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Genetics

उम्र पर निर्भर गुर्दे की हानि के साथ चूहों के गुर्दे और सीरम में माइक्रोआरएनए अभिव्यक्ति का मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन मूल्यांकन

Published: April 29, 2022 doi: 10.3791/63258
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1, 1, 1, 1,2, 3, 1
1Division of Nephrology, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University, 2Division of Intensive Care Unit, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University, 3Department of Medical Physiology, Meiji Pharmaceutical University

Summary

हम मात्रात्मक रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन द्वारा उम्र-निर्भर गुर्दे की हानि के साथ चूहों के गुर्दे और सीरम में माइक्रोआरएनए अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

माइक्रोआरएनए (एमआईआरएनए) छोटे, नॉनकोडिंग आरएनए होते हैं जिनमें 21-25 बेस होते हैं। उनका प्रोटीन में अनुवाद नहीं किया जाता है, बल्कि उन्हें अस्थिर करके और उनके अनुवाद को बाधित करके उनके लक्षित संदेशवाहक आरएनए (एमआरएनए) के कामकाज को बाधित करने के लिए काम किया जाता है। यद्यपि विभिन्न माउस अंगों और ऊतकों में एमआईआरएनए अभिव्यक्ति प्रोफाइल की जांच की गई है, माउस किडनी और सीरम एमआईआरएनए को शुद्ध करने और मापने के लिए कोई मानक तरीके नहीं हैं। हमने उम्र पर निर्भर गुर्दे की हानि के साथ चूहों के सीरम और गुर्दे में एमआईआरएनए अभिव्यक्ति को निकालने और मूल्यांकन करने के लिए एक प्रभावी और विश्वसनीय तरीका स्थापित किया है।

विधि मात्रात्मक रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन-पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूआरटी-पीसीआर) का उपयोग करती है, और प्रोटोकॉल को छह चरणों की आवश्यकता होती है: (1) सेनेसेंस-त्वरित माउस प्रतिरोध 1 (एसएएमआर 1) चूहों और सेनेसेंस-त्वरित माउस प्रवण (एसएएमपी 1) चूहों की तैयारी; (2) इन चूहों से सीरम नमूने निकालना; (3) प्रत्येक माउस से एक गुर्दे का नमूना निकालना; (4) प्रत्येक माउस से गुर्दे और सीरम नमूनों से कुल आरएनए (एमआईआरएनए सहित) निकालना; (5) एमआईआरएनए से रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के साथ पूरक डीएनए (सीडीएनए) का संश्लेषण; (6) प्राप्त सीडीएनए का उपयोग करके क्यूआरटी-पीसीआर का संचालन करना।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग यह पुष्टि करने के लिए किया गया था कि, नियंत्रण की तुलना में, एमआईआरएनए -7218-5 पी और एमआईआरएनए -7219-5 पी की अभिव्यक्ति उम्र-निर्भर गुर्दे की हानि के माउस मॉडल के गुर्दे और सीरम में काफी बदल गई थी। इस प्रोटोकॉल ने उम्र पर निर्भर गुर्दे की हानि के माउस मॉडल के गुर्दे और सीरम के बीच संबंध को भी स्पष्ट किया। इस प्रोटोकॉल का उपयोग उम्र पर निर्भर गुर्दे की हानि के साथ चूहों के गुर्दे और सीरम में एमआईआरएनए अभिव्यक्ति निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

विभिन्न एमआरएनए की अभिव्यक्ति जो शरीर विज्ञान और रोग दोनों (जैसे, सूजन, फाइब्रोसिस, चयापचय विकार और कैंसर) में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है, एमआईआरएनए द्वारा विनियमित होने के लिए जानी जाती है, जो छोटे, नॉनकोडिंग आरएनए हैं जो गिरावट का कारण बनते हैं और एमआरएनए1 के प्रतिलेखन को रोकते हैं। इसलिए, यह संभव है कि कुछ एमआईआरएनए विभिन्न बीमारियों 2,3,4,5 के लिए नए उम्मीदवारों और / या चिकित्सीय लक्ष्यों के रूप में काम कर सकते हैं। विभिन्न प्रकार के माउस अंगों और ऊतकों (मस्तिष्क6, हृदय7, फेफड़े8, यकृत9 और गुर्दे10 सहित) में एमआईआरएनए अभिव्यक्ति प्रोफाइल पर शोध किया गया है। हालांकि, उम्र पर निर्भर गुर्दे की हानि वाले चूहों के गुर्दे या सीरम में एमआईआरएनए निकालने और मूल्यांकन करने के लिए कोई मानक या स्थापित तरीके नहीं हैं।

इसलिए, हमने एक प्रोटोकॉल स्थापित किया जिसका उपयोग उम्र पर निर्भर गुर्दे की हानि वाले चूहों के सीरम और गुर्दे में एमआईआरएनए अभिव्यक्ति को मज़बूती से शुद्ध करने और पता लगाने के लिए किया जा सकता है। प्रोटोकॉल में छह मुख्य चरण हैं: (1) 50 सप्ताह के एसएएमआर 1 नर चूहों और एसएएमपी 1 नर चूहों दोनों की तैयारी; (2) चूहों के दोनों उपभेदों के अवर वेना कावा से रक्त के नमूनों का निष्कर्षण, हेपरिन के साथ एक स्पिट्ज ट्यूब के बाद के उपयोग के साथ, सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सीरम नमूना प्राप्त करने के लिए; (3) चूहों से गुर्दे का नमूना निष्कर्षण- एक सिलिकॉन होमोजेनाइज़र का उपयोग गुर्दे के नमूने को अलग से समरूप बनाने के लिए किया जाता है, और नमूना तब माइक्रोसेंट्रिफुग स्पिन कॉलम11 पर बायोपॉलिमर-श्रेडिंग सिस्टम में स्थानांतरित किया जाता है; (4) सिलिका झिल्ली-आधारित स्पिन कॉलम12 के उपयोग के साथ सीरम नमूनों से कुल आरएनए (एमआईआरएनए युक्त) निष्कर्षण और सिलिका झिल्ली-आधारित स्पिन कॉलम11 के उपयोग के साथ गुर्दे के नमूनों से एमआईआरएनए निष्कर्षण युक्त कुल आरएनए; (5) रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस, पॉली (ए) पोलीमरेज़ और ओलिगो-डीटी प्राइमर13,14 का उपयोग करके कुल आरएनए से पूरक डीएनए (सीडीएनए) का संश्लेषण; और (6) अंत में, क्यूआरटी-पीसीआर और एक इंटरकेलेटिंग डाई13,14 का उपयोग करके एमआईआरएनए अभिव्यक्ति का निर्धारण।

