Summary
यहाँ, हम एक बेहतर chemotaxis परख प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य पारंपरिक बैक्टीरियल केमोटैक्सिस विधियों के चरणों और लागतों को कम करना और पौधे-माइक्रोब इंटरैक्शन को समझने के लिए एक मूल्यवान संसाधन के रूप में सेवा करना है।
Abstract
Chemotaxis पहचान अनुसंधान और rhizosphere विकास को बढ़ावा देने वाले बैक्टीरिया के आवेदन के लिए बहुत महत्वपूर्ण है. हमने chemoattractants की जल्दी से पहचान करने के लिए एक सीधी विधि स्थापित की जो सरल चरणों के माध्यम से बाँझ ग्लास स्लाइड पर राइजोस्फीयर विकास को बढ़ावा देने वाले बैक्टीरिया के कीमोटैक्टिक आंदोलन को प्रेरित कर सकती है। बैक्टीरिया समाधान (OD600 = 0.5) और बाँझ chemoattractant जलीय समाधान 1 सेमी के अंतराल पर कांच की स्लाइड पर dropwise जोड़ा गया था। एक इनोक्यूलेशन लूप का उपयोग कीमोएट्रैक्टेंट जलीय घोल को जीवाणु समाधान से जोड़ने के लिए किया गया था। स्लाइड को साफ बेंच पर 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रखा गया था। अंत में, chemoattractant जलीय समाधान जीवाणु गिनती और सूक्ष्म अवलोकन के लिए एकत्र किया गया था। इस अध्ययन में, प्रयोगात्मक परिणामों की कई तुलनाओं के माध्यम से, विधि ने पारंपरिक बैक्टीरियल केमोटैक्सिस विधियों की कई कमियों को पार किया। विधि ने प्लेट गिनती की त्रुटि को कम कर दिया और प्रयोगात्मक चक्र को छोटा कर दिया। chemoattractant पदार्थों की पहचान के लिए, यह नई विधि पारंपरिक विधि की तुलना में 2-3 दिनों की बचत कर सकती है। इसके अतिरिक्त, यह विधि किसी भी शोधकर्ता को 1-2 दिनों के भीतर एक जीवाणु केमोटैक्सिस प्रयोग को व्यवस्थित रूप से पूरा करने की अनुमति देती है। प्रोटोकॉल को पौधे-माइक्रोब इंटरैक्शन को समझने के लिए एक मूल्यवान संसाधन माना जा सकता है।
Introduction
Chemotaxis जड़ों पर पौधे के विकास को बढ़ावा देने वाले राइजोबैक्टीरियल (PGPR) के उपनिवेशीकरण के लिए और पौधे-माइक्रोब इंटरैक्शन को समझने के लिए महत्वपूर्ण है1। पौधों की जड़ में कम आणविक भार यौगिकों (chemoattractants) का एक वर्ग rhizosphere2 के लिए PGPR के chemotactic आंदोलन को प्रेरित करता है। मैलिक एसिड, साइट्रिक एसिड, और जड़ में अन्य घटकों को उत्तेजित करता है बेसिलस उपभेदों 3 के chemotaxis उत्तेजित। उदाहरण के लिए, ग्लूकोज, साइट्रिक एसिड, और मक्का की जड़ में फ्यूमेरिक एसिड एक्सूडेट्स बैक्टीरिया को जड़ की सतह पर भर्ती करते हैं4। डी-गैलेक्टोज, जो रूट एक्सूडेट्स से व्युत्पन्न होता है, बैसिलस वेलेज़ेन्सिस एसक्यूआर 95 के केमोटैक्सिस को प्रेरित करता है। कार्बनिक एसिड, fumarate, मैलिक एसिड, और succinate सहित, chemotaxis और Cajanus cajan में विभिन्न PGPR के उपनिवेशीकरण को प्रभावित - Zea mays intercropping system6. चावल की जड़ में Oleanolic एसिड exudates, तनाव FP357 के लिए एक chemoattractant के रूप में कार्य करता है। अन्य पौधे exudates (हिस्टिडीन, arginine, और aspartate सहित) बैक्टीरिया की chemotactic प्रतिक्रिया में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं8. प्लांट एक्सुडेट्स बैक्टीरिया के आंदोलन को निर्देशित करने के लिए एक संकेत के रूप में कार्य करते हैं, जो राइजोस्फीयर उपनिवेशीकरण के दौरान पहला कदम है। PGPR द्वारा संयंत्र उपनिवेशीकरण भारी प्रासंगिकता की एक प्रक्रिया है, क्योंकि PGPR संयंत्र मेजबान के लिए फायदेमंद हैं।
