Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

ACT1-CUP1-analyser bestemmer substratspesifikke følsomheter for spliceosomale mutanter i spirende gjær

Published: June 30, 2022 doi: 10.3791/63232
Automatic Translation
1
1College of Arts and Sciences, Northwest University

Summary

ACT1-CUP1-analysen, en kobbervekstanalyse, gir en rask avlesning av forløperen messenger RNA (pre-mRNA) spleising og virkningen mutant spleisingsfaktorer har på spliceosomal funksjon. Denne studien gir en protokoll og fremhever tilpasningen som er mulig for å løse spleisingsspørsmålet av interesse.

Abstract

Mutasjoner introdusert i spliceosomet eller dets substrat har betydelig bidratt til vår forståelse av vanskelighetene med spliceosomal funksjon. Enten sykdomsrelatert eller funksjonelt valgt, har mange av disse mutasjonene blitt studert ved hjelp av vekstanalyser i modellorganismen Saccharomyces cerevisiae (gjær). Den spleisespesifikke kobbervekstanalysen, eller ACT1-CUP1-analysen, gir en omfattende analyse av mutasjon på fenotypisk nivå. ACT1-CUP1-analysen bruker reportere som gir kobbertoleranse når de er riktig skjøtet. Således, i nærvær av kobber, korrelerer endringer i gjærens levedyktighet med endringer i mRNA-produksjon gjennom spleising. I et typisk eksperiment utfordres gjærspliceosomet med forskjellige ikke-konsensus-spleisingsreportere og spleisingsfaktormutasjonen av interesse for å oppdage synergetisk eller antitetisk innvirkning på spleising. Her gis en fullstendig beskrivelse av kobberplatepreparasjon, plating av gjærceller og dataevaluering. Et utvalg av komplementære eksperimenter er beskrevet, og fremhever allsidigheten til ACT1-CUP1-reporterne. ACT1-CUP1-analysen er et praktisk verktøy i spleiseverktøykassen takket være direkte avlesning av mutasjonseffekt(er) og de komparative mulighetene fra fortsatt bruk i felt.

Introduction

Spliceosomet er en stor, biologisk maskin som katalyserer fjerning av introner, ikke-kodende regioner i forløperen messenger RNA (pre-mRNA)1,2. Karakterisering av effekten av en enkeltpunktsmutant i 1 av de nesten 100 proteiner og 5 ikke-kodende RNA er ofte tvetydig når man studerer proteinet eller RNA isolert. Endringen i den muterte komponentens funksjon kan best evalueres in vivo i sammenheng med det fulle, fungerende spliceosomet.

Kobbervekstanalysen beskrevet her er en rask måling av spleisingseffektivitet i Saccharomyces cerevisiae eller spirende gjær. Utviklet av CF Lesser og C. Guthrie og publisert i 1993, kombinerer denne analysen det enkle å jobbe med en enkel modellorganisme og den enkle avlesningen av cellens levedyktighet3. Levedyktigheten korrelerer med hvor godt spliceosomene i disse cellene kan gjenkjenne og spleise reporterutskriften.

Denne kobbervekstanalysen kalles mer vanlig ACT1-CUP1-analysen. Navnet ACT1-CUP1 stammer fra de to genene smeltet sammen for å skape en reporter av spleiseeffektivitet. ACT1 er gjærens aktingen, som er sterkt uttrykt og har en effektivt skjøtet intron 4,5. Cup1p er en kobberkelator som sekvestrerer kobber i cellen for å forhindre interferens med vanlige cellulære funksjoner 6,7,8. ACT1-CUP1-reporteren inneholder disse genene i rekkefølge slik at CUP1 bare er i riktig leseramme hvis pre-mRNA-spleising av ACT1s intron forekommer (figur 1). Det resulterende fusjonsproteinet inneholder de første 21 aminosyrene av aktin og full lengde Cup1p-protein, noe som øker gjærens levedyktighet i et kobberrikt miljø3. Dermed resulterer en økning i mengden spleising av reporteren i en høyere konsentrasjon av Cup1p og en høyere kobbermotstand (figur 1). Sammenlignet med andre reportergener, påvirker CUP1 cellens levedyktighet selv ved lave nivåer, har et bredt følsomhetsområde, og kan brukes til å velge direkte for spleising av mutasjoner 3,6,7. I tillegg er CUP1 ikke avgjørende for standard gjærvekst, og dermed påvirkes ikke cellulær homeostase under oppsettet for denne analysen. I tillegg til slettings- eller temperaturvekstanalyser gir ACT1-CUP1 informasjon om effekten på skjøting under ellers optimale gjærvekstforhold.

Spliceosomet gjenkjenner substratet gjennom tre introniske sekvenser, nemlig 5' spleisestedet (5' SS), grenstedet (BS) og 3' spleisestedet (3' SS). Tallrike ACT1-CUP1-reportere har blitt generert som inneholder ikke-konsensussekvenser på disse nettstedene. Et utvalg av de vanligste ACT1-CUP1-reporterne er vist i figur 1 og tabell 1. Ettersom spliceosomet samhandler med hvert skjøtested unikt på forskjellige punkter i spleisingssyklusen, kan robustheten til spliceosomet testes på forskjellige trinn basert på hvilken ikke-konsensusreporter som brukes. Ikke-konsensusreportere er oppkalt etter den muterte posisjonen i intronen og basen den ble mutert til. For eksempel er A3c en reporter med en mutasjon ved 5 'SS, spesielt posisjon 3 fra konsensus adenosin til en cytosin. Denne reporteren vil samhandle sterkt med spliceosome mutasjoner som påvirker 5 'SS utvalg og bruk. I sin første studie bestemte Lesser og Guthrie hvilke 5 'SS-mutasjoner som hemmet spleising3. Senere samme år ble ikke-konsensusreportere på alle tre spleisestedene publisert av Burgess og Guthrie i en suppressorskjerm av mutasjoner i ATPase Prp16p9. Ved å sammenligne konsensus med ikke-konsensusreportere, har ACT1-CUP1-analysen vært en viktig nøkkel til å forstå robustheten og selektiviteten til gjærspleisosomet og å utlede funksjonen til andre eukaryoters spliceosomer.

Som ikke-konsensus ACT1-CUP1-reportere sensibiliserer spliceosomet til ytterligere forstyrrelse, kan virkningen av en enkelt spleisingsfaktormutasjon karakteriseres gjennom reporterne det positivt eller negativt påvirker. Dette har blitt brukt til å skjøte forskningsspørsmål på en rekke måter. For det første kan og har ACT1-CUP1-analysen blitt brukt som en genetisk skjerm for mutasjoner i spleisingsfaktorer. For eksempel fungerer Prp8p, det største spleisingsproteinet, som en plattform hvor RNA-kjernen i spliceosomet katalyserer spleisingsreaksjonen. Dette ble delvis utledet gjennom hvordan Prp8p-mutanter forbedret eller reduserte spleisingen av forskjellige ACT1-CUP1-reportere 10,11,12,13,14,15,16,17. Andre proteinkomponenter i spliceosomet har også blitt undersøkt ved bruk av ACT1-CUP1, inkludert Hsh155p, Cwc2p, Cef1p og Ecm2p 18,19,20,21,22,23,24,25. De energiske tersklene for Prp16p og fire andre ATPaser involvert i spliceosomal overgang har også blitt studert med denne analysen 9,26,27,28,29,30. De små nukleære RNA-ene (snRNA-ene) har også blitt grundig studert ved bruk av ACT1-CUP1 for å identifisere pre-mRNA-sekvensene de koordinerer og endringene i sekundærstrukturen snRNA-ene gjennomgår under spleising3,31,32,33,34,35,36,37.