यह नया प्रोटोकॉल उन अध्ययनों पर आधारित था जो विभिन्न प्रकार के ऊतक 11,12,13 में एमआईआरएनए को निकालने और मूल्यांकन करने में सफल रहे। प्रोटोकॉल की बायोपॉलिमर-श्रेडिंग प्रणाली को ऊतकों से उच्च गुणवत्ता वाले कुल आरएनए को शुद्ध करने में सक्षम होने के लिए प्रदर्शित किया गया था11. एक इंटरकेलेटिंग डाई के साथ क्यूआरटी-पीसीआर द्वारा एमआईआरएनए अभिव्यक्ति के मूल्यांकन के लिए उपयोग किए जाने वाले इस प्रोटोकॉल के पहलुओं की सटीकता और संवेदनशीलता13,14 स्थापित की गई है, उदाहरण के लिए, निकाले गए कुल आरएनए से रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस, पॉली (ए) पोलीमरेज़ और ओलिगो-डीटी प्राइमरों के साथ सीडीएनए संश्लेषण। नए प्रोटोकॉल के कई फायदे हैं: सादगी, समय की बचत और कम तकनीकी त्रुटियां। इस प्रकार, इसका उपयोग उन जांचों के लिए किया जा सकता है जिनके लिए गुर्दे और सीरम एमआईआरएनए प्रोफाइल की सटीक और संवेदनशील पहचान की आवश्यकता होती है। कई रोग स्थितियों के अध्ययन भी नए प्रोटोकॉल का उपयोग कर सकते हैं।

एसएएमपी 1 चूहों में एमआईआरएनए अभिव्यक्ति प्रोफाइल, जो आयु-निर्भर गुर्दे की हानि का एक मॉडल है, नीचे दिखाए गए अनुसार निर्धारित किया जा सकता है। मनुष्यों में, आयु-निर्भर गुर्दे की हानि गुर्दे की विफलता की प्रगति से जुड़ी होती है और गुर्दे के अंतरालीय फाइब्रोसिस के क्षेत्र में वृद्धि और ग्लोमेरुलोस्क्लेरोसिस15,16 की प्रगति दोनों की विशेषता है। आयु-निर्भर गुर्दे की हानि भी क्रोनिक किडनी रोग और अंत-चरण गुर्दे की बीमारी15,16 की एक महत्वपूर्ण और लगातार विशेषता है।

Protocol

प्रायोगिक प्रोटोकॉल जिची मेडिकल यूनिवर्सिटी की पशु नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था और प्रयोगशाला जानवरों के लिए जिची मेडिकल यूनिवर्सिटी गाइड और प्रयोगात्मक जानवरों के उपयोग और देखभाल से संबंधित इसके दिशानिर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया था। यह प्रोटोकॉल चार 50 सप्ताह पुराने एसएएमआर 1 नर चूहों और एसएएमपी 1 नर चूहों (40-45 ग्राम) का उपयोग करता है।

1. सीरम नमूना संग्रह

  1. प्रत्येक माउस के लिए निम्नलिखित तैयार करें: 1.0 मिलीलीटर सिरिंज के साथ 30 ग्राम सुई, हेपरिन के साथ 1.0 एमएल स्पिट्ज सेंट्रीफ्यूजेशन ट्यूब, 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफुज ट्यूब, आइसोफ्लूरेन एनेस्थेटिक, एक कॉर्क शीट, 70% इथेनॉल, फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के साथ सिक्त दो कपास झाड़ू, पीबीएस के साथ एक पेट्री डिश, चिमटी, और सर्जिकल कैंची
  2. 1.5% आइसोफ्लूरेन के साथ माउस को संवेदनाहारी करें और 1.5% पर बनाए रखें। किग्रा) को चमड़े के नीचे प्रशासित करें, फिर इसके पेट में 70% इथेनॉल के 1.0 मिलीलीटर इंजेक्ट करें और इसे कॉर्क शीट पर लापरवाह स्थिति में रखें।
  3. पेडल निकासी पलटा के गायब होने से संज्ञाहरण की गहराई की पुष्टि करें। चिमटी और सर्जिकल कैंची के साथ, पेट की त्वचा को चीरा। मांसपेशियों और पेरिटोनियल झिल्ली को मूत्राशय से पसलियों के निचले-बाएं किनारे तक काटें।
  4. पेरिटोनियल झिल्ली को उठाने के लिए चिमटी का उपयोग करें, और सर्जिकल कैंची के साथ पेरिटोनियल झिल्ली के ऊपरी किनारे में एक पार्श्व चीरा बनाएं। पसलियों के सबसे निचले किनारे के साथ चीरा जारी रखें।
  5. दो पीबीएस-सिक्त कपास झाड़ू का उपयोग करके अवर वेना कावा की पहचान करें। अवर वेना कावा में 1.0 मिलीलीटर सिरिंज के साथ 30 जी सुइयों में से एक डालें और फिर सिरिंज खींचें। हेमोलिसिस से बचने के लिए सुई को धीरे-धीरे अवर वेना कावा से बाहर निकालें। रक्त को हेपरिन के साथ 1.0 एमएल स्पिट्ज ट्यूब में स्थानांतरित करें और फिर ट्यूब को कई बार उलटकर मिलाएं।
    नोट: माउस गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा इच्छामृत्यु है।
  6. कमरे के तापमान (आरटी), 10 मिनट के लिए 3,000 × ग्राम पर स्पिट्ज ट्यूब स्पिन करें।
  7. सतह पर तैरनेवाला धीरे-धीरे एस्पिरेट करें, सुनिश्चित करें कि इसमें तलछट नहीं है, और फिर इसे अप्रयुक्त 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  8. उपयोग करने से पहले ट्यूब को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: यदि चरण 3 पर तुरंत आगे बढ़ते हैं, तो ट्यूब को -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करने की आवश्यकता नहीं है।

