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Biology

प्रभावी मौखिक आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) वयस्क एनोफिलीज़ गाम्बिया मच्छरों के लिए प्रशासन

Published: March 1, 2022 doi: 10.3791/63266
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 4,5, 5,6, 1, 5,7,8
1Division of Parasitic Diseases and Malaria, Entomology Branch, Centers for Disease Control and Prevention, 2Department of Entomology, Cornell University, 3Centro de Estudios en Biotecnologia, Universidad del Valle de Guatemala, 4Department of Cell Biology, Johns Hopkins School of Medicine, 5Johns Hopkins Malaria Research Institute, Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health, 6Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health and Malaria Research Institute, 7Department of Cell Biology, Johns Hopkins School of Medicine, 8Biomedical Sciences Department, Idaho College of Osteopathic Medicine

Summary

बैक्टीरिया द्वारा उत्पादित डीएसआरएनए का मौखिक प्रशासन, आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) के लिए एक वितरण विधि जो नियमित रूप से केनोरहाबिडिटिस एलिगेंस में उपयोग की जाती है, यहां वयस्क मच्छरों पर सफलतापूर्वक लागू की गई थी। हमारी विधि इंजेक्शन के उपयोग के बिना मजबूत रिवर्स जेनेटिक्स अध्ययन और संचरण-अवरुद्ध वेक्टर अध्ययन के लिए अनुमति देती है।

Abstract

आरएनए हस्तक्षेप दो दशकों के लिए रिवर्स आनुवंशिक विश्लेषण के लिए एक भारी उपयोग किया जाने वाला उपकरण रहा है। वयस्क मच्छरों में, डबल-फंसे हुए आरएनए (डीएसआरएनए) प्रशासन को मुख्य रूप से इंजेक्शन के माध्यम से पूरा किया गया है, जिसके लिए महत्वपूर्ण समय की आवश्यकता होती है और क्षेत्र अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त नहीं है। इन सीमाओं को दूर करने के लिए, यहां हम वयस्क एनोफिल्स गाम्बिया को डीएसआरएनए के मौखिक वितरण द्वारा आरएनएआई के मजबूत सक्रियण के लिए एक अधिक कुशल विधि प्रस्तुत करते हैं। लंबे dsRNAs Escherichia कोलाई तनाव HT115 (DE3) में उत्पादित किया गया था, और 10% सुक्रोज में गर्मी से मारे गए dsRNA युक्त बैक्टीरिया का एक केंद्रित निलंबन कपास गेंदों पर वयस्क मच्छरों के लिए विज्ञापन-libitum की पेशकश की गई थी। कपास की गेंदों को उपचार की अवधि के लिए हर 2 दिनों में बदल दिया गया था। डबल्सेक्स (सेक्स भेदभाव में शामिल एक जीन) या कांटा सिर (जो लार ग्रंथि प्रतिलेखन कारक को एन्कोड करता है) को लक्षित करने के लिए इस विधि का उपयोग करने के परिणामस्वरूप क्रमशः मात्रात्मक रीयल-टाइम पीसीआर (क्यूआरटी-पीसीआर) या प्रतिदीप्ति कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा मापा जाता है, जैसा कि क्रमशः मात्रात्मक रीयल-टाइम पीसीआर (क्यूआरटी-पीसीआर) या प्रतिदीप्ति कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा मापा जाता है। लार ग्रंथि आकृति विज्ञान में दोष भी देखे गए थे। यह अत्यधिक लचीला, उपयोगकर्ता के अनुकूल, कम लागत, dsRNA वितरण के समय-कुशल तरीका मोटे तौर पर कीट वेक्टर फिजियोलॉजी और उससे परे के लिए महत्वपूर्ण लक्ष्य जीन पर लागू हो सकता है।

Introduction

मच्छरों द्वारा कई बीमारियां फैलती हैं, जिससे मच्छर शरीर विज्ञान और आनुवंशिकी का अध्ययन एक महत्वपूर्ण उपक्रम बन जाता है। इन जीवों में आरएनएआई का उपयोग पिछले 20 वर्षों में प्रमुख रहा है और कई मच्छर जीनों के कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए अनुमति दी गई है 1,2,3,4,5। DSRNA वितरण के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल की जाने वाली तकनीक माइक्रोइंजेक्शन रही है, जिसमें कमियां हैं कि यह मच्छरों को घायल कर सकती है और इसके लिए महत्वपूर्ण समय और प्रयास की आवश्यकता होती है। आरएनएआई के लिए मौखिक वितरण विधियों का परीक्षण किया गया है, लेकिन मुख्य रूप से मच्छरों के लार्वा चरण में 6,7,8,9। वयस्क मच्छरों में dsRNA के मौखिक वितरण का पूरी तरह से पता नहीं लगाया गया है और वेक्टर जीव विज्ञान और वेक्टर नियंत्रण के अध्ययन के लिए एक उपयोगी उपकरण हो सकता है।

मलेरिया एनोफिलीज मच्छरों द्वारा प्रेषित किया जाता है जब एक संक्रमित मादा मच्छर एक असंक्रमित मेजबान से रक्त भोजन लेती है और मलेरिया परजीवीयुक्त लार इंजेक्ट करती है। अंततः एक मच्छर की लार में प्रेषित होने के लिए, परजीवी को कई बाधाओं को दूर करना चाहिए, जिसमें मच्छर प्रतिरक्षा प्रणाली से बचना, मिडगट बाधा का ट्रैवर्सल, और लार ग्रंथियों का आक्रमणशामिल है। मच्छर लार ग्रंथि (एसजी) वास्तुकला परजीवी आक्रमण के लिए महत्वपूर्ण है और यह वास्तुकला प्रमुख लार ग्रंथि-व्यक्त प्रतिलेखन कारकों के साथ-साथ यौन द्विरूपता के निर्धारकों दोनों द्वारा नियंत्रित की जाती है। लार ग्रंथियों के सेलुलर विनिर्देश और होमोस्टेटिक रखरखाव के लिए और लार प्रोटीन के उत्पादन और स्राव के लिए कई अत्यधिक संरक्षित प्रतिलेखन कारकों की आवश्यकता होती है जो रक्त-आहार 12,13,14 में कार्य करते हैं। फोर्क हेड (एफकेएच) एक पंखों वाला हेलिक्स प्रतिलेखन कारक है जो कीट एसजी संरचना और कार्य के एक प्रमुख नियामक के रूप में कार्य करता है (फल मक्खियों और रेशम कीट कीट में अध्ययन के आधार पर)15,16,17,18,19,20। ड्रोसोफिला एसजी में, एफकेएच ऋषि के साथ कार्य करता है, एक एसजी-विशिष्ट बुनियादी हेलिक्स-लूप-हेलिक्स (बीएचएलएच) प्रतिलेखन कारक, एसजी अस्तित्व और लार उत्पादन को बढ़ावा देनेके लिए 19। ड्रोसोफिला में लार उत्पादन का एक महत्वपूर्ण, सकारात्मक सह-नियामक क्रेबा है, जो एक अच्छी तरह से अध्ययन किया गया ल्यूसीन जिपर ट्रांसक्रिप्शन कारक है जो स्रावी मार्ग जीन21,22,23 की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है। मादा लार ग्रंथियों में रूपात्मक भेदभाव की एक मजबूत डिग्री भी है जो संभवतः एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है, न केवल रक्त-भोजन में, बल्कि इस ऊतकपर आक्रमण करने के लिए परजीवियों की क्षमता में भी।

