Summary
Aqui, apresentamos um protocolo de ensaio de quimiotaxis melhorado. O objetivo deste protocolo é reduzir as etapas e custos dos métodos tradicionais de quimioterapia bacteriana e servir como um recurso valioso para a compreensão das interações entre plantas e micróbios.
Abstract
A identificação de quimiotaxis é muito importante para a pesquisa e aplicação de bactérias promotoras do crescimento da rizofera. Estabelecemos um método simples para identificar rapidamente os quimioattractants que poderiam induzir o movimento quimotactic de bactérias promotoras do crescimento da rizosfera em lâminas de vidro estéreis através de passos simples. A solução bacteriana (OD600 = 0,5) e a solução aquosa quimioattractant estéril foram adicionadas dropwise no slide de vidro em um intervalo de 1 cm. Um loop inoculante foi usado para conectar a solução aquosa quimioattractant à solução bacteriana. O slide foi mantido em temperatura ambiente por 20 minutos no banco limpo. Finalmente, foi coletada a solução aquosa quimioattractant para contagem bacteriana e observação microscópica. Neste estudo, por meio de múltiplas comparações de resultados experimentais, o método superou múltiplas deficiências dos métodos tradicionais de quimioterapia bacteriana. O método reduziu o erro de contagem de placas e encurtou o ciclo experimental. Para a identificação de substâncias quimioattractant, este novo método pode economizar de 2 a 3 dias em comparação com o método tradicional. Além disso, este método permite que qualquer pesquisador complete sistematicamente um experimento de quimiotaxis bacteriana dentro de 1-2 dias. O protocolo pode ser considerado um recurso valioso para entender as interações entre plantas e micróbios.
Introduction
A quimiotaxis é importante para a colonização da rizobacteriana promotora do crescimento vegetal (PGPR) nas raízes e para a compreensão das interações entre plantas e micróbios1. Uma classe de compostos de baixo peso molecular (quimioattractants) em exudatas de raízes vegetais induzem o movimento quimotactic de PGPR à rizosfera2. Ácido malicílico, ácido cítrico e outros componentes nos exsudatos radiculares estimulam a quimotaxis das cepas de Bacillus3. Por exemplo, glicose, ácido cítrico e ácido fumarico na raiz do milho exsudam bactérias para a superfície raiz4. D-galactose, que é derivado de exudatas raiz, induz a quimiotaxis de Bacillus velezensis SQR95. Ácidos orgânicos, incluindo fumarato, ácido málico e succinato, influenciam a quimiotaxis e a colonização de vários PGPR no Cajan cajan - Zea mays intercropping system6. O ácido oleanolico em exsudates de raiz de arroz, atua como um quimioattractant para a cepa FP357. Outros exsudatos de plantas (incluindo histidina, arginina e aspartato) podem desempenhar um papel crucial na resposta quimotactica das bactérias8. Exsudatos vegetais funcionam como um sinal para direcionar o movimento das bactérias, que é o primeiro passo durante a colonização da rizofera. A colonização vegetal pela PGPR é um processo de enorme relevância, pois o PGPR é benéfico para o hospedeiro da planta.
Muitos métodos têm sido usados para analisar quimotaxis bacterianos. O método da placa de natação é um dos métodos descritos anteriormente9. Neste método, as placas foram feitas com um meio semisoólido. Um tampão quimotactic contendo ágar (1,0%, w/v) foi adicionado à placa. O tampão é aquecido e misturado com o quimioattractant. Em seguida, 8 μL de suspensão bacteriana foi adicionado dropwise ao meio da placa e a placa foi colocada em uma incubadora a 28 °C. A placa era regularmente observada e fotografada. No entanto, o ciclo experimental do método da placa de natação foi muito longo. No método capilar10, uma ponta de pipeta serve como câmara para segurar 100 μL de suspensão bacteriana. A agulha de seringa de 1 mL foi usada como capilar. Uma agulha de seringa contendo quimioattractants com diferentes gradientes de concentração foi inserida na ponta de pipeta de 100 μL. Após a incubação à temperatura ambiente por 3h, a agulha da seringa foi removida, o conteúdo foi diluído e banhado no meio. O acúmulo bacteriano na seringa foi representado por unidades formadoras de colônias (UFC) nas placas. No entanto, o erro experimental dentro das réplicas para o método capilar foi grande. Outro método utilizou um dispositivo SlipChip microfluidic11. Resumidamente, a solução de albumina de soro bovino (BSA) foi injetada em todos os canais e removida usando um vácuo. As soluções contendo diferentes quimioattractants (concentração de 1 mM apenas para detecção qualitativa), células bacterianas suspensas em soro fisiológico tampão salino tampão tampão tampão de fosfato (controle negativo) foram adicionadas às micro-habitas superior, média e inferior, respectivamente. A incubação foi então realizada em um ambiente escuro à temperatura ambiente por 30 minutos. As células bacterianas foram então detectadas nos microwells. O dispositivo Microfluídico SlipChip, no entanto, era caro. Portanto, cada um dos métodos descritos acima tinha vantagens e desvantagens.