बैक्टीरियल कीमोटैक्सिस का विश्लेषण करने के लिए कई तरीकों का उपयोग किया गया है। तैराकी प्लेट विधि पहले वर्णित तरीकों में से एक है9। इस विधि में, प्लेटों को एक अर्ध-ठोस माध्यम से बनाया गया था। एक कीमोटैक्टिक बफर जिसमें आगर (1.0%, w / v) होता है, प्लेट में जोड़ा गया था। बफर को गर्म किया जाता है, और फिर chemoattractant के साथ मिश्रित किया जाता है। फिर, बैक्टीरिया निलंबन के 8 μL को प्लेट के बीच में ड्रॉपवाइज जोड़ा गया था और प्लेट को 28 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में रखा गया था। प्लेट को नियमित रूप से देखा और फोटो खिंचवाया गया। हालांकि, तैराकी प्लेट विधि का प्रयोगात्मक चक्र बहुत लंबा था। केशिका जैसी विधि 10 में, एक पिपेट टिप बैक्टीरियल निलंबन के 100 μL को पकड़ने के लिए एक कक्ष के रूप में कार्य करता है। 1 एमएल सिरिंज सुई का उपयोग केशिका के रूप में किया गया था। एक सिरिंज सुई जिसमें विभिन्न सांद्रता ग्रेडिएंट के साथ chemoattractants होते हैं, को 100 μL पिपेट टिप में डाला गया था। 3 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेशन के बाद, सिरिंज सुई को हटा दिया गया था, सामग्री को पतला किया गया था और माध्यम पर चढ़ाया गया था। सिरिंज में जीवाणु संचय को प्लेटों में कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) द्वारा दर्शाया गया था। हालांकि, केशिका जैसी विधि के लिए प्रतिकृति के भीतर प्रयोगात्मक त्रुटि बड़ी थी। एक अन्य विधि एक microfluidic SlipChip डिवाइस 11 का उपयोग किया. संक्षेप में, गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) समाधान को सभी चैनलों में इंजेक्ट किया गया था और एक वैक्यूम का उपयोग करके हटा दिया गया था। विभिन्न chemoattractants युक्त समाधान (केवल गुणात्मक पता लगाने के लिए 1 mM एकाग्रता), फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा और फॉस्फेट buffered खारा बफर (नकारात्मक नियंत्रण) में निलंबित जीवाणु कोशिकाओं को क्रमशः शीर्ष, मध्य और नीचे माइक्रोवेल में जोड़ा गया था। इनक्यूबेशन तब 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक अंधेरे वातावरण में किया गया था। इसके बाद माइक्रोवेल्स में बैक्टीरियल कोशिकाओं का पता चला। माइक्रोफ्लुइडिक स्लिपचिप डिवाइस, हालांकि, महंगा था। इसलिए, ऊपर वर्णित विधियों में से प्रत्येक के फायदे और नुकसान थे।
हम जटिल चरणों के बिना बाँझ कांच स्लाइड का उपयोग कर जड़ exudates में rhizobacterial chemoattractants की तेजी से पहचान के लिए एक बेहतर chemotaxis परख की स्थापना की. इस अध्ययन में, प्रयोगात्मक परिणामों की कई तुलनाओं के माध्यम से, विधि ने पारंपरिक बैक्टीरियल केमोटैक्सिस विधियों की कई कमियों को पार किया। विधि ने प्लेट गिनती की त्रुटि को कम कर दिया और प्रयोगात्मक चक्र को छोटा कर दिया। इसलिए, यदि एक chemoattractant पदार्थ की पहचान करने के लिए उपयोग किया जाता है, तो यह नई विधि 2-3 दिनों की बचत कर सकती है और प्रयोगात्मक सामग्रियों की लागत को कम कर सकती है।
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Protocol
1. सामग्री और उपकरण
नोट: बेसिलस अल्टिटुडिनिस LZP02 (CP075052) को इस अध्ययन के लिए पूर्वोत्तर चीन 12,13 में चावल के राइजोस्फीयर से अलग किया गया था।
