Summary
Den orala administreringen av dsRNA som produceras av bakterier, en leveransmetod för RNA-interferens (RNAi) som rutinmässigt används i Caenorhabditis elegans, tillämpades framgångsrikt här på vuxna myggor. Vår metod möjliggör robusta omvända genetikstudier och transmissionsblockerande vektorstudier utan användning av injektion.
Abstract
RNA-interferens har varit ett starkt använt verktyg för omvänd genetisk analys i två decennier. Hos vuxna myggor har dubbelsträngad RNA (dsRNA) administrering utförts främst via injektion, vilket kräver betydande tid och inte är lämplig för fältapplikationer. För att övervinna dessa begränsningar presenterar vi här en effektivare metod för robust aktivering av RNAi genom oral leverans av dsRNA till vuxna Anopheles gambiae. Långa dsRNA producerades i Escherichia coli-stammen HT115 (DE3), och en koncentrerad suspension av värmedödade dsRNA-innehållande bakterier i 10% sackaros erbjöds på bomullsbollar ad-libitum till vuxna myggor. Bomullsbollar byttes ut varannan dag under behandlingens varaktighet. Användning av denna metod för att rikta in sig på doublesex (en gen som är involverad i könsdifferentiering) eller gaffelhuvud (som kodar för en transkriptionsfaktor för spottkörteln) resulterade i minskat målgenuttryck och / eller proteinimmunfluorescenssignal, mätt med kvantitativ realtids-PCR (qRT-PCR) respektive fluorescenskonfokalmikroskopi. Defekter i spottkörtelns morfologi observerades också. Denna mycket flexibla, användarvänliga, billiga och tidseffektiva metod för dsRNA-leverans kan vara allmänt tillämplig på målgener som är viktiga för insektsvektorfysiologi och därefter.
Introduction
Många sjukdomar överförs av myggor, vilket gör studien av myggfysiologi och genetik till ett viktigt företag. Användningen av RNAi i dessa organismer har varit framträdande under de senaste 20 åren och har möjliggörat funktionell karakterisering av många mygggener 1,2,3,4,5. Den vanligaste tekniken för dsRNA-leverans har varit mikroinjektion, vilket har nackdelarna att det kan skada myggorna och kräver betydande tid och ansträngning. Orala leveransmetoder för RNAi har testats, men främst i larvstadiet av myggorna 6,7,8,9. Oral leverans av dsRNA hos vuxna myggor har inte utforskats fullt ut och kan vara ett användbart verktyg för studier av vektorbiologi och vektorkontroll.
Malaria överförs av Anopheles myggor när en infekterad kvinnlig mygga tar en blodmåltid från en oinfekterad värd och injicerar saliv som innehåller malariaparasiter10. För att i slutändan överföras i myggans saliv måste parasiten övervinna många hinder, inklusive att undvika myggimmunsystemet, korsa midgutbarriären och invasion av spottkörtlarna11. Myggsaltkörtelns (SG) arkitektur är nyckeln till parasitinvasion och att arkitekturen styrs både av viktiga spottkörteluttryckta transkriptionsfaktorer såväl som determinanter för sexuell dimorfism. Flera mycket bevarade transkriptionsfaktorer krävs för cellulär specifikation och homeostatiskt underhåll av spottkörtlarna och för produktion och utsöndring av salivproteiner som fungerar vid blodmatning 12,13,14. Gaffelhuvud (Fkh) är en bevingad helixtranskriptionsfaktor som fungerar som en viktig regulator för insekts SG-struktur och funktion (baserat på studier i fruktflugor och silkesmaskmoth)15,16,17,18,19,20. I Drosophila SG fungerar Fkh med Salvia, en SG-specifik grundläggande helix-loop-helix (bHLH) transkriptionsfaktor, för att främja SG-överlevnad och salivproduktion19. En viktig, positiv medregulator för salivproduktion i Drosophila är CrebA, en välstuderad transkriptionsfaktor för leucin dragkedja som uppreglerar uttrycket av sekretoriska väggener 21,22,23. Det finns också en stark grad av morfologisk differentiering hos kvinnliga spottkörtlar som sannolikt spelar en nyckelroll, inte bara vid blodmatning utan också i parasiternas förmåga att invadera denna vävnad24.
Många av de gener som är involverade i att bestämma spottkörtelns överlevnad, struktur, fysiologi och sexuell dimorfism har komplexa spatiotemporala uttrycksprofiler 25,26,27, och de traditionella leveransmetoderna för dsRNA för att inducera RNAi är inte alltid effektiva för att rikta in sig på dessa typer av gener i denna eller andra vävnader. Oral leverans av dsRNA i larvstadiet Aedes aegypti och An. gambiae myggor har emellertid använts framgångsrikt för att tysta den kvinnospecifika formen av dsx-genen 9,28. Tidigare studier med dsRNA i myggsaltkörtlar fann att även om stora mängder dsRNA krävdes, var ljuddämpningseffekten relativt långvarig (minst 13 dagar)29. Här testades förmågan hos värmedödad E. coli-stam HT115 (DE3) som uttrycker sekvensspecifikt dsRNA för dsx, fkh eller CrebA att inducera RNAi-tystnad av dessa gener hos vuxna kvinnliga myggor. Oral administrering av dsRNA-inducerad gennedslagning i An. gambiae, med tydliga minskningar av mRNA-nivåer och med fenotyper som överensstämmer med funktionsförlusten hos dessa gener. Således kommer detta tillvägagångssätt sannolikt att fungera för att slå ner funktionen hos en mängd olika spottkörtelgener.
Protocol
1. Kloning av dsRNA till E. coli-uttrycksvektor
- Välj målgensekvensen som ska infogas i en lämplig vektor för uttryck av dsRNA. Hämta uttrycksvärdena från Vectorbase.org med följande metod.
- Sök efter en gen av intresse (t.ex. tabell 1) i sökrutan på hemsidan.
- På den resulterande gensidan navigerar du till 8. Transkriptomik avsnitt.