Estabelecemos um ensaio de quimiotaxis melhorado para a identificação rápida de quimioattractants rizobacterianos em exsudatos radiculares usando lâminas de vidro estéreis sem etapas complicadas. Neste estudo, por meio de múltiplas comparações de resultados experimentais, o método superou múltiplas deficiências dos métodos tradicionais de quimioterapia bacteriana. O método reduziu o erro de contagem de placas e encurtou o ciclo experimental. Portanto, se usado para identificar uma substância quimiofos, este novo método pode economizar de 2 a 3 dias e reduzir o custo de materiais experimentais.
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Protocol
1. Materiais e equipamentos
NOTA: Bacillus altitudinis LZP02 (CP075052) foi isolado da rizosfera do arroz no nordeste da China12,13 para este estudo.
- Cultura B. altitudinis LZP02 em Luria-Bertani (LB) médio (peptone, 10 g L-1; NaCl, 8 g L-1 e extrato de levedura, 5 g L-1) por 10 h. Colete células por centrifugação a 9.569 x g por 2 min a 4 °C. e armazene com 15% de glicerol a -80 °C.
NOTA: Para este experimento, as sementes de arroz (Oryza sativa Longgeng 46) foram fornecidas pelo Instituto de Pesquisa de Arroz da Academia heilongjiang de Ciências Agrícolas.
2. Coleção de exsudatos de raiz
- Distribua aleatoriamente sementes de arroz em uma câmara de crescimento.
NOTA: As sementes de arroz foram esterilizadas com 30% de H2O2 por 30 min e encharcadas em água durante a noite. As condições foram as seguintes: luz controlada (ciclo claro/escuro de 16/8 horas), temperatura (22 ± 2 °C) e umidade relativa (͂ 70%). - Cultura sementes de arroz por uma semana e adicione água estéril duas vezes.
- Selecione mudas de arroz de tamanho semelhante e plante em 50 mL de meio líquido Murashige e Skoog (MS). Incubar por 48 h a 22 °C em condições assépticas.
NOTA: Os exsudatos de raiz de arroz serão liberados no ms médio14,15,16.
3. Análise de espectrometria de massa cromatografia líquida de exsudatos radiculares
- Colete 100 μL da amostra (meio MS contendo exsudatos radiculares) em um tubo centrífuga de 1,5 mL. Adicione 20 μL do solvente de extração (acetonitrilo-água de metanol, 2:2:1, incluindo padrão interno). Homogeneize a amostra a 45 Hz por 4 min, seguida de ultrassônica no gelo por 5 minutos em banho-maria.
- Repita a homogeneização e o ciclo ultrassônico três vezes. Incubar a amostra a -20 °C por 1h, seguida de centrifugação a 133.778 x g e 4 °C por 15 min.
- Transfira o supernatante resultante para frascos LC-MS e armazene a -80 °C até análise UHPLC-QE. Prepare as amostras de controle de qualidade (QC) misturando partes iguais do sobrenatante de todas as amostras.
NOTA: Cada volume amostral foi de 600 μL (seis réplicas por experimento) no experimento apresentado. - Realize a análise LC-MS/MS utilizando o sistema UHPLC, a coluna UPLC HSS T3 (2,1 mm x 100 mm, 1,8 μm) e a Q Exactive12.
- Use solução aquosa de ácido fórmico de 0,1% e solução aquosa de acetato de amônio 5 mmol/L como fase móvel A e acetonitrilo como fase móvel B. Use ácido fórmico e acetato de amônio como modos positivos e negativos de íons, respectivamente.
