Summary
Hier haben wir die Alizarin-Rot-Färbung verwendet, um zu zeigen, dass die Exposition gegenüber Bleiacetat eine Veränderung der Knochenmasse bei Zebrafischlarven verursacht. Diese Färbemethode kann an die Untersuchung des Knochenverlustes bei Zebrafischlarven angepasst werden, der durch andere gefährliche Giftstoffe induziert wird.
Abstract
Chemisch induzierter Knochenverlust aufgrund von Bleiexposition (Pb) könnte eine Reihe nachteiliger Auswirkungen auf das Skelettsystem von Mensch und Tier haben. Die spezifischen Effekte und Mechanismen im Zebrafisch sind jedoch noch unklar. Alizarinrot hat eine hohe Affinität zu Kalziumionen und kann helfen, den Knochen sichtbar zu machen und die skelettale Mineralmasse zu veranschaulichen. In dieser Studie zielten wir darauf ab, Bleiacetat (PbAc)-induzierten Knochenverlust in Zebrafischlarven durch Alizarin-Rotfärbung nachzuweisen. Zebrafischembryonen wurden mit einer Reihe von PbAc-Konzentrationen (0, 5, 10, 20 mg/L) zwischen 2 und 120 h nach der Befruchtung behandelt. Die gesamte Skelettfärbung wurde 9 Tage nach der Befruchtung an Larven durchgeführt, und die gesamte gefärbte Fläche wurde mit der ImageJ-Software quantifiziert. Die Ergebnisse zeigten, dass die mineralisierten Gewebe rot gefärbt waren und der gefärbte Bereich in der PbAc-Expositions-Gruppe signifikant abnahm, mit einer dosisabhängigen Veränderung der Knochenmineralisierung. Dieser Artikel stellt ein Färbeprotokoll zur Untersuchung von Skelettveränderungen bei PbAc-induzierten Knochendefekten vor. Die Methode kann auch in Zebrafischlarven zum Nachweis von Knochenschwund verwendet werden, der durch andere Chemikalien induziert wird.
Introduction
Neuere Studien haben bestätigt, dass Osteoporose aufgrund von Glukokortikoiden, Aromatasehemmern und übermäßigem Alkoholkonsum häufig ist 1,2. Blei (Pb) ist ein giftiges Metall, das in Pflanzen, Böden und Gewässern vorkommt3. Obwohl die nachteiligen Auswirkungen von Pb auf den menschlichen Körper viel Aufmerksamkeit erregt haben, muss seine irreversible Wirkung auf den Knochen weiter untersucht werden. Bleiintoxikation verursacht eine Vielzahl von pathologischen Veränderungen sowohl im sich entwickelnden als auch im erwachsenen Skelett, die normale Lebensaktivitäten beeinträchtigen. Studien haben einen Zusammenhang zwischen chronischer Pb-Exposition und Knochenschäden gefunden4, einschließlich beeinträchtigter Knochenstrukturen5,6, reduzierter Knochenmineraldichte und sogar erhöhtem Osteoporoserisiko7.
Mineralisiertes Gewebe ist von großer Bedeutung für die Knochenstärke8, und die Ablagerung der Knochenmineralisierungsmatrix ist ein kritischer Index der Knochenbildung9. Alizarinrot hat eine hohe Affinität zu Kalziumionen, und die Alizarinrot-Färbung ist ein Standardverfahren zur Beurteilung der Knochenbildung10. Nach dieser Methode wird mineralisiertes Gewebe rot gefärbt, während alles andere Gewebe transparent bleibt. Die gefärbte Fläche wird dann durch digitale Bildanalyse11 quantifiziert.
