Summary
Ici, nous avons utilisé la coloration rouge alizarine pour montrer que l’exposition à l’acétate de plomb provoque un changement de masse osseuse chez les larves de poisson zèbre. Cette méthode de coloration peut être adaptée à l’étude de la perte osseuse chez les larves de poisson zèbre induite par d’autres substances toxiques dangereuses.
Abstract
La perte osseuse induite chimiquement due à l’exposition au plomb (Pb) pourrait déclencher une série d’effets néfastes sur les systèmes squelettiques humains et animaux. Cependant, les effets et les mécanismes spécifiques chez le poisson zèbre restent flous. Le rouge d’alizarine a une forte affinité pour les ions calcium et peut aider à visualiser l’os et illustrer la masse minérale squelettique. Dans cette étude, nous avons cherché à détecter la perte osseuse induite par l’acétate de plomb (PbAc) chez les larves de poisson zèbre en utilisant la coloration rouge alizarine. Les embryons de poisson zèbre ont été traités avec une série de concentrations de PbAc (0, 5, 10, 20 mg / L) entre 2 et 120 h après la fécondation. Une coloration du squelette entier a été effectuée sur les larves 9 jours après la fécondation, et la surface totale colorée a été quantifiée à l’aide du logiciel ImageJ. Les résultats ont indiqué que les tissus minéralisés étaient colorés en rouge et que la zone colorée diminuait considérablement dans le groupe exposé au PbAc, avec un changement dose-dépendant de la minéralisation osseuse. Cet article présente un protocole de coloration pour étudier les changements squelettiques dans les défauts osseux induits par PbAc. La méthode peut également être utilisée chez les larves de poisson zèbre pour la détection de la perte osseuse induite par d’autres produits chimiques.
Introduction
Des études récentes ont confirmé que l’ostéoporose due aux glucocorticoïdes, aux inhibiteurs de l’aromatase et à la consommation excessive d’alcool est courante 1,2. Le plomb (Pb) est un métal toxique présent dans les plantes, le sol et les milieux aquatiques3. Bien que les effets néfastes du plomb sur le corps humain aient attiré beaucoup d’attention, son impact irréversible sur les os doit être étudié plus avant. L’intoxication au plomb provoque un large éventail de changements pathologiques dans le squelette en développement et chez l’adulte, affectant les activités normales de la vie. Des études ont trouvé une association entre l’exposition chronique au plomb et les lésions osseuses4, y compris des structures osseuses altérées5,6, une densité minérale osseuse réduite et même un risque accru d’ostéoporose7.
Les tissus minéralisés sont d’une grande importance pour la solidité osseuse8, et le dépôt de la matrice de minéralisation osseuse est un indice critique de la formation osseuse9. Le rouge d’alizarine a une forte affinité pour les ions calcium, et la coloration au rouge d’alizarine est une procédure standard pour évaluer la formation osseuse10. Selon cette méthode, les tissus minéralisés sont colorés en rouge, tandis que tous les autres tissus restent transparents. La zone colorée est ensuite quantifiée par analyse d’images numériques11.
Le poisson zèbre est un organisme modèle important largement utilisé dans la découverte de médicaments et les modèles de maladies. Des études génétiques chez le poisson zèbre et l’homme ont démontré des similitudes dans les mécanismes sous-jacents de la morphogenèse squelettique au niveau moléculaire12. De plus, le criblage de médicaments ou de biomolécules à haut débit est plus réalisable dans de grandes couvées de poisson-zèbre que dans des modèles murins, ce qui facilite l’étude mécaniste de molécules proostéogènes ou ostéotoxiques13. La coloration différentielle du squelette au total10 est fréquemment utilisée dans l’étude de la dysplasie squelettique chez les petits vertébrés et les fœtus de mammifères. La coloration rouge d’alizarine a été réalisée pour étudier la toxicité pour le développement osseux des produits chimiques dans les larves de poisson zèbre. Ici, nous avons utilisé le plomb comme exemple pour décrire un protocole de détection des défauts osseux induits par l’acétate de plomb chez les larves de poisson zèbre.
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Protocol
Toutes les procédures animales décrites ici ont été examinées et approuvées par l’Animal Care Institute du comité d’éthique de l’Université Soochow.
1. Pisciculture et collecte d’embryons 14
- Nourrissez les poissons trois fois par jour; s’assurer que le poisson zèbre est maintenu à 28,5 ± 0,5 °C avec un cycle lumière/obscurité de 14:10 h.
