Summary
在这里，我们使用茜素红染色来证明醋酸铅暴露会导致斑马鱼幼虫的骨量变化。这种染色方法可以适用于研究由其他有害毒物引起的斑马鱼幼虫损失的骨质流失。
Abstract
铅（Pb）暴露引起的化学诱导骨质流失可能会对人类和动物骨骼系统产生一系列不利影响。然而，斑马鱼的具体效果和机制尚不清楚。茜素红对钙离子具有很高的亲和力，可以帮助可视化骨骼并说明骨骼矿物质质量。在这项研究中，我们旨在通过使用茜素红染色来检测醋酸铅（PbAc）诱导的斑马鱼幼虫骨质流失。在受精后2至120小时之间用一系列PbAc浓度（0，5，10，20mg / L）处理斑马鱼胚胎。在受精后9天对幼虫进行全支架骨骼染色，并使用ImageJ软件定量总染色面积。结果表明：PbAc暴露组矿化组织呈红色，染色面积显著减少，骨矿化度呈剂量依赖性变化。本文提出了一种染色方案，用于研究PbAc诱导的骨缺损的骨骼变化。该方法还可用于斑马鱼幼虫，以检测由其他化学物质引起的骨质流失。
Introduction
最近的研究证实，糖皮质激素、芳香酶抑制剂和过量饮酒引起的骨质疏松症很常见1，2.铅 （Pb） 是一种有毒金属，存在于植物、土壤和水生环境中3.虽然Pb对人体的不良影响备受关注，但其对骨骼的不可逆影响仍需进一步研究。铅中毒会导致发育和成人骨骼发生多种病理变化，影响正常生活活动。研究发现，慢性铅暴露与骨损伤之间存在关联4，包括骨骼结构受损5，6，骨矿物质密度降低，甚至骨质疏松症风险增加7。
矿化组织对骨强度非常重要8，骨矿化基质沉积是骨形成的关键指标9。茜素红对钙离子具有很高的亲和力，茜素红染色是评估骨形成的标准程序10。根据这种方法，矿化组织被染成红色，而所有其他组织保持透明。然后通过数字图像分析11对染色区域进行量化。
斑马鱼是一种重要的模式生物，广泛用于药物发现和疾病模型。斑马鱼和人类的遗传研究表明，在分子水平上骨骼形态发生的潜在机制相似12。此外，与鼠模型相比，高通量药物或生物分子筛选在大离合斑马鱼中更可行，促进了成骨或骨毒性分子的机理研究13。 toto10 中骨骼的差异染色经常用于研究小型脊椎动物和哺乳动物胎儿的骨骼发育不良。采用茜素红染色法研究斑马鱼幼虫中化学物质的骨发育毒性。本文以铅为例描述了检测斑马鱼幼虫中醋酸铅诱导的骨缺陷的方案。
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Protocol
此处概述的所有动物程序均已由苏州大学伦理委员会动物护理研究所审查和批准。
1. 鱼类饲养与胚胎采集 14
- 每天喂鱼三次;确保斑马鱼保持在28.5±0.5°C，光照/黑暗循环为14：10小时。
- 晚上用产卵池中的隔离板将雄鱼和雌鱼分开，男女比例为2：1。
- 第二天早上，在上午9：00移除隔离板，并在2小时后收集胚胎。
- 在实验前将胚胎置于保持在28.5°C的生化培养箱中。
2. 化学品暴露
- 准备母料：称取乙酸铅三水合物（5克），搅拌将其溶解在超纯水（50毫升）中。
注意：PbAc是有毒的。戴上合适的防尘口罩、防护服和手套。在通风橱下进行实验。 - 选择斑马鱼胚胎并将其随机分配到干净的6孔板中（在3mL斑马鱼繁殖水中每孔30个胚胎;其组成见 表1 ）。在受精后2至120小时（hpf）用PbAc（0，5，10，20mg / L）处理胚胎。
注意：根据剂量范围查找实验选择PbAc的浓度。结果表明：在120 hpf下，斑马鱼胚胎醋酸铅的LC50 为41.044 mg/L。因此，最高浓度设置为LC50 的一半，并通过2倍稀释制备一系列溶液。 - 从受精后 5 天开始每天喂食幼虫 （dpf） 两次。将斑马鱼胚胎保持在28.5±0.5°C，光照/黑暗循环为14：10小时。
- 每 24 小时刷新一次无铅培养基（斑马鱼繁殖水），直到 9 dpf。
注意：实验完成后，将所有含铅溶液倒入指定的液体罐中，并由实验管理中心处理。
3.茜素红染色
注意：在整个染色过程中，请佩戴合适的防尘口罩、防护服和手套。所有溶液的组成如 表1所示。
- 具体染色步骤
注意：染色过程在室温下在24孔板中进行。加入每种溶液后，将24孔板以低速放置在振动台上。- 以 9 dpf 从每组中随机取出 10 只斑马鱼幼虫，并将鱼固定在 1 mL 的 2% 多聚甲醛/1x 磷酸盐缓冲盐水中 2 小时。
- 倒出溶液并用 100 mM Tris-HCl （pH 7.5）/ 10 mM MgCl2 洗涤斑马鱼幼虫 10 分钟。