ACT1-CUP1-analysen krever en gjærstamme der alle kopier av CUP1-genet er slått ut. Siden CUP1 kan ha et høyt kopinummer 6,38, kan forberedelse av en full knock-out-belastning kreve flere runder eller omfattende screening. Som et resultat har cup1Δ gjærstammer ofte blitt delt mellom laboratorier, som har reporterne.

Hvis mutasjon(er) i en spleisingsfaktor vurderes fra en plasmidkopi, bør villtypegenet for denne faktoren slås ut. I tillegg bør gjærbakgrunnen tillate seleksjon av minst to plasmider, en som inneholder en ACT1-CUP1-reporter, historisk på et leucin næringsstoffseleksjonsplasmid, og en som inneholder en mutasjon eller forstyrrelse i spleisingsmaskineriet som skal studeres (figur 2). Vanligvis, i en enkelt analyse, vil flere gjærstammer, som hver bærer spørringen splicing perturbation (QSP) og en annen reporter, teste spørringens innvirkning på spleising.

De uavhengige variablene i ACT1-CUP1-analysen tillater en forsker å vurdere alvorlighetsgraden av en QSP. Disse uavhengige variablene er konsentrasjonen av kobber og utvalget av flere ikke-konsensus spleising reportere. For det første, ettersom gjærstammene dyrkes på plater som inneholder en rekke kobberkonsentrasjoner (figur 2), inkluderer oppsettet av analysen å velge gradienten av konsentrasjoner som brukes. Studier kan bruke et kurs kobberkonsentrasjonsgradient for å få en innledende avlesning av levedyktighet og deretter gjenta analysen med en finere gradient for å identifisere subtile levedyktighetsforskjeller. Den andre variabelen er det brede spekteret av ACT1-CUP1-reportere som er mulig å teste (figur 1 og tabell 1). Hvis QSP påvirker gjærens levedyktighet annerledes i nærvær av en ikke-konsensusreporter versus villtype, kan det konkluderes med at QSP påvirker et trinn i spleising eller en region av spliceosomet som er viktig under anerkjennelsen eller behandlingen av den regionen av intronen.

Gjærverktøykassen er omfattende, og ACT1-CUP1-analysen er en integrert del av skjøteforskningen. ACT1-CUP1-analysen utføres ofte sammen med en mer grundig genetisk, strukturell og / eller biokjemisk analyse av virkningen av en QSP. Siden disse mer detaljerte studiene generelt har en lengre prosedyre og/eller høyere prislapp, er en hyppig tilnærming screening for interessante mutanter med ACT1-CUP1 først.

Forutsatt her er en ACT1-CUP1 analyseprotokoll, inkludert kobberplateforberedelse. Denne analysen gir forskere et første svar på QSPs effekt på spleising og hvilke introniske regioner som er mest påvirket av forstyrrelsen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Gjærstammekonstruksjon

  1. Generer eller oppnå en S. cerevisiae-stamme hvis bakgrunn inkluderer leu2 og cup1Δ. For å generere denne bakgrunnen, bruk den veletablerte gjærmetoden som bruker litiumacetat og enkeltstrenget DNA39.
    MERK: Haploide gjærstammer kan inneholde en, to eller flere kopier av CUP1 6,38. Se genomisk informasjon for den valgte gjærstammen når du designer knock-out primere for å flankere CUP1-genplasseringen (e).
  2. Utfør en gjærtransformasjon for å inkorporere QSP enten via genomisk inkorporering eller på et plasmid. Bruk en veletablert protokoll som de som er beskrevet i tidligere forskning40,41,42.
  3. Utfør en gjærtransformasjon med den resulterende belastningen (e) fra trinn 1.2. for å legge til ønsket ACT1-CUP1 reporter plasmid.
    MERK: Celler må opprettholdes på leucin drop-out (-Leu) plater og medier for å sikre oppbevaring av ACT1-CUP1 reporter plasmider etter denne transformasjonen.
  4. Utfør trinn 1.2. og 1.3. for hver QSP og hver ACT1-CUP1 reporter plasmid som skal testes, inkludert kontrollstammer.

2. Forberedelse av kobberplater

  1. Velg et kobberkonsentrasjonsområde som passer til reporterne som skal testes (se tabell 1 for ofte brukte reporteres dødelighet).
    MERK: Et eksempel på et omfattende kobberkonsentrasjonsområde er 30 forskjellige kobberkonsentrasjoner på 0 mM, 0,025 mM, 0,05 mM, 0,075 mM, 0,1 mM, 0,15 mM, 0,2 mM, 0,25 mM, 0,3 mM, 0,35 mM, 0,4 mM, 0,45 mM, 0,5 mM, 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM og 2,5 mM Cu2+.
  2. Lag en stamløsning av 1 M CuSO4 og sterilt filter gjennom et 0,22 μm PES (polyetersulfon) sterilt filter.
  3. Per ønsket kobberplate, lag en 2 ml fortynning av CuSO4-stammen i sterilt vann.
    MERK: Siden platen med 0 mM Cu 2+ alltid vil bli analysert og avbildet som referanse, anbefales det å lage to 0 mM Cu2+ plater, en i begynnelsen og en på slutten av pletteringstrinnet (trinn 3.4.).
    1. Beregn mengden lager for den endelige ønskede kobberkonsentrasjonen i 40 ml av platevolumet (tilleggstabell 1).
    2. Tilsett beregnet mengde sterilt vann og 1 M CuSO4 lager til et sterilt rør på 2 ml.
  4. Hell tallerkener til ACT1-CUP1-analysen.
    MERK: Et alternativ til protokollen nedenfor er å først kombinere media og agar i en stor beholder og aliquot etter autoklavering i mindre beholdere for å oppnå forskjellige kobberkonsentrasjoner for hver plate. Uansett hvilken metode som tas, er det viktig å sikre at mediekonsentrasjonen er konsistent mellom alle platene til tross for at hver har en annen kobberkonsentrasjon.
    1. Merk hver tomme plate som skal helles med den endelige kobberkonsentrasjonen den vil inneholde. Forbered minst en firkantet plate per kobberkonsentrasjon som skal testes.
    2. Merk en 100 ml flaske per kobberkonsentrasjon som skal testes.
    3. Til hver flaske, tilsett 790 mg agar (2% w / v agar) og en rørstang.
    4. I et stort beger kombinerer du -Leu-vekstmediet for alle kobberplatene som skal helles. Oppløs 265 mg gjærnitrogenbase (YNB) og 64 mg drop-out blanding minus leucin (og andre næringsstoffer som kan være nødvendige for å opprettholde QSP-plasmidet i cellene) i 34 ml avionisert vann per plate.
    5. Tilsett 34 ml av -Leu vekstmedieløsningen til hver tilberedte 100 ml flaske og kork med aluminiumsfolie. Merk folien med den tiltenkte kobberkonsentrasjonen.
    6. Autoklav for å sterilisere og oppløse agar ved hjelp av den anbefalte væskesyklusen for autoklaven.
    7. Så raskt som mulig, tilsett 4 ml 20 % w/v glukose (sterilt filtrert) til hver flaske.
    8. Match etikettene og tilsett 2 ml fortynninger av CuSO4 til den tiltenkte flasken.
      MERK: Siden titalls kobberplater kan lages samtidig, vil hver med en annen konsentrasjon, merking av alle flasker, rør og plater tydelig med den tiltenkte kobberkonsentrasjonen forhindre forvirring under platehelling.
    9. Bruk en rørplate til å blande for ~ 30 s og hell eller pipet 35 ml i den merkede platen, unngå bobler. La avkjøles før lagring eller bruk.
      MERK: Platene lages ofte 1 dag eller 2 dager før analysen og oppbevares ved 4 °C til noen timer før bruk. Platene skal være ved romtemperatur (RT) før plating begynner (trinn 3.4.).