- Séparer les poissons adultes mâles et femelles par des panneaux d’isolement dans des bassins de frai à un ratio mâle/femelle de 2:1 le soir.
- Le lendemain matin, retirez les planches d’isolement à 9h00 et récupérez les embryons 2 h plus tard.
- Placer les embryons dans un incubateur biochimique maintenu à 28,5 °C avant l’expérience.
2. Exposition aux produits chimiques
- Préparer le bouillon mère : peser l’acétate de plomb trihydraté (5 g) et le dissoudre dans de l’eau ultrapure (50 mL) sous agitation.
ATTENTION : Le PbAc est toxique. Portez des masques antipoussières, des vêtements de protection et des gants appropriés. Effectuez l’expérience sous une hotte. - Sélectionner et répartir au hasard les embryons de poisson-zèbre dans des plaques propres à 6 puits (30 embryons par puits dans 3 mL d’eau de reproduction du poisson zèbre; voir le tableau 1 pour sa composition). Traiter les embryons avec du PbAc (0, 5, 10, 20 mg/L) de 2 à 120 h après la fécondation (HPF).
NOTE: Les concentrations de PbAc ont été choisies en fonction des expériences de détermination de la gamme de doses. Les résultats ont montré que la CL50 de l’acétate de plomb sur les embryons de poisson zèbre était de 41,044 mg/L à 120 hpf. Par conséquent, la concentration la plus élevée a été fixée à la moitié de la CL50 et une série de solutions préparées par dilution 2 fois. - Nourrissez les larves deux fois par jour à partir de 5 jours après la fécondation (dpf). Maintenir les embryons de poisson zèbre à 28,5 ± 0,5 °C avec un cycle lumière/obscurité de 14h10.
- Rafraîchir le milieu sans plomb (eau de reproduction du poisson zèbre) toutes les 24 heures jusqu’à 9 dpf.
NOTE: À la fin des expériences, toutes les solutions contenant du plomb ont été versées dans un réservoir de liquide désigné et traitées par le centre de gestion de l’expérience.
3. Coloration rouge Alizarin
REMARQUE: Portez des masques antipoussières, des vêtements de protection et des gants appropriés pendant tout le processus de coloration. Les compositions de toutes les solutions sont indiquées dans le tableau 1.
- Étapes de coloration spécifiques
NOTE: Le processus de teinture a été effectué dans une plaque de 24 puits à température ambiante. Après l’ajout de chaque solution, placer la plaque de 24 puits sur la table vibrante réglée à basse vitesse.- Prélever 10 larves de poisson zèbre au hasard de chaque groupe à 9 dpf et fixer les poissons dans 1 mL de solution saline tamponnée au paraformaldéhyde à 2 % / 1x tamponnée au phosphate pendant 2 h.
- Décanter la solution et laver les larves de poisson zèbre avec 100 mM de Tris-HCl (pH 7,5)/10 mM de MgCl2 pendant 10 min.
- Décanter la solution et incuber les larves dans les solutions suivantes pendant 5 min chacune pour la coloration : solution d’éthanol anhydre (EtOH) (80 % EtOH/100 mM Tris-HCl (pH 7,5)/10 mM MgCl2, 50 % EtOH/100 mM Tris-HCl (pH = 7,5) et 25 % EtOH/100 mM Tris-HCl (pH = 7,5).
- Décanter la solution, enlever le pigment par blanchiment avec une solution composée de 3% H2O2 et 0,5% KOH, et observer une fois toutes les 10 minutes jusqu’à ce que le pigment soit complètement éliminé.
- Rincer les larves de poisson zèbre plusieurs fois avec 25% de glycérine / 0,1% de KOH pendant 10 minutes chacune jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de bulles.
REMARQUE: Il est important d’éviter les bulles; Sinon, les bulles dans le corps du poisson zèbre apparaîtront comme un champ de vision noir sous le microscope, ce qui affectera les observations et l’analyse quantitative. - Colorer les larves en les faisant tremper dans 1 mL d’alizarine à 0,01 % pendant 50 min.
- Décanter la solution et ajouter 1 ml de glycérine à 50 % / 0,1 % de KOH pendant 10 minutes pour effacer le bruit de fond. Conservez les poissons dans de la glycérine fraîche à 50 % / 0,1 % de KOH pour une observation ultérieure.