- Coloque o gradiente de elução da seguinte forma: 0 min, 1% B; 1 min, 1% B; 8 min, 99% B. 10 min, 99% B. 10,1 min, 1% B; 12 min, 1% B. Ajuste a taxa de fluxo e o volume de injeção para 0,5 mL/min e 2 μL, respectivamente.
NOTA: A macromolécula (>1.000 Daltons) não pode ser detectada.
4. Ensaio de quimioterapia
- Prepare a solução aquosa quimioattractant. Certifique-se de que é estéril. Filtre a solução de quimioterapia com um filtro de bactérias de 0,22 μm.
NOTA: A solução aquosa quimioattractant foi a única substância obtida dos estudos de LC-MS dissolvidos na água. A concentração e o volume podem ser ajustados adequadamente de acordo com diferentes estudos. A solução de ácido cítrico foi usada como exemplo. Todas as ações devem ser realizadas ao lado de uma lâmpada. - Marque a posição do meio do deslizamento de vidro em um intervalo de 1 cm. Certifique-se de que a lâmina de vidro seja esterilizada várias vezes na chama.
- Adicione os 30 μL de solução de quimioattractant à esquerda do slide de vidro. Certifique-se de que as bactérias foram cultivadas até o estágio logarítmico (2 x 108 UFC/mL) em meio LB. Adicione 30 μL da solução bacteriana à direita do escorregador de vidro.
NOTA: Prepare um grupo de controle negativo com um volume igual de água estéril. A solução salina (0,9% NaCI) foi utilizada como controle positivo para eliminar as alterações causadas pela força intermolecular no experimento. - Esterilize um laço inoculante várias vezes na chama. Use o laço inoculante para conectar a solução aquosa quimioattractant à solução bacteriana e mantê-la em temperatura ambiente por 20 minutos em um banco limpo.
NOTA: O experimento deve ser realizado em um ambiente sem vento. Ajuste o tempo antes de desconectar a linha de conexão para cepas de diferentes habilidades atléticas adequadamente. - Após 20 min, desconecte a linha de conexão com papel filtro.
- Certifique-se de que o tubo centrífuga de 1,5 mL é estéril. Colete a solução aquosa quimioattractant à esquerda do escorregador de vidro. Transfira a solução para o tubo de centrífuga estéril de 1,5 mL.
- Adicione o volume apropriado de safranin ao tubo centrífuga. Após 2 minutos, colete os líquidos miscíveis para contar bactérias e observação microscópica com uma câmara de contagem de sangue.
5. Análise de resultados
- Determine o número de microrganismos viáveis atraídos usando a seguinte equação:
onde NBC: Número total de células bacterianas; N: Número de bactérias em 80 grades.
NOTA: O software de análise estatística foi utilizado para análise de dados. O erro foi baseado em três diferentes valores experimentais replicados e foi calculado utilizando-se de uma ANOVA unidirecional, seguida pela análise pós-hoc da Turquia. P ≤ 0,05 foi considerado significativo.
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Representative Results
Foram detectados 584 e 937 metabólitos conhecidos nos índices de íons positivos e negativos, respectivamente. Estudos anteriores mostraram que os quimioattractants são tipicamente ácidos orgânicos, aminoácidos e carboidratos17,18.
Neste estudo, foram selecionados 16 tipos de quimioattractants dos estudos da LC-MS nos exsudatos da rizosfera de arroz para experimentos subsequentes (Tabela 1). Usando o método da placa de natação, examinamos os compostos de baixo peso molecular secretados pela raiz para um atrativo do rizosférico B. altitudinis LZP02. Para comparar os pontos fortes dos diferentes quimioattractants, foi introduzido o índice de quimiotaxis (RCI), que mostra a razão da média das bactérias do tratamento com o controle correspondente. Um RCI mais alto indica uma reação mais forte ao quimioattractant. Os resultados indicaram que, 100 μM ácido cítrico (RCI = 2,34) e 100 μM ácido cáafico (RCI = 1,85) apresentaram os maiores índices de quimiotaxis (Figura 2). Imagens representativas mostraram que as áreas de enxame de ácido cítrico e ácido cafeco foram mais comparadas à CK (Figura 3).