3. ACT1-CUP1-analyse

  1. Strek ut de ønskede belastningene på -Leu-plater.
    MERK: Hvis du arbeider fra kryolagre, bør det tas hensyn til at cellene er tilstrekkelig gjenopplivet fra lagring før plating. En anbefalt prosedyre for dette er å strekke seg fra den kryogene bestanden og la den vokse i 3-5 dager ved 30 °C. Deretter restreak en liten fargeprøve og la den vokse i ytterligere 2-3 dager ved 30 ° C.
  2. Vokse over natten kulturer i 10 ml media.
    1. Forbered -Leu vekstmedier ved å bruke de samme forholdene som beskrevet i trinn 2.4.2. Per 10 ml media, tilsett 66 mg gjærnitrogenbase (YNB) og 16 mg drop-out blanding minus leucin til 9 ml avionisert vann. Pass gjennom et 0,22 μm PES sterilt filter.
    2. Per gjærstamme, tilsett 9 ml -Leu vekstmedium og 1 ml 20% w / v glukose (sterilt filtrert) til et sterilt 50 ml konisk rør.
    3. Bruk en steril pinne eller pipetspiss, samle en liten (~ 1 mm rund) fargeprøve av gjær og inokulere media.
    4. Rist alle overnattingskulturene ved 180 o/min og 30 °C.
      MERK: Hvis tilgjengelig, kan rotatorer brukes i stedet for en shaker.
  3. Fortynn stammene til en OD600 0,5 ± 0,05 i 10% glyserol.
    1. Per stamme, tilsett 100 μL kultur til en kyvette som inneholder 900 μL vann.
    2. Mål OD600 med et spektrofotometer.
    3. Beregn fortynningen som kreves for å være ved en OD600 på 0,5 i et endelig volum på 2 ml.
    4. Fortynn hver stamme til OD600 0,5 i 10% glyserol (steril).
    5. Mål OD600 på nytt for å bekrefte at celletettheten er innenfor ønsket område på 0,5 ± 0,05.
  4. Plate stammene på kobberplatene.
    MERK: En rekke metoder kan brukes til å plate stammene, inkludert håndpipettering 5-10 μL volumer, ved hjelp av en repetisjon eller flerkanals pipetter, eller stempling med en pinnereplikator. Denne siste metoden er beskrevet nedenfor, selv om de fleste trinnene vil være like uavhengig av metoden.
    1. Sett opp et sterilt arbeidssted og en tent Bunsen-brenner.
    2. For en 48-pinners replikator, pipet 200 μL av hver fortynnet stamme i en separat brønn på en 96-brønnplate. Fyll de tomme mellomrommene i 6 x 8 rutenettet med 200 μL 10% glyserol (steril).
      MERK: Et eksempel på et pletteringsskjema for ni gjærstammer er i tilleggstabell 2.
    3. Dypp replikatoren i en grunne tallerken med 95% (v / v) etanol og flamme for å sterilisere. La det avkjøles i minst 2 minutter etter at flammen slukker for å unngå at varmen sjokkerer cellene.
    4. Plasser fire plater i nærheten av brenneren og fjern lokkene.
    5. Dypp replikatoren i 96-brønnsplaten og løft den opp i en rask bevegelse.
    6. Legg forsiktig på tallerkenen og vugg lett frem og tilbake for å legge til rette for en god overføring.
    7. Løft opp i en rask bevegelse og plasser i nøyaktig samme retning i 96-brønnsplaten.
    8. Gjenta for opptil tre andre plater. Gjenta prosessen med å dyppe replikatoren i etanol, flamme for å sterilisere og vente på å avkjøle hver fjerde plate.
    9. Etter at en plate er belagt, flytt med en jevn bevegelse til siden, men fortsatt innenfor flammens steriliseringsparaply.
      MERK: Det anbefales å gjøre gjærfortynninger og plating nær en flamme. Platene kan lett bli forurenset under tørking.
    10. La platene tørke helt før du legger lokkene på, vanligvis 3-5 min.
    11. Inkuber platene i 3 dager ved 30 °C.

4. Datainnsamling og analyse

  1. Fjern platene fra inkubatoren og inspiser dem visuelt.
  2. Ta opp bildene av platene med et tilgjengelig kamera eller annet digitalt bildesystem.
  3. Registrering (eller score) for hver stamme observeres den siste kobberkonsentrasjonens synlige vekst.
    MERK: Cellene er i stand til å spleise og forbli levedyktige frem til den konsentrasjonen. For konsistens, bruk alltid samme metode, enten med øye eller fra platebildene, for å score den siste levedyktige kobberkonsentrasjonen. Svært små kolonier er noen ganger synlige ved øyet, men ikke på bildet. Forskjellen mellom direkte visuell inspeksjon eller opptak fra bilder er liten, vanligvis et trinn i gradienten. Siden bilder av koloniene ofte brukes i publikasjoner, anbefales det å score etter bildene.
  4. Kombiner data fra flere ACT1-CUP1-analyser for samme belastning for å trekke konklusjoner om hvordan QSP påvirker skjøting.
    MERK: Publikasjonstall viser vanligvis bilder av gjærkoloniene ved 0 mM Cu2+ konsentrasjon, den siste levedyktige kobberkonsentrasjonen, og den påfølgende konsentrasjonen der kolonien er død. Data kan også vises som et stolpediagram med feilfelt for standardavviket mellom replikasjoner. Data trenger ikke å normaliseres, men kan være ved å sette levedyktigheten til WT-spleisingsfaktorkontrollen til 1 og sammenligne effekten av mutasjonen (e) introdusert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vekstanalyser, som ACT1-CUP1, krever visuell, komparativ vurdering av flere kolonier. Her ble hver stamme dyrket til metning over natten, fortynnet til en OD600 på 0,5, og belagt på 20 plater som inneholdt en rekke kobberkonsentrasjoner fra 0 mM til 1,1 mM CuSO4 (figur 3). Dette området er mindre enn det som er oppført i protokollen, da det tillot full vurdering av virkningen av QSP-ene og ACT1-CUP1-reporterne som brukes og beskrives nedenfor. Platene ble avbildet og skåret (figur 3 og tilleggstabell 3).

