP's en melders dat moet worden gebruikt, wordt het niet geadviseerd om meer dan 30 stammen tegelijk te testen met de pin replicator-methode. Met de extra tijd om elke stap uit te voeren, zullen de cellen bezinken en zullen de testresultaten inconsistent zijn vanwege de verminderde levensvatbaarheid van de cel.
Naast de beperkingen die ACT1-CUP1 inherent heeft als groeitest, kan een QSP een complexere impact hebben op splicing dan met deze methode kan worden opgelost. Omdat splicing een proces met meerdere stappen is en factoren worden gerecycled, kan het waargenomen fenotype resulteren in de verstoring die meer dan één splicingstap beïnvloedt. Dit geldt zelfs voor de daaropvolgende analyses die act1-cup1 kunnen opvolgen, waarvan sommige hieronder worden beschreven. De gegevens zullen de meest verstoorde stap van het proces benadrukken, ook al kunnen andere stappen worden beïnvloed door de gewijzigde functie van de splicingfactor.
Primer-uitbreiding van ACT1-CUP1-verslaggevers werd voor het eerst gebruikt in het originele artikel van Lesser en Guthrie en wordt vaak uitgevoerd als de ACT1-CUP1-resultaten een groeidefect vertonen3. Deze test richt zich op de verslaggever en gebruikt de lengte van de PCR-producten om de relatieve hoeveelheden niet-gesplitste, gedeeltelijk gesplitste en volledig gesplitste verslaggevers te bepalen (figuur 5A). De algehele efficiëntie van de splicing en of het defect sterker van invloed is op de eerste of tweede katalytische stap, worden berekend door verhoudingen van de PCR-producthoeveelhedente nemen 14. 5' SS-reporter G5a heeft bijvoorbeeld minder splicing in vergelijking met de wild-type reporter, maar de efficiëntie van de eerste en tweede stap volgt een vergelijkbaar patroon als wild-type (figuur 5A). Dit wijst op een defect voorafgaand aan de eerste katalytische stap, mogelijk in spliceosoomassemblage, omdat beide stappen op dezelfde manier worden beïnvloed31.
Nieuwe assays zijn ontwikkeld op basis van de canonieke ACT1-CUP1-test, zoals screening op mutanten die splicing verbeteren in aanwezigheid van andere splicingfactormutanten en/of niet-consensus splicingsequenties (figuur 5B). Bijvoorbeeld, het blootstellen van gist die de ACT1-CUP1-reporter bevat aan UV en vervolgens selecteren in aanwezigheid van koper leverde Prp8- en Hsh155-mutanten op die de splicing van niet-consensussequenties verbeterden14,19.
Voortbouwend op de studie van het effect van splice-sites en constitutieve splicingfactoren, is CUP1-groeiafhankelijkheid gebruikt om meerdere intron-splicing, nucleaire exportcontrole en de impact van UTR en andere perifere sequenties op splicing te bestuderen (figuur 5C). Sommige van deze studies hebben verslaggevers gemaakt met CUP1 en andere intron-bevattende gistgenen die complexere splicingpatronen kunnen hebben om het effect op de intronische secundaire structuur en multi-intron transcript splicing 48,49,50,51,52 te bestuderen. Het verband tussen splicing en nucleaire export werd bestudeerd door gesplitste of niet-gesplitste transcripties te hebben die CUP1 coderen in frame53,54. De lengte van de afstandsafhankelijkheid van de pyrimidinetrack en de spliceplaatsselectie als gevolg van specifieke factoren is ook getest 20,55,56,57. Deze voorbeelden en vele andere benadrukken de veelzijdigheid van ACT1-CUP1 en andere CUP1-groeitests.
De ACT1-CUP1-test koppelt verstoringen aan een complexe reactiecyclus met een eenvoudig groeifenotype met een breed gevoeligheidsbereik. Deze legacy-test is door meerdere laboratoria gebruikt om de basis te leggen voor het begrip van de splicingcyclus. Meer recent is ACT1-CUP1 gebruikt om vragen te beantwoorden die voortvloeien uit de schat aan structurele gegevens die nu beschikbaarzijn 21,22,25. Structurele studies van spliceosomen gebonden aan niet-consensussequenties kunnen worden gecombineerd met ACT1-CUP1-resultaten om te interpreteren hoe veranderde structuur en veranderde functie correleren. ACT1-CUP1 is een ideaal eerste scherm voor splicingmutaties die een aanvulling kunnen vormen op complexere analyses.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteur heeft niets te onthullen.