- Leta efter de listade relevanta RNA-seq- och microarray-genuttrycksexperimenten.
- Transkribera värden av intresse i kalkylarkprogrammet och skapa en datatabell.
- Välj en kommersiellt tillgänglig plasmid med minst en T7-promotor som ska användas. Om den valda plasmiden bara har en T7-promotor (som de flesta kommersiella plasmider gör), inkludera en andra T7-promotor i omvänd primer som ska användas för amplifiering av dsDNA för genen av intresse.
OBS: DsRNA-sekvensen för målgenerna kan väljas med hjälp av webbapplikationen E-RNAi för design av RNAi-reagenser30. Antingen långt dsRNA (cirka 400 bp) eller korthårnålt dsRNA (shRNA) kan utformas baserat på specifika gensekvenser. Dessa sekvenser bör förstärkas och sekvenseras för identitetsbekräftelse före kloning. De utvalda genregionerna, plasmiderna och promotorerna som används i denna studie listas i kompletterande fil 1. - Utför kloning enligt en enkel enstegsprocedur som beskrivits tidigare 9,31. För detta ändamål rena PCR-produkten och ligera till det linjäriserade plasmid-DNA. Använd ligeringsprodukten för värmechocktransformation av kompetenta E. coli-celler 32. Markera de transformerade cellerna genom blå/vit screening. Bekräfta insatsens orientering med en T7-primer PCR och bekräfta sekvensen med M13-primers.
OBS: Vita / blå screeningar kan användas när plasmiden som valts för transformation bär lacZ-genen som kodar för β-galaktosidas. Vita kolonier bör innehålla önskad insats i lacZ och kan väljas för att ytterligare bekräfta närvaron och orienteringen av målsekvensen33. - Rena plasmiden från den första transformationen och använd den för att omvandla kompetent E. coli HT115 (DE3) som tidigare beskrivits34. Efter bekräftelse på att plasmiden med insatsen är närvarande i den kompetenta E. coli HT115 (DE3), gör glycerolbestånd av bakterier för engångsbruk.
OBS: Ett lämpligt icke-relaterat kontroll-dsRNA bör förvärvas eller förberedas för användning i varje experiment. I detta fall används sekvensen för den orelaterade genen aintegumenta (myra) från Arabidopsis thaliana .
2. Beredning av värmedödade bakterier som uttrycker dsRNA
- Odla en kultur från en enda bakteriekoloni av E. coli-stammen HT115 (DE3) som innehåller dsRNA-uttryckande plasmid i 50 ml Luria Broth (LB) innehållande 100 μg/ml ampicillin och 12,5 μg/ml tetracyklin, på en plattformsskakare (180 rpm) vid 37 °C i 12 timmar.
- Späd bakteriekulturen (1:1000) till 2x jästtryptonmedier (2x YT) innehållande 100 μg/ml ampicillin och 12,5 μg/ml tetracyklin.
- Inducera dsRNA-produktion genom att tillsätta 40 μM (slutlig koncentration) isopropyl β-D-1-tiogalaktatopyranosid (IPTG).
- När cellerna når en O.D.600 = 0,4, ungefär efter 2 timmars induktion vid 37 °C med omrörning vid 180 rpm, bereda en koncentrerad suspension av värmedödade bakterier enligt beskrivningen av Taracena et al 9. Pelletera cellerna genom centrifugering (4000 x g, 4 °C, 10 min) och tvätta cellerna i en volym natriumfosfatbuffert (PBS).
- Snurra igen under samma förhållanden, återupphäng i PBS till 1/100 av den ursprungliga volymen och placera vid 70 ° C i 1 timme.
- Gör 400 μL alikvoter av de värmedödade bakterierna och förvara dessa alikvoter vid -20 ° C tills vidare användning (förvara inte i mer än en vecka). Denna suspension av värmedödade bakterier innehåller det specifika dsRNA för RNAi-experimenten. Utför denna procedur både för målgenen dsRNA-bakterier och för den orelaterade dsRNA-kontrollen som ska användas i varje experiment.
3. Mata myggor med värmedödade bakterier som uttrycker dsRNA
- Tina en alikvot dsRNA (HT115 (DE3) bakteriesuspension) och blanda med 1,6 ml 12% sockerlösning innehållande 0,2% metylparaben.
- Blötlägg en liten bomullstuss i denna lösning och placera den blötlagda bomullstussen i en bur som innehåller 5 dagar gamla myggor. Se till att myggorna matar på denna lösning och plockar upp både sockret och de dsRNA-innehållande bakterierna samtidigt.
- Byt bomullsbollen blöt i dsRNA-sockerlösning varannan dag i 8 på varandra följande dagar.
- Håll myggburar under konstanta förhållanden, dvs 27 ° C och 80% relativ luftfuktighet med en fotoperiod på 12 h: 12 h ljus: mörk fotocykel, åtskild av en 30 min gryning och 30 min skymningsperiod.
4. Analys av genuttrycksnivåer
- Kallbedöva myggorna genom att placera behållaren på is i en minut eller tills myggorna slutar röra sig. När myggorna är bedövade, placera dem på en kall yta för att isolera honor för dissektion.
- Spraya 70% etanol till myggorna och placera dem på en glasyta med PBS. Med ett par pincett, säkra mygghuvudet stadigt och dra bröstkorgen mycket långsamt, så att spottkörtlarna kan släppas ut i PBS.
- Håll spottkörtlarna i iskall PBS tills 10 individer har dissekerats. Pool Ten SGs för RNA-extraktion med användning av guanidiniumtiocyanat-fenol-kloroformmetoden. Suspendera RNA-pelleten i 30 μL RNasfritt vatten.
- Använd 1 μL alikvot av RNA extraherat från SG i föregående steg, för att läsa absorbans vid 260 och 280 nm och beräkna RNA-koncentrationen för varje prov genom att multiplicera med utspädningsfaktorn. Ett 260/280-förhållande på ~ 2,0 indikerar RNA av god kvalitet.