4. Acquisition d’images
- Transférez une larve sur la lame de verre à chaque fois, en gardant la larve au milieu de la goutte liquide.
- Observez les larves au microscope stéréoscopique.
- Allumez l’appareil photo, ouvrez le logiciel (voir le tableau des matériaux) et conservez les paramètres par défaut.
- Cliquez sur AE et choisissez un temps d’exposition approprié (60 ms dans cette expérience) pour obtenir la meilleure image.
- Capturez toutes les images sous les mêmes paramètres. Enregistrez les images dans .tif format pour une analyse ultérieure.
5. Analyse d’images
Remarque : Voir le fichier supplémentaire pour un exemple avec un ensemble d’exemples de graphiques pour l’analyse d’image.
- Double-cliquez sur l’icône ImageJ et analysez les images enregistrées à l’étape 4.5.
- Cliquez sur Fichier | Ouvrez pour ouvrir les images enregistrées à l’étape 4.5.
- Cliquez sur l’image | Tapez, sélectionnez 8 bits.
- Cliquez sur Modifier | Inverser.
- Cliquez sur Analyser | Calibrer, sélectionnez Non calibré dans l’interface contextuelle, cochez Calibrage global en bas à gauche de l’interface inférieure, puis cliquez sur OK.
- Cliquez sur Analyser | Définir l’échelle | Cliquez pour supprimer l’échelle dans l’interface contextuelle, cochez Global ci-dessous, puis cliquez sur OK.
- Cliquez sur Analyser | Définir les mesures, sélectionnez la zone d’élément dans l’interface contextuelle, cochez le seuil Limiter au (pour mesurer uniquement la plage sélectionnée), puis cliquez sur OK.
- Cliquez sur l’image | Ajuster| Seuil, faites glisser le curseur au milieu de l’interface contextuelle pour sélectionner le seuil approprié (modifiez le seuil pour chaque image) afin que toutes les cibles à tester dans une image soient sélectionnées, puis cliquez sur Définir.
- Cliquez sur Analyser | Mesurer. Notez les dates de chaque groupe.
- Utilisez une ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaison multiple de Tukey pour analyser les différences et définissez le niveau de signification à p < 0,001 (***).
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Representative Results
La coloration rouge alizarine est une méthode sensible et spécifique pour mesurer les changements dans la minéralisation osseuse chez les larves de poisson zèbre. Dans cette étude, nous avons observé que le PbAc avait des effets néfastes sur les larves de poisson zèbre, notamment la mort, la malformation, la diminution de la fréquence cardiaque et le raccourcissement de la longueur corporelle. De plus, les zones squelettiques minérales des larves de poisson zèbre ont été évaluées pour examiner la perte osseuse induite par le PbAc. À 9 dpf (figure 1A), de nombreux os du squelette de la tête sont minéralisés et donc colorés en rouge, tels que les parasphénoïdes (PS), les opérons (OP), les cératobranchiaux (CB) et les notochordes (NC). En revanche, les otolithes (OT) (structures non osseuses) apparaissent brun-noir plutôt que rouges. Une analyse numérique a été effectuée pour quantifier la surface colorée totale dans chaque image. Par rapport au groupe témoin, les groupes acétate de plomb traités avec 10 et 20 mg/L de PbAc ont montré une diminution significative (p < 0,001) dans la zone colorée (Figure 1B). Les changements dans la minéralisation osseuse ont montré une dépendance à la dose.