Utilizando o novo método de ensaio de quimiotaxis (Figura 1), os resultados mostraram que a concentração bacteriana dos experimentos de ácido cítrico, ácido fárico e galactose (100 μM) foram significativamente maiores do que os dos grupos de controle negativo e positivo. O ácido cítrico foi o quimioattractant mais forte. Os resultados experimentais (Figura 4 e Tabela 2) concordaram com os resultados do método tradicional de placa de natação (Figura 2). Imagens microscópicas representativas do novo ensaio de quimiotaxis são mostradas na Figura 5.
Em comparação com o método da placa de natação, nossos resultados confirmaram a viabilidade do novo ensaio de quimiotaxis. Esta técnica pode economizar um tempo considerável, reduzir o custo dos reagentes e reduzir erros no resultado. Os resultados do novo método foram intuitivos, e o método mostrou a motilidade das bactérias.
Figura 1: Diagrama esquemático do novo ensaio de quimiotaxis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Resultados do método da placa de natação. (A) Resposta chemotactic de B. altitudinis LZP02 para o aumento das concentrações de ácidos orgânicos, ácidos fenólicos e carboidratos. (B) Resposta chemotactic de B. altitudinis LZP02 para o aumento das concentrações de aminoácidos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Resultados do método da placa de natação. Comparação da resposta chemotactic de B. altitudinis LZP02 em direção a ácidos orgânicos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Resultados do novo método de ensaio de quimiotaxis. Número total de células bacterianas. Resposta chemotactic de B. altitudinis LZP02 para o aumento das concentrações de ácido cítrico, ácido cafeína e galactose. Os resultados são expressos como a média de pelo menos três ensaios para cada determinação. As barras de erro indicam os SDs com base em três diferentes valores experimentais replicados. Colunas identificadas por diferentes letras são significativamente diferentes em P ≤ 0,05 de acordo com a ANOVA unidirecional, seguida pela análise pós-hoc da Turquia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Resultados do novo método de ensaio de quimiotaxis. As imagens foram obtidas sob um microscópio leve. (A) Solução salina( B), (C) ácido cítrico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Índice | Nome | Pontuação | Abundância |
| PDVS01062 | Ácido cítrico | 0 | 200471.6 |
| NEG00016 | Ácido malic | 0.9944492 | 2093440.97 |
| NEG00038 | 2,5-ácido dihidroxybenómico | 0.8886685 | 114774.98 |
| PDV01763 | Ácido cafeína | 0 | 6195.5 |
| PDV00154 | Ácido ferúlico | 0.4725294 | 12723.95 |
| PDV2156 | Frutose | 0 | 6767.81 |
| PDV01289 | Galactose | 0 | 871476.14 |
| NEG00021 | Manose | 0.9898174 | 683176.34 |
| PDV00037 | Valina | 0.9660872 | 5985865.24 |
| POS00018 | Prolina | 0.9887274 | 2739147.17 |
| POS00124 | Fenilalanina | 0.6106034 | 11940645.8 |
| PDV00092 | Glicina | 0.7418478 | 22787114.1 |
| PDV00079 | Treonina | 0.8086754 | 1039040.18 |
| NEG00010 | Leucina | 0.9962673 | 3546561.95 |
| PDV00266 | Histidina | 0 | 3010220.41 |
| PDVS01993 | Serina | 0 | 645602.04 |
| Nota: PDV e NEG na primeira coluna indicam índice de íons positivos e negativos, respectivamente. A terceira coluna indica que o espectro de segundo nível foi usado para marcar correspondência de banco de dados e os quimioattractants não degradados foram combinados pelo espectro de primeira ordem. O placar varia de 0 a 1. | |||
Tabela 1: 16 tipos de quimioattractants dos estudos de LC-MS nos exsudatos da rizosfera de arroz.
| Quimioattractant | RCI |
| NaCl | 1.95±0.03 |
| Ácido cítrico | 3.63±0.12 |
| Ácido cafeína | 2.71±0.26 |
| Galactose | 2.56±0.16 |
Tabela 2: Índice de quimiotaxis (RCI) do novo método de ensaio de quimiotaxis.