2. गुर्दे के नमूने संग्रह

  1. प्रत्येक माउस के लिए निम्नलिखित तैयार करें: 2.0 एमएल क्रायोट्यूब, आइसोफ्लूरेन संवेदनाहारी, एक कॉर्क शीट, 70% इथेनॉल, पीबीएस, चिमटी और सर्जिकल कैंची के साथ एक पेट्री डिश।
  2. 1.5% आइसोफ्लूरेन के साथ माउस को संवेदनाहारी करें और 1.5% पर बनाए रखें। किग्रा) चमड़े के नीचे प्रशासित करें, फिर इसके पेट में 70% इथेनॉल के 1.0 मिलीलीटर इंजेक्ट करें, और इसे कॉर्क शीट पर लापरवाह स्थिति में रखें।
  3. पेडल निकासी पलटा के गायब होने से संज्ञाहरण की गहराई की पुष्टि करें। पेट की त्वचा में चीरा लगाने के लिए चिमटी और सर्जिकल कैंची का उपयोग करें। मांसपेशियों और पेरिटोनियल झिल्ली को मूत्राशय से पसलियों के निचले-बाएं किनारे तक काटें।
  4. पेरिटोनियल झिल्ली को उठाने के लिए चिमटी का उपयोग करें और सर्जिकल कैंची के साथ पेरिटोनियल झिल्ली के ऊपरी किनारे में एक पार्श्व चीरा बनाएं। पसलियों के सबसे निचले किनारे के साथ चीरा जारी रखें।
  5. बाएं गुर्दे की पहचान करें। वाहिकाओं से रक्त को फ्लश करने के लिए इसे पीबीएस के साथ रिफ्लक्स करें जब तक कि गुर्दे पीले-सफेद रंग में न बदल जाए। बाएं गुर्दे की धमनी और नस को तोड़ने के लिए सर्जिकल कैंची का उपयोग करके पहले पूरे गुर्दे को उत्पादित करें। पेट्री डिश में गुर्दे रखें और इसे पीबीएस के साथ ध्यान से धो लें।
    नोट: माउस गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा इच्छामृत्यु है।
  6. 10 मिलीग्राम नमूनों में गुर्दे को काटने के लिए चिमटी और सर्जिकल कैंची का उपयोग करें (10 मिलीग्राम अगले चरण के लिए एक उपयुक्त नमूना आकार है)। गुर्दे के प्रत्येक नमूने को अपने स्वयं के 2.0 एमएल क्रायोट्यूब में रखें। ट्यूब की टोपी बंद करें।
  7. दीर्घकालिक भंडारण के लिए, प्रत्येक क्रायोट्यूब को तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करें और इसे -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. सीरम नमूने से कुल आरएनए निष्कर्षण

  1. गुआनिडाइन-आधारित लाइसिस अभिकर्मक, 80% इथेनॉल, 100% इथेनॉल, 100% क्लोरोफॉर्म, बायोपॉलिमर स्पिन कॉलम (2.0 एमएल संग्रह ट्यूब11 में), झिल्ली-लंगर वाले स्पिन कॉलम (2.0 एमएल संग्रह ट्यूब11 में), वॉश बफर # 1 (यानी, वॉश बफर युक्त गुआनिडाइन और 100% इथेनॉल) 1: 4 के अनुपात में गुआनिडीन और 100% इथेनॉल युक्त वॉश बफर), आरएनएएसई मुक्त पानी, 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब, और 2.0 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब।
  2. सबसे पहले, 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में 200 μL सीरम नमूना लें, और फिर फिनोल / गुआनिडाइन-आधारित लाइसिस अभिकर्मक के 1,000 μL जोड़ें। 5 एस के लिए मिश्रण भंवर।
  3. 5 मिनट के लिए आरटी पर नमूना सेते हैं।
  4. ट्यूब में सीरम नमूने के लिए क्लोरोफॉर्म के 200 μL जोड़ें और ट्यूब टोपी कसकर बंद करें। क्लोरोफॉर्म और सीरम नमूने को मिलाने के लिए ट्यूब 15x को उल्टा करें।
  5. प्रत्येक नमूना 3 मिनट के लिए आरटी पर ऊष्मायन किया जाता है। अगला, 12,000 एक्स जी पर 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूना स्पिन।
  6. गोली परेशान किए बिना एक नए 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब के लिए सतह पर तैरनेवाला के 300 μL स्थानांतरण। 100% इथेनॉल के 450 μL जोड़ें, और 5 एस के लिए ट्यूब भंवर।
    नोट: निम्नलिखित सभी चरणों में, इसे अपकेंद्रित्र करने के लिए 2.0 एमएल संग्रह ट्यूब में आरएनए और डीएनए के पृथक्करण के लिए झिल्ली-लंगर वाले स्पिन कॉलम रखें।
  7. फिर, नमूने के 700 μL को हटा दें, इसे झिल्ली-लंगर वाले स्पिन कॉलम पर लोड करें, और टोपी बंद करें। 8,000 × ग्राम पर 15 एस के लिए आरटी पर कॉलम स्पिन करें, और कॉलम में सतह पर तैरनेवाला छोड़ दें। संग्रह ट्यूब में शेष गोली त्यागें।
  8. नमूना को अच्छी तरह से साफ करने के लिए झिल्ली-लंगर वाले स्पिन कॉलम में वॉश बफर # 1 के 700 μL जोड़ें जो सीरम / प्लाज्मा किट ( सामग्री की तालिका देखें) का हिस्सा है। कॉलम कैप बंद करें और 8,000 × ग्राम पर 15 एस के लिए आरटी पर कॉलम स्पिन करें , और कॉलम में सतह पर तैरनेवाला छोड़ दें। संग्रह ट्यूब में शेष गोली त्यागें।
  9. ट्रेस लवण को हटाने के लिए, वॉश बफर # 2 के 500 μL लें और इसे झिल्ली-लंगर वाले स्पिन कॉलम पर लोड करें। कॉलम कैप को बंद करने के बाद, 8,000 × ग्राम पर 15 एस के लिए आरटी पर कॉलम स्पिन करें, और कॉलम में सतह पर तैरनेवाला छोड़ दें। संग्रह ट्यूब में गोली त्यागें।
  10. ट्रेस लवण को हटाने के लिए, 80% इथेनॉल के 500 μL लें और इसे झिल्ली-लंगर वाले स्पिन कॉलम पर लोड करें। कॉलम कैप को बंद करने के बाद, 8,000 × ग्राम पर 15 एस के लिए आरटी पर कॉलम स्पिन करें, और कॉलम में सतह पर तैरनेवाला छोड़ दें। संग्रह ट्यूब में गोली त्यागें।
  11. 15,000 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए आरटी पर झिल्ली-लंगर वाले स्पिन कॉलम को फिर से स्पिन करें।
  12. झिल्ली-लंगर वाले स्पिन कॉलम को एक नए 1.5 एमएल संग्रह ट्यूब में स्थानांतरित करने के बाद, कुल आरएनए को भंग करने के लिए कॉलम में 14 μL आरएनए-मुक्त पानी जोड़ें। कॉलम कैप बंद करने के बाद, आरटी पर छोड़ी गई ट्यूब के साथ 5 मिनट प्रतीक्षा करें आरटी पर 15,000 × ग्राम पर 1 मिनट के लिए कॉलम को फिर से स्पिन करें।
  13. उपयोग करने से पहले -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों के साथ ट्यूबों को स्टोर करें।