- Använd 1 μg av det renade RNA för att syntetisera komplementärt DNA (cDNA) med hjälp av ett kommersiellt omvänd transkriptionssats.
- Gör en 1:10-utspädning av cDNA för att förbereda en RT-PCR-reaktion enligt tillverkarens rekommendationer. För varje prov, förbered en reaktion för målgenen och parallellt sätta upp en reaktion med hushållsgenen (HK). Ställ in varje genreaktion i en teknisk tre exemplar för att eliminera effekten av slumpmässig variation från metoden.
OBS: Här har An. gambiae ribosomal S7-genen (GeneBank: L20837.1) och aktin (VectorBase: AGAP000651) använts som HK-gener. - Använd alla primers i en slutlig koncentration på 300 nM, enligt SYBR-gröna tillverkarens indikationer. Förstärk med standard PCR-förhållanden: 95 ° C i 10 minuter, följt av 40 cykler på 15 s vid 95 ° C och 60 s vid 60 ° C.
OBS: För att kvantifiera genuttryck används delta-delta-Ct-metoden (ΔΔCt). Delta Ct (ΔCt) är skillnaden mellan Ct för målgenen och Ct för hushållsgenen. ΔΔCt är skillnaden mellan ΔCt i experimentgruppen och ΔCt i kontrollgruppen35.
5. Fenotypisk utvärdering: framgångsrik blodmatning
- För att utvärdera förmågan att blodmata, sätt grupper av 15 kvinnliga myggor behandlade med mål och kontrollera dsRNA på små burar (12 cm diameter) och svält dem i 4 timmar.
- Med hjälp av ett cirkulerande vattenbad inställt på 37 ° C, glasmyggmatare (24 mm diameter) och parafilmmembran, erbjuder defibrinerat fårblod till myggorna.
OBS: Blod kan förvärvas från en kommersiell leverantör som aseptiskt drar det från friska, donatordjur av amerikanskt ursprung och manuellt defibrinates utan antikoagulantia eller tillsatser. - Genom direkt observation, räkna och registrera antalet sonderingsförsök att framgångsrikt förvärva en blodmåltid från de första fem kvinnorna för att bli helt engorged i varje grupp.
OBS: För att undvika signifikanta metaboliska förändringar i myggorna, som kan störa energiresurser som påverkar blodsökande beteende, hölls svält till ett minimum (4 timmar). Som ett resultat skulle inte alla myggor ivrigt söka blodmjölet och vi begränsade antalet engorged honor till fem (en tredjedel av varje grupps totala), för att minska effekten av tidsvariabler som exponering för mänsklig lukt, temperaturförändring mellan kamrarna och matningsytorna etc.
6. Fenotypisk utvärdering: Spottkörtelns morfologi och nedreglering av relevanta proteiner
- Isolera färsk vävnad i 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) enligt beskrivningen i steg 4.2 och fixera i iskall aceton i 90 s. Skölj flera gånger i 1x PBS efter att acetonen har tagits bort. Inkubera med primära antikroppar över natten vid 4 °C med antiserum (se materialtabell) utspätt till 1x PBS.
OBS: Se materialförteckningen för identifiering av de primära antikroppar som används för salivproteiner (Anopheles anti-trombocytprotein, AAPP; Mucin 2, MUC2), SG-transkriptionsfaktorer (Gaffelhuvud, fkh; Salvia, salvia; Cykliskt AMP-responselementbindande protein A, CrebA) och en markör för sekretoriska vesiklar (Rab11). Dessa antikroppar används som avläsningar för SG-form och funktion. Alla antikroppar som är lämpliga för immunofluorescens bör dock vara lämpliga för detta protokoll. - Tvätta i 1x PBS flera gånger. Tillsätt sekundära antikroppar (fluorescerande) utspädda i 1x PBS och inkubera i mörkret vid rumstemperatur i 2 timmar. Tillsätt någon motfläck [såsom 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI; DNA), vetegroddar agglutinin (WGA; för kitin), falloidin (för F-aktin) och/eller Nilröd (för lipider)] 30 min före slutet av 2 timmars inkubation.
- Tvätta tre gånger i 1x PBS. Montera sedan vävnaderna i 100% glycerol på en vanlig mikroskopbild med en 1 mm tjock täckglidning och förvara vid -20 ° C tills avbildning med ett fluorescenskonfokalmikroskop.
OBS: För att få kvantitativa data måste bildinställningarna hållas konstanta. Här inkluderades endast projektionsbilder med maximal intensitet genom hela 3D-volymen av vävnaden, och all bildkvantifiering normaliserades mellan behandlingar (inom ett experiment) baserat på DAPI-signal i icke-SG-vävnadsrester (fettkropp, nagelband eller huvud) som också finns på bilden.
Representative Results
Till att börja med användes mikroarrayuttrycksdata från VectorBase för att skanna potentiella mål över utvecklingsstadier36,37 för att bestämma uttrycksstatusen för alla gener som är relevanta för den aktuella studien (tabell 1). Som förväntat visade alla våra valda målgener uttryck hos vuxna SGs. Nivåerna av aapp och salvia var särskilt höga (tabell 1). Också i noten var de höga uttrycksnivåerna av f-Agdsx hos vuxna kvinnliga SGs9.
Specifika segment från varje gen utvärderades för användning som dsRNA med hjälp av webbapplikationen E-RNAi för design av RNAi-reagenser30. De ~ 400 bp-regioner som innehåller sekvenser som är unika för varje målgen klonades sedan (figur 1A), omvandlades till lämpliga bakteriestammar och användes för att förbereda suspensioner av värmedödade bakterier, som inducerades för att producera dsRNA. Vuxna myggor matades i 8 dagar på sackarosindränkta bomullsbollar som innehöll bakteriesuspensionerna av dsRNA för f-Agdsx, fkh eller myra (den orelaterade negativa kontrollen).