- संस्कृति बी। अल्टिट्यूडिनिस LZP02 में Luria-Bertani (एलबी) माध्यम (पेप्टोन, 10 ग्राम एल -1; NaCl, 8 ग्राम एल -1 और खमीर निकालने, 5 ग्राम एल -1) 10 ज के लिए। 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 9,569 x g पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर 15% ग्लिसरॉल के साथ स्टोर करें।
नोट: इस प्रयोग के लिए, चावल के बीज (Oryza sativa Longgeng 46) हेइलोंगजियांग एकेडमी ऑफ एग्रीकल्चरल साइंसेज के चावल अनुसंधान संस्थान द्वारा प्रदान किए गए थे।
2. रूट exudates का संग्रह
- बेतरतीब ढंग से एक विकास कक्ष में चावल के बीज वितरित करें।
नोट: चावल के बीज को 30 मिनट के लिए 30% H2O2 के साथ निष्फल किया गया था और रात भर पानी में भिगोया गया था। स्थितियां इस प्रकार थीं: नियंत्रित प्रकाश (16/8 घंटे प्रकाश / अंधेरे चक्र), तापमान (22 ± 2 डिग्री सेल्सियस) और सापेक्ष आर्द्रता (70%) - एक सप्ताह के लिए चावल के बीज को संस्कृति करें और दो बार बाँझ पानी जोड़ें।
- इसी तरह के आकार के चावल के अंकुर का चयन करें और 50 मिलीलीटर मुराशिगे और स्कूग (एमएस) तरल माध्यम में पौधे लगाएं। एसेप्टिक परिस्थितियों के तहत 22 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
नोट:: चावल रूट exudates MS medium14,15,16 में जारी किया जाएगा।
3. तरल क्रोमैटोग्राफी-जड़ exudates के द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण
- एक 1.5 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में नमूना (एमएस माध्यम जड़ exudates युक्त) के 100 μL ले लीजिए. निष्कर्षण विलायक के 20 μL जोड़ें (acetonitrile-मेथनॉल-पानी, 2: 2: 1, आंतरिक मानक सहित)। 4 मिनट के लिए 45 हर्ट्ज पर नमूने homogenize, एक पानी के स्नान में 5 मिनट के लिए बर्फ पर ultrasonication के बाद।
- homogenization और अल्ट्रासोनिक चक्र तीन बार दोहराएँ। नमूने को 1 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, इसके बाद 133,778 एक्स जी जी और 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूजेशन।
- परिणामस्वरूप supernatant एलसी-एमएस शीशियों के लिए स्थानांतरण और UHPLC-QE विश्लेषण तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर। सभी नमूनों के supernatant के बराबर भागों को मिलाकर गुणवत्ता नियंत्रण (QC) नमूने तैयार करें।
नोट: प्रत्येक नमूना मात्रा प्रस्तुत प्रयोग में 600 μL (प्रति प्रयोग छह प्रतिकृति) था। - UHPLC सिस्टम, UPLC HSS T3 कॉलम (2.1 मिमी x 100 मिमी, 1.8 μm) और Q Exactive12 का उपयोग करके LC-MS/MS विश्लेषण करें।
- मोबाइल चरण A के रूप में 0.1% फॉर्मिक एसिड जलीय घोल और 5 mmol/L अमोनियम एसीटेट जलीय घोल का उपयोग करें और मोबाइल चरण B के रूप में एसिटोनिट्राइल का उपयोग करें।
- क्षालन ढाल को निम्नानुसार सेट करें: 0 मिनट, 1% बी; 1 मिनट, 1% बी; 8 मिनट, 99% B. 10 मिनट, 99% B. 10.1 मिनट, 1% B; 12 मिनट, 1% B. प्रवाह दर और इंजेक्शन की मात्रा को क्रमशः 0.5 mL/ मिनट और 2 μL पर सेट करें।
नोट:: मैक्रोमोलेक्यूल (>1,000 डाल्टन) का पता नहीं लगाया जा सकता।
4. Chemotaxis परख
- chemoattractant जलीय घोल तैयार करें। सुनिश्चित करें कि यह बाँझ है। एक 0.22 μm बैक्टीरिया फिल्टर के साथ chemoattractant समाधान फ़िल्टर.