For dette representative eksperimentet inkluderer gjærbakgrunnen et forstyrret ADE2-gen , noe som resulterer i at koloniene er varierende nyanser av rødt (figur 3A, B). Denne vanlige gjærforstyrrelsen i adenosinproduksjonsveien forårsaker en opphopning av en rødpigmentert forløper for adenosin. Dermed er den røde fargen en indikator på gjærkoloniens modenhet (dvs. mengden og alderen til cellene som er tilstede). I forbindelse med en ACT1-CUP1-analyse kan den røde fargen tjene som en indikator på forurensende sopparter hvis den er hvit eller gul i fargen. Fargen kan være en sekundær bekreftelse på kobbertoleranse, da mer levedyktige kolonier vil være en dypere rød nyanse.

Ved plating med en pin-replikator er det flere vanlige avvik. For det første er det mulig å lage kolonier som er ovalformede hvis replikatoren løftes opp mens du beveger deg til venstre eller høyre (figur 3B, oransje pil). I tillegg kan mikrokolonier også dannes fra små dråper av celleoppløsning hvis pinnereplikatoren bringes inn i vinkel eller hvis den ristes over platen (figur 3B, rød pil). Ofte uskyldig, av og til, kan mikrokoloniene blande seg med en stemplet koloni, og dette forhindrer tolkning av den kolonien. Ytterligere pletteringsproblemer inkluderer utilstrekkelig ventetid etter sterilisering for at replikatorpinnene skal avkjøles og utilstrekkelig kontakt mellom platen og pinnene slik at dårlig overføring av kulturmediet oppstår. I begge tilfeller vil få, om noen, celler vokse på platen, inkludert for kontrollstammene som inneholder villtypereporteren. Som med enhver vekstanalyse, uavhengig av metoden for plating, er det viktig å utføre ACT1-CUP1 i tre eksemplarer for å bekrefte at resultatene er konsistente og repeterbare. Ideelt sett bør disse forskjellige replikasjonene utføres på kobberplater tilberedt på forskjellige tidspunkter for å sikre reproduserbarhet.

For disse representative eksperimentene ble A3c-reporteren valgt for å markere virkningen av en ikke-konsensussekvens på kobbertoleranse i fravær av ytterligere spliceosomforstyrrelser. A3c reduserer mengden CUP1 mRNA som produseres betydelig, da det forstyrrer spliceosomets evne til å gjenkjenne og utnytte 5 'SS15. Gjær med A3c-reporteren overlevde til 0,15 mM Cu2+, mens villtype-reportercellene opprettholdt levedyktigheten til slutten av området for kobberkonsentrasjoner som ble testet (figur 3C). Villtypereporteren som inneholder celler vokser til 2,5 mM Cu2+ uten innvirkning på levedyktigheten (data ikke vist).

U6 snRNA er en viktig katalytisk komponent i spliceosomet. Flere studier har brukt ACT1-CUP1 for å studere effekten mutasjoner kan ha på dette RNA 16,32,34. Duplisert for denne studien ble tre U6 snRNA-sekvenser studert, nemlig villtypesekvensen (WT), posisjon 57 substituert fra en uridin til en cytosin (U57c) og posisjon 57 substituert fra en uridin til en adenosin (U57a) (figur 3 og figur 4). Kombinert med ACT1-CUP1-reportere som påvirker de katalytiske trinnene i spleising, ble det bestemt at U57c favoriserer det første katalytiske trinnet, og U57a favoriserer progresjonen til andre trinn16,32.

For å sette opp for ACT1-CUP1-analysen ble det opprettet en stamme med den genomiske kopien av U6 snRNA slettet og U6 snRNA wild-type eller muterte sekvenser inkludert på plasmider. Siden U6 snRNA er en viktig komponent i cellen, ble tre separate transformasjoner brukt til først å slå ut det genomiske U6 snRNA samtidig som cellens levedyktighet opprettholdes, deretter introdusere muterte U6 snRNA på plasmider, og til slutt legge til ACT1-CUP1-reporterne. For den første transformasjonen ble en cup1Δ gjærstamme brukt i knock-out av genomisk kopi av U6 snRNA samtidig som WT U6 snRNA ble lagt til på et URA-seleksjonsmarkørplasmid for å opprettholde levedyktighet. En påfølgende transformasjon la til enten wild-type eller mutert U6 snRNA på et TRP-seleksjonsmarkørplasmid, og valgte mot URA-markøren via 5-FOA-seleksjon. Dermed ble det generert tre cup1Δ gjærstammer, hver med en av U6 snRNA-sekvensene, nemlig WT, U57a og U57c. En siste gjærtransformasjon for hver stamme la til en av de tre forskjellige ACT1-CUP1 reporterplasmidene som skal brukes i dette eksperimentet. Reporterne som ble valgt ut var den ville typen reporter, A3c, og en mutasjon av grenstedets adenosin til guanin (BS-G). Totalt ni stammer ble generert for dette eksperimentet, som hver inneholdt en U6 snRNA-sekvens og en ACT1-CUP1-reporter (tilleggstabell 4 og tilleggstabell 5).

Resultatene viste at de forskjellige basene ved U6 snRNA-posisjon 57 har unike effekter på spliceosomet i kombinasjon med en 5' SS- eller BS-mutasjon (figur 4). Både A3c- og BS-G-reporterne hemmer primært spleising ved å stabilisere den første katalytiske trinnkonformasjonen14,15. Dermed er U57c en additiv mutasjon som reduserer kobbertoleransen i kombinasjon med en av disse reporterne (figur 4B). I motsetning til dette øker U57a kobbertoleransen fordi den fremmer progresjon til det andre trinnet (figur 4B) 16,32. BS-G-reporterstammens reduserte kobbertoleranse med U57a sammenlignet med U6 snRNA WT fremhever en sannsynlig sekundær innvirkning av BS-G på det andre trinnet med spleising16.

Disse resultatene fremhever også den kvalitative karakteren til denne analysen og hvorfor spørrings- og reportersekvenser av villtype bør testes. Mens det generelle mønsteret av økt eller redusert kobbertoleranse gjelder for disse U6 snRNA-mutasjonene sammenlignet med villtype U6 snRNA, kan den nøyaktige konsentrasjonen av kobber som cellene overlever variere mellom studier (tabell 1) og varierte mellom disse representative dataene og andre publiserte resultater. Dette skyldes sannsynligvis bakgrunnen for stammen som inneholder CUP1-slettingen , men kan også skyldes den generelle helsen til stammene før plating (dvs. hvor snart etter generering av stammen eller restreak fra cryo analysen ble utført), forskjeller i hvordan platene fremstilles og variasjon mellom forskjellige inkubatorer. En lignende varians ble observert i Mayerle og medarbeidere for Prp8-spørringsmutasjoner i litteraturen43. Dermed kan sammenligning av kobbertoleransetrender utføres for forskjellige ACT1-CUP1-analyser, men den numeriske sammenligningen av kobberkonsentrasjonene bør bare gjøres innenfor samme laboratorium og til tider med samme sett med kobberplater.

