Summary
Aquí, presentamos un protocolo mejorado de ensayo de quimiotaxis. El objetivo de este protocolo es reducir los pasos y los costos de los métodos tradicionales de quimiotaxis bacteriana y servir como un recurso valioso para comprender las interacciones planta-microbio.
Abstract
La identificación de quimiotaxis es muy importante para la investigación y aplicación de bacterias promotoras del crecimiento de la rizosfera. Establecimos un método sencillo para identificar rápidamente los quimioatrayentes que podrían inducir el movimiento quimiotáctico de las bacterias promotoras del crecimiento de la rizosfera en portaobjetos de vidrio estériles a través de pasos simples. La solución bacteriana (OD600 = 0,5) y la solución acuosa quimioatrayente estéril se agregaron gota a gota en el portaobjetos de vidrio a un intervalo de 1 cm. Se utilizó un asa inoculante para conectar la solución acuosa quimioatrayente a la solución bacteriana. El tobogán se mantuvo a temperatura ambiente durante 20 minutos en el banco limpio. Finalmente, se recogió la solución acuosa quimioatrayente para el recuento bacteriano y la observación microscópica. En este estudio, a través de múltiples comparaciones de resultados experimentales, el método superó múltiples deficiencias de los métodos tradicionales de quimiotaxis bacteriana. El método redujo el error de conteo de placas y acortó el ciclo experimental. Para la identificación de sustancias quimioatrayentes, este nuevo método puede ahorrar 2-3 días en comparación con el método tradicional. Además, este método permite a cualquier investigador completar sistemáticamente un experimento de quimiotaxis bacteriana en 1-2 días. El protocolo puede considerarse un recurso valioso para comprender las interacciones planta-microbio.
Introduction
La quimiotaxis es importante para la colonización de las rizobacterias promotoras del crecimiento de las plantas (PGPR) en las raíces y para comprender las interacciones planta-microbio1. Una clase de compuestos de bajo peso molecular (quimioatrayentes) en los exudados de la raíz de las plantas inducen el movimiento quimiotáctico de PGPR a la rizosfera2. El ácido málico, el ácido cítrico y otros componentes de los exudados radiculares estimulan la quimiotaxis de las cepas de Bacillus3. Por ejemplo, la glucosa, el ácido cítrico y el ácido fumárico en los exudados de la raíz del maíz reclutan bacterias a la superficie de la raíz4. La D-galactosa, que se deriva de los exudados radiculares, induce la quimiotaxis de Bacillus velezensis SQR95. Los ácidos orgánicos, incluyendo fumarato, ácido málico y succinato, influyen en la quimiotaxis y la colonización de varios PGPR en el sistema de cultivo intercalado Cajanus cajan - Zea mays6. El ácido oleanólico en los exudados de la raíz de arroz, actúa como quimioatrayente para la cepa FP357. Otros exudados vegetales (incluyendo histidina, arginina y aspartato) pueden desempeñar un papel crucial en la respuesta quimiotáctica de las bacterias8. Los exudados de las plantas funcionan como una señal para dirigir el movimiento de las bacterias, que es el primer paso durante la colonización de la rizosfera. La colonización de plantas por PGPR es un proceso de enorme relevancia, ya que los PGPR son beneficiosos para el huésped de la planta.
Se han utilizado muchos métodos para analizar la quimiotaxis bacteriana. El método de la placa de natación es uno de los métodos descritos anteriormente9. En este método, las placas se hicieron con un medio semisólido. Se agregó un tampón quimiotáctico que contenía agar (1.0%, p/v) a la placa. El tampón se calienta y luego se mezcla con el quimioatrayente. Luego, se agregaron 8 μL de suspensión de bacterias gota a gota a la mitad de la placa y la placa se colocó en una incubadora a 28 ° C. La placa fue observada y fotografiada regularmente. Sin embargo, el ciclo experimental del método de la placa de natación fue muy largo. En el método capilar10, una punta de pipeta sirve como cámara para contener 100 μL de suspensión bacteriana. Se utilizó una aguja de jeringa de 1 ml como capilar. Se insertó una aguja de jeringa que contenía quimioatrayentes con diferentes gradientes de concentración en la punta de la pipeta de 100 μL. Después de la incubación a temperatura ambiente durante 3 h, se retiró la aguja de la jeringa, el contenido se diluyó y se enchapó en el medio. La acumulación bacteriana en la jeringa estaba representada por unidades formadoras de colonias (UFC) en las placas. Sin embargo, el error experimental dentro de las réplicas para el método capilar fue grande. Otro método utilizó un dispositivo Microfluídico SlipChip11. Brevemente, la solución de albúmina sérica bovina (BSA) se inyectó en todos los canales y se retiró al vacío. Las soluciones que contenían diferentes quimioatrayentes (concentración de 1 mM solo para detección cualitativa), células bacterianas suspendidas en solución salina tamponada con fosfato y tampón salino tamponado con fosfato (control negativo) se agregaron a los micropocillos superior, medio e inferior, respectivamente. La incubación se realizó en un ambiente oscuro a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las células bacterianas se detectaron en los micropocillos. El dispositivo microfluídico SlipChip, sin embargo, era caro. Por lo tanto, cada uno de los métodos descritos anteriormente tenía ventajas y desventajas.