- 倒出溶液并将幼虫在以下溶液中孵育5分钟以进行脱色：无水乙醇（EtOH）溶液（80%EtOH / 100 mM Tris-HCl （pH 7.5）/ 10 mM MgCl2，50%EtOH / 100 mM Tris-HCl（pH = 7.5）和25%EtOH / 100mM Tris-HCl（pH = 7.5）。
- 倒出溶液，用由3%H2O2 和0.5%KOH组成的溶液漂白除去颜料，每10分钟观察一次，直到色素完全去除。
- 用25%甘油/ 0.1%KOH冲洗斑马鱼幼虫几次，每次10分钟，直到没有气泡。
注意：避免气泡很重要;否则，斑马鱼体内的气泡在显微镜下会出现黑色视野，影响观察和定量分析。 - 通过在 1 mL 的 0.01% 茜素中浸泡 50 分钟来染色幼虫。
- 倒出溶液并加入1mL 50%甘油/ 0.1%KOH10分钟以清除背景。将鱼储存在新鲜的50%甘油/ 0.1%KOH中以供随后观察。
4. 图像采集
- 每次将一只幼虫转移到载玻片上，将幼虫保持在液滴的中间。
- 在体视显微镜下观察幼虫。
- 打开相机，打开软件（请参阅 材料表），并保留默认设置。
- 单击 AE，然后选择适当的曝光时间（本实验中为60毫秒）以获得最佳图像。
- 在相同设置下捕获所有图像。以.tif格式保存图像以供以后分析。
5. 图像分析
注意：有关包含一组用于图像分析的示例图形的示例，请参阅 补充文件 。
- 双击 ImageJ 图标并分析步骤 4.5 中保存的图像。
- 点击 “文件”|” 打开以打开在步骤 4.5 中保存的图像。
- 点击 图片 |键入，选择 8 位。
- 点击 编辑 |反转。
- 点击 “分析”|”校准，在弹出的界面中选择 未校准的OD ，勾选下方界面左下角的 全局校准 ，点击 确定。
- 点击“分析”|”设置比例 |单击以在弹出的界面中去除比例，选中下面的全局，然后单击确定。
- 点击 “分析”|”设置测量，在弹出界面中选择项目 区域 ，选中下面的 限制 阈值（仅测量所选范围），然后单击 确定。
- 点击 图片 |调整|阈值，滑动弹出界面中间的滑块以选择合适的阈值（更改每个图像的阈值），以便选中一个图像中要测试的所有目标，然后单击 设置。
- 点击 “分析”|”测量。记录每个组的日期。
- 使用单因素方差分析，然后使用Tukey的多重比较检验来分析差异，并将显著性水平设置为 p < 0.001 （***）。
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Representative Results
茜素红染色是测量斑马鱼幼虫骨矿化变化的灵敏特异方法。在这项研究中，我们观察到PbAc对斑马鱼幼虫有不利影响，包括死亡、畸形、心率下降和体长缩短。此外，还评估了斑马鱼幼虫的矿物骨骼区域，以检查PbAc诱导的骨质流失。在9 dpf（图1A）时，头部骨骼的许多骨骼被矿化，因此染成红色，例如蝶旁（PS），眼睑（OP），角分支（CB）和脊索（NC）。相比之下，耳石（OT）（非骨结构）呈现棕黑色而不是红色。进行数字分析以量化每张图像中的总染色区域。与对照组相比，用10和20 mg/L PbAc处理的醋酸铅组染色区域显着降低（p < 0.001）（图1B）。骨矿化的变化显示出剂量依赖性。
图1：不同浓度的PbAc对斑马鱼幼虫头骨的影响 。 （A）在9 dpf幼虫中用茜素红色染色的头骨背侧图像。矿化组织染成红色。比例尺 = 0.5 毫米。 （B） 9 dpf时相对矿化面积的变化;每组10只幼虫。数据表示为SEM±平均值。进行了三次重复。 p < 0.001 ***。缩写：PS = 副蝶骨;OP = 操作;OT = 耳石;CB = 角分支;NC = 公元;DPF = 受精后的天数。 请点击此处查看此图的大图。
| 溶液 | 组成 | |
| 斑马鱼养殖水 | pH 7-7.3， 27-29 °C， 电导率 450-550 μs， 盐度 0.25-0.75 %0， 溶解氧 >6 mg/L， 光周期 14/10 h， 硬度 100-200 mg/L， 氯 0 mg/L， 氨氮浓度 <0.02 mg/L， 亚硝酸盐 <1 mg/L， 硝酸盐 <50 mg/L， 二氧化碳 <50 mg/L | |