Figure 1
Figur 1: ACT1-CUP1 reporter design. Konsentrasjonen av skjøtet reporter korrelerer direkte med gjær kobbertoleranse. Diagrammet over reporteren inkluderer de tre spleisestedene til 5'-spleisestedet (5' SS), grenstedet (BS) og 3'-spleisestedet (3' SS). Gjærkonsensussekvensene for disse stedene er vist, med de som er målrettet for spaltning angitt i fet skrift og nummerert basert på deres plassering i intronen. Vanlige ikke-konsensus ACT1-CUP1 reportersekvenser er vist i små bokstaver under deres tilsvarende konsensussekvensplasseringer og er oppført i tabell 1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Arbeidsflyt for ACT1-CUP1-analyse. For denne analysen må en gjærstamme være cup1Δ leu2 og inneholde ønsket ACT1-CUP1 reporter plasmid og QSP-genet, merket Gene i figuren. QSP-genet må enten settes inn genomisk eller på et plasmid. Protokollen ved hjelp av en pin-replikator innebærer fire trinn for å forberede gjærcellene. Trinn 1 er å vokse cellene til metning. Trinn 2 er å måle OD 600 av kulturen og fortynne til en OD600 på 0,5. Trinn 3 er å fordele over en 96-brønns plate. Trinn 4 er å plate på plater som inneholder økende konsentrasjoner av kobber (indikert med økende blå farge). Trinn 1, trinn 2 og trinn 4 vil være identiske for håndpipettering. Når platene er belagt, inkuberes de i 3 dager ved 30 °C og scores deretter for levedyktighet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Representative visninger av ACT1-CUP1-data. For dette eksperimentet blir gjærspliceosomer utfordret med to forskjellige U6 snRNA-mutasjoner og testet i nærvær av tre ikke-konsensusreportere. Tre kopier av denne analysen presenteres på de samme platene for demonstrasjonsformål. Det anbefales at denne analysen replikerer på separate plater og på separate dager. (A) En fullført analyse med en kobbergradient på 0 mM til 1,1 mM over 20 plater vises. Etter hvert som kobberkonsentrasjonen øker, viser stammer med lavere spleising redusert sammenløp til det punktet hvor kobberkonsentrasjonen blir dødelig. Gjærbakgrunnen var ade2, og dermed er modne kolonier røde i fargen. (B) Sammenligning av de samme platene ved 0 mM og 0,1 mM CuSO4 avbildet med et håndholdt kamera kontra et digitalt bildesystem. Dette er et eksempel på hvordan en rekke ikke-konsensusreportere kan sammenlignes side om side og med villtypereporteren. Vanlige observasjoner på plater inkluderer en falsk dråpe kulturmedier som falt fra pinnereplikatoren (rød pil) og svak ovaling av koloniene på grunn av glidning av tappen langs overflaten av platen eller bevegelse av platen før kulturdråpen har tørket tilstrekkelig (oransje pil). (C) Eksempel på A3c-reporterens effekt på cellens levedyktighet sammenlignet med villtypereporteren. Bilder som de som vises i (B) beskjæres og justeres for å markere vekstforskjellene ved forskjellige kobberkonsentrasjoner. Kobbertoleransen til A3c-reporterstammen reduseres til 0,15 mM Cu2+ sammenlignet med villtype-reporterstammens levedyktighet til slutten av det testede området. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Representative ACT1-CUP1-resultater som overvåker spleising i gjær med spleisingskomponentmutasjoner . (A) Skjematisk av RNA-komponentene på det aktive stedet umiddelbart etter det første katalytiske trinnet. U2 og U6 snRNA er duplekserte, noe som bringer 5 'SS og BS av intronen i umiddelbar nærhet. Den introniske bindingen mellom A259 (BS) og G1 (5' SS) er indikert med den oransje prikken. Plasseringen av ikke-konsensussekvenssubstitusjonene i ACT1-CUP1-reporteren som ble testet i dette eksperimentet, er angitt med fet svart. Den muterte posisjonen i U6 snRNA (U57) er i fet grønn, og de erstattede basene er i enten blå eller rosa. (B) En mulighet for presentasjon av ACT1-CUP1-data i en publikasjon inkluderer flere bilder av kolonier fra relevante Cu2+ -konsentrasjoner. WT-reporteren overlevde forbi kobberkonsentrasjonen som ble testet for alle de tre U6 snRNA-stammene som ble spurt. (C) Et søylediagram som sammenligner effektene per reporter og per U6 snRNA-mutant. Normalisering utføres for hver ACT1-CUP1-reporter ved å sette kobbertoleransen til U6 snRNA WT til 1 og beregne forholdet for U57c- og U57a-mutasjonene. Feilfelt representerer standardavviket fra tre replikasjoner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Ytterligere metoder for å komplimentere ACT1-CUP1-resultater. (A) Primerforlengelse utføres via en primerglødning i 3 'ACT1-eksonet og forlenger deretter inn i intronen. I dette eksemplet er primeren sluttmerket med IR700-fargestoff, og primerforlengelsen ble utført som beskrevet i 20,21. Primerforlengelse av U6 snRNA utføres i samme reaksjon for å tjene som en belastningskontroll. 7% 19: 1 bis / akrylamid, denatureringsgel løser pre-mRNA, mRNA og lariat-produktene etter primerforlengelse ved bruk av en nær infrarød gelavbildningsenhet som beskrevet i van der Feltz et al.22. Intensiteten til de forskjellige båndene kan brukes til å måle den totale skjøteeffektiviteten, samt skille skjøteforskjellene som oppstår ved første eller andre trinn, som kvantifisert med ImageJ44 eller annen gelbåndkvantifiseringsprogramvare. Både skjøteeffektiviteten og skjøtetrinnseffektiviteten beregnes som beskrevet i Query og Konarska14. (B) Mutasjonsskjermer med ACT1-CUP1-reportere kan bruke kobbervalg for å identifisere mutanter som påvirker spleising. Genet (e) av interesse kan deretter sekvenseres i de resulterende stammene for å avgjøre om mutasjonen skjedde i det genet. (C) Endringer kan gjøres til reporteren utenfor skjøtestedene for å overvåke spleiseendringer i forhold til intronstruktur, eksoniske sekvenser, antall eksoner eller kjernefysisk eksport av ikke-spleiset RNA. Regioner i grått er valgfrie utvidelsesregioner som skal inkluderes på en reporter, og områder i rødt er regioner der sekvensen og strukturelle endringer kan testes for deres potensielle innvirkning på skjøting ved hjelp av ACT1-CUP1-analysen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Reporter navn Intronic-regionen Sekvens Siste levedyktige Cu2+ konsentrasjon (mM)
WT 5' GUAUGU > 2.5
G1a 5ʹ en UAUGU 0,0133 eller 0,0532
A3C 5ʹ GUcUGU 0,15^,18 eller 0,216
G5a 5ʹ GUAUaU 0,303 eller 0,259
WT Filial-sted UACUAAC > 2.5
C256a Filial-sted UAaUAAC 0,1526 eller 0,1832
U257c/a Filial-sted UACc / aAAC 0,226 eller 0,332 eller 0,545 0,059,32
A258c/u Filial-sted UACUc / uAC 0,826 1,045 eller 1,646
BS-C Filial-sted UACUAcC 0,153 eller 0,1832,56 eller 0,2 26
BS-G Filial-sted UACUAgC 0,0516,32 eller 0,625 eller 0,846
C260g Filial-sted UACUAAg 0,826
WT 3' UAG > 2.5
U301g 3ʹ G AG 0,1518
A302g/u 3' Ug/uG 0.0139 0,07516 eller 0,1824
G303c 3ʹ UAc 0,0532

Tabell 1: Liste over vanlige reportere og rapportert letalitet i Cu2+-konsentrasjonen. Det er over 100 sitater av Lesser og Guthrie3. Mens et lite utvalg av disse sitatene ble brukt til å lage denne tabellen, fremhever de den generelle trenden med små til moderate forskjeller mellom studier i rapporterte kobber levedyktighetskonsentrasjoner. I ACT1-CUP1 er det viktig å sammenligne villtypeprotein eller RNA med mutantene med samme gjærstammebakgrunn ved å bruke de publiserte konsentrasjonene som en veiledning, men i påvente av at de observerte konsentrasjonene kan variere. Data samlet fra figur 3 (^) og flere publikasjoner kommentert med følgende sitater 3,9,16,18,24,25,26,32,45,46.