Zebrafische sind ein wichtiger Modellorganismus, der in der Arzneimittelforschung und in Krankheitsmodellen weit verbreitet ist. Genetische Studien an Zebrafischen und Menschen haben Ähnlichkeiten in den zugrunde liegenden Mechanismen der Skelettmorphogenese auf molekularer Ebene gezeigt12. Darüber hinaus ist ein Hochdurchsatz-Wirkstoff- oder Biomolekül-Screening in großen Gelege von Zebrafischen besser durchführbar als in Mausmodellen, was die mechanistische Untersuchung proosteogener oder osteotoxischer Moleküle erleichtert13. Die differentielle Färbung des Skeletts in toto10 wird häufig bei der Untersuchung von Skelettdysplasie bei kleinen Wirbeltieren und Säugetierföten verwendet. Die Alizarin-Rotfärbung wurde durchgeführt, um die Knochenentwicklungstoxizität von Chemikalien in Zebrafischlarven zu untersuchen. Hier haben wir Blei als Beispiel verwendet, um ein Protokoll zum Nachweis von Bleiacetat-induzierten Knochendefekten in Zebrafischlarven zu beschreiben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier beschriebenen Tierverfahren wurden vom Animal Care Institute der Ethikkommission der Soochow University überprüft und genehmigt.
1. Fischzucht und Embryonenentnahme 14
- Füttern Sie Fische dreimal täglich; Stellen Sie sicher, dass die Zebrafische bei 28,5 ± 0,5 °C mit einem Hell-Dunkel-Zyklus von 14:10 h gehalten werden.
- Trennen Sie die männlichen und weiblichen erwachsenen Fische abends durch Isolationsbretter in Laichbecken im Verhältnis 2:1 von Männchen zu Weibchen.
- Am nächsten Morgen entfernen Sie die Isolierplatten um 9:00 Uhr und sammeln die Embryonen 2 h später.
- Die Embryonen werden vor dem Experiment in einen biochemischen Inkubator gegeben, der bei 28,5 °C gehalten wird.
2. Chemische Exposition
- Bereiten Sie die Mutterbrühe vor: Bleiacetattrihydrat (5 g) wiegen und unter Rühren in Reinstwasser (50 ml) auflösen.
ACHTUNG: PbAc ist giftig. Tragen Sie geeignete Staubmasken, Schutzkleidung und Handschuhe. Führen Sie das Experiment unter einem Abzug durch. - Auswahl und zufällige Verteilung der Zebrafischembryonen in saubere 6-Well-Platten (30 Embryonen pro Vertiefung in 3 ml Zebrafisch-Brutwasser; siehe Tabelle 1 für die Zusammensetzung). Behandeln Sie die Embryonen mit PbAc (0, 5, 10, 20 mg / L) von 2 bis 120 h nach der Befruchtung (hpf).
ANMERKUNG: Die Konzentrationen von PbAc wurden entsprechend den Dosisbereichsfindungsexperimenten ausgewählt. Die Ergebnisse zeigten, dass die LC50 von Bleiacetat auf Zebrafischembryonen 41,044 mg / L bei 120 hpf betrug. Daher wurde die höchste Konzentration auf die Hälfte des LC50 eingestellt und eine Reihe von Lösungen durch 2-fache Verdünnung hergestellt. - Füttern Sie die Larven zweimal täglich ab 5 Tagen nach der Befruchtung (dpf). Halten Sie die Zebrafischembryonen bei 28,5 ± 0,5 °C mit einem Hell-Dunkel-Zyklus von 14:10 Uhr.
- Erfrischen Sie das bleifreie Medium (Zebrafisch-Brutwasser) alle 24 h bis 9 dpf.
HINWEIS: Nach Abschluss der Experimente wurden alle bleihaltigen Lösungen in einen dafür vorgesehenen Flüssigkeitstank gegossen und vom Experimentmanagementzentrum behandelt.
3. Alizarin-Rotfärbung
HINWEIS: Tragen Sie während des gesamten Färbevorgangs geeignete Staubmasken, Schutzkleidung und Handschuhe. Die Zusammensetzungen aller Lösungen sind in Tabelle 1 dargestellt.