Acknowledgments
Dank aan Aaron Hoskins en de Hoskins-lableden van de Universiteit van Wisconsin-Madison voor het gebruik van giststammen en apparatuur bij het genereren van figuren 3-5. Dank aan Harpreet Kaur en Xingyang Fu voor hun inzichtelijke commentaar op het manuscript. Bedankt aan de ondersteunende studenten, medewerkers en faculteit van northwest university tijdens het schrijven, monteren en filmen van dit artikel. Bedankt aan Isabelle Marasigan voor hulp bij het filmen van deze methode.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL sterile microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| 2 mL sterile microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-138 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | Fisher Scientific | 07-201-332 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| 96-well round bottom microplate | Fisher Scientific | 07-200-760 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| 190 proof ethanol | Fisher Scientific | 22-032-600 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| 500 mL Filter System (0.22 µm) | CellTreat Scientific Products | 229707 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | Any molecular grade agar will work. |
| Autoclave | Tuttnauer | 3870EA | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Bunsen burner | Humboldt | PN6200.1 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Cell Density Meter | VWR | 490005-906 | Or other spectral device that can measure absorbance at 595 nm. |
| Copper sulfate Pentahydrate | Fisher Scientific | LC134051 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Digital imaging system | Cytiva | 29399481 | ImageQuant 4000 (used for Figure 3), Amersham ImageQuant 800, or comparable item from a different manufacturer. |
| Dropout mix (-Leu) | USBiological Life Sciences | D9525 | Use the appropriate drop out mix for your experiment. It is possible you will be using a yeast nutrient marker for your query perturbation also. In that case, the drop out mix should be for that marker and Leu |
| D-Glucose | Fisher Scientific | AAA1682836 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Gel band quantifying software | Cytiva | 29-0006-05 | ImageQuant TL v8.1 (used for figure 5A) or comparable item from a different manufacturer. |
| Hand held camera | Nikon | D3500 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Near infra-red gel imaging device | Cytiva | 29238583 | Amersham Typhoon NIR (used for Figure 5a) or comparable item from a different manufacturer. |
| Laboratory grade clamp | Fisher Scientific | 05-769-7Q | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Laboratory grade stand and clamp | Fisher Scientific | 12-000-101 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Magnetic stir bars | Fisher Scientific | 14-513-51 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Pin replicator | VP Scientific | VP 407AH | |
| Semi-micro disposable cuvettes | VWR | 97000-590 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Shaker | JEIO Tech | IST-3075 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Spectrophotometer | Biowave | 80-3000-45 | Or any spectophotometer that can measure the absorbance at 600 nm. |
| Square plates | VWR | 102091-156 | Circular plates may also be used though are more challenging if using a pin replicator. |
| Stir plate | Fisher Scientific | 11-520-16S | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Yeast nitrogen base | USBiological Life Sciences | Y2025 | Or comparable item from a different manufacturer. |
References
- Wahl, M. C., Will, C. L., Luhrmann, R. The spliceosome: Design principles of a dynamic RNP machine. Cell. 136 (4), 701-718 (2009).
- Wilkinson, M. E., Charenton, C., Nagai, K.
- Lesser, C. F., Guthrie, C. Mutational analysis of pre-mRNA splicing in Saccharomyces cerevisiae using a sensitive new reporter gene, CUP1. Genetics. 133 (4), 851-863 (1993).
- Ng, R., Abelson, J. Isolation and sequence of the gene for actin in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (7), 3912-3916 (1980).
- Gallwitz, D., Sures, I. Structure of a split yeast gene: Complete nucleotide sequence of the actin gene in I. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (5), 2546-2550 (1980).
- Fogel, S., Welch, J. W., Cathala, G., Karin, M. Gene amplification in yeast: CUP1 copy number regulates copper resistance. Current Genetics. 7 (5), 347-355 (1983).
- Hamer, D. H., Thiele, D. J., Lemontt, J. E. Function and autoregulation of yeast copperthionein. Science. 228 (4700), 685-690 (1985).
- Winge, D. R., Nielson, K. B., Gray, W. R., Hamer, D. H. Yeast metallothionein. Sequence and metal-binding properties. Journal of Biological Chemistry. 260 (27), 14464-14470 (1985).
- Burgess, S. M., Guthrie, C. A mechanism to enhance mRNA splicing fidelity: The RNA-dependent ATPase Prp16 governs usage of a discard pathway for aberrant lariat intermediates. Cell. 73 (7), 1377-1391 (1993).
- Collins, C. A., Guthrie, C. Allele-specific genetic interactions between Prp8 and RNA active site residues suggest a function for Prp8 at the catalytic core of the spliceosome. Genes & Development. 13 (15), 1970-1982 (1999).