Tilleggstabell 1: Innholdet i en enkelt kobberplate og et eksempel på beregninger gjort for å oppnå kobberfortynninger fra 0 mM til 2,5 mM fra en 1 M CuSO4-lager . Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Supplerende tabell 2: Eksempel på et pletteringsskjema for 48-pinners replikatoren. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Supplerende tabell 3: Eksempel på levedyktighet skåret fra kobberplater inkubert i 3 dager ved 30 °C. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Supplerende tabell 4: Liste over gjærstammer som brukes til å generere representative data. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Supplerende tabell 5: Liste over plasmider som brukes til å generere de representative dataene. U6 snRNA-plasmider generert og publisert i tidligere forskning22,47. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ACT1-CUP1 er en vekstanalyse, og det må tas hensyn til at observerte vekstforskjeller kun kan tilskrives skjøtefeil. Alle belastninger skal håndteres på lignende måte før plating, inkludert å ha en lignende lengde og type vekst og lagringsforhold. Hvis du bruker temperaturfølsomme stammer, bør ACT1-CUP1-analyser bare utføres under forhold der disse stammene vokser sammenlignbart med villtype. Tilsvarende, for QSP-komponenten, anbefales det å ha identiske gjærbakgrunner og ekspresjonsnivåer av QSP-gen (er) for ikke å skygge tolkningen av resultatene. Når man vurderer antall QSP-er og reportere som skal brukes, anbefales det ikke å analysere mer enn 30 stammer om gangen med pinnereplikatormetoden. Med den ekstra tiden til å utføre hvert trinn, vil cellene bosette seg, og analyseresultatene vil være inkonsekvente på grunn av redusert celle levedyktighet.

I tillegg til begrensningene ACT1-CUP1 iboende har som vekstanalyse, kan en QSP ha en mer kompleks innvirkning på spleising enn det som kan løses med denne metoden. Siden spleising er en flertrinnsprosess og faktorer resirkuleres, kan den observerte fenotypen resultere i at forstyrrelsen påvirker mer enn ett skjøtetrinn. Dette gjelder selv for de påfølgende analysene som kan følge opp ACT1-CUP1, hvorav noen er beskrevet nedenfor. Dataene vil fremheve det mest forstyrrede trinnet i prosessen, selv om andre trinn kan påvirkes av den endrede funksjonen til skjøtefaktoren.

Primerforlengelse av ACT1-CUP1-reportere ble først brukt i Lesser og Guthries originale papir og utføres ofte hvis ACT1-CUP1-resultatene viser en vekstfeil3. Denne analysen retter seg mot reporteren og bruker lengden på PCR-produktene til å bestemme de relative mengdene av uspleisede, delvis skjøtede og fullt skjøtede reporter tilstede (figur 5A). Samlet skjøteeffektivitet og om feilen påvirker det første eller andre katalytiske trinnet sterkere beregnes ved å ta forholdstall for PCR-produktmengdene14. For eksempel har 5 'SS reporter G5a redusert spleising sammenlignet med wild-type reporteren, men dens første og andre trinns effektivitet følger et lignende mønster som wild-type (figur 5A). Dette peker mot en defekt før det første katalytiske trinnet, muligens i spleiseosommontering, fordi begge trinnene påvirkes på samme måte31.

Nye analyser er utviklet fra den kanoniske ACT1-CUP1-analysen, for eksempel screening for mutanter som forbedrer spleising i nærvær av andre spleisingsfaktormutanter og/eller ikke-konsensus spleisingssekvenser (figur 5B). For eksempel, å utsette gjær som inneholder ACT1-CUP1-reporteren for UV og deretter velge i nærvær av kobber, ga Prp8- og Hsh155-mutanter som forbedret spleisingen av ikke-konsensussekvenser14,19.

Ved å utvide forbi studien av effekten av spleisesteder og konstitutive spleisingsfaktorer, har CUP1-vekstavhengighet blitt brukt til å studere flere intronspleising, kjernefysisk eksportkontroll og virkningen av UTR og andre perifere sekvenser på spleising (figur 5C). Noen av disse studiene har skapt reportere med CUP1 og andre intronholdige gjærgener som kan ha mer komplekse spleisingsmønstre for å studere effekten på intronisk sekundær struktur og multi-intron-transkripsjonsspleising 48,49,50,51,52. Koblingen mellom spleising og kjernefysisk eksport ble studert ved å ha enten skjøtede eller uspleisede transkripsjoner som koder for CUP1 i ramme53,54. Lengden på pyrimidinsporet og spleisestedets avstandsavhengighet på grunn av spesifikke faktorer er også testet 20,55,56,57. Disse eksemplene og mange andre fremhever allsidigheten til ACT1-CUP1 og andre CUP1-vekstanalyser.