För analys av RNAi-utfodring av kvinnliga myggor bestämdes först om f-Agdsx eller fkh dsRNA-matningar inducerade nedtystning av gener. En minskning med 98,8% (±2,1) i fkh-transkriptnivåer observerades i gruppen som matades med fkh-dsRNA (figur 1B), vilket indikerar att dsRNA mycket effektivt minskade överflödet av fkh-transkript i SGs. Överraskande nog reducerades fkh mRNA-nivåerna med 82,0% (±18,9) i myggorna behandlade med dsRNA för f-Agdsx, som hade en 89,86% (±4,48) av f-Agdsx-reduktion , vilket tyder på att fkh kan vara ett mål för F-Dsx i spottkörteln. Samtidigt med den signifikanta minskningen av fkh-uttrycksnivåerna uppvisade fkh-knockdown-myggorna en signifikant ökning av antalet sonderingsförsök som behövdes för att blodmata. Dessa myggor uppvisade i genomsnitt fem gånger fler utfodringsförsök än kontrollgruppen eller f-Agdsx dsRNA matade myggor för att vara helt engorged med blod (Figur 1C). Detta ledde till att man frågade om fkh knockdown RNAi-behandlingarna orsakade förändringar i lokalisering och / eller distribution av viktiga transkriptionsregulatorer (SG TF Sage and CrebA) (Figur 2), utsöndrade proteiner (AAPP och mucin) (Figur 3) och sekretoriska maskiner [Nile Red (lipider) och Rab11 (sekretoriska vesiklar)] (Figur 4). Viktigt är att betydande skillnader i färgningsintensitet observerades över olika lobregioner, lober och enskilda SG.
Som förutspått reducerades nivåerna av salvia och CrebA-färgning markant i alla SG-lober efter fkh RNAi (figur 2B) jämfört med myrkontroll RNAi (figur 2A). Minskningar av både de högsta maximala intensitetsvärdena (röda streckade linjer och numeriska etiketter) och lägsta maximala intensitetsvärden (blå streckade linjer och numeriska etiketter) i linjeskanningsprofiler föreslog minskningar av områden med både hög och låg signal i vävnaden (figur 2A,B). Dessa data tyder på att An. gambiae fkh RNAi är effektivt och att fkh reglerar produktionen och / eller stabiliteten hos SG TF Sage och CrebA i An. gambiae, analogt med deras genetiska förhållande i Drosophila SGs19,38,39.
Vid behandling av mycket rikliga salivkomponentproteiner reducerades nivåerna av Anopheles trombocythämmande protein (AAPP)40,41 i alla tre SG-loberna efter fkh RNAi, jämfört med kontroll RNAi-behandling (figur 3A,B; grön). Å andra sidan observerades inga förändringar i nivåerna av Mucin (Figur 3A,B; lila). Dessa data tyder på att Fkh bidrar annorlunda till uttrycket av olika salivproteingener.
Slutligen observerades två markörer för sekretion (figur 4A,B): Rab11 (vesiklar associerade med apikala återvinningsendosomer)42 och Nilröd (lipider). Minskad Rab11-fluorescens observerades i distala laterala (DL) lober efter fkh RNAi-behandling (figur 4A v vs. 4B v; grön). Ökad Rab11-signal i de mediala (M) och proximala laterala (PL) loberna (figur 4A vii, ix vs. 4B vii, ix; grön) inträffade emellertid också. Ingen märkbar skillnad observerades i Nilröd signal (figur 4A,B; lila) efter fkh RNAi jämfört med kontroll-RNAi-behandlingen. Dessa data tyder på att fkh-reduktion kan förändra vissa sekretoriska maskinåtgärder på ett komplext sätt som skiljer sig mellan SG-lober.
| Dataset: | Goltsev | Neira Oviedo | Neira Oviedo | Bagare | Bagare | Bagare | Bagare | ||
| gen symbol | funktion | AGAP-ID | embryo (25 timmar) | L3 larver | L3 SG | vuxen kvinna kropp (3 dagar) |
vuxen man kropp (3 dagar) |
vuxen kvinna SG (3 dagar) |
vuxen man SG (3 dagar) |
| AAPP | salivprotein | AGAP009974 | 3.92 | 4.38 | 4.33 | 3.81 | 2.46 | 11.92 | 2.69 |
| CrebA | txn-faktor | 4499 | 6.28 | 5.22 | 5.92 | 2.99 | 2.96 | 3.27 | 3.13 |
| " | txn-faktor | AGAP011038 | 4.50 | 4.46 | 5.23 | 2.96 | 2.86 | 3.05 | 2.88 |
| Dsx | txn-faktor | 4004050 | 4.91 | 5.39 | 5.55 | 3.72 | 4.00 | 4.57 | 4.01 |
| fkh | txn-faktor | AGAP001671 | 5.18 | 4.67 | 5.25 | 2.99 | 3.09 | 3.21 | 3.05 |
| MUC2 | salivprotein | AGAP012020 | 4.59 | 5.53 | 5.63 | 2.96 | 3.07 | 3.08 | 3.26 |
| Rab11 | vesikulär handel | AGAP004559 | 10.21 | 7.47 | 8.60 | 4.90 | 3.79 | 3.38 | 2.96 |
| salvia | txn-faktor | 4333 | 5.32 | 5.96 | 8.89 | 3.40 | 3.33 | 7.37 | 7.23 |
Tabell 1: Medelvärde för log2-mikroarrayuttrycksprofiler för An. gambiae gener av intresse. Visas är gennamn, funktionell kategori, Vectorbase (AGAP) identifierare och genomsnittliga log2 microarray uttrycksdata som samlats in från Vectorbase. Dessa data indikerar att våra gener av intresse (involverade i spottkörteln (SG) cellbiologi och utsöndring) uttrycks och berikas i larvstadium 3 (L3) och vuxna SG, jämfört med hela individer.