- Spezifische Färbeschritte
HINWEIS: Der Färbeprozess wurde in einer 24-Well-Platte bei Raumtemperatur durchgeführt. Nachdem jede Lösung hinzugefügt wurde, stellen Sie die 24-Well-Platte auf den Schütteltisch, der bei niedriger Geschwindigkeit eingestellt ist.- Entfernen Sie 10 Zebrafischlarven zufällig aus jeder Gruppe bei 9 dpf und fixieren Sie den Fisch in 1 ml 2% Paraformaldehyd / 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung für 2 h.
- Dekantieren Sie die Lösung und waschen Sie die Zebrafischlarven mit 100 mM Tris-HCl (pH 7,5)/10 mMMgCl2 für 10 min.
- Dekantieren Sie die Lösung und inkubieren Sie die Larven in den folgenden Lösungen für jeweils 5 min zur Entfärbung: wasserfreie Ethanollösung (EtOH) (80% EtOH/100 mM Tris-HCl (pH 7,5)/10 mM MgCl2, 50% EtOH/100 mM Tris-HCl (pH=7,5) und 25% EtOH/100mM Tris-HCl (pH=7,5).
- Dekantieren Sie die Lösung, entfernen Sie das Pigment durch Bleichen mit einer Lösung aus 3%H2O2und 0,5% KOH und beobachten Sie einmal alle 10 Minuten, bis das Pigment vollständig entfernt ist.
- Spülen Sie die Zebrafischlarven mehrmals mit 25% Glycerin/0,1% KOH für jeweils 10 min ab, bis keine Blasen mehr vorhanden sind.
HINWEIS: Es ist wichtig, Blasen zu vermeiden; Andernfalls erscheinen die Blasen im Zebrafischkörper als schwarzes Sichtfeld unter dem Mikroskop, was die Beobachtungen und die quantitative Analyse beeinflusst. - Färben Sie die Larven, indem Sie 1 ml 0,01% Alizarin für 50 min einweichen.
- Dekantieren Sie die Lösung und fügen Sie 1 ml 50% Glycerin / 0,1% KOH für 10 min hinzu, um den Hintergrund zu löschen. Lagern Sie die Fische in frischem 50% Glycerin/0,1% KOH für die anschließende Beobachtung.
4. Bildaufnahme
- Übertragen Sie jedes Mal eine Larve auf den Glasobjektträger, wobei die Larve in der Mitte des Flüssigkeitstropfens bleibt.
- Beobachten Sie die Larven unter einem Stereomikroskop.
- Schalten Sie die Kamera ein, öffnen Sie die Software (siehe Materialtabelle) und behalten Sie die Standardeinstellungen bei.
- Klicken Sie auf AE und wählen Sie eine geeignete Belichtungszeit (60 ms in diesem Experiment), um das beste Bild zu erhalten.
- Nehmen Sie alle Bilder unter den gleichen Einstellungen auf. Speichern Sie die Bilder für .tif spätere Analyse im Format.
5. Bildanalyse
HINWEIS: In der Zusatzdatei finden Sie ein Beispiel mit einer Reihe von Beispieldiagrammen für die Bildanalyse.
- Doppelklicken Sie auf das ImageJ-Symbol und analysieren Sie die in Schritt 4.5 gespeicherten Bilder.
- Klicken Sie auf Datei | Öffnen Sie, um die in Schritt 4.5 gespeicherten Bilder zu öffnen.
- Klicken Sie auf Bild | Geben Sie ein, wählen Sie 8-Bit.
- Klicken Sie auf Bearbeiten | Umkehren.
- Klicken Sie auf Analysieren | Kalibrieren, wählen Sie Unkalibrierte OD in der Popup-Schnittstelle, aktivieren Sie Globale Kalibrierung unten links auf der unteren Benutzeroberfläche und klicken Sie auf OK.
- Klicken Sie auf Analysieren | Maßstab einstellen | Klicken Sie, um die Skalierung in der Popup-Oberfläche zu entfernen, aktivieren Sie Global unten und klicken Sie auf OK.
- Klicken Sie auf Analysieren | Legen Sie Messungen fest, wählen Sie den Elementbereich in der Popup-Oberfläche aus, aktivieren Sie unten den Schwellenwert begrenzen (um nur den ausgewählten Bereich zu messen) und klicken Sie auf OK.