4. गुर्दे के नमूने से कुल आरएनए का निष्कर्षण

  1. पहले निम्नलिखित आइटम तैयार करें: एक सिलिकॉन होमोजेनाइज़र, बर्फ, एक भंवर मिक्सर, 100% इथेनॉल,100% क्लोरोफॉर्म, बायोपॉलिमर स्पिन कॉलम (2.0 एमएल संग्रह ट्यूब11 में), झिल्ली-लंगर वाले स्पिन कॉलम (2.0 एमएल संग्रह ट्यूब 11 में), फिनोल / आरएनएएसई मुक्त पानी, 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब, और 2.0 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब।
  2. सिलिकॉन होमोजेनाइज़र में 10 मिलीग्राम गुर्दे का नमूना रखें, और फिनोल / गुआनिडाइन-आधारित लाइसिस अभिकर्मक के 700 μL जोड़ें।
  3. होमोजेनाइज़र सेट करें। नमूने को समरूप बनाने के लिए गुर्दे के नमूने के खिलाफ होमोजेनाइज़र के मूसल को धीरे से दबाएं और मोड़ें। गुआनिडाइन-आधारित लिसिस अभिकर्मक में गुर्दे का नमूना पूरी तरह से समरूप होने तक मूसल को दबाना और मोड़ना जारी रखें।
  4. आगे के होमोजेनाइजेशन के लिए, होमोजेनाइज्ड लाइसेट (2.0 एमएल संग्रह ट्यूब में) लें और इसे बायोपॉलिमर स्पिन कॉलम में स्थानांतरित करें।
  5. 14,000 × ग्राम पर 3 मिनट के लिए आरटी पर होमोजेनाइज्ड लाइसेट अपकेंद्रित्र करें और फिर अवक्षेपित गोली को उलटने के लिए एक अप्रयुक्त 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में पूरे अवक्षेपित गोली को स्थानांतरित करें
  6. ट्यूब में क्लोरोफॉर्म के 140 μL के साथ गोली मिलाएं; फिर, ट्यूब कैप को कसकर बंद करें। लाइसेट और क्लोरोफॉर्म को मिलाने के लिए ट्यूब 15एक्स को उल्टा करें।
    नोट: क्लोरोफॉर्म का उपयोग हुड के बिना सुरक्षित रूप से किया जा सकता है।
  7. 2-3 मिनट के लिए आरटी पर नमूना सेते हैं। 12,000 × ग्राम पर 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूना अपकेंद्रित्र।
  8. सतह पर तैरनेवाला (जो आमतौर पर ~ 300 μL है) को एक नए 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, अवक्षेप को परेशान किए बिना। 100% इथेनॉल की इसकी मात्रा (जो आमतौर पर ~ 450 μL है) का 1.5 गुना जोड़ें। 5 एस के लिए मिश्रण भंवर।
    नोट: निम्नलिखित सभी चरणों में, इसे अपकेंद्रित्र करने के लिए 2.0 एमएल संग्रह ट्यूब में आरएनए और डीएनए को अलग करने के लिए झिल्ली-लंगर वाले स्पिन कॉलम रखें।
  9. झिल्ली लंगर स्पिन स्तंभों में से एक पर नमूना के 700 μL लोड। टोपी बंद करें और 15 एस के लिए 15,000 × ग्राम पर कॉलम अपकेंद्रित्र करें। संग्रह ट्यूब में शेष अवक्षेपित लाइसेट को त्यागें।
  10. इसे अच्छी तरह से धोने के लिए स्पिन कॉलम में वॉश बफर # 1 के 700 μL जोड़ें। टोपी बंद करें और 15 एस के लिए 15,000 × ग्राम पर कॉलम अपकेंद्रित्र करें। संग्रह ट्यूब में शेष अवक्षेपित लाइसेट को त्यागें।
  11. नमक की ट्रेस मात्रा को हटाने के लिए, झिल्ली-लंगर वाले स्पिन कॉलम पर वॉश बफर # 2 के 500 μL लोड करें। कॉलम कैप को बंद करने के बाद, कॉलम को 15 एस के लिए 15,000 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें। संग्रह ट्यूब में अवक्षेपित लाइसेट को त्यागें।
  12. चरण 4.11 दोहराएँ।
  13. 15,000 × ग्राम पर 1 मिनट के लिए झिल्ली-लंगर वाले स्पिन कॉलम को फिर से अपकेंद्रित्र करें। संग्रह ट्यूब में अवक्षेपित लाइसेट को त्यागें।
  14. झिल्ली-लंगर वाले स्पिन कॉलम लें और इसे एक नए 1.5 एमएल संग्रह ट्यूब में स्थानांतरित करें। कुल आरएनए को भंग करने के लिए कॉलम में आरएनएएसई मुक्त पानी के 30 μL जोड़ें। कॉलम की टोपी बंद करने के बाद, आरटी पर ट्यूब के साथ 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें, और फिर 15,000 × ग्राम पर 1 मिनट के लिए कॉलम अपकेंद्रित्र करें।
  15. एक नए माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब के लिए कुल आरएनए युक्त नमूने की कुल मात्रा हस्तांतरण। बर्फ पर ट्यूब रखें, और स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा कुल आरएनए एकाग्रता को मापें। सुनिश्चित करें कि कुल आरएनए एकाग्रता ~ 300-1,500 एनजी /
  16. उपयोग करने से पहले -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूने युक्त ट्यूबों को स्टोर करें।

5. सीरम में कुल आरएनए के रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के साथ सीडीएनए का संश्लेषण