Figur 1: f-Agdsx och fkh knockdown hos vuxna An. gambiae minskar fkh mRNA-nivåerna i SG: erna och påverkar den kvinnliga förmågan att blodmata. (A) Representativ bild av plasmiddesignen som används för dsRNA-produktion i denna metodik. Den andra T7-promotorsekvensen läggs till plasmiden genom att inkludera den i 3 'primern som används för att förstärka insatsen som ska klonas i pGEMT-plasmiden. Plasmiden omvandlas sedan till E. coli HT115 (DE3) bakterier och en matningslösning görs av en suspension av inducerade värmedödade bakterier i 10% sockervatten. (B) Djur som utfodrades med en dsRNA-utfodringslösning för antingen f-Agdsx eller fkh, uppvisade signifikant lägre nivåer av fkh-transkript (enkelriktad ANOVA med flera jämförelser; n = 15). Men endast gruppen som matades med fkh dsRNA (C) visade en signifikant skillnad i antalet bitande försök som behövdes för att förvärva en blodmåltid. Myggor i denna grupp behövde i genomsnitt fem gånger så många sonderingsförsök för att få en framgångsrik blodmåltid än vad som behövs av kontrollen eller de dsx-dsRNA-matade grupperna (envägs ANOVA med flera jämförelser; n = 15). Felstaplar anger standardfelet för medelvärdet (SEM). Varje experiment utfördes i tre separata biologiska replikat. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: fkh knockdown hos vuxna An. gambiae spottkörtlar minskar SG transkriptionsfaktornivåer. Visas är representativa bilder från dag 13 vuxen kvinnlig An. gambiae SGs efter 8 dagar (dag 5-13) av oral exponering för antingen (A) icke-relaterad dsRNA-kontroll (myra) eller (B) dsRNA som riktar sig mot SG TF-gaffelhuvudet (fkh, AGAP001671) i 10% sackaros färgat med färgämnena DAPI (DNA; rött), märkt vetegroddar agglutinin (WGA, chitin / O-GlcNAcylation; blå), antisera mot SG TFs Sage (grön) och CrebA (lila). Skalstångslängder som visas är mikron. SGs (i) är skisserade med vita streck. Gula linjer i zoomade lobbilder (av de regioner som omges av gula rutor och märkta "infällda") indikerar var linjeskanningarna av signalintensiteten genomfördes. Gröna och lila kanalintensiteter som motsvarar linjeskanningar för varje zoomad lob ritas (alltid från vänster till höger i SG) i diagrammen under bilderna; X-axel = avstånd (i pixlar) och Y-axel = grå enhet (pixelintensitet). Pixelintensitetens dynamiska omfång avgränsas av röda (maximala) och blå (minsta) prickade linjer och motsvarande värden visas i varje diagram. MIP = maximal intensitet 3D-projektion genom hela SG-djupet. DL: distal sidolob; M: medial lob; PL: proximal sidolob; SD: salivkanal. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: fkh knockdown hos vuxna An. gambiae spottkörtlar minskar SG utsöndrade proteinnivåer. Visas är representativa bilder från dag 13 vuxna kvinnliga An. gambiae SGs efter 8 dagar (dag 5-13) av oral exponering för antingen (A) icke-relaterad dsRNA-kontroll (myra) eller (B) dsRNA som riktar sig mot SG TF-gaffelhuvudet (fkh,AGAP001671) i 10% sackaros färgat med färgämnena DAPI (DNA; rött), märkt vetegroddar agglutinin (WGA, kitin / O-GlcNAcylation; blå), och salivproteinerna AAPP (grön) och Mucin (MUC2, lila). Skalstångslängder som visas är mikron. SGs (i) är skisserade med vita streck. Gula linjer i zoomade lobbilder (av de regioner som omges av gula rutor) anger var linjeskanningarna av signalintensiteten genomfördes. Gröna och lila kanalintensiteter som motsvarar linjeskanningar för varje lob ritas (alltid från vänster till höger i SG) i diagrammen under bilderna; X-axel = avstånd (i pixlar) och Y-axel = grå enhet (pixelintensitet). Pixelintensitetens dynamiska omfång avgränsas av röda (maximala) och blå (minsta) streckade linjer och motsvarande värden visas i varje diagram. MIP = maximal intensitet 3D-projektion genom hela SG-djupet. DL: distal sidolob; M: medial lob; PL: proximal sidolob; SD: salivkanal. Kursiva "DL" -etiketter (Bi) anger två synliga regioner i samma DL-lob. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: fkh knockdown hos vuxna An. gambiae spottkörtlar minskar SG sekretionsmarkörer. Visas är representativa bilder från dag 13 vuxna kvinnliga An. gambiae SGs efter 8 dagar (dag 5-13) av oral exponering för antingen (A) icke-relaterad dsRNA-kontroll (myra) eller (B) dsRNA som riktar sig mot SG TF-gaffelhuvudet (fkh, AGAP001671) i 10% sackaros färgat med färgämnena DAPI (DNA; rött), märkt vetegroddar agglutinin (WGA, chitin / O-GlcNAcylation; blå), Nilröd (lipider; lila) och antisera mot återvinningsendosomen vesiklarmarkör Rab11 (grön). Skalstångslängder som visas är mikron. SGs (i) är skisserade med vita streck. Gula linjer i zoomade lobbilder (av de regioner som omges av gula rutor) anger var linjeskanningarna av signalintensiteten genomfördes. Gröna och lila kanalintensiteter som motsvarar linjeskanningar för varje lob ritas (alltid från vänster till höger i SG) i diagrammen under bilderna; X-axel = avstånd (i pixlar) och Y-axel = grå enhet (pixelintensitet). Pixelintensitetens dynamiska omfång avgränsas av röda (maximala) och blå (minsta) streckade linjer och motsvarande värden visas i varje diagram. MIP = maximal intensitet 3D-projektion genom hela SG-djupet. DL: distal sidolob; M: medial lob; PL: proximal sidolob; SD: salivkanal. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande akt 1. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Förmågan att effektivt leverera dsRNA till An. gambiae myggor genom oral utfodring har breda konsekvenser för studier av vektorbiologi både i laboratoriet och i fältet. Mikroinjektion har länge accepterats som det föredragna sättet att leverera kemikalier, antikroppar, RNAi och genetiska modifieringsstrategier hos myggor43,44. Konsekvensen av väsentlig fysisk manipulation, cellskador och stress kan undvikas genom användning av oral leverans, vilket också kan vara potentiellt lämpligt för storskaliga eller fältapplikationer. Tidigare arbete har föreslagit att RNAi verkar allestädes närvarande inom en enskild vuxen mygga29, vilket möjliggör effekter i alla vävnader, inklusive spottkörtlar. Genom att mata myggor med ett stort antal dsRNA-uttryckande E. coli som smälts asynkront under en lång tidsram kan man potentiellt uppnå konsekvent och enhetlig exponering för RNAi över alla individer i en bur. Denna metod gör det möjligt att mata ett stort antal myggor och analysera potentiell variation av de resulterande fenotyperna beroende på målgenen. En viktig faktor är emellertid möjligheten till heterogen fördelning av bakterierna, och därmed dsRNA, i bomullsfibern. De 400 μL bakterier som används dagligen för myggsockermatning skulle innehålla cirka ≤4,6 μg dsRNA, som beskrivits och beräknats tidigare9 men mängden dsRNA som intas av varje mygga bestämdes inte individuellt. Om byggandet av dsRNA-konstruktioner blir rutinmässigt möjliggör detta enkla behandlingsprotokoll snabb assimilering av denna teknik av någon myggforskare. A priori är tidsutgifterna under behandlingen (30 min per dag) triviala jämfört med den tid det tar att lära sig och applicera mikroinjektion på liknande provstorlekar.