लार ग्रंथि अस्तित्व, संरचना, शरीर विज्ञान, और यौन द्विरूपता को निर्धारित करने में शामिल जीनों में से कई में जटिल स्पैटिओटेम्पोरल अभिव्यक्ति प्रोफाइल 25,26,27 है, और आरएनएआई को प्रेरित करने के लिए डीएसआरएनए के पारंपरिक वितरण के तरीके हमेशा इस या अन्य ऊतकों में इन प्रकार के जीनों को लक्षित करने में कुशल नहीं होते हैं। हालांकि, लार्वा चरण एडीज एजिप्टी और एन गैम्बियाई मच्छरों में डीएसआरएनए के मौखिक वितरण का उपयोग डीएसएक्स जीन 9,28 के मादा-विशिष्ट रूप को चुप करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है। मच्छर लार ग्रंथियों में dsRNA का उपयोग करके पिछले अध्ययनों में पाया गया कि, हालांकि बड़ी मात्रा में dsRNA की आवश्यकता थी, मौन प्रभाव अपेक्षाकृत लंबे समय तक चलने वाला था (कम से कम 13 दिन)29। यहां, वयस्क मादा मच्छरों में इन जीनों के आरएनएआई को शांत करने के लिए डीएसएक्स, एफकेएच, या क्रेबा के लिए अनुक्रम-विशिष्ट डीएसआरएनए व्यक्त करने वाले गर्मी से मारे गए ई कोलाई स्ट्रेन एचटी 115 (डीई 3) की क्षमता का परीक्षण किया गया था। DSRNA प्रेरित जीन नॉकडाउन का मौखिक प्रशासन An. gambiae में, mRNA के स्तर में स्पष्ट कटौती के साथ और इन जीनों के नुकसान के कार्य के अनुरूप फेनोटाइप के साथ। इस प्रकार, यह दृष्टिकोण संभवतः विभिन्न प्रकार के लार ग्रंथि जीन के कार्य को खटखटाने के लिए काम करेगा।

Protocol

1. क्लोनिंग dsRNA ई कोलाई अभिव्यक्ति वेक्टर में

  1. dsRNA की अभिव्यक्ति के लिए एक उपयुक्त वेक्टर में सम्मिलित करने के लिए लक्ष्य जीन अनुक्रम का चयन करें। निम्न विधि का उपयोग कर Vectorbase.org से व्यंजक मान प्राप्त करें।
    1. मुखपृष्ठ खोज बॉक्स पर रुचि के जीन (जैसे, तालिका 1) के लिए खोजें.
    2. परिणामी जीन पृष्ठ में, 8 पर नेविगेट करें । Transcriptomics अनुभाग.
    3. सूचीबद्ध प्रासंगिक आरएनए-सेक और माइक्रोएरे जीन अभिव्यक्ति प्रयोगों की तलाश करें।
    4. स्प्रेडशीट सॉफ़्टवेयर में रुचि के मूल्यों को ट्रांसक्राइब करें और एक डेटा तालिका बनाएँ.
  2. कम से कम एक T7 प्रमोटर का उपयोग करने के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्लास्मिड का चयन करें। यदि चयनित प्लास्मिड में केवल एक टी 7 प्रमोटर है (जैसा कि अधिकांश वाणिज्यिक प्लास्मिड करते हैं), तो ब्याज के जीन के लिए डीएसडीएनए के प्रवर्धन के लिए उपयोग किए जाने वाले रिवर्स प्राइमर में एक दूसरा टी 7 प्रमोटर शामिल करें।
    नोट: लक्ष्य जीन के लिए dsRNA अनुक्रम RNAI अभिकर्मकों30 के डिजाइन के लिए वेब अनुप्रयोग E-RNAI का उपयोग कर चुना जा सकता है। या तो लंबे dsRNA (लगभग 400 bp) या छोटे-हेयरपिन dsRNA (shRNA) को विशिष्ट जीन अनुक्रमों के आधार पर डिज़ाइन किया जा सकता है। क्लोनिंग से पहले पहचान की पुष्टि के लिए इन अनुक्रमों को प्रवर्धित और अनुक्रमित किया जाना चाहिए। इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले चयनित जीन क्षेत्रों, प्लास्मिड, और प्रमोटरों को पूरक फ़ाइल 1 में सूचीबद्ध किया गया है।
  3. पहले 9,31 वर्णित एक साधारण एक-चरणीय प्रक्रिया के अनुसार क्लोनिंग करें। इस उद्देश्य के लिए, पीसीआर उत्पाद को शुद्ध करें और रैखिक प्लास्मिड डीएनए के लिए लिगेट करें। सक्षम ई कोलाई कोशिकाओं32 के गर्मी सदमे परिवर्तन के लिए बंधाव के उत्पाद का उपयोग करें। नीले/सफेद स्क्रीनिंग के माध्यम से परिवर्तित कोशिकाओं का चयन करें। एक T7-प्राइमर पीसीआर का उपयोग करके सम्मिलित करने के अभिविन्यास की पुष्टि करें और M13 प्राइमरों का उपयोग करके अनुक्रम की पुष्टि करें।
    नोट: सफेद / नीले रंग की स्क्रीनिंग का उपयोग तब किया जा सकता है जब परिवर्तन के लिए चुने गए प्लास्मिड में लैकजेड जीन होता है जो β-गैलेक्टोसिडेस के लिए कोड करता है। सफेद उपनिवेशों में lacZ के भीतर वांछित सम्मिलित होना चाहिए और लक्ष्य अनुक्रम33 की उपस्थिति और अभिविन्यास की पुष्टि करने के लिए चुना जा सकता है।
  4. पहले परिवर्तन से प्लास्मिड को शुद्ध करें और सक्षम ई कोलाई एचटी 115 (डीई 3) को बदलने के लिए इसका उपयोग करें जैसा कि पहलेवर्णित 34 था। इस बात की पुष्टि के बाद कि डालने के साथ प्लास्मिड सक्षम ई कोलाई एचटी 115 (डीई 3) में मौजूद है, एकल उपयोग के लिए बैक्टीरिया के ग्लिसरॉल स्टॉक बनाएं।
    नोट: एक उपयुक्त गैर-संबंधित नियंत्रण dsRNA का अधिग्रहण किया जाना चाहिए या प्रत्येक प्रयोग में उपयोग करने के लिए तैयार किया जाना चाहिए। इस मामले में, Arabidopsis thaliana से असंबंधित जीन aintegumenta (चींटी) के लिए अनुक्रम का उपयोग किया जाता है।