| 2% 多聚甲醛和 1x PBS 的混合溶液 （50 mL） | 25 mL 4% 多聚甲醛、5 mL 10x PBS 缓冲液和双蒸水 （ddH2O） 至 50 mL | |
| 100 mM Tris-HCl （pH 7.5） 和 10 mM MgCl2 的混合溶液 （50 mL） | 5 mL 的 1 M Tris-HCl （pH=7.5）、0.5 mL 的 1 M MgCl 2 和ddH 2O q.s. 至 50 mL | |
| 80% 无水乙醇、10 mM MgCl2 和 100 mM Tris-HCl 的混合溶液 （50 mL） （pH=7.5） | 42.1 mL 95% 无水乙醇、5 mL 1 M Tris-HCl （pH=7.5）、0.5 mL 1 M MgCl 2 和 ddH2O q.s. 至 50 mL | |
| 50% 无水乙醇和 100 mM Tris-HCl 的混合溶液 （50 mL） （pH=7.5） | 26.3 mL 95% 无水乙醇、5 mL 1 M Tris-HCl （pH=7.5） 和ddH 2O q.s. 至 50 mL | |
| 25% 无水乙醇和 100 mM Tris-HCl 的混合溶液 （50 mL） （pH=7.5） | 13.2 mL 95% 无水乙醇、5 mL 1 M Tris-HCl （pH=7.5） 和ddH 2O q.s. 至 50 mL | |
| 3% H 2 O2溶液和0.5% KOH溶液的混合溶液 | 使用前混合等量的6%H2O2 和1%KOH | |
| 25% 甘油和 0.1% KOH 的混合溶液 （50 mL） | 12.5 mL 100% 甘油、0.25 mL 20% KOH 和ddH 2O q.s. 至 50 mL | |
| 0.01% 茜素（50 毫升） | 1 mL 0.5% 茜素、12.5 mL 100% 甘油、5 mL 1 M Tris-HCl （pH = 7.5） 和 ddH2O q.s. 至 50 mL | |
| 50%甘油和0.1%KOH的混合溶液（50 mL） | 25 mL 100% 甘油、0.25 mL 20% KOH 和ddH 2O q.s. 至 50 mL | |
表1：茜素红染色方案中使用的溶液组成。 缩写：q.s. = 量子足够（根据需要）。
补充文件：一组用于图像分析的示例图形。请点击此处下载此文件。
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Discussion
斑马鱼是研究骨代谢疾病的合适模型。与啮齿动物模型相比，斑马鱼模型的建立速度相对较快，并且更容易测量疾病的严重程度。在野生型斑马鱼幼虫中，头部骨骼的矿化发生在5 dpf，轴骨架的矿化发生在7 dpf15。因此，颅骨如PS，OP，CB和NC在9 dpf时发育良好。幼虫完全脱色漂白后，清除软组织，使鱼体外观透明。加入茜素红染色试剂，对斑马鱼的矿骨进行染色和可视化。
图像分析对于获得本实验的可靠实验结论至关重要。选择姿势良好、背景干净的斑马鱼照片进行定量分析。当我们量化单个图像的染色区域时，将计算一条鱼的所有红色矿化骨头。因此，我们可以比较铅暴露组和对照组之间的骨量变化。在这项研究中，PbAc暴露导致斑马鱼的发育毒性，并且在9 dpf的10和20 mg / L PbAc暴露组中观察到矿骨染色面积显着减少。因此，早期胚胎暴露于PbAc降低了斑马鱼幼虫的骨量。 图1 显示了斑马鱼幼虫中通过茜素红染色观察到的PbAc诱导的骨质流失。
与钙化基质结合的染料用于标记整个骨架。钙黄绿素是一种荧光发色团，也可以特异性地与活组织中的钙结合，并已用于标记骨骼结构和研究骨骼生长10。与钙黄绿素不同，固定组织的茜素红染色可产生骨骼变化的永久记录，便于比较几个标本。显微计算机断层扫描（Micro CT）可以通过获取一系列2D X射线来提供矿化组织的准确定量分析。然而，由于斑马鱼的体积小，而且发育中的斑马鱼骨骼的许多骨骼很薄，Micro CT分析工具无法准确表征这些骨骼16。