Feeding dsRNA används rutinmässigt för omvänd genetik studier i modellorganismen Caenorhabditis elegans45. Denna tunga användningsnivå understryker värdet av den muntliga leveransmetoden. Konstruktion av ett An. gambiae genomomfattande bibliotek i transformerad E. coli, liknande den som finns i C. elegans46,47, skulle möjliggöra snabb omvänd genetisk screening hos myggor i ökad skala. Det är dock viktigt att notera att metodens effektivitet i hög grad beror på de endogena nivåerna av transkript och om uttrycket inte är begränsat till målvävnaden utan uttryckt bredare 4,8,44. Dessutom finns det bevis för att vissa insekticider kan inducera beteendemässig undvikande från myggor48, och utfodring med bakterier som potentiellt inducerar negativa effekter i dem kan utlösa liknande mönster av undvikande. I laboratoriets kontrollerade miljö, där myggorna inte hade en alternativ matkälla, hade de inget val att undvika sockervattnet med E. coli och behovet av en näringsrik källa skulle förmodligen åsidosätta instinkten att undvika bakterierna. Detta bör dock övervägas om strategin var avsedd att användas i mindre kontrollerade miljöer.
Det kan vara möjligt att rikta in sig på flera gener samtidigt (med hjälp av en konstruktion, flera konstruktioner eller en blandning av transformerade bakterieisolat), men ytterligare studier behövs för att bedöma effektiviteten. En annan viktig faktor för denna punkt är utvärderingen av möjliga off-target eller synergistiska effekter vid användning av enstaka eller flera mål. Upprättandet av lämpliga kontrollgener och grupper är en viktig del av den experimentella designen. Vidare är det frestande att spekulera i att detta tillvägagångssätt kan användas för att rikta in sig på andra patogener eller virus49. Tidigare arbete mot RNAi-induktion i myggor utfördes under förhållanden där reagenset injicerades direkt, så E. coli var inte närvarande. E. coli kan ge ett skyddande fack som möjliggör långsammare frisättning av dsRNA över tiden, vilket säkerställer att exponeringen är mer eller mindre kontinuerlig under en mycket längre period29.
Slutligen visar dessa resultat att effekterna av denna teknik är avstämbara genom att justera tidsramen (längd och startdag) för exponering och mängden E. coli som används. Denna funktion gjorde det möjligt för oss att studera funktionerna hos väsentliga gener (dsx och fkh) genom att identifiera optimala knockdown-förhållanden genom försök och fel. Detta ökar kraftigt sannolikheten för att målgener av intresse kan undersökas med hjälp av denna teknik.
Sammanfattningsvis konstaterades att oral leverans av RNAi till vuxna myggor kan vara enkel, mångsidig och ett kraftfullt tillvägagångssätt för att studera mygggenfunktion och för att skapa nya och formbara verktyg för vektorkontroll av myggburna sjukdomar.