नोट: मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर प्रयोगों (MIQE) दिशानिर्देशों के प्रकाशन के लिए न्यूनतम जानकारी विश्वसनीय, असमान परिणाम प्राप्त करने के लिए बेहतर प्रयोगात्मक प्रथाओं का उपयोग करने की सलाहदेते हैं 17. इस प्रोटोकॉल में, सीडीएनए को रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस, पॉली (ए) पोलीमरेज़ और ओलिगो-डीटी प्राइमरों का उपयोग करके दो-चरणीय प्रक्रिया में शुद्ध कुल आरएनए से संश्लेषित किया जाता है।

  1. निम्नलिखित पहले तैयार करें: एक भंवर मिक्सर, एक थर्मल साइक्लर, आठ-अच्छी तरह से स्ट्रिप ट्यूब, प्रत्येक आठ-पट्टी ट्यूब की टोपी, आसुत जल, बर्फ, रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस किट (सामग्री की तालिका देखें) पिघला हुआ राज्य में 13,14, और 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब।
  2. थर्मल साइक्लर शुरू करें।
  3. मास्टर मिश्रण समाधान तैयार करें; आठ-अच्छी तरह से पट्टी ट्यूब प्रति मास्टर मिश्रण के कुल 8.0 μL प्राप्त करने के लिए, रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस मिश्रण (किट में शामिल) के 2.0 μL और 10x न्यूक्लिक एसिड मिश्रण के 2.0 μL को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन बफर के 4.0 μL में जोड़ें।
  4. एक आठ अच्छी तरह से पट्टी ट्यूब के प्रत्येक ट्यूब में मास्टर मिश्रण समाधान के 8.0 μL प्लेस।
  5. आठ अच्छी तरह से पट्टी ट्यूब के प्रत्येक ट्यूब में कुल आरएनए का एक 12 μL विभाज्य रखें, और ट्यूब की टोपी बंद करें। आरटी पर 15 एस और 2,000 × ग्राम के लिए ट्यूब अपकेंद्रित्र।
  6. थर्मल साइक्लर में ट्यूब रखें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए सेते हैं। सीडीएनए को संश्लेषित करने के लिए 95 डिग्री सेल्सियस मिनट पर एक अतिरिक्त 5 मिनट के लिए नमूना सेते हैं।
  7. इनक्यूबेशन के बाद, सीडीएनए को एक नए 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। आसुत जल के साथ सीडीएनए को दस गुना (1:10) पतला करें। भंवर और आरटी और 2,000 × ग्राम पर 5 एस के लिए ट्यूब अपकेंद्रित्र।
  8. बर्फ पर अस्थायी रूप से पतला सीडीएनए स्टोर करें। उपयोग करने से पहले -80 डिग्री सेल्सियस पर पतला नमूने स्टोर करें।

6. गुर्दे में कुल आरएनए के रिवर्स प्रतिलेखन के साथ सीडीएनए का संश्लेषण

नोट: एमआईक्यूई दिशानिर्देश विश्वसनीय और स्पष्ट परिणाम सुनिश्चित करने के लिए बेहतर प्रयोगात्मक प्रथाओं को प्रोत्साहित करतेहैं 17. यह प्रोटोकॉल दो-चरणीय प्रक्रिया में शुद्ध कुल आरएनए के 1.0 μg से सीडीएनए को संश्लेषित करने के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस, पॉली (ए) पोलीमरेज़ और ओलिगो डीटी प्राइमरों का उपयोग करता है।

  1. सबसे पहले, निम्नलिखित तैयार करें: एक भंवर मिक्सर, एक थर्मल साइक्लर, 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब, आठ-अच्छी तरह से स्ट्रिप ट्यूब, प्रत्येक आठ-स्ट्रिप ट्यूब की टोपी, आसुत जल, बर्फ, और एक रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस किट (सामग्री की तालिका देखें) पिघला हुआ राज्य में 13,14।
  2. थर्मल साइक्लर शुरू करें।
  3. मास्टर मिश्रण समाधान तैयार करें; ट्यूब प्रति मास्टर मिश्रण समाधान के कुल 8.0 μL प्राप्त करने के लिए, किट में शामिल है कि रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस मिश्रण के 2.0 μL और रिवर्स प्रतिलेखन बफर के 4.0 μL करने के लिए 10x न्यूक्लिक एसिड मिश्रण के 2.0 μL जोड़ें।
  4. एक आठ अच्छी तरह से पट्टी ट्यूब के प्रत्येक ट्यूब के लिए मास्टर मिश्रण समाधान के 8.0 μL जोड़ें।
  5. कुल आरएनए घनत्व को निम्नानुसार समायोजित करें। आरनेस मुक्त पानी के 12 μL के साथ गुर्दे के नमूने से कुल आरएनए के 1.0 μg के पृथक्करण के लिए, कुल आरएनए की एक उपयुक्त मात्रा लें और ऊपर वर्णित एकाग्रता का उपयोग करके आसुत जल में स्थानांतरित करें (चरण 4.15 में।
    नोट: डीएनए संदूषण की उपस्थिति में, दूषित डीएनए क्यूआरटी-पीसीआर द्वारा सह-प्रवर्धित होता है।
  6. चरण 5.5.-5.8 में ऊपर वर्णित के रूप में एक ही प्रक्रिया निष्पादित करें।

7. एमआईआरएनए का क्यूआरटी-पीसीआर

नोट: एमआईआरएनए के क्यूआरटी-पीसीआर के लिए एक इंटरकैलेटर विधि का उपयोग किया जाता है। प्राइमरों का उपयोग आरएनए के लिए किया जाता है: यू 6 छोटे परमाणु 2 (आरएनयू 6-2), एमआईआरएनए -223-3 पी, एमआईआरएनए -423-5 पी, एमआईआरएनए -7218-5 पी, और एमआईआरएनए -7219-5 पी।