Se estableció un ensayo de quimiotaxis mejorado para la identificación rápida de quimioatrayentes rizobacterianos en exudados radiculares utilizando portaobjetos de vidrio estériles sin pasos complicados. En este estudio, a través de múltiples comparaciones de resultados experimentales, el método superó múltiples deficiencias de los métodos tradicionales de quimiotaxis bacteriana. El método redujo el error de conteo de placas y acortó el ciclo experimental. Por lo tanto, si se utiliza para identificar una sustancia quimioatrayente, este nuevo método puede ahorrar 2-3 días y reducir el costo de los materiales experimentales.
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Protocol
1. Materiales y equipos
NOTA: Bacillus altitudinis LZP02 (CP075052) fue aislado de la rizosfera del arroz en el noreste de China12,13 para este estudio.
- Cultura B. altitudinis LZP02 en luria-bertani (LB) medio (peptona, 10 g L-1; NaCl, 8 g de L-1 y extracto de levadura, 5 g de L-1) durante 10 h. Recoger las células por centrifugación a 9.569 x g durante 2 min a 4 °C. y almacenar con glicerol al 15% a -80 °C.
NOTA: Para este experimento, las semillas de arroz (Oryza sativa Longgeng 46) fueron proporcionadas por el Instituto de Investigación del Arroz de la Academia de Ciencias Agrícolas de Heilongjiang.
2. Colección de exudados radiculares
- Distribuya aleatoriamente las semillas de arroz en una cámara de crecimiento.
NOTA: Las semillas de arroz se esterilizaron con 30% de H2O2 durante 30 minutos y se remojaron en agua durante la noche. Las condiciones fueron las siguientes: la luz controlada (ciclo luz/oscuridad de 16/8 h), la temperatura (22 ± 2 °C) y la humedad relativa (͂70%). - Cultive semillas de arroz durante una semana y agregue agua estéril dos veces.
- Seleccione plántulas de arroz de tamaño similar y plante en 50 ml de murashige y Skoog (MS) medio líquido. Incubar durante 48 h a 22 °C en condiciones asépticas.
NOTA: Los exudados de raíz de arroz se liberarán en el medio MS14,15,16.
3. Cromatografía líquida-análisis espectrometría de masas de exudados radiculares
- Recoger 100 μL de la muestra (medio MS que contiene exudados radiculares) en un tubo centrífugo de 1,5 ml. Añadir 20 μL del disolvente de extracción (acetonitrilo-metanol-agua, 2:2:1, incluida la norma interna). Homogeneizar la muestra a 45 Hz durante 4 min, seguido de ultrasonidos en hielo durante 5 min en un baño de agua.
- Repita el ciclo de homogeneización y ultrasonido tres veces. Incubar la muestra a -20 °C durante 1 h, seguida de centrifugación a 133.778 x g y 4 °C durante 15 min.
- Transfiera el sobrenadante resultante a viales de LC-MS y guárdelo a -80 °C hasta el análisis UHPLC-QE. Prepare las muestras de control de calidad (QC) mezclando porciones iguales del sobrenadante de todas las muestras.
NOTA: Cada volumen de muestra fue de 600 μL (seis réplicas por experimento) en el experimento presentado. - Realizar análisis LC-MS/MS utilizando sistema UHPLC, columna UPLC HSS T3 (2,1 mm x 100 mm, 1,8 μm) y Q Exactive12.
- Use una solución acuosa de ácido fórmico al 0,1% y una solución acuosa de acetato de amonio de 5 mmol/L como fase móvil A y acetonitrilo como fase B móvil. Use ácido fórmico y acetato de amonio como modos de iones positivos y negativos, respectivamente.