2. गर्मी से मारे गए बैक्टीरिया dsRNA व्यक्त की तैयारी

  1. ई कोलाई स्ट्रेन HT115 (DE3) के एक एकल जीवाणु कॉलोनी से एक संस्कृति विकसित करें जिसमें लुरिया शोरबा (एलबी) के 50 मिलीलीटर में प्लास्मिड को व्यक्त करने वाले डीएसआरएनए शामिल हैं, जिसमें एम्पिसिलिन के 100 μg / mL और टेट्रासाइक्लिन के 12.5 μg / mL शामिल हैं, एक प्लेटफ़ॉर्म शेकर (180 आरपीएम) पर 12 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर।
  2. बैक्टीरियल संस्कृति (1: 1000) को 2x खमीर ट्रिपटोन (2x YT) मीडिया में पतला करें जिसमें एम्पीसिलीन के 100 μg / mL और टेट्रासाइक्लिन के 12.5 μg / mL शामिल हैं।
  3. 40 μM (अंतिम एकाग्रता) isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) जोड़कर dsRNA उत्पादन को प्रेरित करें।
  4. जब कोशिकाएं एक O.D.600 = 0.4 तक पहुंचती हैं, तो 180 rpm पर आंदोलन के साथ 37 °C पर प्रेरण के लगभग 2 घंटे के बाद, Taracena et al 9 द्वारा वर्णित गर्मी से मारे गए बैक्टीरिया का एक केंद्रित निलंबन तैयार करें। सेंट्रीफ्यूजेशन (4000 x g, 4 °C, 10 मिनट) द्वारा कोशिकाओं को गोली मारें और सोडियम फॉस्फेट बफर (PBS) की एक मात्रा में कोशिकाओं को धोएं।
  5. फिर से एक ही शर्तों के तहत स्पिन करें, प्रारंभिक मात्रा के 1/100 तक पीबीएस में फिर से निलंबित करें, और 1 घंटे के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  6. गर्मी से मारे गए बैक्टीरिया के 400 μL ऐलीकोट बनाएं और इन ऐलीकोट को -20 डिग्री सेल्सियस पर तब तक स्टोर करें जब तक कि आगे का उपयोग न हो (एक सप्ताह से अधिक समय तक स्टोर न करें)। गर्मी से मारे गए बैक्टीरिया के इस निलंबन में आरएनएआई प्रयोगों के लिए विशिष्ट डीएसआरएनए होता है। लक्ष्य-जीन dsRNA-बैक्टीरिया के लिए और प्रत्येक प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले संयुक्त राष्ट्र से संबंधित dsRNA-नियंत्रण दोनों के लिए इस प्रक्रिया को पूरा करें।

3. गर्मी से मारे गए बैक्टीरिया dsRNA व्यक्त के साथ मच्छरों को खिला

  1. डीफ्रॉस्ट dsRNA (HT115 (DE3) बैक्टीरिया निलंबन) के एक एलीकोट और 0.2% methylparaben युक्त 12% चीनी समाधान के 1.6 mL के साथ मिश्रण।
  2. इस घोल में एक छोटी सी कॉटन बॉल भिगोकर रखें और 5 दिन पुराने मच्छरों वाले पिंजरे के अंदर भीगी हुई कॉटन बॉल को रखें। सुनिश्चित करें कि मच्छर इस समाधान पर फ़ीड करते हैं, चीनी और डीएसआरएनए युक्त बैक्टीरिया दोनों को एक साथ उठाते हैं।
  3. लगातार 8 दिनों के लिए हर दूसरे दिन dsRNA-चीनी समाधान में भिगोया कपास की गेंद बदलें।
  4. मच्छर के पिंजरों को निरंतर परिस्थितियों में रखें, यानी, 27 डिग्री सेल्सियस और 80% सापेक्ष आर्द्रता 12 घंटे की फोटोपीरियड के साथ: 12 घंटे की रोशनी: अंधेरे फोटोसाइकिल, 30 मिनट की सुबह और 30 मिनट की शाम की अवधि से अलग।

4. परख लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति के स्तर

  1. एक मिनट के लिए बर्फ पर कंटेनर रखकर या जब तक मच्छरों को हिलना बंद नहीं कर देता तब तक मच्छरों को ठंडा-एनेस्थेटिक करें। एक बार जब मच्छरों को एनेस्थेटिक किया जाता है, तो विच्छेदन के लिए मादाओं को अलग करने के लिए उन्हें ठंडी सतह पर रखें।
  2. मच्छरों को 70% इथेनॉल स्प्रे करें और उन्हें पीबीएस के साथ एक ग्लास सतह पर रखें। संदंश की एक जोड़ी के साथ, मच्छर के सिर को स्थिर रखें और छाती को बहुत धीरे-धीरे खींचें, जिससे लार ग्रंथियों को पीबीएस में जारी किया जा सके।
  3. लार ग्रंथियों को बर्फ-ठंडे पीबीएस में रखें जब तक कि 10 व्यक्तियों को विच्छेदित नहीं किया जाता है। ग्वानिडिनियम थायोसाइनेट-फिनोल-क्लोरोफॉर्म विधि का उपयोग करके आरएनए निष्कर्षण के लिए पूल दस एसजी। RNase मुक्त पानी के 30 μL में आरएनए गोली निलंबित.
  4. पिछले चरण में एसजी से निकाले गए आरएनए के 1 μL एलीकोट का उपयोग करें, 260 और 280 एनएम पर अवशोषण को पढ़ने के लिए और कमजोर पड़ने वाले कारक के साथ गुणा करके प्रत्येक नमूने की आरएनए एकाग्रता की गणना करने के लिए। ~ 2.0 का 260/280 अनुपात अच्छी गुणवत्ता वाले आरएनए को इंगित करता है।
  5. एक वाणिज्यिक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन किट का उपयोग करके पूरक डीएनए (cDNA) को संश्लेषित करने के लिए शुद्ध आरएनए के 1 μg का उपयोग करें।
  6. निर्माता की सिफारिशों के अनुसार आरटी-पीसीआर प्रतिक्रिया तैयार करने के लिए सीडीएनए का 1: 10 कमजोर पड़ने का निर्माण करें। प्रत्येक नमूने के लिए, लक्ष्य जीन के लिए एक प्रतिक्रिया तैयार करें और समानांतर में, हाउसकीपिंग (एचके) जीन के साथ एक प्रतिक्रिया सेट करें। विधि से यादृच्छिक भिन्नता के प्रभाव को खत्म करने के लिए प्रत्येक जीन प्रतिक्रिया को एक तकनीकी प्रतिलिपि में सेट करें।
    नोट: यहाँ, An. gambiae राइबोसोमल S7 जीन (GeneBank: L20837.1) और एक्टिन (VectorBase: AGAP000651) HK जीन के रूप में इस्तेमाल किया गया है।
  7. SYBR-हरे निर्माता के संकेतों के बाद, 300 nM की अंतिम एकाग्रता पर सभी प्राइमरों का उपयोग करें। मानक पीसीआर स्थितियों के साथ बढ़ाएं: 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, इसके बाद 95 डिग्री सेल्सियस पर 15 सेकंड के 40 चक्र और 60 डिग्री सेल्सियस पर 60 सेकंड।
    नोट: जीन अभिव्यक्ति को मापने के लिए, डेल्टा-डेल्टा-सीटी विधि (ΠΠCt) का उपयोग किया जाता है। डेल्टा सीटी (ΠCt) लक्ष्य जीन के सीटी और हाउसकीपिंग जीन के सीटी के बीच का अंतर है। प्रयोगात्मक समूह के ΠCt और नियंत्रण समूह35 के ΠCt के बीच का अंतर है।