荧光转基因报告系还有助于实时可视化活幼虫甚至更成熟鱼类的骨骼发育17。同样，茜素红S 体内 染色允许评估活鱼和连续跟踪畸形18。因此，茜素红染色是分析斑马鱼幼虫骨质流失的有用且具有成本效益的方法。但是，由于实验步骤的复杂性和所用溶液的数量，分析茜素红染图像的最终结果可能会受到实验操作的影响。此外，由于体体积和软组织增加，很难将这种染色方法用于成年斑马鱼;显微CT分析或转基因系将是成年斑马鱼骨骼成像的更好选择。总之，这里介绍的方案可用于研究化学毒物暴露后斑马鱼幼虫骨矿化的变化。该程序可用于建立斑马鱼模型以研究骨骼疾病和开发新的治疗药物。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
这项工作得到了国家自然科学基金（81872646; 81811540034; 81573173）和江苏省高等教育机构优先学术项目开发（PAPD）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Tris-HCl (pH=7.5) | Solarbio,Beijing,China | 21 | for detaining |
| 4% Paraformaldehyde Fix Solution | BBI,Shanghai,China | 14 | fixing tissues |
| 10x PBS buffer | BBI,Shanghai,China | 15 | for fixing |
| 35% H2O2 | Yonghua,Jiangsu,China | 8 | removing pigment |
| 50 mL Centrifuge tube | AKX,Jiangsu,China | 4 | |
| 95% Anhydrous ethanol | Enox,Jiangsu,China | 2 | destaining |
| Alizarin red (Purity 99.5%) | Solarbio,Beijing,China | 1 | staining |
| Biochemical incubator | Yiheng,Shanghai,China | 3 | raising zebrafish embryos |
| Electronic scale | Sartorius,Germany | 5 | weighing the solid raw materials |
| Glycerin (Purity 99.5%) | BBI,Shanghai,China | 7 | storing the stained fish |
| ImageJ (software) | USA | 9 | digital analysis |
| KOH (Purity 99.9%) | Sigma,America | 10 | bleaching solution |
| Lead acetate trihydrate (Purity 99.5%) | Aladdin,Shanghai,China | 11 | |
| MgCl2 (Purity 99.9%) | Aladdin,Shanghai,China | 12 | cleaning solution |
| NIS-Elements F (software) | Nikon, Japan | 13 | observing and taking photos |
| Pipe | AKX, Jiangsu, China | 18 | removal of embryos and solution |
| plates (24-well) | Corning,America | 17 | container for staining embryos |
| plates (6-well) | Corning,America | 16 | container for breeding embryos |
| Shaking table | Beyotime, China | 19 | mixing the solution |
| Stereo microscope | Nikon,Japan | 20 | observing and taking photos |
| Zebrafish | Zebrafish Experiment Center of Soochow University,Suzhou,China | 22 | experimental animal |
References
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