नोट: chemoattractant जलीय समाधान पानी में भंग एलसी-एमएस अध्ययन से प्राप्त एकल पदार्थ था। एकाग्रता और मात्रा को विभिन्न अध्ययनों के अनुसार उचित रूप से समायोजित किया जा सकता है। साइट्रिक एसिड समाधान का उपयोग एक उदाहरण के रूप में किया गया था। सभी क्रियाओं को एक दीपक के किनारे किया जाना चाहिए। - 1 सेमी के अंतराल पर कांच की स्लाइड की मध्य स्थिति को चिह्नित करें। सुनिश्चित करें कि कांच की स्लाइड को लौ पर कई बार निष्फल किया गया है।
- कांच स्लाइड के बाईं ओर chemoattractant समाधान के 30 μL जोड़ें। सुनिश्चित करें कि बैक्टीरिया को एलबी माध्यम में लॉगरिदमिक चरण (2 x 108 सीएफयू / एमएल) के लिए सुसंस्कृत किया गया था। कांच स्लाइड के दाईं ओर बैक्टीरियल समाधान के 30 μL जोड़ें।
नोट:: बाँझ पानी की एक समान मात्रा के साथ एक नकारात्मक नियंत्रण समूह तैयार करें। लवणीय समाधान (0.9% NaCI) का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था ताकि प्रयोग पर अंतर-आणविक बल के कारण होने वाले परिवर्तनों को समाप्त किया जा सके। - लौ पर कई बार एक टीका पाश निष्फल. chemoattractant जलीय समाधान को जीवाणु समाधान से जोड़ने के लिए इनोक्यूलेशन लूप का उपयोग करें और इसे एक साफ बेंच पर 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रखें।
नोट: प्रयोग एक हवा रहित वातावरण में किया जाना चाहिए। उचित रूप से विभिन्न एथलेटिक क्षमताओं के उपभेदों के लिए कनेक्शन लाइन डिस्कनेक्ट करने से पहले समय समायोजित करें। - 20 मिनट के बाद, फ़िल्टर पेपर के साथ कनेक्टिंग लाइन को डिस्कनेक्ट करें।
- सुनिश्चित करें कि 1.5 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब बाँझ है। कांच की स्लाइड के बाईं ओर chemoattractant जलीय समाधान ले लीजिए। 1.5 mL बाँझ सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के लिए समाधान हस्तांतरण।
- सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के लिए safranin की उपयुक्त मात्रा जोड़ें। 2 मिनट के बाद, रक्त गिनती कक्ष के साथ बैक्टीरिया और माइक्रोस्कोपिक अवलोकन की गिनती के लिए मिस्किबल तरल पदार्थ एकत्र करें।
5. परिणाम विश्लेषण
- निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके आकर्षित किए गए व्यवहार्य सूक्ष्मजीवों की संख्या ज्ञात कीजिये:
जहां एनबीसी: बैक्टीरिया कोशिकाओं की कुल संख्या; एन: 80 ग्रिड में बैक्टीरिया की संख्या।
नोट: सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ़्टवेयर डेटा विश्लेषण के लिए उपयोग किया गया था। त्रुटि तीन अलग-अलग दोहराए गए प्रयोगात्मक मूल्यों पर आधारित थी और तुर्की के पोस्ट-हॉक विश्लेषण के बाद एक तरफा एनोवा का उपयोग करके गणना की गई थी। पी ≤ 0.05 को महत्वपूर्ण माना जाता था।
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Representative Results
सकारात्मक और नकारात्मक आयन सूचकांकों में क्रमशः कुल 584 और 937 ज्ञात मेटाबोलाइट्स का पता लगाया गया था। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि chemoattractants आमतौर पर कार्बनिक एसिड, अमीनो एसिड, और कार्बोहाइड्रेट 17,18 हैं।