5. फेनोटाइपिक मूल्यांकन: सफल रक्त खिला

  1. रक्त-फ़ीड करने की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए, लक्ष्य के साथ इलाज किए गए 15 मादा मच्छरों के समूहों को सेट करें और छोटे पिंजरों (12 सेमी व्यास) पर dsRNA को नियंत्रित करें और उन्हें 4 घंटे के लिए भूखा रखें।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस, ग्लास मच्छर फीडर (24 मिमी व्यास) और पैराफिल्म झिल्ली पर सेट किए गए परिसंचारी पानी के स्नान का उपयोग करके, मच्छरों को डिफिब्रिनेटेड भेड़ के रक्त की पेशकश करते हैं।
    नोट: रक्त को एक वाणिज्यिक विक्रेता से प्राप्त किया जा सकता है जो इसे अमेरिकी मूल के स्वस्थ, दाता जानवरों से खींचता है और एंटीकोआगुलंट्स या एडिटिव्स के बिना मैन्युअल रूप से डिफिब्रिनेट करता है।
  3. प्रत्यक्ष अवलोकन द्वारा, प्रत्येक समूह में पूरी तरह से engorged बनने के लिए पहली पांच महिलाओं से सफलतापूर्वक रक्त भोजन प्राप्त करने के लिए जांच के प्रयासों की संख्या की गणना और रिकॉर्ड करें।
    नोट: मच्छरों में महत्वपूर्ण चयापचय परिवर्तनों से बचने के लिए, जो रक्त की मांग वाले व्यवहार को प्रभावित करने वाले ऊर्जा संसाधनों में हस्तक्षेप कर सकता है, भुखमरी को न्यूनतम (4 ज) तक रखा गया था। नतीजतन, हर मच्छर रक्त-भोजन की तलाश नहीं करेगा और हमने महिलाओं की गिनती को पांच (प्रत्येक समूह के कुल का एक तिहाई) तक सीमित कर दिया है, ताकि समय चर के प्रभाव को कम किया जा सके जैसे कि मानव गंध के संपर्क में आना, कक्षों और खिला सतहों के बीच तापमान परिवर्तन, आदि।

6. फेनोटाइपिक मूल्यांकन: लार ग्रंथि आकृति विज्ञान और प्रासंगिक प्रोटीन के नीचे विनियमन

  1. चरण 4.2 में वर्णित 1x फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पीबीएस) में ताजा ऊतक को अलग करें और 90 सेकंड के लिए बर्फ-ठंडे एसीटोन में ठीक करें। एसीटोन को हटाने के बाद 1x पीबीएस में कई बार कुल्ला करें। एंटीसीरम के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट करें ( सामग्री की तालिका देखें) 1x पीबीएस में पतला।
    नोट: लार प्रोटीन के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राथमिक एंटीबॉडी की पहचान के लिए सामग्री की तालिका देखें (एनोफिलीज़ एंटी-प्लेटलेट प्रोटीन, एएपीपी; Mucin 2, MUC2), SG प्रतिलेखन कारक (कांटा सिर, fkh; ऋषि, ऋषि; चक्रीय-एएमपी प्रतिक्रिया तत्व-बाध्यकारी प्रोटीन ए, क्रेबा), और स्रावी पुटिकाओं (Rab11) का एक मार्कर। इन एंटीबॉडी का उपयोग एसजी फॉर्म और फ़ंक्शन के लिए रीडआउट के रूप में किया जाता है। हालांकि, इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए उपयुक्त कोई भी एंटीबॉडी इस प्रोटोकॉल के लिए उपयुक्त होना चाहिए।
  2. 1x PBS में कई बार धोएं। 1x PBS में पतला द्वितीयक एंटीबॉडी (फ्लोरोसेंट) जोड़ें, और 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में इनक्यूबेट करें। किसी भी counterstain जोड़ें [जैसे 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; डीएनए), गेहूं रोगाणु agglutinin (WGA; chitin के लिए), phalloidin (एफ-एक्टिन के लिए), और / या नील लाल (लिपिड के लिए)] 2 घंटे इनक्यूबेशन के अंत से 30 मिनट पहले।
  3. 1x PBS में तीन बार धोएं। फिर, एक मानक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर 100% ग्लिसरॉल में ऊतकों को 1 मिमी मोटी कवरस्लिप के साथ माउंट करें और एक प्रतिदीप्ति कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके इमेजिंग तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट:: मात्रात्मक डेटा प्राप्त करने के लिए, इमेजिंग सेटिंग्स स्थिर रखा जाना चाहिए। यहां, ऊतक की पूरी 3 डी मात्रा के माध्यम से केवल अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण छवियों को शामिल किया गया था, और सभी छवि परिमाणीकरण को गैर-एसजी ऊतक अवशेषों (वसा शरीर, छल्ली, या सिर) में डीएपीआई सिग्नल के आधार पर उपचार (एक प्रयोग के भीतर) के बीच सामान्यीकृत किया गया था।

Representative Results

शुरू करने के लिए, वेक्टरबेस से माइक्रोएरे अभिव्यक्ति डेटा का उपयोग वर्तमान अध्ययन के लिए प्रासंगिक सभी जीनों की अभिव्यक्ति की स्थिति निर्धारित करने के लिए विकास ता्मक चरणों36,37 में संभावित लक्ष्यों को स्कैन करने के लिए किया गया था (तालिका 1)। जैसा कि अपेक्षित था, हमारे सभी चुने हुए लक्ष्य जीनों ने वयस्क एसजी में अभिव्यक्ति दिखाई। ऐप और ऋषि के स्तर विशेष रूप से उच्च थे (तालिका 1)। इसके अलावा ध्यान देने योग्य वयस्क महिला एसजी9 में एफ-एजीडीएसएक्स की अभिव्यक्ति के उच्च स्तर थे।

प्रत्येक जीन से विशिष्ट खंडों को आरएनएआई अभिकर्मकों 30 के डिजाइन के लिए वेब एप्लिकेशन ई-आरएनएआई का उपयोग करके डीएसआरएनए के रूप में उपयोग के लिए मूल्यांकन किया गया था। प्रत्येक लक्ष्य जीन के लिए अद्वितीय अनुक्रमों वाले ~ 400 बीपी क्षेत्रों को तब क्लोन किया गया था (चित्रा 1 ए), उपयुक्त जीवाणु उपभेदों में बदल दिया गया था, और गर्मी से मारे गए बैक्टीरिया के निलंबन को तैयार करने के लिए उपयोग किया जाता था, जिन्हें डीएसआरएनए का उत्पादन करने के लिए प्रेरित किया गया था। वयस्क मच्छरों को सुक्रोज-भिगोए गए कपास की गेंदों पर 8 दिनों के लिए खिलाया गया था, जिसमें f-Agdsx, fkh, या चींटी (असंबंधित नकारात्मक नियंत्रण) के लिए dsRNA के जीवाणु निलंबन होते थे।