- Establezca el gradiente de elución de la siguiente manera: 0 min, 1% B; 1 min, 1% B; 8 min, 99% B. 10 min, 99% B. 10.1 min, 1% B; 12 min, 1% B. Ajuste el caudal y el volumen de inyección a 0,5 mL/min y 2 μL, respectivamente.
NOTA: La macromolécula (>1.000 Daltons) no se puede detectar.
4. Ensayo de quimiotaxis
- Prepare la solución acuosa quimioatrayente. Asegúrese de que sea estéril. Filtre la solución quimioatrayente con un filtro de bacterias de 0,22 μm.
NOTA: La solución acuosa quimioatrayente fue la única sustancia obtenida de los estudios LC-MS disuelta en agua. La concentración y el volumen se pueden ajustar adecuadamente de acuerdo con diferentes estudios. Se utilizó la solución de ácido cítrico como ejemplo. Todas las acciones deben realizarse por el lado de una lámpara. - Marque la posición central de la diapositiva de vidrio en un intervalo de 1 cm. Asegúrese de que el portaobjetos de vidrio esté esterilizado varias veces en la llama.
- Añadir los 30 μL de solución quimioatrayente a la izquierda del portaobjetos de vidrio. Asegúrese de que las bacterias se cultivaron hasta la etapa logarítmica (2 x 108 UFC/ml) en medio LB. Agregue 30 μL de la solución bacteriana a la derecha del portaobjetos de vidrio.
NOTA: Prepare un grupo de control negativo con un volumen igual de agua estéril. Se utilizó la solución salina (NaCI al 0,9%) como control positivo para eliminar los cambios causados por la fuerza intermolecular en el experimento. - Esterilizar un bucle de inoculación varias veces en la llama. Use el bucle de inoculación para conectar la solución acuosa quimioatrayente a la solución bacteriana y manténgala a temperatura ambiente durante 20 minutos en un banco limpio.
NOTA: El experimento debe llevarse a cabo en un entorno sin viento. Ajuste el tiempo antes de desconectar la línea de conexión para detectar tensiones de diferentes habilidades atléticas de manera adecuada. - Después de 20 minutos, desconecte la línea de conexión con papel de filtro.
- Asegúrese de que el tubo centrífugo de 1,5 ml sea estéril. Recoja la solución acuosa quimioatrayente a la izquierda del portaobjetos de vidrio. Transfiera la solución al tubo de centrífuga estéril de 1,5 ml.
- Agregue el volumen apropiado de safranina al tubo de la centrífuga. Después de 2 min, recoja los líquidos miscibles para contar las bacterias y la observación microscópica con una cámara de conteo de sangre.
5. Análisis de resultados
- Determine el número de microorganismos viables atraídos utilizando la siguiente ecuación:
donde NBC: Número total de células bacterianas; N: Número de bacterias en 80 cuadrículas.
NOTA: Se utilizó software de análisis estadístico para el análisis de datos. El error se basó en tres valores experimentales replicados diferentes y se calculó utilizando ANOVA unidireccional seguido del análisis post-hoc de Turquía. P ≤ 0,05 se consideró significativo.
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Representative Results
Se detectaron un total de 584 y 937 metabolitos conocidos en los índices de iones positivos y negativos, respectivamente. Estudios previos han demostrado que los quimioatrayentes son típicamente ácidos orgánicos, aminoácidos y carbohidratos17,18.
En este estudio, se seleccionaron 16 tipos de quimioatrayentes de los estudios LC-MS en los exudados de la rizosfera de arroz para experimentos posteriores (Tabla 1). Utilizando el método de la placa de natación, examinamos los compuestos de bajo peso molecular secretados por la raíz para detectar un atrayente del rizosférico B. altitudinis LZP02. Para comparar las concentraciones de los diferentes quimioatrayentes, se introdujo el índice de quimiotaxis (RCI), que muestra la relación entre las bacterias de tratamiento promedio y el control correspondiente19. Un RCI más alto indica una reacción más fuerte al quimioatrayente. Los resultados indicaron que, 100 μM de ácido cítrico (RCI = 2,34) y 100 μM de ácido cafeico (RCI = 1,85) tenían los índices de quimiotaxis más altos (Figura 2). Las imágenes representativas mostraron que las áreas de enjambre de ácido cítrico y ácido cafeico fueron más en comparación con CK (Figura 3).