ACT1-CUP1-analysen knytter forstyrrelser til en kompleks reaksjonssyklus med en enkel vekstfenotype med et bredt følsomhetsområde. Denne eldre analysen har blitt brukt av flere laboratorier for å legge grunnlaget for forståelsen av skjøtesyklusen. Mer nylig har ACT1-CUP1 blitt brukt til å svare på spørsmål som oppstår fra mengden strukturelle data som nå er tilgjengelige21,22,25. Strukturelle studier av spliceosomer bundet til ikke-konsensussekvenser kan pares med ACT1-CUP1-resultater for å tolke hvordan endret struktur og endret funksjon korrelerer. ACT1-CUP1 er en ideell første skjerm for spleising av mutasjoner som kan utfylle mer kompleks analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatteren har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Takk til Aaron Hoskins og Hoskins lab medlemmer ved University of Wisconsin-Madison for bruk av gjær stammer og utstyr i genereringen av tallene 3-5. Takk til Harpreet Kaur og Xingyang Fu for innsiktsfulle kommentarer til manuskriptet. Takk til støttende studenter, ansatte og fakultet ved Northwest University under skriving, redigering og filming av dette papiret. Takk til Isabelle Marasigan for hjelp til å filme denne metoden.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL sterile microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-129 Or comparable item from a different manufacturer.
2 mL sterile microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-138 Or comparable item from a different manufacturer.
50 mL sterile centrifuge tubes Fisher Scientific 07-201-332 Or comparable item from a different manufacturer.
96-well round bottom microplate Fisher Scientific 07-200-760 Or comparable item from a different manufacturer.
190 proof ethanol Fisher Scientific 22-032-600 Or comparable item from a different manufacturer.
500 mL Filter System (0.22 µm) CellTreat Scientific Products 229707 Or comparable item from a different manufacturer.
Agar Fisher Scientific BP1423-500 Any molecular grade agar will work.
Autoclave Tuttnauer 3870EA Or comparable item from a different manufacturer.
Bunsen burner Humboldt PN6200.1 Or comparable item from a different manufacturer.
Cell Density Meter VWR 490005-906 Or other spectral device that can measure absorbance at 595 nm.
Copper sulfate Pentahydrate Fisher Scientific LC134051 Or comparable item from a different manufacturer.
Digital imaging system Cytiva 29399481 ImageQuant 4000 (used for Figure 3),  Amersham ImageQuant 800, or comparable item from a different manufacturer.
Dropout mix (-Leu) USBiological Life Sciences D9525 Use the appropriate drop out mix for your experiment. It is possible you will be using a yeast nutrient marker for your query perturbation also. In that case, the drop out mix should be for that marker and Leu
D-Glucose Fisher Scientific AAA1682836 Or comparable item from a different manufacturer.
Gel band quantifying software Cytiva 29-0006-05 ImageQuant TL v8.1 (used for figure 5A) or comparable item from a different manufacturer.
Hand held camera Nikon D3500 Or comparable item from a different manufacturer.
Near infra-red gel imaging device Cytiva 29238583 Amersham Typhoon NIR (used for Figure 5a) or comparable item from a different manufacturer.
Laboratory grade clamp Fisher Scientific 05-769-7Q Or comparable item from a different manufacturer.
Laboratory grade stand and clamp Fisher Scientific 12-000-101 Or comparable item from a different manufacturer.
Magnetic stir bars Fisher Scientific 14-513-51 Or comparable item from a different manufacturer.
Pin replicator VP Scientific VP 407AH
Semi-micro disposable cuvettes VWR 97000-590 Or comparable item from a different manufacturer.
Shaker JEIO Tech IST-3075 Or comparable item from a different manufacturer.
Spectrophotometer Biowave 80-3000-45 Or any spectophotometer that can measure the absorbance at 600 nm.
Square plates VWR 102091-156 Circular plates may also be used though are more challenging if using a pin replicator.
Stir plate Fisher Scientific 11-520-16S Or comparable item from a different manufacturer.
Yeast nitrogen base USBiological Life Sciences Y2025 Or comparable item from a different manufacturer.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wahl, M. C., Will, C. L., Luhrmann, R. The spliceosome: Design principles of a dynamic RNP machine. Cell. 136 (4), 701-718 (2009).
  2. Wilkinson, M. E., Charenton, C., Nagai, K. RNA splicing by the spliceosome. Annual Review of Biochemistry. 89, 359-388 (2020).
  3. Lesser, C. F., Guthrie, C. Mutational analysis of pre-mRNA splicing in Saccharomyces cerevisiae using a sensitive new reporter gene, CUP1. Genetics. 133 (4), 851-863 (1993).
  4. Ng, R., Abelson, J. Isolation and sequence of the gene for actin in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (7), 3912-3916 (1980).
  5. Gallwitz, D., Sures, I. Structure of a split yeast gene: Complete nucleotide sequence of the actin gene in I. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (5), 2546-2550 (1980).
  6. Fogel, S., Welch, J. W., Cathala, G., Karin, M. Gene amplification in yeast: CUP1 copy number regulates copper resistance. Current Genetics. 7 (5), 347-355 (1983).
  7. Hamer, D. H., Thiele, D. J., Lemontt, J. E. Function and autoregulation of yeast copperthionein. Science. 228 (4700), 685-690 (1985).
  8. Winge, D. R., Nielson, K. B., Gray, W. R., Hamer, D. H. Yeast metallothionein. Sequence and metal-binding properties. Journal of Biological Chemistry. 260 (27), 14464-14470 (1985).
  9. Burgess, S. M., Guthrie, C. A mechanism to enhance mRNA splicing fidelity: The RNA-dependent ATPase Prp16 governs usage of a discard pathway for aberrant lariat intermediates. Cell. 73 (7), 1377-1391 (1993).
  10. Collins, C. A., Guthrie, C. Allele-specific genetic interactions between Prp8 and RNA active site residues suggest a function for Prp8 at the catalytic core of the spliceosome. Genes & Development. 13 (15), 1970-1982 (1999).
  11. Siatecka, M., Reyes, J. L., Konarska, M. M. Functional interactions of Prp8 with both splice sites at the spliceosomal catalytic center. Genes & Development. 13 (15), 1983-1993 (1999).
  12. Umen, J. G., Guthrie, C. Mutagenesis of the yeast gene PRP8 reveals domains governing the specificity and fidelity of 3' splice site selection. Genetics. 143 (2), 723-739 (1996).
  13. Grainger, R. J., Beggs, J. D. Prp8 protein: At the heart of the spliceosome. RNA. 11 (5), 533-557 (2005).
  14. Query, C. C., Konarska, M. M. Suppression of multiple substrate mutations by spliceosomal prp8 alleles suggests functional correlations with ribosomal ambiguity mutants. Molecular Cell. 14 (3), 343-354 (2004).
  15. Konarska, M. M., Vilardell, J., Query, C. C. Repositioning of the reaction intermediate within the catalytic center of the spliceosome. Molecular Cell. 21 (4), 543-553 (2006).
  16. Liu, L., Query, C. C., Konarska, M. M. Opposing classes of prp8 alleles modulate the transition between the catalytic steps of pre-mRNA splicing. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (6), 519-526 (2007).
  17. MacRae, A. J., et al. Prp8 positioning of U5 snRNA is linked to 5' splice site recognition. RNA. 24 (6), 769-777 (2018).
  18. Query, C. C., Konarska, M. M. CEF1/CDC5 alleles modulate transitions between catalytic conformations of the spliceosome. RNA. 18 (5), 1001-1013 (2012).