Figure 1 : Effets de différentes concentrations de PbAc sur le crâne des larves de poisson zèbre. (A) Images de la face dorsale de l’os de la tête coloré au rouge d’alizarine chez les larves à 9 dpf. Le tissu minéralisé est coloré en rouge. Barres d’échelle = 0,5 mm. (B) Changements dans la zone minéralisée relative à 9 dpf; 10 larves par groupe. Les données sont exprimées en moyenne ± SEM. Trois répétitions ont été effectuées. p < 0,001 ***. Abréviations : PS = parasphénoïde; OP = opercle; OT = otolithe; CB = cératobranchial; NC = notochorde; DPF = jours après la fécondation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Solution | Composition | |
| Eaux de reproduction du poisson-zèbre | pH 7-7,3, 27-29 °C, conductivité 450-550 μs, salinité 0,25-0,75 %0, oxygène dissous >6 mg/L, photopériode 14/10 h, dureté 100-200 mg/L, chlore 0 mg/L, concentration d’azote ammoniacal <0,02 mg/L, nitrite <1 mg/L, nitrate <50 mg/L, dioxyde de carbone <50 mg/L | |
| Solution mélangée (50 mL) de paraformaldéhyde à 2 % et 1x PBS | 25 mL de paraformaldéhyde à 4 %, 5 mL de tampon PBS 10x et double eau distillée (ddH2O) q.s. à 50 mL | |
| Solution mélangée (50 mL) de Tris-HCl 100 mM (pH 7,5) et 10 mM de MgCl2 | 5 mL de Tris-HCl 1 M (pH = 7,5), 0,5 mL de 1 M MgCl 2 et ddH2O q.s. à 50 mL | |
| Solution mélangée (50 mL) d’éthanol anhydre à 80 %, de 10 mM de MgCl2 et de 100 mM de Tris-HCl (pH = 7,5) | 42,1 mL d’éthanol anhydre à 95 %, 5 mL de Tris-HCl 1 M (pH = 7,5), 0,5 mL de 1 M MgCl2 et ddH2 O q.s. à 50 mL | |
| Solution mélangée (50 mL) d’éthanol anhydre à 50 % et de Tris-HCl à 100 mM (pH = 7,5) | 26,3 mL d’éthanol anhydre à 95 %, 5 mL de Tris-HCl 1 M (pH = 7,5) et ddH2O q.s. à 50 mL | |
| Solution mélangée (50 mL) d’éthanol anhydre à 25 % et de Tris-HCl à 100 mM (pH = 7,5) | 13,2 mL d’éthanol anhydre à 95 %, 5 mL de Tris-HCl 1 M (pH = 7,5) et ddH2O q.s. à 50 mL | |
| Solution mélangée de solution à 3% H 2 O2 et de solution à 0,5% KOH | Quantités égales de 6% H2 O2 et 1% KOH mélangés avant utilisation | |
| Solution mixte (50 mL) de glycérine à 25 % et de KOH à 0,1 % | 12,5 mL de glycérine à 100 %, 0,25 mL de KOH à 20 % et ddH2O q.s. à 50 mL | |
| 0,01 % Alizarine (50 mL) | 1 mL d’alizarine à 0,5 %, 12,5 mL de glycérine à 100 %, 5 mL de Tris-HCl 1 M (pH = 7,5) et ddH2O q.s. à 50 mL | |
| Solution mélangée (50 mL) de glycérine à 50 % et de KOH à 0,1 % | 25 mL de glycérine à 100 %, 0,25 mL de KOH à 20 % et ddH2O q.s. à 50 mL | |
Tableau 1: Composition des solutions utilisées dans le protocole de coloration rouge alizarine. Abréviation : q.s. = quantum suffisant (au besoin).
Fichier supplémentaire : Un ensemble d’exemples de graphiques pour l’analyse d’images. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Le poisson zèbre est un modèle approprié pour étudier les maladies métaboliques osseuses. Comparés aux modèles de rongeurs, les modèles de poisson zèbre sont relativement rapides à établir et la mesure de la gravité de la maladie est plus facile. Chez les larves de poisson-zèbre de type sauvage, la minéralisation du squelette de la tête se produit à 5 dpf et du squelette axial à 7 dpf15. Ainsi, les os crâniens tels que PS, OP, CB et NC sont bien développés à 9 dpf. Une fois les larves complètement tachées et blanchies, les tissus mous ont été nettoyés, ce qui a donné un aspect transparent du corps du poisson. Le réactif de coloration rouge alizarine a été ajouté pour colorer et visualiser les os minéraux du poisson zèbre en rouge.
L’analyse d’images est essentielle pour obtenir des conclusions expérimentales fiables dans cette expérience. Des photographies de poissons-zèbres avec une bonne posture et un arrière-plan propre ont été sélectionnées pour une analyse quantitative. Lorsque nous quantifions la zone colorée pour une seule image, tous les os minéralisés colorés en rouge d’un poisson seront calculés. Ainsi, nous pouvons comparer les changements de masse osseuse entre le groupe exposé au plomb et le groupe témoin. Dans cette étude, l’exposition au PbAc a entraîné une toxicité pour le développement du poisson zèbre, et une réduction significative de la zone colorée de l’os minéral a été observée dans les groupes exposés au PbAc à 10 et 20 mg/L à 9 dpf. Ainsi, l’exposition embryonnaire précoce au PbAc a réduit la masse osseuse des larves de poisson zèbre. La figure 1 montre la perte osseuse induite par le PbAc visualisée par la coloration au rouge d’alizarine chez les larves de poisson zèbre.