  1. निम्नलिखित तैयार करें: एक भंवर मिक्सर, एक वास्तविक समय पीसीआर प्रणाली, क्यूआरटी-पीसीआर के लिए एक 96-अच्छी तरह से प्रतिक्रिया प्लेट, 96-अच्छी तरह से प्रतिक्रिया प्लेट के लिए चिपकने वाली फिल्म, चिपकने वाला फिल्म आवेदक, एक 96-अच्छी तरह से अपकेंद्रित्र रोटर, एमआईआरएनए-विशिष्ट प्राइमर, एक हरी डाई-आधारित पीसीआर किट जिसमें 2 एक्स पीसीआर मास्टर मिक्स और 10 एक्स यूनिवर्सल प्राइमर (सामग्री की तालिका देखें) और एक 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब।
  2. 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में मिश्रण करने के बाद निम्नलिखित भंवर: आसुत जल का 6.25 μL, न्यूक्लियस मुक्त पानी में भंग 5 μM एमआईआरएनए प्राइमर के 1.25 μL प्रत्येक, 2x पीसीआर मास्टर मिश्रण के 12.5 μL, और 10x सार्वभौमिक प्राइमर के 2.5 μL।
  3. चरण 5 (सीरम) या चरण 6 (गुर्दे) में वर्णित सीडीएनए को तैयार करें और पिघलाएं। भंवर और अपकेंद्रित्र 5 एस के लिए सीडीएनए।
  4. अभिकर्मक के 22.5 μL विभाज्य लें (जैसा कि ऊपर चरण 7.2 में वर्णित है) और उन्हें 96-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में अलग से रखें।
  5. प्लेट के प्रत्येक कुएं में सीडीएनए का 2.5 μL विभाज्य जोड़ें।
  6. प्लेट में चिपकने वाली फिल्म को सुरक्षित करने के लिए, चिपकने वाली फिल्म आवेदक का उपयोग करें। 96-अच्छी तरह से अपकेंद्रित्र रोटर में 1,000 एक्स जी पर 30 एस के लिए प्लेट अपकेंद्रित्र। प्रत्येक कुएं के तल पर प्रतिक्रिया को स्थिर करें।

8. पीसीआर साइक्लिंग प्रोग्राम चलाने के लिए वास्तविक समय पीसीआर सिस्टम और सॉफ्टवेयर का उपयोग करना

  1. वास्तविक समय पीसीआर प्रणाली शुरू करें। चरण 7.6 में वर्णित के रूप में बनाई गई प्लेट रखें। वास्तविक समय पीसीआर प्रणाली में। सेटिंग्स संशोधित करें; प्रयोग के लिए एक नाम प्रदान करते हैं, और फिर सिस्टम के प्रयोग प्रकार के रूप में 96-अच्छी तरह से (0.2 एमएल), मात्रात्मक विधि के रूप में तुलनात्मक सीटी (ΔΔC) का चयन करें, सिस्टम रन मोड के रूप में मानक , और लक्ष्य अनुक्रम का पता लगाने के लिए अभिकर्मकों के रूप में एसवाईबीआर ग्रीन अभिकर्मकों का चयन करें।
  2. नमूना और लक्ष्य एमआईआरएनए के लिए नाम प्रदान करें, और प्रत्येक कुएं में नमूना और लक्ष्य एमआईआरएनए का नाम दें। परिणामों की पुष्टि करने के लिए उपयुक्त डेटा प्राप्त करने के लिए डुप्लिकेट नमूने असाइन करें, और एक संदर्भ नमूना और अंतर्जात नियंत्रण चुनें। निष्क्रिय संदर्भ के रूप में उपयोग करने के लिए डाई के लिए, कोई भी नहीं चुनें। अभिकर्मक क्रॉस-संदूषण को खत्म करने के लिए, एमआईआरएनए अभिव्यक्ति के लिए नकारात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस और एक गैर-टेम्पलेट नियंत्रण स्थापित करें।
  3. अगला, सुनिश्चित करें कि प्रतिक्रिया की मात्रा 20 μL पर सेट है और पीसीआर साइकिल चलाने की स्थिति निम्नानुसार सेट की गई है: 15 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, फिर 15 एस के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण के 40 चक्र, 30 एस के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर एनीलिंग, और अंत में 30 एस के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर विस्तार।
  4. प्रक्रिया पूरी होने के बाद क्यूआरटी-पीसीआर डेटा का विश्लेषण करने के लिए सिस्टम के सॉफ्टवेयर प्रोग्राम में विश्लेषण पर क्लिक करें। पुष्टि करें कि प्रोग्राम द्वारा स्वचालित रूप से चयनित थ्रेशोल्ड लाइन प्रत्येक कुएं के लिए उपयुक्त है।
  5. प्रत्येक नमूने में विश्लेषण किए गए अंतर्जात नियंत्रण और लक्ष्य एमआईआरएनए के थ्रेशोल्ड चक्र (सीटी) मूल्य की जांच करें। प्रवर्धन वक्र और थ्रेशोल्ड लाइन के चौराहे द्वारा सीटी मान निर्धारित करें।
    नोट: वर्तमान अध्ययन में, आरएनयू 6-2 और एमआईआरएनए -423-5 पी का उपयोग लक्ष्य एमआईआरएनए अभिव्यक्ति स्तरों के लिए अंतर्जात नियंत्रण के रूप में किया गया था, और प्रत्येक लक्ष्य एमआईआरएनए18 के सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तर निर्धारित करने के लिए ΔΔC विधि का उपयोग किया गया था।

Representative Results

आयु-निर्भर गुर्दे की हानि माउस मॉडल के लिए, हमने 40-45 ग्राम वजन वाले 50 सप्ताह के एसएएमपी 1 नर चूहों का उपयोग किया लगभग 0.8 मिलीलीटर रक्त प्रति माउस एकत्र किया गया था और हेपरिन, उल्टे और सेंट्रीफ्यूज के साथ 1.0 एमएल स्पिट्ज ट्यूब में स्थानांतरित किया गया था। प्रत्येक गुर्दे को पीबीएस के साथ धोया गया था, विच्छेदित किया गया था, और आगे के विश्लेषण के लिए तरल नाइट्रोजन में संग्रहीत किया गया था। पचास सप्ताह के एसएएमआर 1 चूहों ने नियंत्रण के रूप में कार्य किया। इस आयु-निर्भर गुर्दे की हानि मॉडल का उपयोग करके प्राप्त एमआईआरएनए क्यूआरटी-पीसीआर डेटा के आधार पर, हमने देखा कि एमआईआरएनए -7219-5 पी के गुर्दे के स्तर में काफी वृद्धि हुई थी और एमआईआरएनए -7218-5 पी का गुर्दा स्तर नियंत्रण (चित्रा 1) की तुलना में एसएएमपी 1 चूहों में काफी कम हो गया था। एमआईआरएनए -7219-5 पी और एमआईआरएनए -7218-5 पी दोनों के सीरम स्तर नियंत्रण (चित्रा 2) की तुलना में एसएएमपी 1 चूहों में काफी बढ़ गए थे। एमआईआरएनए -223-3 पी की अभिव्यक्ति का स्तर या तो तनाव में और गुर्दे और सीरम (चित्रा 1 और चित्रा 2) के बीच नहीं बदला।

