Summary
Здесь мы использовали красное окрашивание ализарином, чтобы показать, что воздействие ацетата свинца вызывает изменение костной массы у личинок рыбок данио. Этот метод окрашивания может быть адаптирован для исследования потери костной массы у личинок рыбок данио, вызванной другими опасными токсикантами.
Abstract
Химически индуцированная потеря костной массы из-за воздействия свинца (Pb) может вызвать множество неблагоприятных воздействий как на скелетные системы человека, так и на животных. Тем не менее, конкретные эффекты и механизмы у рыбок данио остаются неясными. Красный ализарин обладает высоким сродством к ионам кальция и может помочь визуализировать кость и проиллюстрировать скелетную минеральную массу. В этом исследовании мы стремились обнаружить потерю костной массы, вызванную ацетатом свинца (PbAc), у личинок рыбок данио с помощью красного окрашивания ализарином. Эмбрионы рыбок данио обрабатывали серией концентраций PbAc (0, 5, 10, 20 мг/л) между 2 и 120 ч после оплодотворения. Окрашивание скелета цельным креплением проводилось на личинках через 9 дней после оплодотворения, а общая площадь окрашивания была количественно определена с помощью программного обеспечения ImageJ. Результаты показали, что минерализованные ткани были окрашены в красный цвет, а окрашенная область значительно уменьшилась в группе воздействия PbAc с дозозависимым изменением минерализации кости. В данной статье представлен протокол окрашивания для исследования скелетных изменений в PbAc-индуцированных костных дефектах. Метод также может быть использован у личинок рыбок данио для обнаружения потери костной массы, вызванной другими химическими веществами.
Introduction
Недавние исследования подтвердили, что остеопороз из-за глюкокортикоидов, ингибиторов ароматазы и чрезмерного употребления алкоголя распространен 1,2. Свинец (Pb) является токсичным металлом, обнаруженным в растениях, почве и водной среде3. Хотя неблагоприятное воздействие Pb на организм человека привлекло большое внимание, его необратимое влияние на кости нуждается в дальнейшем исследовании. Свинцовая интоксикация вызывает разнообразный спектр патологических изменений как в развивающемся, так и во взрослом скелете, влияя на нормальную жизнедеятельность. Исследования обнаружили связь между хроническим воздействием Pb и повреждением костей4, включая нарушение костных структур 5,6, снижение минеральной плотности кости и даже повышенный риск остеопороза7.
Минерализованная ткань имеет большое значение для прочности кости8, а отложение матрицы минерализации кости является критическим показателем костного образования9. Ализарин красный имеет высокое сродство к ионам кальция, а окрашивание ализариновым красным является стандартной процедурой оценки формирования кости10. Согласно этому методу, минерализованная ткань окрашивается в красный цвет, в то время как вся остальная ткань остается прозрачной. Затем окрашенная область количественно определяется с помощью анализа11 цифрового изображения.
Рыбка данио является важным модельным организмом, широко используемым в моделях открытия лекарств и заболеваний. Генетические исследования на рыбках данио и людях продемонстрировали сходство в основных механизмах морфогенеза скелета на молекулярном уровне12. Кроме того, высокопроизводительный скрининг лекарств или биомолекул более осуществим в больших скоплениях рыбок данио, чем мышиные модели, что облегчает механистическое изучение проостеогенных или остеотоксических молекул13. Дифференциальное окрашивание скелета в toto10 часто используется при изучении дисплазии скелета у мелких позвоночных и плодов млекопитающих. Красное окрашивание ализарином было выполнено для исследования токсичности химических веществ для развития костей у личинок рыбок данио. Здесь мы использовали свинец в качестве примера для описания протокола обнаружения костных дефектов, вызванных ацетатом свинца, у личинок рыбок данио.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры для животных, описанные здесь, были рассмотрены и одобрены Институтом по уходу за животными Комитета по этике Университета Сучжоу.
1. Рыбоводство и сбор эмбрионов 14
- Кормить рыбу три раза в день; убедитесь, что рыбки данио поддерживаются при температуре 28,5 ± 0,5 ° C с циклом 14:10 ч света / темноты.
- Разделите самцов и самок взрослых рыб с помощью изоляционных досок в нерестилищах при соотношении самцов и самок 2:1 вечером.
- На следующее утро снимите изоляционные доски в 9:00 утра и соберите эмбрионы через 2 часа.
- Поместите эмбрионы в биохимический инкубатор, поддерживаемый при температуре 28,5 °C перед экспериментом.
2. Химическое воздействие
- Подготовьте материнский бульон: взвесьте тригидрат ацетата свинца (5 г) и растворите его в сверхчистой воде (50 мл) при перемешивании.
ВНИМАНИЕ: PbAc токсичен. Носите подходящие пылевые маски, защитную одежду и перчатки. Проведите эксперимент под вытяжным кожухом. - Отбирайте и случайным образом распределяйте эмбрионы рыбок данио по чистым 6-луночным пластинам (30 эмбрионов на лунку в 3 мл воды для размножения рыбок данио; см. таблицу 1 для его состава). Обработайте эмбрионы PbAc (0, 5, 10, 20 мг/л) от 2 до 120 ч после оплодотворения (HPF).
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрации PbAc были выбраны в соответствии с экспериментами по определению диапазона доз. Результаты показали, что LC50 ацетата свинца на эмбрионах рыбок данио составлял 41,044 мг / л при 120 л.с. Следовательно, наибольшую концентрацию устанавливали на половину ЛК50 и серию растворов, приготовленных 2-кратным разбавлением. - Кормите личинок два раза в день с 5 дней после оплодотворения (дпф). Поддерживайте эмбрионы рыбок данио при температуре 28,5 ± 0,5 °C с циклом 14:10 ч света/темноты.
- Обновляйте среду без Pb (воду для размножения рыбок данио) каждые 24 ч до 9 dpf.
ПРИМЕЧАНИЕ: По завершении экспериментов все свинцовосодержащие растворы выливались в специальный резервуар для жидкости и обрабатывались центром управления экспериментом.
3. Ализарин красное окрашивание
ПРИМЕЧАНИЕ: Носите подходящие пылевые маски, защитную одежду и перчатки в течение всего процесса окрашивания. Составы всех растворов приведены в таблице 1.
- Специальные этапы окрашивания
ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс окрашивания проводили в 24-луночной плите при комнатной температуре. После того, как каждый раствор был добавлен, поместите 24-луночную тарелку на встряхивающий стол, установленный на низкой скорости.- Удалите 10 личинок рыбок данио случайным образом из каждой группы при 9 dpf и зафиксируйте рыбу в 1 мл 2% параформальдегида / 1x фосфатно-буферного физиологического раствора в течение 2 ч.
- Деканировать раствор и промыть личинок рыбок данио 100 мМ Tris-HCl (рН 7,5)/10 мМMgCl2 в течение 10 мин.
- Декантируйте раствор и инкубируйте личинки в следующих растворах в течение 5 мин каждый для очистки: раствор безводного этанола (EtOH) (80% EtOH/100 мМ Tris-HCl (pH 7,5)/10 мМ MgCl2, 50% EtOH/100 мМ Tris-HCl (pH=7,5) и 25% EtOH/100mM Tris-HCl (pH=7,5).
- Деканировать раствор, удалить пигмент путем отбеливания раствором, состоящим из 3% H2O2 и 0,5% KOH, и наблюдать один раз в 10 мин до полного удаления пигмента.
- Промыть личинок рыбок данио несколько раз 25% глицерина / 0,1% KOH в течение 10 минут каждый, пока не останется пузырьков.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно избегать пузырьков; в противном случае пузырьки в теле рыбки данио будут появляться в виде черного поля зрения под микроскопом, что повлияет на наблюдения и количественный анализ. - Окрашивают личинки, замачивая в 1 мл 0,01% ализарина в течение 50 мин.
- Деканировать раствор и добавить 1 мл 50% глицерина/0,1% КОН в течение 10 мин для очистки фона. Храните рыбу в свежем 50% глицерине / 0,1% KOH для последующего наблюдения.
4. Получение изображений
- Каждый раз переносите одну личинку на стеклянную горку, удерживая личинку в середине капли жидкости.
- Наблюдайте за личинками под стереомикроскопом.
- Включите камеру, откройте программное обеспечение (см. Таблицу материалов) и сохраните настройки по умолчанию.
- Нажмите на AE и выберите подходящее время экспозиции (60 мс в этом эксперименте), чтобы получить лучшее изображение.
- Захват всех изображений с одинаковыми настройками. Сохраните изображения в .tif формате для последующего анализа.
5. Анализ изображений
ПРИМЕЧАНИЕ: См. файл Supplemental для примера с набором образцов графиков для анализа изображений.
- Дважды щелкните значок ImageJ и проанализируйте изображения, сохраненные на шаге 4.5.
- Нажмите на Файл | Откройте , чтобы открыть изображения, сохраненные на шаге 4.5.
- Нажмите на изображение | Введите, выберите 8-бит.
- Нажмите на Редактировать | Инвертировать.
- Нажмите на Анализ | Откалибруйте, выберите Некалиброванный OD во всплывающем интерфейсе, проверьте Глобальная калибровка в левом нижнем углу нижнего интерфейса и нажмите кнопку ОК.
- Нажмите на Анализ | Установить масштаб | Щелкните, чтобы Удалить масштаб во всплывающем интерфейсе, установите флажок Глобальный ниже и нажмите кнопку ОК.
- Нажмите на Анализ | Установите параметр «Измерения», выберите область элемента во всплывающем интерфейсе, установите флажок Ограничить пороговое значение ниже (чтобы измерить только выбранный диапазон) и нажмите кнопку «ОК».
- Нажмите на изображение | Настроить| Пороговое значение, сдвиньте ползунок в середине всплывающего интерфейса, чтобы выбрать соответствующее пороговое значение (измените пороговое значение для каждого изображения), чтобы были выбраны все цели, которые будут протестированы в одном изображении, и нажмите кнопку Установить.
- Нажмите на Анализ | Мера. Запишите даты каждой группы.
- Используйте одностороннюю ANOVA, за которой следует множественный сравнительный тест Туки, чтобы проанализировать различия, и установите уровень значимости на уровне p < 0,001 (***).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Красное окрашивание ализарином является чувствительным и специфическим методом измерения изменений минерализации костей у личинок рыбок данио. В этом исследовании мы заметили, что PbAc оказывает неблагоприятное воздействие на личинок рыбок данио, включая смерть, пороки развития, снижение частоты сердечных сокращений и сокращение длины тела. Кроме того, минеральные области скелета личинок рыбок данио были оценены для изучения потери костной массы, вызванной PbAc. При 9 dpf (рисунок 1A) многие кости скелета головы минерализуются и, следовательно, окрашиваются в красный цвет, такие как парасфеноид (PS), оперкул (OP), цератобранхиальный (CB) и нотохорд (NC). Напротив, отолиты (OT) (некостные структуры) кажутся коричнево-черными, а не красными. Цифровой анализ был выполнен для количественной оценки общей окрашенной площади на каждом изображении. По сравнению с контрольной группой, группы ацетата свинца, получавшие 10 и 20 мг/л PbAc, показали значительное снижение (p < 0,001) в окрашенной области (рисунок 1B). Изменения в минерализации костей показали дозозависимость.
Рисунок 1: Влияние различных концентраций PbAc на череп личинок рыбок данио. (A) Изображения дорсального аспекта головной кости, окрашенной ализариновым красным цветом в личинках при 9 dpf. Минерализованная ткань окрашивается в красный цвет. Шкала стержней = 0,5 мм. (B) Изменение относительной минерализованной площади при 9 dpf; 10 личинок в группе. Данные выражаются как среднее ± SEM. Было выполнено три реплики. p < 0,001 ***. Сокращения: PS = парасфеноид; ОП = оперкл; ОТ = отолит; CB = цератобранхиальный; NC = нотохорд; dpf = дни после оплодотворения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Решение | Состав | |
| Вода для размножения рыбок данио | pH 7-7,3, 27-29 °C, проводимость 450-550 мкс, соленость 0,25-0,75 %0, растворенный кислород >6 мг/л, фотопериод 14/10 ч, твердость 100-200 мг/л, хлор 0 мг/л, концентрация аммиачного азота <0,02 мг/л, нитрит <1 мг/л, нитрат <50 мг/л, углекислый газ <50 мг/л | |
| Смешанный раствор (50 мл) 2% параформальдегида и 1x PBS | 25 мл 4% параформальдегида, 5 мл 10x буфера PBS и двойная дистиллированная вода (ddH2O) от 50 мл | |
| Смешанный раствор (50 мл) 100 мМ Tris-HCl (рН 7,5) и 10 мМ MgCl2 | 5 мл 1 М Трис-HCl (рН=7,5), 0,5 мл 1 ММгCl2 и ddH2O к.с. до 50 мл | |
| Смешанный раствор (50 мл) 80% безводного этанола, 10 мМMgCl2 и 100 мМ Tris-HCl (pH=7,5) | 42,1 мл 95% безводного этанола, 5 мл 1 М Трис-HCl (рН=7,5), 0,5 мл 1 ММгЛ2 и ddH2O кв.с. до 50 мл | |
| Смешанный раствор (50 мл) 50% безводного этанола и 100 мМ Tris-HCl (pH=7,5) | 26,3 мл 95% безводного этанола, 5 мл 1 М Трис-HCl (рН=7,5) и ddH2O к.с. до 50 мл | |
| Смешанный раствор (50 мл) 25% безводного этанола и 100 мМ Tris-HCl (pH=7,5) | 13,2 мл 95% безводного этанола, 5 мл 1 М Трис-HCl (рН=7,5) и ddH2O кв.с. до 50 мл | |
| Смешанный раствор 3% раствора H2O 2 и 0,5% раствора KOH | Равные количества 6% H2O2 и 1% KOH, смешанные перед использованием | |
| Смешанный раствор (50 мл) 25% глицерина и 0,1% КОН | 12,5 мл 100% глицерина, 0,25 мл 20% KOH и ddH2Oq.s. до 50 мл | |
| 0.01% Ализарин (50 мл) | 1 мл 0,5% ализарина, 12,5 мл 100% глицерина, 5 мл 1 М Трис-HCl (рН=7,5) и ddH2O кв.с. до 50 мл | |
| Смешанный раствор (50 мл) 50% глицерина и 0,1% КОН | 25 мл 100% глицерина, 0,25 мл 20% КОН и ddH2Oк/с до 50 мл | |
Таблица 1: Состав растворов, используемых в протоколе окрашивания ализарина красным цветом. Аббревиатура: q.s. = квантовый достаточный (по мере необходимости).
Дополнительный файл: набор образцов графиков для анализа изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Рыбка данио является подходящей моделью для изучения метаболических заболеваний костей. По сравнению с моделями грызунов, модели рыбок данио относительно быстро устанавливаются, а измерение тяжести заболевания проще. У личинок рыбок данио дикого типа минерализация головного скелета происходит при 5 dpf и осевого скелета при 7 dpf15. Таким образом, черепные кости, такие как PS, OP, CB и NC, хорошо развиты при 9 dpf. После того, как личинки были полностью очищены и обесцвечены, мягкие ткани были очищены, в результате чего появился прозрачный вид тела рыбы. Красный окрашивающий реагент ализарина был добавлен для окрашивания и визуализации минеральных костей у рыбок данио в красном цвете.
Анализ изображений имеет решающее значение для получения надежных экспериментальных выводов в этом эксперименте. Для количественного анализа были отобраны фотографии рыбок данио с хорошей осанкой и чистым фоном. Когда мы количественно оцениваем окрашенную область для одного изображения, будут рассчитаны все минерализованные кости, окрашенные в красный цвет одной рыбы. Таким образом, мы можем сравнить изменения костной массы между группами, подвергшимися воздействию свинца, и контрольной группами. В этом исследовании воздействие PbAc вызывало токсичность для развития у рыбок данио, и значительное снижение окрашенной области минеральной кости наблюдалось в группах воздействия 10 и 20 мг / л PbAc при 9 dpf. Таким образом, раннее эмбриональное воздействие PbAc уменьшало костную массу личинок рыбок данио. На рисунке 1 показана PbAc-индуцированная потерей костной массы, визуализированной красным окрашиванием ализарина в личинках рыбок данио.
Красители, которые связываются с кальцинированной матрицей, используются для маркировки всего скелета. Кальцеин представляет собой флуоресцентный хромофор, который также может специфически связываться с кальцием в живой ткани и использовался для маркировки костных структур и изучения роста костей10. В отличие от кальцеина, ализариновое красное окрашивание неподвижной ткани генерирует постоянную запись скелетных изменений, которая может облегчить сравнение нескольких образцов. Микрокомпьютерная томография (Микро КТ) может обеспечить точный количественный анализ минерализованной ткани путем получения серии 2D-рентгеновских лучей. Однако из-за небольшого размера рыбок данио и того, что многие кости развивающегося скелета рыбки данио являются тонкими, инструменты анализа Микро КТ не могут точноохарактеризовать эти кости 16.
Флуоресцентные трансгенные репортерные линии также помогают визуализировать развитие скелета у живых личинок или даже более зрелых рыб в режиме реального времени17. Аналогичным образом, окрашивание ализариновым красным S in vivo позволяет оценивать живую рыбу и непрерывно отслеживать пороки развития18. Таким образом, окрашивание ализариновым красным цветом является полезным и экономически эффективным способом анализа потери костной массы у личинок рыбок данио. Однако из-за сложности экспериментальных этапов и количества используемых растворов на окончательные результаты анализа изображений ализарина красного цвета может повлиять экспериментальная операция. Кроме того, трудно использовать этот метод окрашивания для взрослых рыбок данио из-за увеличения объема тела и мягких тканей; Микро-КТ-анализ или трансгенные линии были бы лучшим выбором для скелетной визуализации взрослых рыбок данио. Таким образом, представленный здесь протокол может быть использован для изучения изменений минерализации костей у личинок рыбок данио после воздействия химических токсикантов. Эта процедура может быть полезна для создания модели рыбок данио для изучения заболеваний костей и разработки новых терапевтических препаратов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (81872646; 81811540034; 81573173) и Приоритетной академической программой развития высших учебных заведений Цзянсу (PAPD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Tris-HCl (pH=7.5) | Solarbio,Beijing,China | 21 | for detaining |
| 4% Paraformaldehyde Fix Solution | BBI,Shanghai,China | 14 | fixing tissues |
| 10x PBS buffer | BBI,Shanghai,China | 15 | for fixing |
| 35% H2O2 | Yonghua,Jiangsu,China | 8 | removing pigment |
| 50 mL Centrifuge tube | AKX,Jiangsu,China | 4 | |
| 95% Anhydrous ethanol | Enox,Jiangsu,China | 2 | destaining |
| Alizarin red (Purity 99.5%) | Solarbio,Beijing,China | 1 | staining |
| Biochemical incubator | Yiheng,Shanghai,China | 3 | raising zebrafish embryos |
| Electronic scale | Sartorius,Germany | 5 | weighing the solid raw materials |
| Glycerin (Purity 99.5%) | BBI,Shanghai,China | 7 | storing the stained fish |
| ImageJ (software) | USA | 9 | digital analysis |
| KOH (Purity 99.9%) | Sigma,America | 10 | bleaching solution |
| Lead acetate trihydrate (Purity 99.5%) | Aladdin,Shanghai,China | 11 | |
| MgCl2 (Purity 99.9%) | Aladdin,Shanghai,China | 12 | cleaning solution |
| NIS-Elements F (software) | Nikon, Japan | 13 | observing and taking photos |
| Pipe | AKX, Jiangsu, China | 18 | removal of embryos and solution |
| plates (24-well) | Corning,America | 17 | container for staining embryos |
| plates (6-well) | Corning,America | 16 | container for breeding embryos |
| Shaking table | Beyotime, China | 19 | mixing the solution |
| Stereo microscope | Nikon,Japan | 20 | observing and taking photos |
| Zebrafish | Zebrafish Experiment Center of Soochow University,Suzhou,China | 22 | experimental animal |
References
- Compston, J., et al. Recommendations for the registration of agents for prevention and treatment of glucocorticoid-induced osteoporosis: an update from the Group for the Respect of Ethics and Excellence in Science. Osteoporosis International. 19 (9), 1247-1250 (2008).
- Rachner, T. D., Gobel, A., Jaschke, N. P., Hofbauer, L. C. Challenges in preventing bone loss induced by aromatase inhibitors. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 105 (10), (2020).
- Kataba, A., et al. Acute exposure to environmentally relevant lead levels induces oxidative stress and neurobehavioral alterations in larval zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 227, 105607 (2020).
- Morin, S. N., et al. Differences in fracture prevalence and in bone mineral density between Chinese and White Canadians: the Canadian Multicentre Osteoporosis Study (CaMos). Archives of Osteoporosis. 15 (1), 147 (2020).
- Lee, C. M., et al. Chronic lead poisoning magnifies bone detrimental effects in an ovariectomized rat model of postmenopausal osteoporosis. Experimental Toxicologic Pathology. 68 (1), 47-53 (2016).
- Theppeang, K., et al. Associations of bone mineral density and lead levels in blood, tibia, and patella in urban-dwelling women. Environmental Health Perspectives. 116 (6), 784-790 (2008).
- Sun, Y., et al. Osteoporosis in a Chinese population due to occupational exposure to lead. American Journal Industrial Medicine. 51 (6), 436-442 (2008).
- Guadalupe-Grau, A., Fuentes, T., Guerra, B., Calbet, J. A. L. Exercise and bone mass in adults. Sports Medicine. 39 (6), 439-468 (2009).
- Ottani, V., Raspanti, M., Ruggeri, A. Collagen structure and functional implications. Micron. 32 (3), 251-260 (2001).
- Kelly, W. L., Bryden, M. M. A modified differential stain for cartilage and bone in whole mount preparations of mammalian fetuses and small vertebrates. Stain Technology. 58 (3), 131-134 (1983).
- Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis. Biotechnology Journal. 1 (6), 651-655 (2006).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Fernandez, I., Gavaia, P. J., Laize, V., Cancela, M. L. Fish as a model to assess chemical toxicity in bone. Aquatic Toxicology. 194, 208-226 (2018).
- Wang, L., et al. Role of GH/IGF axis in arsenite-induced developmental toxicity in zebrafish embryos. Ecotoxicology Environmental Safety. 201, 110820 (2020).
- Bergen, D. J. M., Kague, E., Hammond, C. L. Zebrafish as an emerging model for osteoporosis: a primary testing platform for screening new osteo-active compounds. Frontiers in Endocrinology. 10, 6 (2019).
- Charles, J. F., et al. Utility of quantitative micro-computed tomographic analysis in zebrafish to define gene function during skeletogenesis. Bone. 101, 162-171 (2017).
- Hammond, C. L., Moro, E. Using transgenic reporters to visualize bone and cartilage signaling during development in vivo. Frontiers in Endocrinology. 3, 91 (2012).
- Bensimon-Brito, A., et al. Revisiting in vivo staining with alizarin red S--a valuable approach to analyse zebrafish skeletal mineralization during development and regeneration. BMC Developmental Biology. 16, 2 (2016).