मादा मच्छरों के आरएनएआई फीडिंग के विश्लेषण के लिए, यह पहली बार निर्धारित किया गया था कि क्या एफ-एजीडीएसएक्स या एफकेएच डीएसआरएनए-फीडिंग ने जीन मौन को प्रेरित किया। FKH प्रतिलेख स्तरों में 98.8% की कमी (±2.1) fkh-dsRNA (चित्रा 1B) के साथ खिलाए गए समूह में देखी गई थी, यह दर्शाता है कि dsRNA ने SGs में fkh टेपों की बहुतायत को बहुत प्रभावी ढंग से कम कर दिया है। आश्चर्यजनक रूप से, fkh mRNA का स्तर f-Agdsx के लिए dsRNA के साथ इलाज किए गए मच्छरों में 82.0% (±18.9) कम हो गया था, जिसमें 89.86% (±4.48 ) की कमी थी। यह सुझाव देते हुए कि एफकेएच लार ग्रंथि में एफ-डीएसएक्स का लक्ष्य हो सकता है। एफकेएच अभिव्यक्ति के स्तर में महत्वपूर्ण कमी के साथ सहवर्ती, एफकेएच-नॉकडाउन मच्छरों ने रक्त-फ़ीड के लिए आवश्यक जांच प्रयासों की संख्या में महत्वपूर्ण वृद्धि का प्रदर्शन किया। इन मच्छरों ने औसतन, नियंत्रण समूह या एफ-एजीडीएक्स डीएसआरएनए की तुलना में पांच गुना अधिक खिलाने के प्रयासों का प्रदर्शन किया, मच्छरों को पूरी तरह से रक्त के साथ engorged किया गया (चित्रा 1 सी)। इससे यह पूछा गया कि क्या एफकेएच नॉकडाउन आरएनएआई उपचारों ने स्थानीयकरण और / या प्रमुख ट्रांसक्रिप्शनल नियामकों (एसजी टीएफ सेज और क्रेबा) (चित्रा 2), स्रावित प्रोटीन (एएपीपी और म्यूसिन) (चित्रा 3), और स्रावी मशीनरी [नाइल रेड (लिपिड) और राब 11 (स्रावी पुटिकाओं)] (चित्रा 4) के वितरण में परिवर्तन का कारण बना। महत्वपूर्ण रूप से, विभिन्न लोब क्षेत्रों, लोब और व्यक्तिगत एसजी में धुंधला तीव्रता में पर्याप्त अंतर देखा गया था।

जैसा कि भविष्यवाणी की गई थी, चींटी नियंत्रण आरएनएआई (चित्रा 2 ए) की तुलना में एफकेएच आरएनएआई (चित्रा 2 बी) के बाद सभी एसजी लोबों में ऋषि और क्रेबा धुंधला होने के स्तर को स्पष्ट रूप से कम कर दिया गया था। लाइन स्कैन प्रोफाइल में उच्चतम अधिकतम तीव्रता मानों (लाल डैश्ड लाइनों और संख्यात्मक लेबल) और सबसे कम अधिकतम तीव्रता मूल्यों (नीली डैश्ड लाइनों और संख्यात्मक लेबल) दोनों में कटौती ने ऊतक के भीतर उच्च और निम्न सिग्नल दोनों के क्षेत्रों में कटौती का सुझाव दिया (आंकड़े 2 ए, बी)। इन आंकड़ों से पता चलता है कि An. gambiae fkh RNAI प्रभावी है और यह कि fkh उत्पादन और / या SG TFs Sage और CrebA की स्थिरता को नियंत्रित करता है, जो ड्रोसोफिला SGs19,38,39 में उनके आनुवंशिक संबंध के अनुरूप है।

अत्यधिक प्रचुर मात्रा में लार-घटक प्रोटीन पर विचार करते समय, एनोफिलीज़ एंटी-प्लेटलेट प्रोटीन (एएपीपी) 40,41 के स्तर को नियंत्रण आरएनएआई उपचार (चित्रा 3 ए, बी; हरे) की तुलना में एफके आरएनएआई के बाद सभी तीन एसजी लोब में कम कर दिया गया था। दूसरी ओर, म्यूसिन के स्तर में कोई बदलाव नहीं देखा गया था (चित्रा 3 ए, बी; बैंगनी)। इन आंकड़ों से पता चलता है कि एफकेएच विभिन्न लार प्रोटीन जीन की अभिव्यक्ति में अलग-अलग योगदान देता है।

अंत में, स्राव के दो मार्करों को देखा गया (आंकड़े 4 ए, बी): Rab11 (एपिकल रीसाइक्लिंग एंडोसोम से जुड़े पुटिकाएं)42 और नील लाल (लिपिड)। FKH RNAI उपचार (चित्रा 4A v बनाम 4B v; हरा) के बाद डिस्टल लेटरल (डीएल) लोब में कम Rab11 प्रतिदीप्ति देखी गई थी। हालांकि, औसत दर्जे का (एम) और समीपस्थ पार्श्व (पीएल) लोब (चित्रा 4 ए vii, ix बनाम 4 बी vii, ix; हरा) में बढ़ी हुई Rab11 सिग्नल भी हुई। नियंत्रण आरएनएआई उपचार की तुलना में एफकेएच आरएनएआई के बाद नील लाल सिग्नल (आंकड़े 4 ए, बी; बैंगनी) में कोई स्पष्ट अंतर नहीं देखा गया था। इन आंकड़ों से पता चलता है कि एफकेएच में कमी कुछ स्रावी मशीनरी कार्रवाई को एक जटिल तरीके से बदल सकती है जो एसजी लोब के बीच भिन्न होती है।

डेटासेट: गोल्तसेव नीरा ओविएडो नीरा ओविएडो नानबाई नानबाई नानबाई नानबाई
जीन प्रतीक फलन AGAP ID भ्रूण (25 घंटे) L3 लार्वा L3 SG वयस्क महिला
शरीर (3 दिन)		 वयस्क पुरुष
शरीर (3 दिन)		 वयस्क महिला
एसजी (3 दिन)		 वयस्क पुरुष
एसजी (3 दिन)
AAPP लार प्रोटीन AGAP009974 3.92 4.38 4.33 3.81 2.46 11.92 2.69
CrebA txn गुणक AGAP001464 6.28 5.22 5.92 2.99 2.96 3.27 3.13
" txn गुणक AGAP011038 4.50 4.46 5.23 2.96 2.86 3.05 2.88
dsx txn गुणक AGAP004050 4.91 5.39 5.55 3.72 4.00 4.57 4.01
fkh txn गुणक AGAP001671 5.18 4.67 5.25 2.99 3.09 3.21 3.05
MUC2 लार प्रोटीन AGAP012020 4.59 5.53 5.63 2.96 3.07 3.08 3.26
Rab11 वेसिकुलर तस्करी AGAP004559 10.21 7.47 8.60 4.90 3.79 3.38 2.96
ऋषि txn गुणक AGAP013335 5.32 5.96 8.89 3.40 3.33 7.37 7.23

तालिका 1: एक के लिए log2 माइक्रोएरे अभिव्यक्ति प्रोफाइल का मतलब है। गैम्बियाई ब्याज के जीन। जीन नाम, कार्यात्मक श्रेणी, वेक्टरबेस (AGAP) पहचानकर्ता, और वेक्टरबेस से एकत्र किए गए लॉग 2 माइक्रोएरे अभिव्यक्ति डेटा का मतलब दिखाया गया है। इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि ब्याज के हमारे जीन (लार ग्रंथि (एसजी) सेल जीव विज्ञान और स्राव में शामिल) को पूरे व्यक्तियों की तुलना में लार्वा चरण 3 (एल 3) और वयस्क एसजी में व्यक्त और समृद्ध किया जाता है।