- Klicken Sie auf Bild | Anpassen| Schwellenwert, schieben Sie den Schieberegler in die Mitte der Popup-Oberfläche, um den entsprechenden Schwellenwert auszuwählen (ändern Sie den Schwellenwert für jedes Bild), so dass alle in einem Bild zu testenden Ziele ausgewählt sind, und klicken Sie auf Festlegen.
- Klicken Sie auf Analysieren | Messen. Notieren Sie die Daten jeder Gruppe.
- Verwenden Sie die Einweg-ANOVA gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleichstest, um die Unterschiede zu analysieren, und legen Sie das Signifikanzniveau auf p < 0,001 (***) fest.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Die Alizarin-Rotfärbung ist eine empfindliche und spezifische Methode zur Messung von Veränderungen der Knochenmineralisierung in Zebrafischlarven. In dieser Studie haben wir beobachtet, dass PbAc nachteilige Auswirkungen auf Zebrafischlarven hatte, einschließlich Tod, Fehlbildung, verminderter Herzfrequenz und Körperlängenverkürzung. Darüber hinaus wurden die mineralischen Skelettbereiche von Zebrafischlarven ausgewertet, um den PbAc-induzierten Knochenverlust zu untersuchen. Bei 9 dpf (Abbildung 1A) sind viele Knochen des Kopfskeletts mineralisiert und daher rot gefärbt, wie Parasphenoid (PS), Operkel (OP), Ceratobranchial (CB) und Notochord (NC). Im Gegensatz dazu erscheinen Otolithen (OT) (nicht-knöcherne Strukturen) eher braun-schwarz als rot. Es wurde eine digitale Analyse durchgeführt, um die gesamte gefärbte Fläche in jedem Bild zu quantifizieren. Im Vergleich zur Kontrollgruppe zeigten Bleiacetatgruppen, die mit 10 und 20 mg/L PbAc behandelt wurden, eine signifikante Abnahme (p < 0,001) im gefärbten Bereich (Abbildung 1B). Die Veränderungen der Knochenmineralisierung zeigten eine Dosisabhängigkeit.
Abbildung 1: Auswirkungen unterschiedlicher Konzentrationen von PbAc auf den Schädel von Zebrafischlarven . (A) Bilder des dorsalen Aspekts des Kopfknochens, der bei Larven bei 9 dpf mit Alizarin rot gefärbt ist. Das mineralisierte Gewebe ist rot gefärbt. Maßstabsbalken = 0,5 mm. (B) Änderungen der relativen mineralisierten Fläche bei 9 dpf; 10 Larven pro Gruppe. Die Daten werden als Mittelwert ± REM ausgedrückt. Drei Replikate wurden durchgeführt. p < 0,001 ***. Abkürzungen: PS = Parasphenoid; OP = Operkel; OT = Otolith; CB = ceratobranchial; NC = Notochord; dpf = Tage nach der Befruchtung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Lösung | Zusammensetzung | |
| Brutwasser von Zebrafischen | pH 7-7,3, 27-29 °C, Leitfähigkeit 450-550 μs, Salzgehalt 0,25-0,75 %0, gelöster Sauerstoff >6 mg/L, Photoperiode 14/10 h, Härte 100-200 mg/L, Chlor 0 mg/L, Ammoniakstickstoffkonzentration <0,02 mg/L, Nitrit <1 mg/L, Nitrat <50 mg/L, Kohlendioxid <50 mg/L | |
| Mischlösung (50 ml) aus 2% Paraformaldehyd und 1x PBS | 25 mL 4% Paraformaldehyd, 5 mL 10x PBS-Puffer und doppelt destilliertes Wasser (ddH2O) q.s. bis 50 mL | |
| Mischlösung (50 ml) aus 100 mM Tris-HCl (pH 7,5) und 10 mMMgCl2 | 5 ml 1 M Tris-HCl (pH=7,5), 0,5 mL 1 M MgCl2 undddH2 O q.s. bis 50 mL | |