Les colorants qui se lient à la matrice calcifiée sont utilisés pour marquer l’ensemble du squelette. La calcéine est un chromophore fluorescent qui peut également se lier spécifiquement au calcium dans les tissus vivants et a été utilisé pour marquer les structures osseuses et étudier la croissance osseuse10. Contrairement à la calcéine, la coloration rouge alizarine des tissus fixes génère un enregistrement permanent des changements squelettiques qui peut faciliter les comparaisons de plusieurs spécimens. La microtomodensitométrie (Micro CT) peut fournir une analyse quantitative précise des tissus minéralisés en acquérant une série de rayons X 2D. Cependant, en raison de la petite taille du poisson zèbre et de la minceur de nombreux os du squelette de poisson-zèbre en développement, les outils d’analyse Micro CT ne peuvent pas caractériser avec précision ces os16.
Les lignes rapporteures transgéniques fluorescentes aident également à visualiser le développement du squelette chez des larves vivantes ou même des poissons plus matures en temps réel17. De même, la coloration in vivo au rouge d’alizarine S permet l’évaluation de poissons vivants et le suivi continu des malformations18. Ainsi, la coloration rouge alizarine est un moyen utile et rentable d’analyser la perte osseuse chez les larves de poisson zèbre. Cependant, en raison de la complexité des étapes expérimentales et du nombre de solutions utilisées, les résultats finaux de l’analyse des images colorées en rouge alizarine peuvent être affectés par l’opération expérimentale. En outre, il est difficile d’utiliser cette méthode de coloration pour le poisson zèbre adulte en raison de l’augmentation du volume corporel et des tissus mous; L’analyse micro-tomodensitométrique ou les lignées transgéniques seraient un meilleur choix pour l’imagerie squelettique du poisson zèbre adulte. En résumé, le protocole présenté ici peut être utilisé pour étudier les changements dans la minéralisation osseuse chez les larves de poisson zèbre à la suite d’une exposition à des substances chimiques toxiques. Cette procédure pourrait être utile pour établir un modèle de poisson zèbre pour étudier les maladies osseuses et développer de nouveaux médicaments thérapeutiques.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (81872646; 81811540034; 81573173) et le développement du programme académique prioritaire des établissements d’enseignement supérieur du Jiangsu (PAPD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Tris-HCl (pH=7.5) | Solarbio,Beijing,China | 21 | for detaining |
| 4% Paraformaldehyde Fix Solution | BBI,Shanghai,China | 14 | fixing tissues |
| 10x PBS buffer | BBI,Shanghai,China | 15 | for fixing |
| 35% H2O2 | Yonghua,Jiangsu,China | 8 | removing pigment |
| 50 mL Centrifuge tube | AKX,Jiangsu,China | 4 | |
| 95% Anhydrous ethanol | Enox,Jiangsu,China | 2 | destaining |
| Alizarin red (Purity 99.5%) | Solarbio,Beijing,China | 1 | staining |
| Biochemical incubator | Yiheng,Shanghai,China | 3 | raising zebrafish embryos |
| Electronic scale | Sartorius,Germany | 5 | weighing the solid raw materials |
| Glycerin (Purity 99.5%) | BBI,Shanghai,China | 7 | storing the stained fish |
| ImageJ (software) | USA | 9 | digital analysis |
| KOH (Purity 99.9%) | Sigma,America | 10 | bleaching solution |
| Lead acetate trihydrate (Purity 99.5%) | Aladdin,Shanghai,China | 11 | |
| MgCl2 (Purity 99.9%) | Aladdin,Shanghai,China | 12 | cleaning solution |
| NIS-Elements F (software) | Nikon, Japan | 13 | observing and taking photos |
| Pipe | AKX, Jiangsu, China | 18 | removal of embryos and solution |
| plates (24-well) | Corning,America | 17 | container for staining embryos |
| plates (6-well) | Corning,America | 16 | container for breeding embryos |
| Shaking table | Beyotime, China | 19 | mixing the solution |
| Stereo microscope | Nikon,Japan | 20 | observing and taking photos |
| Zebrafish | Zebrafish Experiment Center of Soochow University,Suzhou,China | 22 | experimental animal |
References
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