Figure 1
चित्रा 1: f-Agdsx और वयस्क में fkh नॉकडाउन An. gambiae SGs में fkh mRNA के स्तर को कम करता है और रक्त-फ़ीड करने की महिला क्षमता को प्रभावित करता है। (ए) इस पद्धति में डीएसआरएनए उत्पादन के लिए उपयोग किए जाने वाले प्लास्मिड डिजाइन की प्रतिनिधि छवि। दूसरे T7 प्रमोटर अनुक्रम को प्लास्मिड में 3 'प्राइमर में शामिल करके जोड़ा जाता है जिसका उपयोग पीजीईएमटी प्लास्मिड में क्लोन किए जाने वाले सम्मिलित को बढ़ाने के लिए किया जाता है। प्लास्मिड को तब ई कोलाई एचटी 115 (डीई 3) बैक्टीरिया में बदल दिया जाता है और एक खिला समाधान 10% चीनी पानी में प्रेरित गर्मी से मारे गए बैक्टीरिया के निलंबन से बना होता है। (बी) जानवरों को या तो f-Agdsx या fkh के लिए dsRNA फीडिंग समाधान के साथ खिलाया गया, fkh टेपों के काफी कम स्तर (कई तुलनाओं के साथ एक तरफा एनोवा; n = 15) दिखाया गया। हालांकि, केवल एफकेएच डीएसआरएनए (सी) के साथ खिलाए गए समूह ने रक्त भोजन प्राप्त करने के लिए आवश्यक काटने के प्रयासों की संख्या में महत्वपूर्ण अंतर दिखाया। इस समूह में मच्छरों की आवश्यकता होती है, औसतन, नियंत्रण या dsx-dsRNA द्वारा आवश्यक की तुलना में एक सफल रक्त भोजन प्राप्त करने के लिए जांच के प्रयासों की संख्या का पांच गुना (कई तुलनाओं के साथ एक तरफा एनोवा; एन = 15)। त्रुटि पट्टियाँ माध्य (SEM) की मानक त्रुटि को इंगित करती हैं. प्रत्येक प्रयोग तीन अलग-अलग जैविक प्रतिकृतियों में आयोजित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: वयस्क में fkh नॉकडाउन An. gambiae लार ग्रंथियों एसजी प्रतिलेखन कारक के स्तर को कम करता है। दिन 13 वयस्क मादा An. gambiae SGs से प्रतिनिधि छवियों को दिखाया गया है 8 दिनों (दिन 5-13) के बाद या तो (ए) गैर-संबंधित dsRNA नियंत्रण (चींटी) या (बी) dsRNA SG TF फोर्क हेड (fkh, AGAP001671) को लक्षित करने वाले मौखिक जोखिम के बाद 10% सुक्रोज में रंजक DAPI (डीएनए; लाल), लेबल गेहूं रोगाणु agglutinin (WGA, chitin / O-GlcNaAcylation) के साथ दाग में, नीले रंग के साथ दाग 10% सुक्रोज में, SG TFs ऋषि (हरे) और CrebA (बैंगनी) के खिलाफ antisera. दिखाए गए स्केल बार की लंबाई माइक्रोन हैं। एसजी (i) को सफेद डैश के साथ रेखांकित किया गया है। ज़ूम किए गए लोब छवियों में पीली रेखाएं (पीले बक्से से घिरे क्षेत्रों की, और "इनसेट" लेबल वाले क्षेत्रों की) इंगित करती हैं कि सिग्नल तीव्रता के लाइन स्कैन कहां आयोजित किए गए थे। प्रत्येक ज़ूम किए गए लोब के लिए लाइन स्कैन के अनुरूप हरे और बैंगनी चैनल तीव्रता को छवियों के नीचे रेखांकन में प्लॉट किया जाता है (हमेशा एसजी में बाएं से दाएं) प्लॉट किया जाता है; X-अक्ष = दूरी (पिक्सेल में) और Y-अक्ष = ग्रे इकाई (पिक्सेल तीव्रता)। पिक्सेल तीव्रता की गतिशील श्रेणी लाल (अधिकतम) और नीले (न्यूनतम) बिंदीदार रेखाओं द्वारा सीमांकित होती है और संबंधित मान प्रत्येक ग्राफपर दिखाए जाते हैं। एमआईपी = पूरे एसजी गहराई के माध्यम से अधिकतम तीव्रता 3 डी प्रक्षेपण। डीएल: डिस्टल लेटरल लोब; एम: औसत दर्जे का लोब; PL: समीपस्थ पार्श्व लोब; एसडी: लार वाहिनी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: वयस्क में fkh नॉकडाउन An. gambiae लार ग्रंथियों एसजी स्रावित प्रोटीन के स्तर को कम कर देता है। दिन 13 वयस्क महिला An. gambiae SGs से प्रतिनिधि छवियों को दिखाया गया है या तो (ए) गैर-संबंधित dsRNA नियंत्रण (चींटी), या (बी) dsRNA SG TF फोर्क सिर (fkh, AGAP001671) को लक्षित करने के लिए मौखिक जोखिम के 8 दिनों (दिन 5-13) के बाद 10% सुक्रोज में डाई DAPI (डीएनए; लाल), लेबल गेहूं रोगाणु agglutinin (WGA, chitin / O-GlcNaSylation) के साथ दाग में, नीले रंग के साथ दाग में SG TF कांटा सिर (fkh, AGAP001671) और लार प्रोटीन AAPP (हरा) और Mucin (MUC2, बैंगनी). दिखाए गए स्केल बार की लंबाई माइक्रोन हैं। एसजी (i) को सफेद डैश के साथ रेखांकित किया गया है। ज़ूम किए गए लोब छवियों में पीली रेखाएं (पीले बक्से से घिरे क्षेत्रों की) इंगित करती हैं कि सिग्नल तीव्रता के लाइन स्कैन कहां आयोजित किए गए थे। हरे और बैंगनी चैनल तीव्रता प्रत्येक लोब के लिए लाइन स्कैन के अनुरूप छवियों के नीचे रेखांकन में प्लॉट किए जाते हैं (हमेशा एसजी में बाएं से दाएं) प्लॉट किए जाते हैं; X-अक्ष = दूरी (पिक्सेल में) और Y-अक्ष = ग्रे इकाई (पिक्सेल तीव्रता)। पिक्सेल तीव्रता की गतिशील श्रेणी लाल (अधिकतम) और नीली (न्यूनतम) डैश्ड लाइनों द्वारा सीमांकित होती है और संबंधित मान प्रत्येक ग्राफपर दिखाए जाते हैं। एमआईपी = पूरे एसजी गहराई के माध्यम से अधिकतम तीव्रता 3 डी प्रक्षेपण। डीएल: डिस्टल लेटरल लोब; एम: औसत दर्जे का लोब; PL: समीपस्थ पार्श्व लोब; एसडी: लार वाहिनी. इटैलिक "डीएल" लेबल (बीआई) एक ही डीएल लोब के दो दृश्यमान क्षेत्रों को इंगित करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: वयस्क में fkh नॉकडाउन An. gambiae लार ग्रंथियों एसजी स्राव मार्करों को कम कर देता है। दिन 13 वयस्क मादा An. gambiae SGs से प्रतिनिधि छवियों को दिखाया गया है 8 दिनों (दिन 5-13) के बाद या तो (ए) गैर-संबंधित dsRNA नियंत्रण (चींटी), या (बी) dsRNA SG TF फोर्क हेड (fkh, AGAP001671) को लक्षित करने वाले SG TF फोर्क हेड (fkh, AGAP001671) में 10% सुक्रोज में डाई DAPI (डीएनए; लाल), लेबल गेहूं रोगाणु agglutinin (WGA, chitin / O-GlcNaAcilation) के साथ दाग, लेबल गेहूं रोगाणु agglutinin (WGA, chitin / नील लाल (लिपिड; बैंगनी), और रीसाइक्लिंग एंडोसोम पुटिका मार्कर Rab11 (हरा) के खिलाफ एंटीसेरा। दिखाए गए स्केल बार की लंबाई माइक्रोन हैं। एसजी (i) को सफेद डैश के साथ रेखांकित किया गया है। ज़ूम किए गए लोब छवियों में पीली रेखाएं (पीले बक्से से घिरे क्षेत्रों की) इंगित करती हैं कि सिग्नल तीव्रता के लाइन स्कैन कहां आयोजित किए गए थे। हरे और बैंगनी चैनल तीव्रता प्रत्येक लोब के लिए लाइन स्कैन के अनुरूप छवियों के नीचे रेखांकन में प्लॉट किए जाते हैं (हमेशा एसजी में बाएं से दाएं) प्लॉट किए जाते हैं; X-अक्ष = दूरी (पिक्सेल में) और Y-अक्ष = ग्रे इकाई (पिक्सेल तीव्रता)। पिक्सेल तीव्रता की गतिशील श्रेणी लाल (अधिकतम) और नीली (न्यूनतम) डैश्ड लाइनों द्वारा सीमांकित होती है और संबंधित मान प्रत्येक ग्राफपर दिखाए जाते हैं। एमआईपी = पूरे एसजी गहराई के माध्यम से अधिकतम तीव्रता 3 डी प्रक्षेपण। डीएल: डिस्टल लेटरल लोब; एम: औसत दर्जे का लोब; PL: समीपस्थ पार्श्व लोब; एसडी: लार वाहिनी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 1. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Discussion