इस अध्ययन में, चावल राइजोस्फीयर एक्सूडेट्स में एलसी-एमएस अध्ययनों से 16 प्रकार के कीमोएट्रेक्टेंट्स को बाद के प्रयोगों के लिए चुना गया था (तालिका 1)। तैराकी प्लेट विधि का उपयोग करते हुए, हमने राइजोस्फेरिक बी. अल्टिटुडिनिस LZP02 के एक आकर्षण के लिए जड़ द्वारा स्रावित कम आणविक भार यौगिकों की जांच की। विभिन्न chemoattractants की ताकत की तुलना करने के लिए, chemotaxis सूचकांक (RCI), जो इसी नियंत्रण के लिए औसत उपचार बैक्टीरिया के अनुपात को दर्शाता है, को पेश किया गया था। एक उच्च RCI chemoattractant के लिए एक मजबूत प्रतिक्रिया को इंगित करता है। परिणामों ने संकेत दिया कि, 100 μM साइट्रिक एसिड (RCI = 2.34) और 100 μM कैफेइक एसिड (RCI = 1.85) में उच्चतम chemotaxis सूचकांक (चित्रा 2) थे। प्रतिनिधि छवियों से पता चला है कि साइट्रिक एसिड और कैफेइक एसिड के झुंड क्षेत्र सीके (चित्रा 3) की तुलना में अधिक थे।
नए chemotaxis परख विधि (चित्रा 1) का उपयोग करते हुए, परिणामों से पता चला है कि साइट्रिक एसिड, कैफेइक एसिड, और गैलेक्टोज प्रयोगों (100 μM) की जीवाणु एकाग्रता नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण समूहों की तुलना में काफी अधिक थी। साइट्रिक एसिड सबसे मजबूत chemoattractant था। प्रयोगात्मक परिणाम (चित्रा 4 और तालिका 2) पारंपरिक तैराकी प्लेट विधि (चित्रा 2) के परिणामों के साथ समझौते में थे। नए chemotaxis परख के प्रतिनिधि माइक्रोस्कोपिक छवियों चित्रा 5 में दिखाया गया है.
तैराकी प्लेट विधि के साथ तुलना में, हमारे परिणामों ने नए chemotaxis परख की व्यवहार्यता की पुष्टि की। यह तकनीक काफी समय बचा सकती है, अभिकर्मकों की लागत को कम कर सकती है और परिणाम में त्रुटियों को कम कर सकती है। नई विधि के परिणाम सहज ज्ञान युक्त थे, और विधि ने बैक्टीरिया की गतिशीलता को दिखाया।
चित्रा 1: नए chemotaxis परख के योजनाबद्ध आरेख. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: तैराकी प्लेट विधि के परिणाम। (A) B की केमोटैक्टिक प्रतिक्रिया। अल्टिट्यूडिनिस LZP02 कार्बनिक एसिड, फेनोलिक एसिड, और कार्बोहाइड्रेट की सांद्रता बढ़ाने के लिए। (बी) बी की केमोटैक्टिक प्रतिक्रिया। अल्टिट्यूडिनिस LZP02 अमीनो एसिड की सांद्रता बढ़ाने के लिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: तैराकी प्लेट विधि के परिणाम। बी की कीमोटैक्टिक प्रतिक्रिया की तुलना। अल्टिट्यूडिनिस कार्बनिक एसिड की ओर LZP02. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: नई chemotaxis परख विधि के परिणाम. एनबीसी: बैक्टीरिया कोशिकाओं की कुल संख्या। बी की कीमोटैक्टिक प्रतिक्रिया। अल्टिट्यूडिनिस LZP02 साइट्रिक एसिड, कैफेइक एसिड, और गैलेक्टोज की सांद्रता बढ़ाने के लिए। परिणाम प्रत्येक निर्धारण के लिए कम से कम तीन assays के माध्य के रूप में व्यक्त कर रहे हैं। त्रुटि पट्टियाँ तीन अलग-अलग प्रतिकृति प्रयोगात्मक मानों पर आधारित SDs को इंगित करती हैं. विभिन्न अक्षरों द्वारा पहचाने जाने वाले स्तंभ एक तरफा एनोवा के अनुसार पी ≤ 0.05 पर काफी अलग हैं, जिसके बाद तुर्की के पोस्ट-हॉक विश्लेषण किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 5: नई chemotaxis परख विधि के परिणाम. छवियों को एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत प्राप्त किया गया था। (ए) सीके, (बी) खारा समाधान, (सी) साइट्रिक एसिड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| अनुक्रमणिका | नाम | अंक | प्रचुरता |
| POS01062 | साइट्रिक एसिड | 0 | 200471.6 |
| NEG00016 | मैलिक अम्ल | 0.9944492 | 2093440.97 |
| NEG00038 | 2,5-dihydroxybenzoic एसिड | 0.8886685 | 114774.98 |
| POS01763 | कैफेइक अम्ल | 0 | 6195.5 |
| POS00154 | फेरुलिक अम्ल | 0.4725294 | 12723.95 |
| POS02156 | फलशर्करा | 0 | 6767.81 |
| POS01289 | गैलेक्टोज | 0 | 871476.14 |
| NEG00021 | Mannose | 0.9898174 | 683176.34 |
| POS00037 | वैलिन | 0.9660872 | 5985865.24 |