Disclosures
Författarna rapporterar att de inte har några intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka personalen och forskarna inom Entomology Branch och Division of Parasitic Diseases and Malaria vid CDC, och Brian Trigg och Michelle Chiu för hjälp med bakterieberedning vid JHU och / eller hjälpsamma diskussioner om detta arbete. Vi tackar JHMRI Insectary och manager Chris Kizito för tillgång till och uppfödning av An. gambiae myggor. Vi tackar Wei Huang (JHSPH) för hjälp med att erhålla plasmider PJet GFP och pPB47 GFP för användning i denna studie. Finansiering för detta arbete tillhandahölls av: NIH R21AI153588 (till DJA), ett Johns Hopkins Malaria Research Institute Postdoctoral Fellowship (till MW); och genom ett bidrag från Good Ventures Foundation och Open Philanthropy Project till CDC Foundation med titeln Support cryopreservation and suppression of female development in mosquitoes to assist research for malaria, Open Philanthropy Project, 2017. Vi uppskattar djupt hjälp från JHU Microscope Facility-personalen och tillämpligt NIH-bidragsstöd för det mikroskop som används (NIH Grant #: S10OD016374). Resultaten och slutsatserna i detta manuskript är författarnas och representerar inte nödvändigtvis CDC: s åsikter. Användning av handelsnamn är endast för identifiering och innebär inte godkännande av Centers for Disease Control and Prevention, Public Health Service eller US Department of Health and Human Services.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 Kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | 10787018 | |
| 2x Yeast Extract Tryptone (2xYT) Medium | BD Difco | DF0440-17 | |
| AAPP | n/a | n/a | Antisera. 1:50 dilution (rabbit); gift from Fabrizio Lombardo |
| AccuStart II PCR Supermix | Quantabio | 95137-100 | |
| Agarose | Millipore Sigma | A9539 | |
| Ampicillin | Millipore Sigma | A5354 | |
| Anopheles gambiae G3 | BioDefense and Emerging Infections (BEI) Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4) | MRA-112 | |
| BugDorm | BioQuip | 1452 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | P022628181 | |
| CrebA | DSHB | CrebA Rbt-PC | Antisera. 1:50 dilution (rabbit); generated by the Andrew Lab |
| Damiens diet | BioServ | ||
| DAPI | Life Technologies | n/a | 4′,6-diamidino-2-phenylindole; 1:200 dilution. |
| Defibrinated sheep blood | HemoStat | DSB050 | |
| Escherichia coli HT115 (DE3) | |||
| Ethidium bromide | Millipore Sigma | E7637 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4368814 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Millipore Sigma | I5502 | |
| JM109 Competent cells | Promega | L2005 | |
| Luria Broth Media | Thermo Fisher Scientific | 10855001 | |
| Mucin 2 | Proteintech | Muc2; 27 675-1-AP | Antisera. 1:100 dilution (mouse). |
| Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | ||
| Nile Red | Sigma | n/a | Lipid dye; 1:50 dilution. |
| Owl EasyCast B2 Mini Gel Horizontal Electrophoresis | Thermo Fisher Scientific | Model B2 | |
| pGEMT easy | Promega | A3600 | |
| Power SYBR-green PCR master MIX | Applied Biosystems | 4367659 | |
| PureLink PCR purification kit | Thermo Fisher Scientific | K31001 | |
| QuantaStudio 6 | Applied Biosystems | ||
| QuantStudio6 Real Time PCR System | Applied Biosystems | ||
| Rab11 | n/a | n/a | Antisera. 1:100 dilution (rabbit); generated by the Andrew Lab |
| Rh-WGA | Vector Labs | n/a | Rhodamine-conjugated wheat germ agglutinin (chitin, O-GlcNAcylation dye); 1:40 dilution |
| Sage | n/a | n/a | Antisera. 1:50 dilution (rat); generated by the Andrew Lab |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 | |
| Tetracycline | Millipore Sigma | 87128 | |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Zeiss LSM700 fluorescence confocal microscope | Zeiss | ||
| ANTIBODIES | |||
| Chicken anti-Rat IgG (H+L), Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A21472 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A28181 | |
| IgG (H+L) Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A27034 | |
| Rabbit anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A27012 | |
| PRIMERS | |||
| ACT-2f: TACAACTCGATCATGAAGTGCGA | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
| ACT-3r: CCCGGGTACATGGTGGTACCGC CGGA |
CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
| FKH_RNAi_F: GCCGACTTATGCTTAGCCCA | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
| FKH_RNAi_R: TAGCCGTCAATTCCTCCTGC | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
| newDSX-f: AGAGGGCGGGGAAATTCTAGT | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
| newDSX-r: GGGCTTGTGGCAGTACGAATA | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
| S7qf1: AGAACCAGCAGACCACCATC | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
| S7qr1: GCTGCAAACTTCGGCTATTC | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
References
- Hoa, N. T., Keene, K. M., Olson, K. E., Zheng, L. Characterization of RNA interference in an Anopheles gambiae cell line. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 33, 949-957 (2003).
- Caplen, N., Zheng, Z., Falgout, B., Morgan, R. Inhibition of viral gene expression and replication in mosquito cells by dsRNA-triggered RNA interference | Elsevier enhanced reader. Molecular Therapy. 6, 243-251 (2002).
- Brown, A. E., Catteruccia, F. Toward silencing the burden of malaria: progress and prospects for RNAi-based approaches. BioTechniques. , Suppl 38-44 (2006).
- Airs, P. M., Bartholomay, L. C. RNA interference for mosquito and mosquito-borne disease control. Insects. 8, (2017).
- Blandin, S., et al. Reverse genetics in the mosquito Anopheles gambiae: targeted disruption of the Defensin gene. EMBO Reports. 3 (9), 852-856 (2002).
- Garver, L., Dimopoulos, G. Protocol for RNAi assays in adult mosquitoes (A. gambiae). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (5), e230 (2007).
- Whyard, S., et al. Silencing the buzz: a new approach to population suppression of mosquitoes by feeding larvae double-stranded RNAs. Parasites & Vectors. 8, 96 (2015).
- Wiltshire, R. M., Duman-Scheel, M. Advances in oral RNAi for disease vector mosquito research and control. Current Opinion in Insect Science. 40, 18-23 (2020).
- Taracena, M. L., Hunt, C. M., Benedict, M. Q., Pennington, P. M., Dotson, E. M. Downregulation of female doublesex expression by oral-mediated RNA interference reduces number and fitness of Anopheles gambiae adult females. Parasites & Vectors. 12, 170 (2019).
- Grassi, B. Studi di uno zoologo sulla malaria. Real Accademia dei Lincei. 3, 229 (1901).
- Smith, R. C., Jacobs-lorena, M. Plasmodium - Mosquito interactions: A tale of roadblocks and detours. Advances in Insect Physiology. 39, (2010).
- Das, S., et al. Transcriptomic and functional analysis of the Anopheles gambiae salivary gland in relation to blood feeding. BMC Genomics. 11, 1-14 (2010).
- Francischetti, I. M. B., Valenzuela, J. G., Pham, V. M., Garfield, M. K., Ribeiro, J. M. C. Toward a catalog for the transcripts and proteins (sialome) from the salivary gland of the malaria vector Anopheles gambiae. Journal of Experimental Biology. 205, 2429-2451 (2002).
- Henderson, K. D., Isaac, D. D., Andrew, D. J. Cell fate specification in thedrosophila salivary gland: The integration of homeotic gene function with the DPP signaling cascade. Developmental Biology. 205, 10-21 (1999).
- Mach, V., Ohno, K., Kokubo, H., Suzuki, Y. The Drosophila fork head factor directly controls larval salivary gland-specific expression of the glue protein gene Sgs3. Nucleic Acids Research. 24 (12), 2387-2394 (1996).