मौखिक भोजन द्वारा एक गाम्बियाई मच्छरों को प्रभावी ढंग से डीएसआरएनए वितरित करने की क्षमता प्रयोगशाला और क्षेत्र दोनों में वेक्टर जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए व्यापक निहितार्थ है। माइक्रोइंजेक्शन को लंबे समय से रसायनों, एंटीबॉडी, आरएनएआई और मच्छरों में आनुवंशिक संशोधन रणनीतियों के वितरण के पसंदीदा मोड के रूप में स्वीकार किया गया है 43,44। पर्याप्त शारीरिक हेरफेर, सेलुलर क्षति और तनाव के परिणाम को मौखिक वितरण के उपयोग से टाला जा सकता है, जो बड़े पैमाने पर या क्षेत्र अनुप्रयोगों के लिए संभावित रूप से उपयुक्त हो सकता है। पिछले काम ने सुझाव दिया है कि आरएनएआई एक व्यक्तिगत वयस्क मच्छर29 के भीतर सर्वव्यापी रूप से कार्य करता है, जिससे लार ग्रंथियों सहित सभी ऊतकों में प्रभाव पड़ता है। बड़ी संख्या में डीएसआरएनए-व्यक्त ई कोलाई के साथ मच्छरों को खिलाकर जो एक लंबी समय सीमा में अतुल्यकालिक रूप से पच जाते हैं, कोई संभावित रूप से पिंजरे में सभी व्यक्तियों में आरएनएआई के लिए सुसंगत और समान जोखिम प्राप्त कर सकता है। यह विधि बड़ी संख्या में मच्छरों को खिलाने और लक्ष्य जीन के आधार पर परिणामी फेनोटाइप की संभावित परिवर्तनशीलता का विश्लेषण करने की अनुमति देती है। हालांकि, एक महत्वपूर्ण विचार बैक्टीरिया के विषम वितरण की संभावना है, और इसलिए कपास फाइबर में डीएसआरएनए। मच्छर चीनी-फीडिंग के लिए दैनिक रूप से उपयोग किए जाने वाले बैक्टीरिया के 400 μL में लगभग ≤4.6 μg dsRNA होगा, जैसा कि पहले वर्णित और गणना की गईथी 9 लेकिन प्रत्येक मच्छर द्वारा निगला गया dsRNA की मात्रा व्यक्तिगत रूप से निर्धारित नहीं की गई थी। यदि dsRNA निर्माण नियमित हो जाता है, तो यह सरल उपचार प्रोटोकॉल किसी भी मच्छर शोधकर्ता द्वारा इस तकनीक के तेजी से आत्मसात करने की अनुमति देता है। एक प्राथमिकता, उपचार के दौरान समय व्यय (प्रति दिन 30 मिनट) सीखने और समान नमूना आकारों के लिए माइक्रोइंजेक्शन लागू करने में लगने वाले समय की तुलना में तुच्छ है।

डीएसआरएनए को खिलाने का उपयोग नियमित रूप से मॉडल जीव Caenorhabditis elegans45 में रिवर्स जेनेटिक्स अध्ययन के लिए किया जाता है। उपयोग का यह भारी स्तर मौखिक वितरण दृष्टिकोण के मूल्य को रेखांकित करता है। परिवर्तित ई कोलाई में एक ए. गाम्बिया जीनोम-वाइड लाइब्रेरी का निर्माण, जो सी. एलिगेंस46,47 में मौजूद है, के समान, बढ़े हुए पैमाने पर मच्छरों में तेजी से रिवर्स आनुवंशिक स्क्रीनिंग की अनुमति देगा। हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि विधि की दक्षता प्रतिलेख के अंतर्जात स्तरों पर बहुत अधिक निर्भर करती है और यदि अभिव्यक्ति लक्ष्य ऊतक तक सीमित नहीं है, लेकिन अधिक व्यापक रूप से4,8,44 व्यक्त की गई है। इसके अतिरिक्त, इस बात के सबूत हैं कि कुछ कीटनाशक मच्छरों से व्यवहारिक परिहार को प्रेरित कर सकते हैं48, और बैक्टीरिया के साथ खिलाना जो संभावित रूप से उनमें प्रतिकूल प्रभाव पैदा करते हैं, परिहार के समान पैटर्न को ट्रिगर कर सकते हैं। प्रयोगशाला की नियंत्रित सेटिंग में, जहां मच्छरों के पास एक वैकल्पिक खाद्य स्रोत नहीं था, उनके पास ई कोलाई के साथ चीनी पानी से बचने का विकल्प नहीं था और एक पौष्टिक स्रोत की आवश्यकता शायद बैक्टीरिया से बचने के लिए वृत्ति को ओवरराइड करेगी। हालांकि, इस पर विचार किया जाना चाहिए यदि रणनीति का उपयोग कम नियंत्रित सेटिंग्स में किया जाना था।

एक साथ कई जीनों को लक्षित करना संभव हो सकता है (एक निर्माण, कई निर्माणों, या परिवर्तित जीवाणु आइसोलेट्स के मिश्रण का उपयोग करके), लेकिन प्रभावशीलता का आकलन करने के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता है। इस बिंदु के लिए एक और महत्वपूर्ण विचार एकल या एकाधिक लक्ष्यों का उपयोग करते समय संभावित ऑफ-टारगेट या सहक्रियात्मक प्रभावों का मूल्यांकन है। उपयुक्त नियंत्रण जीन और समूहों की स्थापना प्रयोगात्मक डिजाइन का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है। इसके अलावा, यह अनुमान लगाने के लिए मोहक है कि इस दृष्टिकोण का उपयोग अन्य रोगजनकों या वायरस को लक्षित करने के लिए किया जा सकताहै। मच्छरों में आरएनएआई प्रेरण की ओर पिछला काम उन परिस्थितियों में किया गया था जहां अभिकर्मक को सीधे इंजेक्ट किया गया था, इसलिए ई कोलाई मौजूद नहीं थे। ई कोलाई एक सुरक्षात्मक डिब्बे प्रदान कर सकता है जो समय के साथ डीएसआरएनए की धीमी रिहाई के लिए अनुमति देता है, यह सुनिश्चित करता है कि एक्सपोजर बहुत लंबी अवधिमें कम या ज्यादा निरंतर है।

