Summary
在这里，我们提出了一种改进的趋化性测定方案。该协议的目标是减少传统细菌趋化性方法的步骤和成本，并作为理解植物 - 微生物相互作用的宝贵资源。
Abstract
趋化性鉴定对于根际生长促进菌的研究与应用具有重要意义。我们建立了一种简单的方法来快速鉴定 可以通过简单的步骤 在无菌载玻片上诱导根际生长促进细菌的趋化运动的化学引诱剂。细菌溶液（OD600 = 0.5）和无菌化学引诱剂水溶液以1cm的间隔滴加在载玻片上。使用接种回路将化学引诱剂水溶液连接到细菌溶液。将载玻片在室温下在干净的工作台上保持20分钟。最后，收集化学引诱剂水溶液进行细菌计数和显微镜观察。本研究通过对实验结果的多重比较，克服了传统细菌趋化性方法的多重缺点。该方法降低了计板误差，缩短了实验周期。对于化学引诱物质的鉴定，与传统方法相比，这种新方法可以节省2-3天。此外，这种方法允许任何研究人员在1-2天内系统地完成细菌趋化性实验。该协议可以被认为是理解植物 - 微生物相互作用的宝贵资源。
Introduction
趋化性对于植物根系上促进生长的根际细菌（PGPR）的定植和理解植物 - 微生物相互作用非常重要1。植物根系分泌物中的一类低分子量化合物（化学引诱剂）诱导PGPR向根际的趋化运动2。根系分泌物中的苹果酸、柠檬酸和其他成分刺激芽孢杆菌菌株的趋化性3。例如，玉米根系分泌物中的葡萄糖、柠檬酸和富马酸将细菌招募到根部表面4。D-半乳糖来源于根系分泌物，诱导黄芽孢杆菌SQR95的趋化性。有机酸，包括富马酸盐、苹果酸和琥珀酸盐，会影响Cajanus cajan - Zea mays间作系统中各种PGPR的趋化性和定植6。水稻根系分泌物中的齐墩果酸可作为菌株FP357的化学引诱剂。其他植物渗出物（包括组氨酸、精氨酸和天冬氨酸）可在细菌的趋化反应中起至关重要的作用8。植物分泌物作为引导细菌运动的信号，这是根际定植的第一步。PGPR的植物定植是一个具有巨大相关性的过程，因为PGPR对植物宿主有益。
许多方法已被用于分析细菌趋化性。游泳板法是前面描述的方法之一9。在这种方法中，用半固体介质制成板。将含有琼脂（1.0%，w / v）的趋化缓冲液加入平板中。将缓冲液加热，然后与化学吸引剂混合。然后，将8μL细菌悬浮液滴入板的中间，并将板置于28°C的培养箱中。 该板材定期被观察和拍照。然而，游泳板法的实验周期非常长。在毛细管样方法10中，移液器吸头用作容纳100μL细菌悬浮液的腔室。1 mL注射器针头用作毛细管。将含有具有不同浓度梯度的化学吸引剂的注射器针头插入100μL移液器尖端。在室温下孵育3小时后，取出注射器针头，稀释内容物并镀在培养基上。注射器中的细菌积累由板中的集落形成单元（CFU）表示。然而，类似毛细管的方法的重复实验误差很大。另一种方法使用微流体滑片装置11。简而言之，将牛血清白蛋白（BSA）溶液注射到所有通道中并使用真空除去。将含有不同化学引诱剂（仅定性检测的1 mM浓度）、悬浮在磷酸盐缓冲盐水和磷酸盐缓冲液中的细菌细胞（阴性对照）的溶液分别加入到顶部、中间和底部微孔中。然后在室温下的黑暗环境中孵育30分钟。然后在微孔中检测到细菌细胞。然而，微流体SlipChip设备很昂贵。因此，上述每种方法都有优点和缺点。
我们建立了一种改进的趋化性测定法，用于使用无菌载玻片快速鉴定根系分泌物中的根际细菌化学引诱剂，而无需复杂的步骤。本研究通过对实验结果的多重比较，克服了传统细菌趋化性方法的多重缺点。该方法降低了计板误差，缩短了实验周期。因此，如果用于鉴定化学引诱剂物质，这种新方法可以节省2-3天并降低实验材料的成本。
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Protocol
1. 材料和设备
注：从东北水稻根际中分离出 高山芽孢杆菌 LZP02（CP075052）12，13 。
- 文化 B. 山茱萸 LZP02在卢里亚 - 贝尔塔尼（LB）培养基（蛋白胨，10克L-1;NaCl，8克L-1 和酵母提取物，5克L-1）10小时。通过在4°C下以9，569× g 离心2分钟收集细胞，并在-80°C下用15%甘油储存。
注：本实验中，水稻种子（米 苜蓿龙莘46）由黑龙江省农业科学院水稻研究所提供。
2. 根系分泌物的收集
- 在生长室中随机分配水稻种子。
注意：将稻种子用30%H 2O 2 灭菌30分钟，并在水中浸泡过夜。条件如下：受控光（16/8 h光/暗循环），温度（22±2°C）和相对湿度（͂70%）。 - 将水稻种子培养一周，并加入无菌水两次。
- 选择大小相似的水稻幼苗，并将植物种植在50 mL的Murashige和Skoog（MS）液体培养基中。在无菌条件下在22°C下孵育48小时。
注意：水稻根系分泌物将释放到MS培养基中14，15，16。
3. 根系分泌物的液相色谱-质谱分析