| Mischlösung (50 ml) aus 80% wasserfreiem Ethanol, 10 mMMgCl2 und 100 mM Tris-HCl (pH=7,5) | 42,1 ml 95% wasserfreies Ethanol, 5 ml 1 M Tris-HCl (pH=7,5), 0,5 ml 1 MMgCl2 und ddH2 O q.s. bis 50 mL | |
| Mischlösung (50 ml) aus 50% wasserfreiem Ethanol und 100 mM Tris-HCl (pH=7,5) | 26,3 ml 95% wasserfreies Ethanol, 5 mL 1 M Tris-HCl (pH=7,5) und ddH2O q.s. bis 50 mL | |
| Mischlösung (50 ml) aus 25% wasserfreiem Ethanol und 100 mM Tris-HCl (pH=7,5) | 13,2 ml 95% wasserfreies Ethanol, 5 mL 1 M Tris-HCl (pH=7,5) und ddH2O q.s. bis 50 mL | |
| Mischlösung aus 3%iger H2O2-Lösungund 0,5%iger KOH-Lösung | Gleiche Mengen von 6%H2O2und 1% KOH gemischt vor Gebrauch | |
| Mischlösung (50 ml) aus 25% Glycerin und 0,1% KOH | 12,5 ml 100% Glycerin, 0,25 ml 20% KOH und ddH2O q.s. bis 50 mL | |
| 0,01% Alizarin (50 ml) | 1 ml 0,5% Alizarin, 12,5 ml 100% Glycerin, 5 ml 1 M Tris-HCl (pH=7,5) und ddH2O q.s. bis 50 mL | |
| Mischlösung (50 ml) aus 50% Glycerin und 0,1% KOH | 25 ml 100 % Glycerin, 0,25 ml 20 % KOH und ddH2O q.s. bis 50 mL | |
Tabelle 1: Zusammensetzung der Lösungen, die im Alizarin-Rot-Färbeprotokoll verwendet werden. Abkürzung: q.s. = quantum enough (je nach Bedarf).
Ergänzende Datei: Eine Reihe von Beispieldiagrammen für die Bildanalyse. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der Zebrafisch ist ein geeignetes Modell zur Untersuchung von Knochenstoffwechselerkrankungen. Im Vergleich zu Nagetiermodellen sind Zebrafischmodelle relativ schnell zu etablieren, und die Messung der Schwere der Erkrankung ist einfacher. Bei Wildtyp-Zebrafischlarven erfolgt die Mineralisierung des Kopfskeletts bei 5 dpf und des axialen Skeletts bei 7 dpf15. Daher sind Schädelknochen wie PS, OP, CB und NC bei 9 dpf gut entwickelt. Nachdem die Larven vollständig entfärbt und gebleicht waren, wurden die Weichteile gereinigt, was zu einem transparenten Aussehen des Fischkörpers führte. Das Alizarinrot-Färbereagenz wurde hinzugefügt, um die Mineralknochen im Zebrafisch rot zu färben und sichtbar zu machen.
Die Bildanalyse ist entscheidend, um zuverlässige experimentelle Schlussfolgerungen in diesem Experiment zu erhalten. Fotos von Zebrafischen mit guter Haltung und sauberem Hintergrund wurden für die quantitative Analyse ausgewählt. Wenn wir die gefärbte Fläche für ein einzelnes Bild quantifizieren, werden alle mineralisierten Knochen, die von einem Fisch rot gefärbt sind, berechnet. So können wir die Knochenmassenänderungen zwischen der bleiexponierten und der Kontrollgruppe vergleichen. In dieser Studie verursachte die PbAc-Exposition eine Entwicklungstoxizität bei Zebrafischen, und eine signifikante Verringerung des gefärbten Bereichs von Mineralknochen wurde in den 10 und 20 mg/L PbAc-Expositions-Gruppen bei 9 dpf beobachtet. So reduzierte eine frühe embryonale Exposition gegenüber PbAc die Knochenmasse von Zebrafischlarven. Abbildung 1 zeigt den PbAc-induzierten Knochenverlust, visualisiert durch Alizarin-Rotfärbung in den Zebrafischlarven.