Utilizando el nuevo método de ensayo de quimiotaxis (Figura 1), los resultados mostraron que la concentración bacteriana de los experimentos de ácido cítrico, ácido cafeico y galactosa (100 μM) fue significativamente mayor que la de los grupos de control negativos y positivos. El ácido cítrico fue el quimioatrayente más fuerte. Los resultados experimentales (Figura 4 y Tabla 2) estuvieron de acuerdo con los resultados del método tradicional de placas de natación (Figura 2). Las imágenes microscópicas representativas del nuevo ensayo de quimiotaxis se muestran en la Figura 5.
En comparación con el método de la placa de natación, nuestros resultados confirmaron la viabilidad del nuevo ensayo de quimiotaxis. Esta técnica puede ahorrar una cantidad considerable de tiempo, reducir el costo de los reactivos y reducir los errores en el resultado. Los resultados del nuevo método fueron intuitivos, y el método mostró la motilidad de las bacterias.
Figura 1: Diagrama esquemático del nuevo ensayo de quimiotaxis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Resultados del método de la placa de natación. (A) Respuesta quimiotáctica de B. altitudinis LZP02 para aumentar las concentraciones de ácidos orgánicos, ácidos fenólicos y carbohidratos. (B) Respuesta quimiotáctica de B. altitudinis LZP02 para aumentar las concentraciones de aminoácidos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Resultados del método de la placa de natación. Comparación de la respuesta quimiotáctica de B. altitudinis LZP02 hacia los ácidos orgánicos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Resultados del nuevo método de ensayo de quimiotaxis. NBC: Número total de células bacterianas. Respuesta quimiotáctica de B. altitudinis LZP02 para aumentar las concentraciones de ácido cítrico, ácido cafeico y galactosa. Los resultados se expresan como la media de al menos tres ensayos para cada determinación. Las barras de error indican las SD basadas en tres valores experimentales replicados diferentes. Las columnas identificadas por diferentes letras son significativamente diferentes en P ≤ 0,05 según el ANOVA unidireccional seguido del análisis post-hoc de Turquía. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Resultados del nuevo método de ensayo de quimiotaxis. Las imágenes se obtuvieron bajo un microscopio de luz. (A) CK, (B) solución salina, (C) ácido cítrico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Índice | Nombre | Puntuación | Abundancia |
| POS01062 | Ácido cítrico | 0 | 200471.6 |
| NEG00016 | Ácido málico | 0.9944492 | 2093440.97 |
| NEG00038 | Ácido 2,5-dihidroxibenzoico | 0.8886685 | 114774.98 |
| POS01763 | Ácido cafeico | 0 | 6195.5 |
| POS00154 | Ácido ferúlico | 0.4725294 | 12723.95 |
| POS02156 | Fructosa | 0 | 6767.81 |
| POS01289 | Galactosa | 0 | 871476.14 |
| NEG00021 | Manosa | 0.9898174 | 683176.34 |
| POS00037 | Valina | 0.9660872 | 5985865.24 |
| POS00018 | Prolina | 0.9887274 | 2739147.17 |
| POS00124 | Fenilalanina | 0.6106034 | 11940645.8 |
| POS00092 | Glicina | 0.7418478 | 22787114.1 |
| POS00079 | Treonina | 0.8086754 | 1039040.18 |
| NEG00010 | Leucina | 0.9962673 | 3546561.95 |
| POS00266 | Histidina | 0 | 3010220.41 |
| POS01993 | Serina | 0 | 645602.04 |
| Nota: POS y NEG en la primera columna indican índice de iones positivo y negativo, respectivamente. La tercera columna indica, que el espectro de segundo nivel se utilizó para puntuar la coincidencia de la base de datos y los quimioatrayentes no calificados se compararon con el espectro de primer orden. La puntuación oscila entre 0 y 1. | |||
Tabla 1: 16 tipos de quimioatrayentes de los estudios LC-MS en los exudados de la rizosfera del arroz.
| Quimioatrayente | RCI |
| NaCl | 1.95±0.03 |
| Ácido cítrico | 3.63±0.12 |
| Ácido cafeico | 2.71±0.26 |
| Galactosa | 2.56±0.16 |
Tabla 2: Índice de quimiotaxis (RCI) del nuevo método de ensayo de quimiotaxis.