- Weiserova, M., et al. Mini-Mu transposition of bacterial genes on the transmissible plasmid. Folia Microbiologica. 32 (5), 368-375 (1987).
- Abrams, E. W., Mihoulides, W. K., Andrew, D. J. Fork head and Sage maintain a uniform and patent salivary gland lumen through regulation of two downstream target genes, PH4αSG1 and PH4αSG2. Development. 133, 3517-3527 (2006).
- Myat, M. M., Isaac, P. P., Andrew, D. J. Early genes required for salivary gland fate determination and morphogenesis in Drosophila melanogaster. Advances in Dental Research. 14, 89-98 (2000).
- Fox, R. M., Vaishnavi, A., Maruyama, R., Andrew, D. J. Organ-specific gene expression: the bHLH protein Sage provides tissue specificity to Drosophila FoxA. Development of Cell Biology. 140, 2160-2171 (2013).
- Maruyama, R., Grevengoed, E., Stempniewicz, P., Andrew, D. J. Genome-wide analysis reveals a major role in cell fate maintenance and an unexpected role in endoreduplication for the Drosophila FoxA gene fork head. PLOS ONE. 6, 20901 (2011).
- Johnson, D. M., et al. CrebA increases secretory capacity through direct transcriptional regulation of the secretory machinery, a subset of secretory cargo, and other key regulators. Traffic. 21, 560-577 (2020).
- Fox, R. M., Hanlon, C. D., Andrew, D. J. The CrebA/Creb3-like transcription factors are major and direct regulators of secretory capacity. Journal of Cell Biology. 191, 479-492 (2010).
- Abrams, E. W., Andrew, D. J. CrebA regulates secretory activity in the Drosophila salivary gland and epidermis. Development. 132, 2743-2758 (2005).
- Wells, M. B., Andrew, D. J. Anopheles salivary gland architecture shapes plasmodium sporozoite availability for transmission. mBio. 10 (4), 01238 (2019).
- Pei-Wen, L., Xiao-Cong, L., Jin-Bao, G., Yan, L., Xiao-Guang, C. Molecular cloning, characterization and expression analysis of sex determiantion gene doublesex from Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae). Acta Entomologica Sinica. 58 (2), 122-131 (2015).
- Scali, C., Catteruccia, F., Li, Q., Crisanti, A. Identification of sex-specific transcripts of the Anopheles gambiae doublesex gene. The Journal of Experimental Biology. 208, 3701-3709 (2005).
- Price, D. C., Egizi, A., Fonseca, D. M. Characterization of the doublesex gene within the Culex pipiens complex suggests regulatory plasticity at the base of the mosquito sex determination cascade. BMC Evolutionary Biology. 15, 1-13 (2015).
- Mysore, K., et al. siRNA-mediated silencing of doublesex during female development of the dengue vector mosquito Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9, 1-21 (2015).
- Boisson, B., et al. Gene silencing in mosquito salivary glands by RNAi. FEBS Letters. 580, 1988-1992 (2006).
- Horn, T., Boutros, M. E-RNAi: a web application for the multi-species design of RNAi reagents-2010 update. Nucleic Acids Research. 38, 332-339 (2010).
- Taracena, M. L., et al. Genetically modifying the insect gut microbiota to control chagas disease vectors through systemic RNAi. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9, (2015).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
- Ullmann, A., Jacob, F., Monod, J. Characterization by in vitro complementation of a peptide corresponding to an operator-proximal segment of the β-galactosidase structural gene of Escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 24, 339-343 (1967).
- Timmons, L. Bacteria-mediated RNAi-General outline. Carnegie Institution of Washington. , (2000).
- Pfaffl, M. W. Relative quantification. Real-time PCR. , 63-82 (2004).
- Neira-Oviedo, M., et al. The RNA-Seq approach to studying the expression of mosquito mitochondrial genes. Insect Molecular Biology. 20, 141-152 (2011).
- Baker, D. A., et al. A comprehensive gene expression atlas of sex- and tissue-specificity in the malaria vector, Anopheles gambiae. BMC Genomics. 12, (2011).
- Loganathan, R., Hoon, J., Wells, M. B., Andrew, D. J. Secrets of secretion - How studies of the Drosophila salivary gland have informed our understanding of the cellular networks underlying secretory organ form and function. Cellular Networks in Development. , Elsevier Inc. 143 (2021).
- Chung, S., Hanlon, C. D., Andrew, D. J. Building and specializing epithelial tubular organs: The Drosophila salivary gland as a model system for revealing how epithelial organs are specified, form and specialize. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 3, 281-300 (2014).
- Yoshida, S., et al. Inhibition of collagen-induced platelet aggregation by anopheline antiplatelet protein, a saliva protein from a malaria vector mosquito. Blood. 111, 2007-2014 (2008).
- Wells, M. B., Villamor, J., Andrew, D. J. Salivary gland maturation and duct formation in the African malaria mosquito Anopheles gambiae. Scientific Reports. 7 (1), 601 (2017).
- Takahashi, S., et al. Rab11 regulates exocytosis of recycling vesicles at the plasma membrane. Journal of Cell Science. 125, 4049-4057 (2012).
- Catteruccia, F., Levashina, E. A. RNAi in the malaria vector, Anopheles gambiae. Methods in Molecular Biology. 555, 63-75 (2009).
- Balakrishna Pillai, A., et al. RNA interference in mosquito: understanding immune responses, double-stranded RNA delivery systems and potential applications in vector control. Insect Molecular Biology. 26, 127-139 (2017).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30, 313-321 (2003).
- Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
- Carrasco, D., et al. Behavioural adaptations of mosquito vectors to insecticide control. Current Opinion in Insect Science. 34, 48-54 (2019).
- Magalhaes, T., et al. Induction of RNA interference to block Zika virus replication and transmission in the mosquito Aedes aegypti. Insect Biochemistry and Molecular Biology. , 111 (2019).