Farbstoffe, die an verkalkte Matrix binden, werden verwendet, um das gesamte Skelett zu kennzeichnen. Calcein ist ein fluoreszierendes Chromophor, das auch spezifisch an Kalzium in lebendem Gewebe binden kann und zur Markierung von Knochenstrukturen und zur Untersuchung des Knochenwachstums verwendet wurde10. Im Gegensatz zu Calcein erzeugt die Alizarin-Rotfärbung von fixiertem Gewebe eine permanente Aufzeichnung von Skelettveränderungen, die den Vergleich mehrerer Proben erleichtern kann. Die Mikrocomputertomographie (Mikro-CT) kann eine genaue quantitative Analyse von mineralisiertem Gewebe durch die Erfassung einer Reihe von 2D-Röntgenstrahlen ermöglichen. Aufgrund der geringen Größe des Zebrafisches und der Tatsache, dass viele der Knochen des sich entwickelnden Zebrafischskeletts dünn sind, können Mikro-CT-Analysewerkzeuge diese Knochen jedoch nicht genau charakterisieren16.
Fluoreszierende transgene Reporterlinien helfen auch, die Skelettentwicklung bei lebenden Larven oder noch reiferen Fischen in Echtzeit zu visualisieren17. In ähnlicher Weise ermöglicht die Alizarinrot-S-In-vivo-Färbung die Bewertung lebender Fische und die kontinuierliche Verfolgung von Missbildungen18. Daher ist die Alizarin-Rotfärbung eine nützliche und kostengünstige Möglichkeit, den Knochenverlust bei Zebrafischlarven zu analysieren. Aufgrund der Komplexität der experimentellen Schritte und der Anzahl der verwendeten Lösungen können jedoch die Endergebnisse der Analyse von Alizarin-rot gefärbten Bildern durch den experimentellen Betrieb beeinflusst werden. Darüber hinaus ist es schwierig, diese Färbemethode für erwachsene Zebrafische aufgrund des erhöhten Körpervolumens und der Weichteile anzuwenden; Mikro-CT-Analyse oder transgene Linien wären eine bessere Wahl für die Skelettbildgebung von erwachsenen Zebrafischen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das hier vorgestellte Protokoll verwendet werden kann, um die Veränderungen der Knochenmineralisierung in Zebrafischlarven nach Exposition gegenüber chemischen Giftstoffen zu untersuchen. Dieses Verfahren könnte nützlich sein, um ein Zebrafischmodell zur Untersuchung von Knochenerkrankungen und zur Entwicklung neuer therapeutischer Medikamente zu etablieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (81872646; 81811540034; 81573173) und der Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Tris-HCl (pH=7.5) | Solarbio,Beijing,China | 21 | for detaining |
| 4% Paraformaldehyde Fix Solution | BBI,Shanghai,China | 14 | fixing tissues |
| 10x PBS buffer | BBI,Shanghai,China | 15 | for fixing |
| 35% H2O2 | Yonghua,Jiangsu,China | 8 | removing pigment |
| 50 mL Centrifuge tube | AKX,Jiangsu,China | 4 | |
| 95% Anhydrous ethanol | Enox,Jiangsu,China | 2 | destaining |
| Alizarin red (Purity 99.5%) | Solarbio,Beijing,China | 1 | staining |
| Biochemical incubator | Yiheng,Shanghai,China | 3 | raising zebrafish embryos |
| Electronic scale | Sartorius,Germany | 5 | weighing the solid raw materials |
| Glycerin (Purity 99.5%) | BBI,Shanghai,China | 7 | storing the stained fish |
| ImageJ (software) | USA | 9 | digital analysis |
| KOH (Purity 99.9%) | Sigma,America | 10 | bleaching solution |
| Lead acetate trihydrate (Purity 99.5%) | Aladdin,Shanghai,China | 11 | |
| MgCl2 (Purity 99.9%) | Aladdin,Shanghai,China | 12 | cleaning solution |
| NIS-Elements F (software) | Nikon, Japan | 13 | observing and taking photos |
| Pipe | AKX, Jiangsu, China | 18 | removal of embryos and solution |
| plates (24-well) | Corning,America | 17 | container for staining embryos |
| plates (6-well) | Corning,America | 16 | container for breeding embryos |
| Shaking table | Beyotime, China | 19 | mixing the solution |
| Stereo microscope | Nikon,Japan | 20 | observing and taking photos |
| Zebrafish | Zebrafish Experiment Center of Soochow University,Suzhou,China | 22 | experimental animal |
References
- Compston, J., et al. Recommendations for the registration of agents for prevention and treatment of glucocorticoid-induced osteoporosis: an update from the Group for the Respect of Ethics and Excellence in Science. Osteoporosis International. 19 (9), 1247-1250 (2008).