Figure 1
चित्रा 1: एसएएमपी 1 चूहों के गुर्दे में अलग-अलग व्यक्त माइक्रोआरएनए एसएएमआर 1 चूहों (नियंत्रण, एन = 4) और एसएएमपी 1 चूहों (एन = 4) में एमआईआरएनए -223-3 पी, एमआईआरएनए -7218-5 पी, और एमआईआरएनए -7219-5 पी की अभिव्यक्ति का क्यूआरटी-पीसीआर विश्लेषण। डेटा मानक त्रुटि (त्रुटि सलाखों) ± मतलब है; समूह के बीच मतभेदों का विश्लेषण करने के लिए टी-परीक्षणों का उपयोग किया गया था; पी < 0.05 को महत्वपूर्ण माना जाता था (* पी < 0.05), एनएस: महत्वपूर्ण नहीं। संक्षिप्त नाम: एमआईआरएनए = माइक्रोआरएनए; एसएएमपी 1 = सेनेसेंस-त्वरित माउस प्रवण; एसएएमआर 1 = सेनेसेंस-त्वरित माउस प्रतिरोध 1; क्यूआरटी-पीसीआर = मात्रात्मक रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन-पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: एसएएमपी 1 चूहों के सीरम में अलग-अलग व्यक्त एमआईआरएनए 1 चूहों (नियंत्रण, एन = 4) और एसएएमपी 1 चूहों (एन = 4) में एमआईआरएनए -223-3 पी, एमआईआरएनए -7218-5 पी, और एमआईआरएनए -7219-5 पी की अभिव्यक्ति का क्यूआरटी-पीसीआर विश्लेषण। डेटा एसई (त्रुटि सलाखों) ± मतलब है; समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर की जांच के लिए टी-परीक्षणों का उपयोग किया गया था। * पी टी-टेस्ट द्वारा 0.05 <। संक्षिप्त नाम: एमआईआरएनए = माइक्रोआरएनए; एसएएमपी 1 = सेनेसेंस-त्वरित माउस प्रवण; एसएएमआर 1 = सेनेसेंस-त्वरित माउस प्रतिरोध 1; क्यूआरटी-पीसीआर = मात्रात्मक रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन-पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

लक्ष्य एमआईआरएनए के अभिव्यक्ति स्तर को क्यूआरटी-पीसीआर का उपयोग करके उपरोक्त वर्णित प्रोटोकॉल द्वारा सफलतापूर्वक निर्धारित किया गया था। निकाले गए एमआईआरएनए का मूल्यांकन सार्थक क्यूआरटी-पीसीआर डेटा प्राप्त करने में एक महत्वपूर्ण कदम है। क्यूआरटी-पीसीआर करने से पहले एमआईआरएनए की पर्याप्त गुणवत्ता की पुष्टि करने के लिए, स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री का उपयोग 260 एनएम पर अवशोषण के अनुपात को 280 एनएम पर निर्धारित करने के लिए किया जाना चाहिए। डीएनए संदूषण हो सकता है, और / या प्रतिक्रिया प्लेट के प्रत्येक कुएं में प्राइमर डिमर मौजूद हो सकते हैं यदि क्यूआरटी-पीसीआर अपेक्षित लंबाई और पिघलने के तापमान का एक भी पीसीआर प्रवर्धन प्रदान नहीं करता है, या यदि यह एक मोनोमोडल पिघलने वक्र प्रदान करता है।

एमआईआरएनए अभिव्यक्ति के स्तर का मूल्यांकन क्यूआरटी-पीसीआर के अलावा कई तरीकों से किया जा सकता है, जिसमें उत्तरी सोख्ता, एक माइक्रोएरे और राइबोन्यूक्लिज संरक्षण परख शामिल हैं। हालांकि, क्यूआरटी-पीसीआर विधि एक संवेदनशील, सटीक, सरल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रक्रिया है जिसके लिए उत्तरी सोख्ता और राइबोन्यूक्लिज संरक्षण परख19 के लिए आवश्यक लोगों की तुलना में एक छोटी नमूना मात्रा की आवश्यकता होती है। चूंकि माइक्रोएरे एक साथ हजारों एमआईआरएनए की अभिव्यक्ति को माप सकते हैं, इसलिए उनका उपयोग उम्मीदवार एमआईआरएनए मार्करों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। माइक्रोएरे डेटा क्यूआरटी-पीसीआर20 द्वारा प्राप्त डेटा के साथ एक उच्च समग्र सहसंबंध भी दिखाता है। तथापि, विभिन्न अध्ययनों में प्राप्त माइक्रोएरे डेटा की तुलना करने के लिए इष्टतम पद्धति के संबंध में कोई सर्वसम्मति नहीं बनीहै।

सीरम एमआईआरएनए के मूल्यांकन में निम्नलिखित विशेषताएं हैं। सबसे पहले, सीरम इकट्ठा करना आसान है, और जैसा कि सीरम एमआईआरएनए ठंड और विगलन, तापमान और एसिड के खिलाफ स्थिर हैं, एमआईआरएनए अच्छे बायोमार्कर हो सकते हैं। दूसरा, प्रजातियों के बीच एमआईआरएनए की उच्च होमोलॉजी है, और जानवरों के प्रयोगों के परिणाम आसानी से मनुष्यों के लिए एक्सट्रपलेशन किए जाते हैं। तीसरा, सीरम एमआईआरएनए ने चिकित्सीय दवाओं के रूप में उपयोग की क्षमता दिखाईहै 3. कई अध्ययनों से यह भी पता चला है कि अंगों में एमआईआरएनए की अभिव्यक्ति का स्तर सीरम 22,23,24 में एमआईआरएनए के साथ सहसंबद्ध है। वर्तमान अध्ययन में, एमआईआरएनए -223-3 पी, जिनमें से गुर्दे के स्तर ने एसएएमआर 1 और एसएएमपी 1 चूहों के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाया, ने सीरम में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाया। इसके विपरीत, एमआईआरएनए -7218-5 पी और एमआईआरएनए -7219-5 पी, जिनमें से गुर्दे के स्तर ने एसएएमआर 1 और एसएएमपी 1 चूहों के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर दिखाया, सीरम में काफी तनाव अंतर दिखाया।