- Siatecka, M., Reyes, J. L., Konarska, M. M. Functional interactions of Prp8 with both splice sites at the spliceosomal catalytic center. Genes & Development. 13 (15), 1983-1993 (1999).
- Umen, J. G., Guthrie, C. Mutagenesis of the yeast gene PRP8 reveals domains governing the specificity and fidelity of 3' splice site selection. Genetics. 143 (2), 723-739 (1996).
- Grainger, R. J., Beggs, J. D. Prp8 protein: At the heart of the spliceosome. RNA. 11 (5), 533-557 (2005).
- Query, C. C., Konarska, M. M. Suppression of multiple substrate mutations by spliceosomal prp8 alleles suggests functional correlations with ribosomal ambiguity mutants. Molecular Cell. 14 (3), 343-354 (2004).
- Konarska, M. M., Vilardell, J., Query, C. C. Repositioning of the reaction intermediate within the catalytic center of the spliceosome. Molecular Cell. 21 (4), 543-553 (2006).
- Liu, L., Query, C. C., Konarska, M. M. Opposing classes of prp8 alleles modulate the transition between the catalytic steps of pre-mRNA splicing. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (6), 519-526 (2007).
- MacRae, A. J., et al. Prp8 positioning of U5 snRNA is linked to 5' splice site recognition. RNA. 24 (6), 769-777 (2018).
- Query, C. C., Konarska, M. M. CEF1/CDC5 alleles modulate transitions between catalytic conformations of the spliceosome. RNA. 18 (5), 1001-1013 (2012).
- Tang, Q., et al. SF3B1/Hsh155 HEAT motif mutations affect interaction with the spliceosomal ATPase Prp5, resulting in altered branch site selectivity in pre-mRNA splicing. Genes & Development. 30 (24), 2710-2723 (2016).
- Carrocci, T. J., Zoerner, D. M., Paulson, J. C., Hoskins, A. A. SF3b1 mutations associated with myelodysplastic syndromes alter the fidelity of branchsite selection in yeast. Nucleic Acids Research. 45 (8), 4837-4852 (2017).
- Kaur, H., Groubert, B., Paulson, J. C., McMillan, S., Hoskins, A. A. Impact of cancer-associated mutations in Hsh155/SF3b1 HEAT repeats 9-12 on pre-mRNA splicing in Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 15 (4), 0229315 (2020).
- vander Feltz, C., et al. Saccharomyces cerevisiae Ecm2 modulates the catalytic steps of pre-mRNA splicing. RNA. 27 (5), 591-603 (2021).
- Carrocci, T. J., Paulson, J. C., Hoskins, A. A. Functional analysis of Hsh155/SF3b1 interactions with the U2 snRNA/branch site duplex. RNA. 24 (8), 1028-1040 (2018).
- Hogg, R., de Almeida, R. A., Ruckshanthi, J. P., O'Keefe, R. T. Remodeling of U2-U6 snRNA helix I during pre-mRNA splicing by Prp16 and the NineTeen Complex protein Cwc2. Nucleic Acids Research. 42 (12), 8008-8023 (2014).
- Hansen, S. R., Nikolai, B. J., Spreacker, P. J., Carrocci, T. J., Hoskins, A. A. Chemical inhibition of pre-mRNA splicing in living Saccharomyces cerevisiae. Cell Chemical Biology. 26 (3), 443-448 (2019).
- Xu, Y. Z., Query, C. C. Competition between the ATPase Prp5 and branch region-U2 snRNA pairing modulates the fidelity of spliceosome assembly. Molecular Cell. 28 (5), 838-849 (2007).
- Staley, J. P., Guthrie, C. An RNA switch at the 5' splice site requires ATP and the DEAD box protein Prp28p. Molecular Cell. 3 (1), 55-64 (1999).
- Bousquet-Antonelli, C., Presutti, C., Tollervey, D. Identification of a regulated pathway for nuclear pre-mRNA turnover. Cell. 102 (6), 765-775 (2000).
- Villa, T., Guthrie, C. The Isy1p component of the NineTeen complex interacts with the ATPase Prp16p to regulate the fidelity of pre-mRNA splicing. Genes & Development. 19 (16), 1894-1904 (2005).
- Mayas, R. M., Maita, H., Staley, J. P. Exon ligation is proofread by the DExD/H-box ATPase Prp22p. Nature Structure and Molecular Biology. 13 (6), 482-490 (2006).
- Lesser, C. F., Guthrie, C. Mutations in U6 snRNA that alter splice site specificity: Implications for the active site. Science. 262 (5142), 1982-1988 (1993).