- Rachner, T. D., Gobel, A., Jaschke, N. P., Hofbauer, L. C. Challenges in preventing bone loss induced by aromatase inhibitors. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 105 (10), (2020).
- Kataba, A., et al. Acute exposure to environmentally relevant lead levels induces oxidative stress and neurobehavioral alterations in larval zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 227, 105607 (2020).
- Morin, S. N., et al. Differences in fracture prevalence and in bone mineral density between Chinese and White Canadians: the Canadian Multicentre Osteoporosis Study (CaMos). Archives of Osteoporosis. 15 (1), 147 (2020).
- Lee, C. M., et al. Chronic lead poisoning magnifies bone detrimental effects in an ovariectomized rat model of postmenopausal osteoporosis. Experimental Toxicologic Pathology. 68 (1), 47-53 (2016).
- Theppeang, K., et al. Associations of bone mineral density and lead levels in blood, tibia, and patella in urban-dwelling women. Environmental Health Perspectives. 116 (6), 784-790 (2008).
- Sun, Y., et al. Osteoporosis in a Chinese population due to occupational exposure to lead. American Journal Industrial Medicine. 51 (6), 436-442 (2008).
- Guadalupe-Grau, A., Fuentes, T., Guerra, B., Calbet, J. A. L. Exercise and bone mass in adults. Sports Medicine. 39 (6), 439-468 (2009).
- Ottani, V., Raspanti, M., Ruggeri, A. Collagen structure and functional implications. Micron. 32 (3), 251-260 (2001).
- Kelly, W. L., Bryden, M. M. A modified differential stain for cartilage and bone in whole mount preparations of mammalian fetuses and small vertebrates. Stain Technology. 58 (3), 131-134 (1983).
- Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis. Biotechnology Journal. 1 (6), 651-655 (2006).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Fernandez, I., Gavaia, P. J., Laize, V., Cancela, M. L. Fish as a model to assess chemical toxicity in bone. Aquatic Toxicology. 194, 208-226 (2018).
- Wang, L., et al. Role of GH/IGF axis in arsenite-induced developmental toxicity in zebrafish embryos. Ecotoxicology Environmental Safety. 201, 110820 (2020).
- Bergen, D. J. M., Kague, E., Hammond, C. L. Zebrafish as an emerging model for osteoporosis: a primary testing platform for screening new osteo-active compounds. Frontiers in Endocrinology. 10, 6 (2019).
- Charles, J. F., et al. Utility of quantitative micro-computed tomographic analysis in zebrafish to define gene function during skeletogenesis. Bone. 101, 162-171 (2017).
- Hammond, C. L., Moro, E. Using transgenic reporters to visualize bone and cartilage signaling during development in vivo. Frontiers in Endocrinology. 3, 91 (2012).
- Bensimon-Brito, A., et al. Revisiting in vivo staining with alizarin red S--a valuable approach to analyse zebrafish skeletal mineralization during development and regeneration. BMC Developmental Biology. 16, 2 (2016).