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Discussion
Pesquisas crescentes indicam que as interações entre plantas e bactérias ocorrem principalmente na rizosfera e são influenciadas por exsudates raiz20,21,22,23,24. Os exsudatos de raízes vegetais incluem uma variedade diversificada de metabólitos primários, incluindo ácidos fenólicos, ácidos orgânicos e aminoácidos, bem como compostos secundários mais complexos25,26,27. Para cada bactéria, substâncias específicas têm sido demonstradas ter efeitos de recrutamento em exsudatos da rizosfera. Neste campo de pesquisa, muitos dos métodos de quimiotaxis relatados na literatura são altamente dependentes de ensaios. Há relatos sobre uma variedade de abordagens, que todas têm vantagens e desvantagens específicas.
No presente estudo, focamos na introdução de um ensaio de quimiotaxis melhorado para a identificação rápida de quimioattractants rizobacterianos em exsudatos radiculares. Neste protocolo, todos os experimentos foram realizados em condições assépticas. Na etapa 4, usamos o laço de inoculação para conectar a solução aquosa quimioattractant à solução de bactérias, e mantivemos o slide em temperatura ambiente por 20 minutos. Vale ressaltar que a largura da linha de conexão foi controlada para aproximadamente 2 mm, e o experimento deve ser realizado em um ambiente sem vento.
As modificações apropriadas devem ser feitas de acordo com a cepa experimental que está sendo utilizada. O tempo de cultura logarítmica deve ser selecionado de acordo com o ciclo de crescimento de diferentes cepas. Para cepas de diferentes habilidades de enxame, o tempo antes de desconectar a linha de conexão pode ser ajustado adequadamente. Pequenas espécies de bactérias de tamanho pequeno que não podem ser observadas sob um microscópio leve não são adequadas para este método. Por exemplo, nanobactérias podem ser tão pequenas quanto 80 nm de diâmetro e só podem ser vistas através de um microscópio eletrônico. Este método é adequado para cepas com flagela.
O novo método reduz o erro de contagem de placas e encurta o ciclo experimental. Para a identificação de substâncias quimiofos, o novo método pode economizar de 2 a 3 dias. O novo método permite que qualquer pesquisador complete sistematicamente um experimento de quimioterapia bacteriana dentro de 1-2 dias. Comparado com o dispositivo microfluido, o novo método é menos caro. O protocolo também supera algumas deficiências dos métodos tradicionais de quimioterapia bacteriana. Além disso, o novo método pode ser usado de várias outras formas. Por exemplo, devemos utilizar este método para identificar rapidamente bactérias no solo estimuladas por sinais de exsudatos específicos da raiz vegetal. O novo método é simples em design, fácil de executar e tem ótimo valor de aplicação. Este protocolo pode ser apresentado como um recurso valioso para a identificação e compreensão das interações entre plantas e micróbios.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela National Natural Science Foundation of China (Nos. 31870493), os Principais Projetos de Pesquisa e Desenvolvimento em Heilongjiang, China (GA21B007), e as Taxas Básicas de Pesquisa das Universidades da Província de Heilongjiang, China (No. 135409103).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 490-79-9 | |
| Acetonitrile | CNW Technologies | 75-05-8 | |
| Ammonium acetate | CNW Technologies | 631-61-8 | |
| Caffeic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 331-39-5 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Fresco17 | |
| Citric acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 77-92-9 | |
| Clean bench | Shanghai Boxun Industrial Co., Ltd. | BJ-CD | |
| Ferulic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 1135-24-6 | |
| Formic acid | CNW Technologies | 64-18-6 | |
| Fructose | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 57-48-7 | |
| Galactose | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 59-23-4 | |
| Glycine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 56-40-6 | |
| Grinding Mill | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd. |
JXFSTPRP-24 | |
| Histidine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 71-00-1 | |
| Internal standard: 2-Chloro-L-phenylalanine | Shanghai Hengbai Biotech C.,Ltd. | 103616-89-3 | |
| Leucine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 61-90-5 | |
| Malic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 6915-15-7 | |
| Mannose | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 3458-28-4 | |
| Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | Q Exactive Focus | |
| Methanol | CNW Technologies | 67-56-1 | |
| Optical Microscope | Olympus | BX43 | |
| Phenylalanine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 63-91-2 | |
| Proline | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 147-85-3 | |
| Scales | Sartorius | BSA124S-CW | |
| Serine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 56-45-1 | |
| Threonine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 72-19-5 | |
| UHPLC | Agilent | 1290 UHPLC | |
| Ultrasound Instrument | Shenzhen Leidebang Electronics Co., Ltd. |
PS-60AL | |
| Valine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 7004-03-7 |
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