- 在1.5mL离心管中收集100μL样品（含有根系分泌物的MS培养基）。加入20μL提取溶剂（乙腈 - 甲醇 - 水，2：2：1，包括内标）。将样品以45 Hz匀浆4分钟，然后在水浴中在冰上超声超声5分钟。
- 重复均质化和超声波循环三次。将样品在-20°C孵育1小时，然后在133，778× g 和4°C下离心15分钟。
- 将所得上清液转移到LC-MS小瓶中并储存在-80°C直至UHPLC-QE分析。通过混合所有样品的上清液的相等部分来制备质量控制（QC）样品。
注意：在所提出的实验中，每个样品体积为600μL（每个实验六次重复）。 - 使用 UHPLC 系统、UPLC HSS T3 色谱柱（2.1 mm x 100 mm，1.8 μm）和 Q Exactive12 执行 LC-MS/MS 分析。
- 使用0.1%甲酸水溶液和5 mmol/L乙酸铵水溶液作为流动相A，乙腈作为流动相B.分别使用甲酸和乙酸铵作为正负离子模式。
- 设置洗脱梯度如下：0分钟，1%B;1分钟， 1% B;8分钟， 99% B. 10分钟， 99% B. 10.1分钟， 1% B;12分钟，1%B.将流速和注射体积分别设置为0.5 mL / min和2μL。
注：无法检测到大分子（>1，000道尔顿）。
4. 趋化性测定
- 制备化学引诱剂水溶液。确保它是无菌的。用0.22μm细菌过滤器过滤化学吸引剂溶液。
注：化学引诱剂水溶液是从LC-MS研究中获得的溶解在水中的单一物质。浓度和体积可以根据不同的研究进行适当调整。以柠檬酸溶液为例。所有操作都必须由灯的侧面执行。 - 以1厘米的间隔标记载玻片的中间位置。确保载玻片在火焰上灭菌多次。
- 在载玻片的左侧加入30μL化学引诱剂溶液。确保将细菌培养到LB培养基中的对数阶段（2 x 108 CFU / mL）。在载玻片的右侧加入30μL细菌溶液。
注意：准备一个阴性对照组，用等体积的无菌水。以生理盐水溶液（0.9%NaCI）为阳性对照，以消除实验中分子间力引起的变化。 - 在火焰上对接种回路进行多次灭菌。使用接种回路将化学引产剂水溶液连接到细菌溶液，并将其在室温下在干净的工作台上保持20分钟。
注意：实验必须在无风环境中进行。在断开连接线之前，请适当调整不同运动能力的压力之前的时间。 - 20分钟后，用滤纸断开连接线。
- 确保 1.5 mL 离心管无菌。收集载玻片左侧的化学引诱剂水溶液。将溶液转移到1.5mL无菌离心管中。
- 将适量的萨夫兰宁加入离心管中。2分钟后，收集可混溶液体用于计数细菌和用血液计数室进行显微镜观察。
5. 结果分析
- 使用以下等式确定吸引的活微生物的数量：
其中NBC：细菌细胞总数;N：80个网格中的细菌数量。
注：统计分析软件用于数据分析。该误差基于三个不同的重复实验值，并使用单因子方差分析进行计算，然后进行土耳其的事后分析。 P ≤ 0.05 被认为是显著的。
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Representative Results
在阳性和阴离子指数中分别检测到584种和937种已知代谢物。先前的研究表明，化学引诱剂通常是有机酸，氨基酸和碳水化合物17，18。
本研究选取了水稻根际渗出物中LC-MS研究中的16种化学引诱剂进行后续实验（表1）。使用游泳板法，我们筛选了根分泌的低分子量化合物，以寻找根际 B. altitudinis LZP02的引诱剂。为了比较不同化学引诱剂的强度，引入了趋化性指数（RCI），该指数显示了平均治疗细菌与相应对照的比率19。较高的RCI表明对化学引诱剂的反应更强。结果表明，100μM柠檬酸（RCI = 2.34）和100μM咖啡酸（RCI = 1.85）具有最高的趋化指数（图2）。代表性图像显示，与CK相比，柠檬酸和咖啡酸的聚集区域更多（图3）。
使用新的趋化性测定方法（图1），结果显示柠檬酸，咖啡酸和半乳糖实验（100μM）的细菌浓度显着高于阴性和阳性对照组。柠檬酸是最强的化学引诱剂。实验结果（图4 和 表2）与传统游泳板法的结果一致（图2）。新的趋化性测定的代表性微观图像如图 5所示。
与游板法相比，我们的结果证实了新的趋化性测定的可行性。该技术可以节省大量时间，降低试剂成本并减少结果错误。新方法的结果是直观的，并且该方法显示了细菌的运动性。
图1：新的趋化性测定示意图。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：游泳板法的结果。 （A） B的趋化反应。 山茱萸 LZP02增加有机酸，酚酸和碳水化合物的浓度。（B） B的趋化反应。 山茱萸 LZP02增加氨基酸的浓度。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：游泳板法的结果。 B. 的趋化反应比较。山茱萸LZP02趋向于有机酸。请点击此处查看此图的放大版本。