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Discussion
El aumento de la investigación indica que las interacciones planta-bacteria ocurren principalmente en la rizosfera y están influenciadas por los exudados de la raíz20,21,22,23,24. Los exudados de las raíces de las plantas incluyen una amplia gama de metabolitos primarios, incluidos ácidos fenólicos, ácidos orgánicos y aminoácidos, así como compuestos secundarios más complejos25,26,27. Para cada bacteria, se ha demostrado que sustancias específicas tienen efectos de reclutamiento en los exudados de la rizosfera. En este campo de investigación, muchos de los métodos de quimiotaxis reportados en la literatura son altamente dependientes del ensayo. Hay informes sobre una variedad de enfoques, que tienen ventajas e inconvenientes específicos.
En el presente estudio, nos centramos en introducir un ensayo de quimiotaxis mejorado para la rápida identificación de quimioatrayentes rizobacterianos en exudados radiculares. En este protocolo, todos los experimentos se realizaron en condiciones asépticas. En el paso 4, utilizamos el bucle de inoculación para conectar la solución acuosa quimioatrayente a la solución de bacterias, y mantuvimos el portaobjetos a temperatura ambiente durante 20 min. Vale la pena señalar que el ancho de la línea de conexión se controló a aproximadamente 2 mm, y el experimento debe llevarse a cabo en un entorno sin viento.
Se deben realizar las modificaciones apropiadas de acuerdo con la cepa experimental que se esté utilizando. El tiempo de cultivo logarítmico debe seleccionarse de acuerdo con el ciclo de crecimiento de las diferentes cepas. Para cepas de diferentes habilidades de enjambre, el tiempo antes de desconectar la línea de conexión se puede ajustar adecuadamente. Las especies de bacterias de tamaño pequeño que no se pueden observar bajo un microscopio de luz no son adecuadas para este método. Por ejemplo, las nanobacterias pueden ser tan pequeñas como 80 nm de diámetro y solo se pueden ver a través de un microscopio electrónico. Este método es adecuado para cepas con flagelos.
El nuevo método reduce el error de conteo de placas y acorta el ciclo experimental. Para la identificación de sustancias quimioatrayentes, el nuevo método puede ahorrar 2-3 días. El nuevo método permite a cualquier investigador completar sistemáticamente un experimento de quimiotaxis bacteriana en 1-2 días. En comparación con el dispositivo microfluídico, el nuevo método es menos costoso. El protocolo también supera algunas deficiencias de los métodos tradicionales de quimiotaxis bacteriana. Además, el nuevo método se puede utilizar de varias otras maneras. Por ejemplo, debemos utilizar este método para identificar rápidamente las bacterias en el suelo estimuladas por las señales de exudados específicos de las raíces de las plantas. El nuevo método es simple en diseño, fácil de realizar y tiene un gran valor de aplicación. Este protocolo se puede presentar como un recurso valioso para la identificación y comprensión de las interacciones planta-microbio.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nos. 31870493), los Proyectos Clave de Investigación y Desarrollo en Heilongjiang, China (GA21B007) y las Tarifas de Investigación Básica de las Universidades en la Provincia de Heilongjiang, China (No. 135409103).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 490-79-9 | |
| Acetonitrile | CNW Technologies | 75-05-8 | |
| Ammonium acetate | CNW Technologies | 631-61-8 | |
| Caffeic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 331-39-5 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Fresco17 | |
| Citric acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 77-92-9 | |
| Clean bench | Shanghai Boxun Industrial Co., Ltd. | BJ-CD | |
| Ferulic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 1135-24-6 | |
| Formic acid | CNW Technologies | 64-18-6 | |
| Fructose | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 57-48-7 | |
| Galactose | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 59-23-4 | |
| Glycine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 56-40-6 | |
| Grinding Mill | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd. |
JXFSTPRP-24 | |
| Histidine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 71-00-1 | |
| Internal standard: 2-Chloro-L-phenylalanine | Shanghai Hengbai Biotech C.,Ltd. | 103616-89-3 | |
| Leucine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 61-90-5 | |
| Malic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 6915-15-7 | |
| Mannose | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 3458-28-4 | |
| Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | Q Exactive Focus | |
| Methanol | CNW Technologies | 67-56-1 | |
| Optical Microscope | Olympus | BX43 | |
| Phenylalanine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 63-91-2 | |
| Proline | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 147-85-3 | |
| Scales | Sartorius | BSA124S-CW | |
| Serine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 56-45-1 | |
| Threonine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 72-19-5 | |
| UHPLC | Agilent | 1290 UHPLC | |
| Ultrasound Instrument | Shenzhen Leidebang Electronics Co., Ltd. |
PS-60AL | |
| Valine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 7004-03-7 |
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