अंत में, इन परिणामों से पता चलता है कि इस तकनीक के प्रभाव एक्सपोजर के समय सीमा (लंबाई और शुरुआती दिन) और उपयोग किए जाने वाले ई कोलाई की मात्रा को समायोजित करके ट्यूनेबल हैं। इस सुविधा ने हमें परीक्षण और त्रुटि द्वारा इष्टतम नॉकडाउन स्थितियों की पहचान करके आवश्यक जीन (डीएसएक्स और एफकेएच) के कार्यों का अध्ययन करने की अनुमति दी। यह इस संभावना को बहुत बढ़ाता है कि इस तकनीक का उपयोग करके ब्याज के लक्षित जीन की जांच की जा सकती है।

संक्षेप में, यह पाया गया कि वयस्क मच्छरों के लिए आरएनएआई का मौखिक वितरण सरल, बहुमुखी और मच्छर जीन समारोह का अध्ययन करने और मच्छर जनित बीमारियों के वेक्टर नियंत्रण के लिए उपन्यास और निंदनीय उपकरणों के निर्माण के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण हो सकता है।

Disclosures

लेखकों की रिपोर्ट है कि उनके पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों को कीट विज्ञान शाखा और सीडीसी में परजीवी रोगों और मलेरिया के प्रभाग के भीतर कर्मचारियों और वैज्ञानिकों को धन्यवाद देना चाहते हैं, और ब्रायन ट्रिग और मिशेल चिउ जेएचयू में बैक्टीरिया की तैयारी और / या इस काम की सहायक चर्चाओं के साथ सहायता के लिए। हम जेएचएमआरआई कीटरी और प्रबंधक क्रिस किजिटो को एन गाम्बियाई मच्छरों तक पहुंचने और पालने के लिए धन्यवाद देते हैं। हम इस अध्ययन में उपयोग के लिए प्लास्मिड PJet GFP और pPB47 GFP प्राप्त करने में सहायता के लिए वेई हुआंग (JHSPH) को धन्यवाद देते हैं। इस काम के लिए धन द्वारा प्रदान किया गया था: एनआईएच R21AI153588 (DJA के लिए), एक जॉन्स हॉपकिन्स मलेरिया रिसर्च इंस्टीट्यूट पोस्टडॉक्टोरल फैलोशिप (मेगावाट के लिए); और गुड वेंचर्स फाउंडेशन और ओपन परोपकार परियोजना से सीडीसी फाउंडेशन को अनुदान द्वारा मलेरिया के लिए अनुसंधान में सहायता के लिए मच्छरों में महिला विकास का समर्थन क्रायोप्रिजर्वेशन और दमन, ओपन परोपकार परियोजना, 2017 शीर्षक दिया गया है। हम गहराई से JHU माइक्रोस्कोप सुविधा कर्मचारियों से सहायता और उपयोग किए गए माइक्रोस्कोप के लिए लागू एनआईएच अनुदान समर्थन की सराहना करते हैं (एनआईएच ग्रांट #: S10OD016374)। इस पांडुलिपि में निष्कर्ष और निष्कर्ष लेखकों के हैं और जरूरी नहीं कि सीडीसी के विचारों का प्रतिनिधित्व करें। व्यापार नामों का उपयोग केवल पहचान के लिए है और इसका मतलब रोग नियंत्रण और रोकथाम केंद्र, सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा, या अमेरिकी स्वास्थ्य और मानव सेवा विभाग द्वारा समर्थन नहीं है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 Kb Plus DNA Ladder Thermo Fisher Scientific 10787018
2x Yeast Extract Tryptone (2xYT) Medium BD Difco DF0440-17
AAPP n/a n/a Antisera. 1:50 dilution (rabbit); gift from Fabrizio Lombardo
AccuStart II PCR Supermix Quantabio 95137-100
Agarose Millipore Sigma A9539
Ampicillin Millipore Sigma A5354
Anopheles gambiae G3 BioDefense and Emerging Infections (BEI) Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4) MRA-112
BugDorm BioQuip 1452
Centrifuge 5810R Eppendorf P022628181
CrebA DSHB CrebA Rbt-PC Antisera. 1:50 dilution (rabbit); generated by the Andrew Lab
Damiens diet BioServ
DAPI Life Technologies n/a 4′,6-diamidino-2-phenylindole; 1:200 dilution.
Defibrinated sheep blood HemoStat DSB050
Escherichia coli HT115 (DE3)
Ethidium bromide Millipore Sigma E7637
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Thermo Fisher Scientific 4368814
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Millipore Sigma I5502
JM109 Competent cells Promega L2005
Luria Broth Media Thermo Fisher Scientific 10855001
Mucin 2 Proteintech Muc2; 27 675-1-AP Antisera. 1:100 dilution (mouse).
Nanodrop 2000 Thermo Fisher Scientific
Nile Red Sigma n/a Lipid dye; 1:50 dilution.
Owl EasyCast B2 Mini Gel Horizontal Electrophoresis Thermo Fisher Scientific Model B2
pGEMT easy Promega A3600
Power SYBR-green PCR master MIX Applied Biosystems 4367659
PureLink PCR purification kit Thermo Fisher Scientific K31001
QuantaStudio 6 Applied Biosystems
QuantStudio6 Real Time PCR System Applied Biosystems
Rab11 n/a n/a Antisera. 1:100 dilution (rabbit); generated by the Andrew Lab
Rh-WGA Vector Labs n/a Rhodamine-conjugated wheat germ agglutinin (chitin, O-GlcNAcylation dye); 1:40 dilution
Sage n/a n/a Antisera. 1:50 dilution (rat); generated by the Andrew Lab
T4 DNA ligase Promega M1801
Tetracycline Millipore Sigma 87128
Trizol Thermo Fisher Scientific 15596018
Zeiss LSM700 fluorescence confocal microscope Zeiss
ANTIBODIES
Chicken anti-Rat IgG (H+L), Alexa Fluor 647 Thermo Fisher Scientific A21472
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647 Thermo Fisher Scientific A28181
IgG (H+L) Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A27034
Rabbit anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A27012
PRIMERS
ACT-2f: TACAACTCGATCATGAAGTGCGA CDC Biotechnology Core Facility Branch n/a qRT-PCR primer
ACT-3r: CCCGGGTACATGGTGGTACCGC
CGGA		 CDC Biotechnology Core Facility Branch n/a qRT-PCR primer
FKH_RNAi_F: GCCGACTTATGCTTAGCCCA CDC Biotechnology Core Facility Branch n/a qRT-PCR primer
FKH_RNAi_R: TAGCCGTCAATTCCTCCTGC CDC Biotechnology Core Facility Branch n/a qRT-PCR primer
newDSX-f: AGAGGGCGGGGAAATTCTAGT CDC Biotechnology Core Facility Branch n/a qRT-PCR primer
newDSX-r: GGGCTTGTGGCAGTACGAATA CDC Biotechnology Core Facility Branch n/a qRT-PCR primer
S7qf1: AGAACCAGCAGACCACCATC CDC Biotechnology Core Facility Branch n/a qRT-PCR primer
S7qr1: GCTGCAAACTTCGGCTATTC CDC Biotechnology Core Facility Branch n/a qRT-PCR primer

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References

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Taracena, M., Hunt, C., Pennington, P., Andrew, D., Jacobs-Lorena, M., Dotson, E., Wells, M. Effective Oral RNA Interference (RNAi) Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes. J. Vis. Exp. (181), e63266, doi:10.3791/63266 (2022).

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