图4：新的趋化性测定方法的结果。 NBC：细菌细胞的总数。 B. 的趋化反应 山茱萸 LZP02增加柠檬酸，咖啡酸和半乳糖的浓度。结果表示为每次测定至少三次测定的平均值。误差线根据三个不同的复制实验值指示SD。根据单因子方差分析，由不同字母标识的列在 P≤0.05处显着不同，然后是土耳其的事后分析。 请点击此处查看此图的放大版本。
图5：新的趋化性测定方法的结果。 这些图像是在光学显微镜下获得的。（A）CK，（B）盐水溶液，（C）柠檬酸。 请点击此处查看此图的放大版本。
| 指数 | 名字 | 得分 | 丰富 |
| 邮编01062 | 柠檬酸 | 0 | 200471.6 |
| NEG00016 | 苹果酸 | 0.9944492 | 2093440.97 |
| NEG00038 | 2，5-二羟基苯甲酸 | 0.8886685 | 114774.98 |
| 邮编01763 | 咖啡酸 | 0 | 6195.5 |
| 邮编00154 | 阿魏酸 | 0.4725294 | 12723.95 |
| 邮编02156 | 果糖 | 0 | 6767.81 |
| 邮编01289 | 半乳糖 | 0 | 871476.14 |
| NEG00021 | 甘露糖 | 0.9898174 | 683176.34 |
| 邮编00037 | 缬氨酸 | 0.9660872 | 5985865.24 |
| 邮编00018 | 脯氨酸 | 0.9887274 | 2739147.17 |
| 邮编00124 | 苯丙氨酸 | 0.6106034 | 11940645.8 |
| 邮编：00092 | 甘氨酸 | 0.7418478 | 22787114.1 |
| 邮编00079 | 苏氨酸 | 0.8086754 | 1039040.18 |
| NEG00010 | 亮氨酸 | 0.9962673 | 3546561.95 |
| 邮编00266 | 组氨酸 | 0 | 3010220.41 |
| 邮编01993 | 丝氨酸 | 0 | 645602.04 |
| 注意：第一列中的 POS 和 NEG 分别表示正负离子指数。第三列表示，使用二级谱对数据库匹配进行评分，未分级的化学引诱剂与一阶谱匹配。分数范围从 0 到 1。 | |||
表1： 水稻根际渗出物中LC-MS研究中的16种化学引诱剂。
| 化学引诱剂 | 断续器 |
| 氯化钠 | 1.95±0.03 |
| 柠檬酸 | 3.63±0.12 |
| 咖啡酸 | 2.71±0.26 |
| 半乳糖 | 2.56±0.16 |
表 2： 新的趋化性测定方法的趋化性指数（RCI）。
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Discussion
越来越多的研究表明，植物与细菌的相互作用主要发生在根际，并受根系分泌物的影响20，21，22，23，24。植物根系分泌物包括多种初级代谢物，包括酚酸、有机酸和氨基酸以及更复杂的二次化合物25、26、27。对于每种细菌，特定物质已被证明在根际渗出物中具有招募作用。在该研究领域，文献中报道的许多趋化性方法都高度依赖于测定。有关于各种方法的报告，这些方法都有特定的优点和缺点。
在本研究中，我们专注于引入一种改进的趋化性测定，以快速鉴定根系分泌物中的根际细菌化学引诱剂。在该协议中，所有实验都是在无菌条件下进行的。在步骤4中，我们使用接种回路将化学引诱剂水溶液连接到细菌溶液，并将载玻片在室温下保持20分钟。值得注意的是，连接线的宽度被控制在2毫米左右，实验必须在无风的环境中进行。
应根据所使用的实验菌株进行适当的修改。对数培养时间应根据不同菌株的生长周期进行选择。对于不同蜂群能力的菌株，可以适当调整断开连接线之前的时间。在光学显微镜下无法观察到的小尺寸细菌物种不适合这种方法。例如，纳米细菌的直径可以小至80nm，只能通过电子显微镜看到。这种方法适用于鞭毛菌株。
新方法减少了计数的误差，缩短了实验周期。对于化学引诱物质的鉴定，新方法可以节省2-3天。新方法允许任何研究人员在1-2天内系统地完成细菌趋化性实验。与微流体装置相比，新方法更便宜。该协议还克服了传统细菌趋化性方法的一些缺点。此外，新方法可以以各种其他方式使用。例如，我们应该利用这种方法快速识别土壤中受特定植物根系分泌物信号刺激的细菌。新方法设计简单，易于执行，具有很大的应用价值。该协议可以作为鉴定和理解植物 - 微生物相互作用的宝贵资源。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