| POS00018 | प्रोलाइन | 0.9887274 | 2739147.17 |
| POS00124 | फेनिलएलनिन | 0.6106034 | 11940645.8 |
| POS00092 | ग्लाइसिन | 0.7418478 | 22787114.1 |
| POS00079 | थ्रेओनीन | 0.8086754 | 1039040.18 |
| NEG00010 | ल्यूसीन | 0.9962673 | 3546561.95 |
| POS00266 | हिस्टिडीन | 0 | 3010220.41 |
| POS01993 | सेरीन | 0 | 645602.04 |
| नोट: पहले कॉलम में पीओएस और एनईजी क्रमशः सकारात्मक और नकारात्मक आयन सूचकांक को इंगित करते हैं। तीसरे कॉलम से संकेत मिलता है, जिसका उपयोग डेटाबेस मिलान को स्कोर करने के लिए दूसरे स्तर के स्पेक्ट्रम का किया गया था और पहले ऑर्डर स्पेक्ट्रम द्वारा अनग्रेडेड केमोएट्रेक्टेंट्स का मिलान किया गया था। स्कोर 0 से 1 तक होता है। | |||
तालिका 1: चावल rhizosphere exudates में एलसी-एमएस अध्ययन से chemoattractants के 16 प्रकार.
| कीमोअकर्षक | RCI |
| NaCl | 1.95±0.03 |
| साइट्रिक एसिड | 3.63±0.12 |
| कैफेइक अम्ल | 2.71±0.26 |
| गैलेक्टोज | 2.56±0.16 |
तालिका 2: Chemotaxis सूचकांक (RCI) नई chemotaxis परख विधि के.
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Discussion
बढ़ते शोध से संकेत मिलता है कि पौधे-बैक्टीरिया इंटरैक्शन मुख्य रूप से राइजोस्फीयर में होते हैं और रूट एक्सूडेट्स 20,21,22,23,24 से प्रभावित होते हैं। पौधे की जड़ exudates प्राथमिक चयापचयों की एक विविध सरणी, phenolic एसिड, कार्बनिक एसिड और अमीनो एसिड के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अधिक जटिल माध्यमिक यौगिकों 25,26,27 सहित शामिल हैं। प्रत्येक जीवाणु के लिए, विशिष्ट पदार्थों को राइजोस्फीयर एक्सुडेट्स में भर्ती प्रभाव दिखाया गया है। इस शोध क्षेत्र में, साहित्य में रिपोर्ट किए गए केमोटैक्सिस विधियों में से कई अत्यधिक परख-निर्भर हैं। विभिन्न प्रकार के दृष्टिकोणों पर रिपोर्टें हैं, जिनमें सभी के विशिष्ट फायदे और कमियां हैं।
वर्तमान अध्ययन में, हम रूट exudates में rhizobacterial chemoattractants की तेजी से पहचान के लिए एक बेहतर chemotaxis परख शुरू करने पर ध्यान केंद्रित किया। इस प्रोटोकॉल में, सभी प्रयोगों को एसेप्टिक परिस्थितियों में किया गया था। चरण 4 में, हमने बैक्टीरिया समाधान के लिए chemoattractant जलीय समाधान को जोड़ने के लिए इनोक्यूलेशन लूप का उपयोग किया, और हमने स्लाइड को 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रखा। यह ध्यान देने योग्य है कि कनेक्शन लाइन की चौड़ाई लगभग 2 मिमी तक नियंत्रित की गई थी, और प्रयोग को एक हवा रहित वातावरण में किया जाना चाहिए।
उपयोग किए जा रहे प्रयोगात्मक तनाव के अनुसार उचित संशोधन किए जाने चाहिए। लॉगरिदमिक संस्कृति समय को विभिन्न उपभेदों के विकास चक्र के अनुसार चुना जाना चाहिए। विभिन्न स्वार्मिंग क्षमताओं के उपभेदों के लिए, कनेक्शन लाइन को डिस्कनेक्ट करने से पहले समय को उचित रूप से समायोजित किया जा सकता है। छोटे आकार की जीवाणु प्रजातियां जिन्हें प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत नहीं देखा जा सकता है, इस विधि के लिए उपयुक्त नहीं हैं। उदाहरण के लिए, नैनोबैक्टीरिया व्यास में 80 एनएम जितना छोटा हो सकता है और केवल इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के माध्यम से देखा जा सकता है। यह विधि फ्लैगेला के साथ उपभेदों के लिए उपयुक्त है।