- McPheeters, D. S. Interactions of the yeast U6 RNA with the pre-mRNA branch site. RNA. 2 (11), 1110-1123 (1996).
- Perriman, R. J., Ares, M. Rearrangement of competing U2 RNA helices within the spliceosome promotes multiple steps in splicing. Genes & Development. 21 (7), 811-820 (2007).
- Mefford, M. A., Staley, J. P. Evidence that U2/U6 helix I promotes both catalytic steps of pre-mRNA splicing and rearranges in between these steps. RNA. 15 (7), 1386-1397 (2009).
- Hilliker, A. K., Mefford, M. A., Staley, J. P. U2 toggles iteratively between the stem IIa and stem IIc conformations to promote pre-mRNA splicing. Genes & Development. 21 (7), 821-834 (2007).
- Wu, G., et al. Pseudouridines in U2 snRNA stimulate the ATPase activity of Prp5 during spliceosome assembly. EMBO Journal. 35 (6), 654-667 (2016).
- Crotti, L. B., Bacikova, D., Horowitz, D. S. The Prp18 protein stabilizes the interaction of both exons with the U5 snRNA during the second step of pre-mRNA splicing. Genes & Development. 21 (10), 1204-1216 (2007).
- Fogel, S., Welch, J. W. Tandem gene amplification mediates copper resistance in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (17), 5342-5346 (1982).
- Gardner, J. M., Jaspersen, S. L. Manipulating the yeast genome: Deletion, mutation, and tagging by PCR. Methods Molecular Biology. 1205, 45-78 (2014).
- JoVE. Yeast Transformation and Cloning. In Biology I: yeast, Drosophila and C. Elegant. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2021).
- Gietz, R. D., Woods, R. A. Yeast transformation by the LiAc/SS Carrier DNA/PEG method. Methods Molecular Biology. 313, 107-120 (2006).
- Gietz, R. D., Woods, R. A.
- Mayerle, M., et al. Structural toggle in the RNaseH domain of Prp8 helps balance splicing fidelity and catalytic efficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 4739-4744 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Beier, D. H., et al. Dynamics of the DEAD-box ATPase Prp5 RecA-like domains provide a conformational switch during spliceosome assembly. Nucleic Acids Research. 47 (20), 10842-10851 (2019).
- vander Feltz, C., DeHaven, A. C., Hoskins, A. A. Stress-induced pseudouridylation alters the structural equilibrium of yeast U2 snRNA Stem II. Journal of Molecular Biology. 430 (4), 524-536 (2018).
- Rodgers, M. L., Didychuk, A. L., Butcher, S. E., Brow, D. A., Hoskins, A. A. A multi-step model for facilitated unwinding of the yeast U4/U6 RNA duplex. Nucleic Acids Research. 44 (22), 10912-10928 (2016).
- Stutz, F., Rosbash, M. A functional interaction between Rev and yeast pre-mRNA is related to splicing complex formation. EMBO Journal. 13 (17), 4096-4104 (1994).
- Libri, D., Lescure, A., Rosbash, M. Splicing enhancement in the yeast rp51b intron. RNA. 6 (3), 352-368 (2000).
- Libri, D., Stutz, F., McCarthy, T., Rosbash, M. RNA structural patterns and splicing: Molecular basis for an RNA-based enhancer. RNA. 1 (4), 425-436 (1995).
- Howe, K. J., Kane, C. M., Ares, M. Perturbation of transcription elongation influences the fidelity of internal exon inclusion in Saccharomyces cerevisiae. RNA. 9 (8), 993-1006 (2003).
- Cuenca-Bono, B., et al. SUS1 introns are required for efficient mRNA nuclear export in yeast. Nucleic Acids Research. 39 (19), 8599-8611 (2011).
- Scherrer, F. W., Spingola, M. A subset of Mer1p-dependent introns requires Bud13p for splicing activation and nuclear retention. RNA. 12 (7), 1361-1372 (2006).
- Hálová, M., et al. Nineteen complex-related factor Prp45 is required for the early stages of cotranscriptional spliceosome assembly. RNA. 23 (10), 1512-1524 (2017).
- Umen, J. G., Guthrie, C. A novel role for a U5 snRNP protein in 3' splice site selection. Genes & Development. 9 (7), 855-868 (1995).
- Crotti, L. B., Horowitz, D. S. Exon sequences at the splice junctions affect splicing fidelity and alternative splicing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 18954-18959 (2009).
- Perriman, R., Ares, M. Invariant U2 snRNA nucleotides form a stem loop to recognize the intron early in splicing. Molecular Cell. 38 (3), 416-427 (2010).