本研究由国家自然科学基金（第31870493号）、黑龙江重点研发项目（GA21B007）和黑龙江省高校基础研究费用（第135409103号）资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 490-79-9 | |
| Acetonitrile | CNW Technologies | 75-05-8 | |
| Ammonium acetate | CNW Technologies | 631-61-8 | |
| Caffeic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 331-39-5 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Fresco17 | |
| Citric acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 77-92-9 | |
| Clean bench | Shanghai Boxun Industrial Co., Ltd. | BJ-CD | |
| Ferulic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 1135-24-6 | |
| Formic acid | CNW Technologies | 64-18-6 | |
| Fructose | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 57-48-7 | |
| Galactose | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 59-23-4 | |
| Glycine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 56-40-6 | |
| Grinding Mill | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd. |
JXFSTPRP-24 | |
| Histidine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 71-00-1 | |
| Internal standard: 2-Chloro-L-phenylalanine | Shanghai Hengbai Biotech C.,Ltd. | 103616-89-3 | |
| Leucine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 61-90-5 | |
| Malic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 6915-15-7 | |
| Mannose | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 3458-28-4 | |
| Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | Q Exactive Focus | |
| Methanol | CNW Technologies | 67-56-1 | |
| Optical Microscope | Olympus | BX43 | |
| Phenylalanine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 63-91-2 | |
| Proline | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 147-85-3 | |
| Scales | Sartorius | BSA124S-CW | |
| Serine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 56-45-1 | |
| Threonine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 72-19-5 | |
| UHPLC | Agilent | 1290 UHPLC | |
| Ultrasound Instrument | Shenzhen Leidebang Electronics Co., Ltd. |
PS-60AL | |
| Valine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 7004-03-7 |
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