  19. Tang, Q., et al. SF3B1/Hsh155 HEAT motif mutations affect interaction with the spliceosomal ATPase Prp5, resulting in altered branch site selectivity in pre-mRNA splicing. Genes & Development. 30 (24), 2710-2723 (2016).
  20. Carrocci, T. J., Zoerner, D. M., Paulson, J. C., Hoskins, A. A. SF3b1 mutations associated with myelodysplastic syndromes alter the fidelity of branchsite selection in yeast. Nucleic Acids Research. 45 (8), 4837-4852 (2017).
  21. Kaur, H., Groubert, B., Paulson, J. C., McMillan, S., Hoskins, A. A. Impact of cancer-associated mutations in Hsh155/SF3b1 HEAT repeats 9-12 on pre-mRNA splicing in Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 15 (4), 0229315 (2020).
  22. vander Feltz, C., et al. Saccharomyces cerevisiae Ecm2 modulates the catalytic steps of pre-mRNA splicing. RNA. 27 (5), 591-603 (2021).
  23. Carrocci, T. J., Paulson, J. C., Hoskins, A. A. Functional analysis of Hsh155/SF3b1 interactions with the U2 snRNA/branch site duplex. RNA. 24 (8), 1028-1040 (2018).
  24. Hogg, R., de Almeida, R. A., Ruckshanthi, J. P., O'Keefe, R. T. Remodeling of U2-U6 snRNA helix I during pre-mRNA splicing by Prp16 and the NineTeen Complex protein Cwc2. Nucleic Acids Research. 42 (12), 8008-8023 (2014).
  25. Hansen, S. R., Nikolai, B. J., Spreacker, P. J., Carrocci, T. J., Hoskins, A. A. Chemical inhibition of pre-mRNA splicing in living Saccharomyces cerevisiae. Cell Chemical Biology. 26 (3), 443-448 (2019).
  26. Xu, Y. Z., Query, C. C. Competition between the ATPase Prp5 and branch region-U2 snRNA pairing modulates the fidelity of spliceosome assembly. Molecular Cell. 28 (5), 838-849 (2007).
  27. Staley, J. P., Guthrie, C. An RNA switch at the 5' splice site requires ATP and the DEAD box protein Prp28p. Molecular Cell. 3 (1), 55-64 (1999).
  28. Bousquet-Antonelli, C., Presutti, C., Tollervey, D. Identification of a regulated pathway for nuclear pre-mRNA turnover. Cell. 102 (6), 765-775 (2000).
  29. Villa, T., Guthrie, C. The Isy1p component of the NineTeen complex interacts with the ATPase Prp16p to regulate the fidelity of pre-mRNA splicing. Genes & Development. 19 (16), 1894-1904 (2005).
  30. Mayas, R. M., Maita, H., Staley, J. P. Exon ligation is proofread by the DExD/H-box ATPase Prp22p. Nature Structure and Molecular Biology. 13 (6), 482-490 (2006).
  31. Lesser, C. F., Guthrie, C. Mutations in U6 snRNA that alter splice site specificity: Implications for the active site. Science. 262 (5142), 1982-1988 (1993).
  32. McPheeters, D. S. Interactions of the yeast U6 RNA with the pre-mRNA branch site. RNA. 2 (11), 1110-1123 (1996).
  33. Perriman, R. J., Ares, M. Rearrangement of competing U2 RNA helices within the spliceosome promotes multiple steps in splicing. Genes & Development. 21 (7), 811-820 (2007).
  34. Mefford, M. A., Staley, J. P. Evidence that U2/U6 helix I promotes both catalytic steps of pre-mRNA splicing and rearranges in between these steps. RNA. 15 (7), 1386-1397 (2009).
  35. Hilliker, A. K., Mefford, M. A., Staley, J. P. U2 toggles iteratively between the stem IIa and stem IIc conformations to promote pre-mRNA splicing. Genes & Development. 21 (7), 821-834 (2007).
  36. Wu, G., et al. Pseudouridines in U2 snRNA stimulate the ATPase activity of Prp5 during spliceosome assembly. EMBO Journal. 35 (6), 654-667 (2016).
  37. Crotti, L. B., Bacikova, D., Horowitz, D. S. The Prp18 protein stabilizes the interaction of both exons with the U5 snRNA during the second step of pre-mRNA splicing. Genes & Development. 21 (10), 1204-1216 (2007).
  38. Fogel, S., Welch, J. W. Tandem gene amplification mediates copper resistance in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (17), 5342-5346 (1982).
  39. Gardner, J. M., Jaspersen, S. L. Manipulating the yeast genome: Deletion, mutation, and tagging by PCR. Methods Molecular Biology. 1205, 45-78 (2014).
  40. JoVE. Yeast Transformation and Cloning. In Biology I: yeast, Drosophila and C. Elegant. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2021).
  41. Gietz, R. D., Woods, R. A. Yeast transformation by the LiAc/SS Carrier DNA/PEG method. Methods Molecular Biology. 313, 107-120 (2006).
  42. Gietz, R. D., Woods, R. A. Genetic transformation of yeast. Biotechniques. 30 (4), 816 (2001).
  43. Mayerle, M., et al. Structural toggle in the RNaseH domain of Prp8 helps balance splicing fidelity and catalytic efficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 4739-4744 (2017).
  44. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  45. Beier, D. H., et al. Dynamics of the DEAD-box ATPase Prp5 RecA-like domains provide a conformational switch during spliceosome assembly. Nucleic Acids Research. 47 (20), 10842-10851 (2019).
  46. vander Feltz, C., DeHaven, A. C., Hoskins, A. A. Stress-induced pseudouridylation alters the structural equilibrium of yeast U2 snRNA Stem II. Journal of Molecular Biology. 430 (4), 524-536 (2018).
  47. Rodgers, M. L., Didychuk, A. L., Butcher, S. E., Brow, D. A., Hoskins, A. A. A multi-step model for facilitated unwinding of the yeast U4/U6 RNA duplex. Nucleic Acids Research. 44 (22), 10912-10928 (2016).
  48. Stutz, F., Rosbash, M. A functional interaction between Rev and yeast pre-mRNA is related to splicing complex formation. EMBO Journal. 13 (17), 4096-4104 (1994).
  49. Libri, D., Lescure, A., Rosbash, M. Splicing enhancement in the yeast rp51b intron. RNA. 6 (3), 352-368 (2000).
  50. Libri, D., Stutz, F., McCarthy, T., Rosbash, M. RNA structural patterns and splicing: Molecular basis for an RNA-based enhancer. RNA. 1 (4), 425-436 (1995).
  51. Howe, K. J., Kane, C. M., Ares, M. Perturbation of transcription elongation influences the fidelity of internal exon inclusion in Saccharomyces cerevisiae. RNA. 9 (8), 993-1006 (2003).
  52. Cuenca-Bono, B., et al. SUS1 introns are required for efficient mRNA nuclear export in yeast. Nucleic Acids Research. 39 (19), 8599-8611 (2011).
  53. Scherrer, F. W., Spingola, M. A subset of Mer1p-dependent introns requires Bud13p for splicing activation and nuclear retention. RNA. 12 (7), 1361-1372 (2006).
  54. Hálová, M., et al. Nineteen complex-related factor Prp45 is required for the early stages of cotranscriptional spliceosome assembly. RNA. 23 (10), 1512-1524 (2017).
  55. Umen, J. G., Guthrie, C. A novel role for a U5 snRNP protein in 3' splice site selection. Genes & Development. 9 (7), 855-868 (1995).
  56. Crotti, L. B., Horowitz, D. S. Exon sequences at the splice junctions affect splicing fidelity and alternative splicing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 18954-18959 (2009).
  57. Perriman, R., Ares, M. Invariant U2 snRNA nucleotides form a stem loop to recognize the intron early in splicing. Molecular Cell. 38 (3), 416-427 (2010).

Tags

Genetikk pre-mRNA spleising Saccharomyces cerevisiae spliceosome ACT1-CUP1 vekst analyse genetisk skjerm mutant skjerm ikke-konsensus sekvens
ACT1-CUP1-analyser bestemmer substratspesifikke følsomheter for spliceosomale mutanter i spirende gjær
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

van der Feltz, C. ACT1-CUP1 Assays… More

van der Feltz, C. ACT1-CUP1 Assays Determine the Substrate-Specific Sensitivities of Spliceosomal Mutants in Budding Yeast. J. Vis. Exp. (184), e63232, doi:10.3791/63232 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter