Summary
Qui, abbiamo usato la colorazione rosso alizarina per dimostrare che l'esposizione all'acetato di piombo provoca un cambiamento di massa ossea nelle larve di zebrafish. Questo metodo di colorazione può essere adattato allo studio della perdita ossea nella perdita di larve di zebrafish indotta da altre sostanze tossiche pericolose.
Abstract
La perdita ossea indotta chimicamente dovuta all'esposizione al piombo (Pb) potrebbe innescare una serie di impatti avversi sui sistemi scheletrici sia umani che animali. Tuttavia, gli effetti e i meccanismi specifici del pesce zebra rimangono poco chiari. Il rosso alizarina ha un'alta affinità per gli ioni calcio e può aiutare a visualizzare l'osso e illustrare la massa minerale scheletrica. In questo studio, abbiamo mirato a rilevare la perdita ossea indotta dall'acetato di piombo (PbAc) nelle larve di zebrafish utilizzando la colorazione rosso alizarina. Gli embrioni di zebrafish sono stati trattati con una serie di concentrazioni di PbAc (0, 5, 10, 20 mg/L) tra 2 e 120 ore dopo la fecondazione. La colorazione scheletrica a montaggio intero è stata condotta sulle larve a 9 giorni dopo la fecondazione e l'area totale colorata è stata quantificata utilizzando il software ImageJ. I risultati hanno indicato che i tessuti mineralizzati erano colorati in rosso e l'area colorata diminuiva significativamente nel gruppo di esposizione al PbAc, con un cambiamento dose-dipendente nella mineralizzazione ossea. Questo documento presenta un protocollo di colorazione per studiare i cambiamenti scheletrici nei difetti ossei indotti da PbAc. Il metodo può essere utilizzato anche nelle larve di zebrafish per la rilevazione della perdita ossea indotta da altre sostanze chimiche.
Introduction
Studi recenti hanno confermato che l'osteoporosi dovuta a glucocorticoidi, inibitori dell'aromatasi e consumo eccessivo di alcol è comune 1,2. Il piombo (Pb) è un metallo tossico presente nelle piante, nel suolo e negli ambienti acquatici3. Sebbene gli effetti avversi del Pb sul corpo umano abbiano attirato molta attenzione, il suo impatto irreversibile sull'osso deve essere studiato ulteriormente. L'intossicazione da piombo provoca una vasta gamma di cambiamenti patologici sia nello scheletro in via di sviluppo che in quello adulto, influenzando le normali attività della vita. Gli studi hanno trovato un'associazione tra esposizione cronica a Pb e danno osseo4, tra cui strutture ossee compromesse5,6, ridotta densità minerale ossea e persino aumento del rischio di osteoporosi7.
Il tessuto mineralizzato è di grande importanza per la resistenza ossea8 e la deposizione della matrice di mineralizzazione ossea è un indice critico della formazione ossea9. Il rosso alizarina ha un'alta affinità per gli ioni calcio e la colorazione rosso alizarina è una procedura standard per valutare la formazione ossea10. Secondo questo metodo, il tessuto mineralizzato è colorato di rosso, mentre tutto il resto del tessuto rimane trasparente. L'area colorata viene quindi quantificata mediante analisi digitale delle immagini11.
Il pesce zebra è un importante organismo modello ampiamente utilizzato nella scoperta di farmaci e nei modelli di malattia. Studi genetici nel pesce zebra e nell'uomo hanno dimostrato somiglianze nei meccanismi alla base della morfogenesi scheletrica a livello molecolare12. Inoltre, lo screening di farmaci o biomolecole ad alto rendimento è più fattibile in grandi covate di zebrafish rispetto ai modelli murini, facilitando lo studio meccanicistico di molecole proosteogeniche o osteotossiche13. La colorazione differenziale dello scheletro in toto10 è frequentemente utilizzata nello studio della displasia scheletrica nei piccoli vertebrati e nei feti di mammiferi. La colorazione rossa dell'alizarina è stata eseguita per studiare la tossicità dello sviluppo osseo delle sostanze chimiche nelle larve di zebrafish. Qui, abbiamo usato il piombo come esempio per descrivere un protocollo per rilevare difetti ossei indotti dall'acetato di piombo nelle larve di zebrafish.
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Protocol
Tutte le procedure per animali descritte qui sono state esaminate e approvate dall'Animal Care Institute del Comitato Etico della Soochow University.
1. Allevamento ittico e raccolta di embrioni 14
- Dai da mangiare ai pesci tre volte al giorno; assicurarsi che i pesci zebra siano mantenuti a 28,5 ± 0,5 °C con un ciclo luce/buio di 14:10 h.
- Separare il pesce adulto maschio e femmina da tavole di isolamento in vasche di deposizione delle uova con un rapporto maschio-femmina di 2: 1 la sera.
- La mattina seguente, rimuovere le tavole di isolamento alle 9:00 e raccogliere gli embrioni 2 ore dopo.
- Mettere gli embrioni in un incubatore biochimico mantenuto a 28,5 °C prima dell'esperimento.
2. Esposizione chimica
- Preparare il brodo madre: pesare l'acetato di piombo triidrato (5 g) e scioglierlo in acqua ultrapura (50 ml) agitando.
ATTENZIONE: PbAc è tossico. Indossare maschere antipolvere, indumenti protettivi e guanti adatti. Eseguire l'esperimento sotto una cappa aspirante. - Selezionare e distribuire casualmente gli embrioni di zebrafish in piastre pulite a 6 pozzetti (30 embrioni per pozzetto in 3 ml di acqua di riproduzione del pesce zebra; vedere Tabella 1 per la sua composizione). Trattare gli embrioni con PbAc (0, 5, 10, 20 mg/L) da 2 a 120 ore dopo la fecondazione (hpf).
NOTA: Le concentrazioni di PbAc sono state scelte in base agli esperimenti di determinazione del range di dose. I risultati hanno mostrato che la LC50 di acetato di piombo sugli embrioni di zebrafish era 41.044 mg/L a 120 hpf. Quindi, la concentrazione più alta è stata fissata a metà della LC50 e una serie di soluzioni preparate mediante diluizione 2 volte. - Nutrire le larve due volte al giorno da 5 giorni dopo la fecondazione (dpf). Mantenere gli embrioni di zebrafish a 28,5 ± 0,5 °C con un ciclo luce/buio di 14:10 h.
- Rinfrescare il terreno privo di Pb (acqua di riproduzione del pesce zebra) ogni 24 ore fino a 9 dpf.
NOTA: Al termine degli esperimenti, tutte le soluzioni contenenti piombo sono state versate in un serbatoio di liquido designato e trattate dal centro di gestione dell'esperimento.
3. Colorazione rosso alizarina
NOTA: Indossare maschere antipolvere, indumenti protettivi e guanti adatti durante l'intero processo di colorazione. Le composizioni di tutte le soluzioni sono mostrate nella Tabella 1.
- Fasi specifiche di colorazione
NOTA: Il processo di tintura è stato effettuato in una piastra da 24 pozzetti a temperatura ambiente. Dopo aver aggiunto ogni soluzione, posizionare la piastra a 24 pozzetti sul tavolo vibrante impostato a bassa velocità.- Rimuovere 10 larve di zebrafish a caso da ciascun gruppo a 9 dpf e fissare il pesce in 1 ml di paraformaldeide al 2% / 1x soluzione salina tamponata con fosfato per 2 ore.
- Decantare la soluzione e lavare le larve di zebrafish con 100 mM Tris-HCl (pH 7,5)/10 mM MgCl2 per 10 min.
- Decantare la soluzione e incubare le larve nelle seguenti soluzioni per 5 minuti ciascuna per la decolorazione: soluzione di etanolo anidro (EtOH) (80% EtOH/100 mM Tris-HCl (pH 7,5)/10 mM MgCl2, 50% EtOH/100 mM Tris-HCl (pH=7,5) e 25% EtOH/100mM Tris-HCl (pH=7,5).
- Decantare la soluzione, rimuovere il pigmento mediante sbiancamento con una soluzione composta da 3%H 2 O2 e 0,5% KOH, e osservare una volta ogni 10 minuti fino a completa rimozione del pigmento.
- Risciacquare le larve di zebrafish più volte con glicerina al 25% / KOH allo 0,1% per 10 minuti ciascuna fino a quando non ci sono bolle.
NOTA: È importante evitare le bolle; Altrimenti, le bolle nel corpo del pesce zebra appariranno come un campo visivo nero al microscopio, che influenzerà le osservazioni e l'analisi quantitativa. - Macchiare le larve immergendo in 1 ml di alizarina allo 0,01% per 50 minuti.
- Decantare la soluzione e aggiungere 1 ml di glicerina al 50% / KOH allo 0,1% per 10 minuti per cancellare lo sfondo. Conservare i pesci in 50% glicerina fresca/0,1% KOH per la successiva osservazione.
4. Acquisizione di immagini
- Trasferire una larva sul vetrino ogni volta, mantenendo la larva nel mezzo della goccia di liquido.
- Osserva le larve al microscopio stereo.
- Accendere la fotocamera, aprire il software (vedere la tabella dei materiali) e mantenere le impostazioni predefinite.
- Fare clic su AE e scegliere un tempo di esposizione appropriato (60 ms in questo esperimento) per ottenere l'immagine migliore.
- Cattura tutte le immagini con le stesse impostazioni. Salvate le immagini in formato .tif per un'analisi successiva.
5. Analisi delle immagini
NOTA: vedere il file supplementare per un esempio con una serie di grafici di esempio per l'analisi delle immagini.
- Fare doppio clic sull'icona di ImageJ e analizzare le immagini salvate nel passaggio 4.5.
- Clicca su File | Aprire per aprire le immagini salvate nel passaggio 4.5.
- Clicca sull'immagine | Digitare, selezionare 8 bit.
- Clicca su Modifica | Inverti.
- Clicca su Analizza | Calibrare, selezionare OD non calibrato nell'interfaccia popup, selezionare Calibrazione globale nella parte inferiore sinistra dell'interfaccia inferiore e fare clic su OK.
- Clicca su Analizza | Imposta scala | Fare clic per rimuovere la scala nell'interfaccia popup, selezionare Globale di seguito e fare clic su OK.
- Clicca su Analizza | Imposta misure, seleziona l'area dell'elemento nell'interfaccia popup, seleziona la soglia Limita a di seguito (per misurare solo l'intervallo selezionato) e fai clic su OK.
- Clicca sull'immagine | Regola| Soglia, fai scorrere il cursore al centro dell'interfaccia popup per selezionare la soglia appropriata (modifica la soglia per ogni immagine) in modo che siano selezionate tutte le destinazioni da testare in un'immagine, quindi fai clic su Imposta.
- Clicca su Analizza | Misura. Registra le date di ciascun gruppo.
- Utilizzare ANOVA unidirezionale seguito dal test di confronto multiplo di Tukey per analizzare le differenze e impostare il livello di significatività a p < 0,001 (***).
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Representative Results
La colorazione rosso alizarina è un metodo sensibile e specifico per misurare i cambiamenti nella mineralizzazione ossea nelle larve di zebrafish. In questo studio, abbiamo osservato che PbAc ha avuto effetti avversi sulle larve di zebrafish, tra cui morte, malformazione, diminuzione della frequenza cardiaca e riduzione della lunghezza del corpo. Inoltre, le aree dello scheletro minerale delle larve di zebrafish sono state valutate per esaminare la perdita ossea indotta da PbAc. A 9 dpf (Figura 1A), molte ossa dello scheletro della testa sono mineralizzate e quindi colorate di rosso, come parasfenoide (PS), opercolo (OP), ceratobranchiale (CB) e notocorda (NC). Al contrario, gli otoliti (OT) (strutture non ossee) appaiono marrone-nero piuttosto che rosso. L'analisi digitale è stata eseguita per quantificare l'area totale colorata in ciascuna immagine. Rispetto al gruppo di controllo, i gruppi di acetato di piombo trattati con 10 e 20 mg/L PbAc hanno mostrato una diminuzione significativa (p < 0,001) nell'area colorata (Figura 1B). I cambiamenti nella mineralizzazione ossea hanno mostrato dose-dipendenza.
Figura 1: Effetti di diverse concentrazioni di PbAc sul cranio delle larve di zebrafish . (A) Immagini dell'aspetto dorsale dell'osso della testa colorato con rosso alizarina nelle larve a 9 dpf. Il tessuto mineralizzato è colorato di rosso. Barre della scala = 0,5 mm. (B) Variazioni dell'area mineralizzata relativa a 9 dpf; 10 larve per gruppo. I dati sono espressi come media ± SEM. Sono state eseguite tre repliche. p < 0,001 ***. Abbreviazioni: PS = parasfenoide; OP = operante; OT = otolite; CB = ceratobranchiale; NC = notocorda; DPF = giorni dopo la fecondazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Soluzione | Composizione | |
| Acqua di allevamento del pesce zebra | pH 7-7,3, 27-29 °C, conducibilità 450-550 μs, salinità 0,25-0,75 %0, ossigeno disciolto >6 mg/L, fotoperiodo 14/10 h, durezza 100-200 mg/L, cloro 0 mg/L, concentrazione azoto ammoniacale <0,02 mg/L, nitrito <1 mg/L, nitrato <50 mg/L, anidride carbonica <50 mg/L | |
| Soluzione miscelata (50 ml) di paraformaldeide al 2% e 1x PBS | 25 mL di paraformaldeide al 4%, 5 ml di tampone PBS 10x e acqua bidistillata (ddH2O) q.s. a 50 mL | |
| Soluzione mista (50 mL) di 100 mM di Tris-HCl (pH 7,5) e 10 mM MgCl2 | 5 mL di 1 M Tris-HCl (pH=7,5), 0,5 mL di 1 M MgCl 2 e ddH2O q.s. a 50 mL | |
| Soluzione mista (50 mL) di etanolo anidro all'80%, 10 mM MgCl2 e 100 mM Tris-HCl (pH=7,5) | 42,1 mL di etanolo anidro al 95%, 5 mL di 1 M Tris-HCl (pH=7,5), 0,5 mL di 1 M MgCl 2 e ddH2 O q.s. a 50 mL | |
| Soluzione mista (50 mL) di etanolo anidro al 50% e 100 mM di Tris-HCl (pH=7,5) | 26,3 mL di etanolo anidro al 95%, 5 mL di 1 M Tris-HCl (pH=7,5) e ddH2O q.s. a 50 mL | |
| Soluzione mista (50 mL) di etanolo anidro al 25% e Tris-HCl da 100 mM (pH=7,5) | 13,2 ml di etanolo anidro al 95%, 5 ml di 1 M Tris-HCl (pH=7,5) e ddH2O q.s. a 50 mL | |
| Soluzione miscelata di soluzione al 3% di H 2 O2e soluzione di KOH allo 0,5% | Quantità uguali di 6% H2O2 e 1% KOH miscelati prima dell'uso | |
| Soluzione mista (50 ml) di glicerina al 25% e KOH allo 0,1% | 12,5 ml di glicerina al 100%, 0,25 ml di KOH al 20% e ddH2O q.s. a 50 ml | |
| 0,01% Alizarina (50 ml) | 1 mL di 0,5% di alizarina, 12,5 mL di 100% glicerina, 5 mL di 1 M Tris-HCl (pH=7,5) e ddH2O q.s. a 50 mL | |
| Soluzione mista (50 ml) di glicerina al 50% e KOH allo 0,1% | 25 ml di glicerina al 100%, 0,25 ml di KOH al 20% e ddH2O q.s. a 50 ml | |
Tabella 1: Composizione delle soluzioni utilizzate nel protocollo di colorazione del rosso alizarina. Abbreviazione: q.s. = quantum enough (come richiesto).
File supplementare: una serie di grafici di esempio per l'analisi delle immagini. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Il pesce zebra è un modello adatto per studiare la malattia metabolica ossea. Rispetto ai modelli di roditori, i modelli di zebrafish sono relativamente veloci da stabilire e la misurazione della gravità della malattia è più facile. Nelle larve di zebrafish wild-type, la mineralizzazione dello scheletro della testa avviene a 5 dpf e lo scheletro assiale a 7 dpf15. Pertanto, le ossa craniche come PS, OP, CB e NC sono ben sviluppate a 9 dpf. Dopo che le larve sono state completamente decolorate e sbiancate, i tessuti molli sono stati eliminati, con conseguente aspetto trasparente del corpo del pesce. Il reagente colorante rosso alizarina è stato aggiunto per colorare e visualizzare le ossa minerali nel pesce zebra in rosso.
L'analisi delle immagini è fondamentale per ottenere conclusioni sperimentali affidabili in questo esperimento. Per l'analisi quantitativa sono state selezionate fotografie di zebrafish con una buona postura e uno sfondo pulito. Quando quantifichiamo l'area colorata per una singola immagine, verranno calcolate tutte le ossa mineralizzate colorate in rosso di un pesce. Pertanto, possiamo confrontare i cambiamenti di massa ossea tra i gruppi esposti al piombo e quelli di controllo. In questo studio, l'esposizione al PbAc ha causato tossicità per lo sviluppo nei pesci zebra e una significativa riduzione dell'area colorata dell'osso minerale è stata osservata nei gruppi di esposizione al PbAc di 10 e 20 mg/L a 9 dpf. Pertanto, l'esposizione embrionale precoce a PbAc ha ridotto la massa ossea delle larve di zebrafish. La Figura 1 mostra la perdita ossea indotta da PbAc visualizzata dalla colorazione rosso alizarina nelle larve di zebrafish.
I coloranti che si legano alla matrice calcificata vengono utilizzati per etichettare l'intero scheletro. La calceina è un cromoforo fluorescente che può anche legarsi specificamente al calcio nei tessuti vivi ed è stato utilizzato per etichettare le strutture ossee e studiare la crescita ossea10. A differenza della calceina, la colorazione rosso alizarina del tessuto fisso genera una registrazione permanente dei cambiamenti scheletrici che possono facilitare il confronto di diversi campioni. La tomografia microcomputerizzata (Micro CT) può fornire un'accurata analisi quantitativa del tessuto mineralizzato acquisendo una serie di raggi X 2D. Tuttavia, a causa delle piccole dimensioni del pesce zebra e molte delle ossa dello scheletro del pesce zebra in via di sviluppo sono sottili, gli strumenti di analisi Micro CT non possono caratterizzare accuratamente queste ossa16.
Le linee fluorescenti transgeniche aiutano anche a visualizzare lo sviluppo scheletrico nelle larve vive o anche nei pesci più maturi in tempo reale17. Analogamente, la colorazione in vivo del rosso alizarina S consente la valutazione dei pesci vivi e il monitoraggio continuo delle malformazioni18. Pertanto, la colorazione rosso alizarina è un modo utile ed economico per analizzare la perdita ossea nelle larve di zebrafish. Tuttavia, a causa della complessità delle fasi sperimentali e del numero di soluzioni utilizzate, i risultati finali dell'analisi delle immagini colorate di rosso alizarina possono essere influenzati dall'operazione sperimentale. Inoltre, è difficile utilizzare questo metodo di colorazione per il pesce zebra adulto a causa dell'aumento del volume corporeo e dei tessuti molli; L'analisi micro CT o le linee transgeniche sarebbero una scelta migliore per l'imaging scheletrico del pesce zebra adulto. In sintesi, il protocollo qui presentato può essere utilizzato per studiare i cambiamenti nella mineralizzazione ossea nelle larve di zebrafish in seguito all'esposizione a sostanze chimiche tossiche. Questa procedura potrebbe essere utile per stabilire un modello di zebrafish per studiare la malattia ossea e sviluppare nuovi farmaci terapeutici.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (81872646; 81811540034; 81573173) e dal Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Tris-HCl (pH=7.5) | Solarbio,Beijing,China | 21 | for detaining |
| 4% Paraformaldehyde Fix Solution | BBI,Shanghai,China | 14 | fixing tissues |
| 10x PBS buffer | BBI,Shanghai,China | 15 | for fixing |
| 35% H2O2 | Yonghua,Jiangsu,China | 8 | removing pigment |
| 50 mL Centrifuge tube | AKX,Jiangsu,China | 4 | |
| 95% Anhydrous ethanol | Enox,Jiangsu,China | 2 | destaining |
| Alizarin red (Purity 99.5%) | Solarbio,Beijing,China | 1 | staining |
| Biochemical incubator | Yiheng,Shanghai,China | 3 | raising zebrafish embryos |
| Electronic scale | Sartorius,Germany | 5 | weighing the solid raw materials |
| Glycerin (Purity 99.5%) | BBI,Shanghai,China | 7 | storing the stained fish |
| ImageJ (software) | USA | 9 | digital analysis |
| KOH (Purity 99.9%) | Sigma,America | 10 | bleaching solution |
| Lead acetate trihydrate (Purity 99.5%) | Aladdin,Shanghai,China | 11 | |
| MgCl2 (Purity 99.9%) | Aladdin,Shanghai,China | 12 | cleaning solution |
| NIS-Elements F (software) | Nikon, Japan | 13 | observing and taking photos |
| Pipe | AKX, Jiangsu, China | 18 | removal of embryos and solution |
| plates (24-well) | Corning,America | 17 | container for staining embryos |
| plates (6-well) | Corning,America | 16 | container for breeding embryos |
| Shaking table | Beyotime, China | 19 | mixing the solution |
| Stereo microscope | Nikon,Japan | 20 | observing and taking photos |
| Zebrafish | Zebrafish Experiment Center of Soochow University,Suzhou,China | 22 | experimental animal |
References
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