नई विधि प्लेट गिनती की त्रुटि को कम करती है और प्रयोगात्मक चक्र को छोटा करती है। chemoattractant पदार्थों की पहचान के लिए, नई विधि 2-3 दिनों की बचत कर सकती है। नई विधि किसी भी शोधकर्ता को व्यवस्थित रूप से 1-2 दिनों के भीतर एक जीवाणु केमोटैक्सिस प्रयोग को पूरा करने की अनुमति देती है। माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस की तुलना में, नई विधि कम महंगी है। प्रोटोकॉल पारंपरिक बैक्टीरियल केमोटैक्सिस विधियों की कुछ कमियों को भी दूर करता है। इसके अलावा, नई विधि का उपयोग विभिन्न अन्य तरीकों से किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, हमें इस विधि का उपयोग मिट्टी में बैक्टीरिया की जल्दी से पहचान करने के लिए करना चाहिए जो विशिष्ट पौधे की जड़ एक्सूडेट्स से संकेतों से प्रेरित होता है। नई विधि डिजाइन में सरल है, प्रदर्शन करने में आसान है, और महान आवेदन मूल्य है। इस प्रोटोकॉल को पौधे-माइक्रोब इंटरैक्शन की पहचान और समझ के लिए एक मूल्यवान संसाधन के रूप में प्रस्तुत किया जा सकता है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (नंबर 31870493), हेइलोंगजियांग, चीन (GA21B007) में प्रमुख अनुसंधान और विकास परियोजनाओं, और हेइलोंगजियांग प्रांत, चीन में विश्वविद्यालयों के बुनियादी अनुसंधान शुल्क (नंबर 135409103) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 490-79-9 | |
| Acetonitrile | CNW Technologies | 75-05-8 | |
| Ammonium acetate | CNW Technologies | 631-61-8 | |
| Caffeic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 331-39-5 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Fresco17 | |
| Citric acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 77-92-9 | |
| Clean bench | Shanghai Boxun Industrial Co., Ltd. | BJ-CD | |
| Ferulic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 1135-24-6 | |
| Formic acid | CNW Technologies | 64-18-6 | |
| Fructose | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 57-48-7 | |
| Galactose | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 59-23-4 | |
| Glycine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 56-40-6 | |
| Grinding Mill | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd. |
JXFSTPRP-24 | |
| Histidine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 71-00-1 | |
| Internal standard: 2-Chloro-L-phenylalanine | Shanghai Hengbai Biotech C.,Ltd. | 103616-89-3 | |
| Leucine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 61-90-5 | |
| Malic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 6915-15-7 | |
| Mannose | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 3458-28-4 | |
| Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | Q Exactive Focus | |
| Methanol | CNW Technologies | 67-56-1 | |
| Optical Microscope | Olympus | BX43 | |
| Phenylalanine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 63-91-2 | |
| Proline | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 147-85-3 | |
| Scales | Sartorius | BSA124S-CW | |
| Serine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 56-45-1 | |
| Threonine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 72-19-5 | |
| UHPLC | Agilent | 1290 UHPLC | |
| Ultrasound Instrument | Shenzhen Leidebang Electronics Co., Ltd. |
PS-60AL | |
| Valine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 7004-03-7 |
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