इस प्रोटोकॉल की निम्नलिखित सीमाएँ हैं। पहला, यकृत और फेफड़े जैसे अन्य अंगों में इसकी उपयोगिता सत्यापित नहीं की गई है, और दूसरा, चूहों, कुत्तों और सूअरों जैसे अन्य प्रयोगशाला जानवरों पर इसका परीक्षण नहीं किया गया है। कई शोध समूहों ने क्यूआरटी-पीसीआर द्वारा एमआईआरएनए के शुद्धिकरण और पता लगाने के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग किया है और बताया है कि इस प्रोटोकॉल ने ऊतकों और सीरम 13,14,22,23,24 से उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए की शुद्धि को सक्षम किया है। एमआईआरएनए 13,14,22,23,24 की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए इस पद्धति को उच्च सटीकता और संवेदनशीलता का प्रदर्शन किया गया है। वर्तमान अध्ययन के परिणाम दर्शाते हैं कि यह प्रोटोकॉल चूहों के सीरम और गुर्दे में एमआईआरएनए अभिव्यक्ति का सफलतापूर्वक पता लगा सकता है। इसलिए, प्रोटोकॉल का उपयोग विभिन्न प्रकार के विकृतियों के साथ चूहों में सीरम और गुर्दे एमआईआरएनए अभिव्यक्ति प्रोफाइल निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। प्रोटोकॉल की सादगी के कारण, बड़ी संख्या में नमूनों को एक साथ संसाधित किया जा सकता है। गुर्दे की विभिन्न रोग स्थितियों में कई एमआईआरएनए की अभिव्यक्ति का विश्लेषण, इस प्रकार, यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर सकता है।

प्रोटोकॉल के कुछ पहलुओं को ध्यान में रखना है। कमरे के तापमान पर होने वाले शुद्ध एमआईआरएनए के क्षरण से बचने के लिए, एमआईआरएनए को बर्फ पर रखा जाना चाहिए। गुर्दे के नमूनों को तब तक समरूप किया जाना चाहिए जब तक कि वे पूरी तरह से लाइसिस अभिकर्मक में भंग न हो जाएं। माउस किडनी में पर्याप्त मात्रा में संयोजी ऊतक होते हैं जो लाइसिस अभिकर्मक में अघुलनशील होते हैं, और इस प्रकार आगे के समरूपता के लिए एक कॉलम श्रेडर की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, उचित अंतर्जात नियंत्रण एमआईआरएनए (नमूनों के बीच स्थिर अभिव्यक्ति के साथ) को क्यूआरटी-पीसीआर प्रयोग के सेटअप में मान्य किया जाना चाहिए। ऐसा इसलिए है क्योंकि इस प्रोटोकॉल के प्रदर्शन के दौरान विभिन्न पदार्थों का हस्तक्षेप अंतर्जात नियंत्रण एमआईआरएनए के अभिव्यक्ति स्तर को बदल सकता है, संभवतः परिणामों से समझौता कर सकता है। अंत में, यह पत्र उम्र पर निर्भर गुर्दे की हानि के साथ चूहों के सीरम और गुर्दे में एमआईआरएनए अभिव्यक्ति का पता लगाने, शुद्धि और मूल्यांकन के लिए एक क्यूआरटी-पीसीआर प्रोटोकॉल का वर्णन करता है।

Disclosures

लेखकों ने घोषणा की है कि उनके हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

कोई नहीं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.0 mL spitz with heparin Greiner-bio-one 450534
Buffer RPE (wash buffer #2 containing guanidine and ethanol in ratio of 1:4) Qiagen 79216 Wash buffer 2
Buffer RWT (wash buffer #1 containing guanidine and ethanol in ratio of 1:2) Qiagen 1067933 Wash buffer 1
MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR Thermo Fisher Scientific 4316813 96-well reaction plate
MicroAmp Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 4311971 Adhesive film for 96-well reaction plate
miRNA-223-3p primer Qiagen MS00003871 5'-CGUGUAUUUGACAAGCUGAGUU
G-3'
miRNA-423-5p primer Qiagen MS00012005 5'-UGAGGGGCAGAGAGCGAGACU
UU-3'
miRNA-7218-5p primer Qiagen MS00068067 5'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG
-3'
miRNA-7219-5p primer Qiagen MS00068081 5'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGA
GA-3'
miRNeasy Mini kit Qiagen 217004 Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube
miRNeasy Serum/Plasma kit Qiagen 217184 Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube
miScript II RT kit (reverse transcription buffer) Qiagen 218161 Reverse transcriptase kit
miScript SYBR Green PCR kit Qiagen 218073 Green dye-based PCR kit
QIA shredder Qiagen 79654 Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube
QIAzol Lysis Reagent (phenol/guanidine-based lysis reagent) Qiagen 79306 Phenol/guanidine-based lysis reagent
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system Thermo Fisher Scientific 4472380 Real-time PCR instrument
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. Thermo Fisher Scientific 4472380 Real-time PCR instrument software
RNase-free water Qiagen 129112
RNU6-2 primer Qiagen MS00033740 Not disclosed due to confidentiality
SAMP1 male mice Nippon SLC Corporation Not assigned
SAMR1 male mice Nippon SLC Corporation Not assigned
Takara biomasher standard Takara Bio 9790B Silicon homogenizer

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उम्र पर निर्भर गुर्दे की हानि के साथ चूहों के गुर्दे और सीरम में माइक्रोआरएनए अभिव्यक्ति का मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन मूल्यांकन
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Yanai, K., Kaneko, S., Ishii, H., Aomatsu, A., Ishibashi, K., Morishita, Y. Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction Evaluation of MicroRNA Expression in Kidney and Serum of Mice with Age-Dependent Renal Impairment. J. Vis. Exp. (182), e63258, doi:10.3791/63258 (2022).… More

Yanai, K., Kaneko, S., Ishii, H., Aomatsu, A., Ishibashi, K., Morishita, Y. Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction Evaluation of MicroRNA Expression in Kidney and Serum of Mice with Age-Dependent Renal Impairment. J. Vis. Exp. (182), e63258, doi:10.3791/63258 (2022).

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