Summary
세균에 의해 생산된 dsRNA의 경구 투여는, 예쁜꼬 마선충에서 일상적으로 사용되는 RNA 간섭(RNAi)에 대한 전달 방법으로서, 성인 모기에 성공적으로 적용되었다. 우리의 방법은 주사를 사용하지 않고도 강력한 역 유전학 연구 및 전송 차단 벡터 연구를 가능하게합니다.
Abstract
RNA 간섭은 이십 년 동안 역유전자 분석에 많이 활용된 도구였다. 성인 모기에서 이중 가닥 RNA (dsRNA) 투여는 주로 주사 를 통해 달성되었으며, 이는 상당한 시간이 필요하며 현장 적용에 적합하지 않습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 여기서 우리는 성인 아노페레스 감비아에 dsRNA의 경구 전달에 의한 RNAi의 강력한 활성화를 위한 보다 효율적인 방법을 제시한다. 긴 dsRNAs는 에스케리치아 콜라이 균주 HT115 (DE3)에서 생산되었고, 10% 수크로오스에서 열-사멸된 dsRNA 함유 박테리아의 농축된 현탁액을 성인 모기에 대한 면화 공 ad-libitum 에 제공하였다. 코튼 볼은 치료 기간 동안 2일마다 교체되었다. 이 방법을 사용하여 이중 성(성분화에 관여하는 유전자) 또는 포크 헤드 (타액선 전사 인자를 인코딩함)를 표적으로 삼아 정량적 Real-Time PCR(qRT-PCR) 또는 형광 공초점 현미경으로 각각 측정한 결과 표적 유전자 발현 및/또는 단백질 면역형광 신호가 감소하였다. 타액선 형태학의 결함도 관찰되었다. dsRNA 전달의 매우 유연하고, 사용자 친화적이고, 저비용이며, 시간-효율적인 이 방법은 곤충 벡터 생리학 및 그 이상에 중요한 표적 유전자에 광범위하게 적용될 수 있다.
Introduction
많은 질병이 모기에 의해 전염되어 모기 생리학 및 유전학에 대한 연구가 중요한 사업이됩니다. 이 유기체에서 RNAi의 사용은 지난 20 년 동안 두드러졌으며 많은 모기 유전자 1,2,3,4,5의 기능적 특성화를 허용했습니다. dsRNA 전달을 위해 가장 일반적으로 사용되는 기술은 미세 주입으로, 모기를 손상시킬 수 있고 상당한 시간과 노력이 필요하다는 단점이 있습니다. RNAi에 대한 경구 전달 방법은 주로 모기 6,7,8,9의 애벌레 단계에서 테스트되었습니다. 성인 모기에서 dsRNA의 경구 전달은 완전히 탐구되지 않았으며 벡터 생물학 및 벡터 조절 연구에 유용한 도구가 될 수 있습니다.
말라리아는 감염된 여성 모기가 감염되지 않은 숙주로부터 혈액 식사를 취하고 말라리아 기생충을 포함하는 타액을 주입 할 때 Anopheles 모기에 의해 전염됩니다10. 궁극적으로 모기의 타액에 전염되기 위해서는 기생충이 모기 면역 체계를 회피하고, 중간 장벽을 통과하고, 타액선의 침입을 포함하여 많은 장애물을 극복해야합니다11. 모기 타액선 (SG) 건축은 기생충 침입의 핵심이며 건축은 주요 타액선 표현 전사 인자뿐만 아니라 성적 이형성의 결정 요인에 의해 제어됩니다. 여러 고도로 보존된 전사 인자는 타액선의 세포 사양 및 항상성 유지와 혈액 공급에서 기능하는 타액 단백질의 생산 및 분비를 위해 요구된다12,13,14. 포크 헤드 (Fkh)는 곤충 SG 구조 및 기능의 주요 조절자 (초파리와 누에 나방의 연구 기반)15,16,17,18,19,20의 주요 조절자 역할을하는 날개 달린 나선 전사 인자입니다. 초파리 SGs에서, Fkh는 SG 생존 및 타액 생산을 촉진하기 위해 SG 특이적 염기성 나선 루프 나선 (bHLH) 전사 인자 인 세이지와 함께 기능합니다19. 초파리에서 타액 생산의 중요하고 긍정적 인 공동 조절자는 분비 경로 유전자21,22,23의 발현을 상향 조절하는 잘 연구 된 류신 지퍼 전사 인자 인 CrebA입니다. 또한 여성 타액선에는 강력한 수준의 형태 학적 분화가 있으며, 이는 혈액 공급뿐만 아니라이 조직을 침범하는 기생충의 능력(24)에서도 중요한 역할을 할 가능성이 큽니다.
타액선 생존, 구조, 생리학 및 성적 이형성을 결정하는 데 관여하는 많은 유전자는 복잡한 시공간 발현 프로필 25,26,27을 가지며, RNAi를 유도하는 dsRNA의 전통적인 전달 방법이 이러한 종류의 유전자를 표적화하는 데 항상 효율적이지는 않다. 그러나, 애벌레 단계 Aedes aegypti 및 An. gambiae 모기에서의 dsRNA의 경구 전달은 dsx 유전자 9,28의 암컷 특이적 형태를 침묵시키기 위해 성공적으로 사용되어 왔다. 모기 타액선에서 dsRNA를 사용한 이전의 연구는 다량의 dsRNA가 필요했지만 침묵 효과가 비교적 오래 지속된다는 것을 발견했습니다 (적어도 13 일)29. 여기서, 성인 암컷 모기에서 이들 유전자의 RNAi 침묵을 유도하는 dsx, fkh, 또는 CrebA에 대한 서열 특이적 dsRNA를 발현하는 열사멸된 대장균 균주 HT115(DE3)의 능력을 시험하였다. dsRNA의 경구 투여는 An. gambiae에서 유전자 녹다운을 유도하였고, mRNA 수준의 명확한 감소와 이들 유전자의 기능 상실과 일치하는 표현형을 가졌다. 따라서이 접근법은 다양한 타액선 유전자의 기능을 무너 뜨리는 데 효과적 일 것입니다.
Protocol
1. dsRNA를 대장균 발현벡터에 클로닝
- dsRNA의 발현을 위해 적절한 벡터에 삽입할 표적 유전자 서열을 선택한다. 다음 방법을 사용하여 Vectorbase.org 에서 표현식 값을 검색합니다.
- 홈페이지 검색 박스에서 관심있는 유전자(예를 들어, 표 1)를 검색한다.
- 결과 유전자 페이지에서 8로 이동합니다 . 전사체 섹션.
- 열거된 관련 RNA-seq 및 마이크로어레이 유전자 발현 실험을 찾아본다.
- 관심 있는 값을 스프레드시트 소프트웨어로 전송하고 데이터 테이블을 만듭니다.
- 사용될 하나 이상의 T7 프로모터를 갖는 상업적으로 이용가능한 플라스미드를 선택하십시오. 선택된 플라스미드가 단지 하나의 T7 프로모터를 갖는 경우(대부분의 상용 플라스미드가 그러하듯이), 관심 유전자에 대한 dsDNA의 증폭에 사용되는 역방향 프라이머에 두 번째 T7 프로모터를 포함한다.
참고: 표적 유전자에 대한 dsRNA 서열은 RNAi 시약(30)의 설계를 위해 웹 애플리케이션 E-RNAi를 사용하여 선택될 수 있다. 긴 dsRNA (약 400 bp) 또는 짧은 헤어핀 dsRNA (shRNA)는 특정 유전자 서열을 기반으로 설계 될 수 있습니다. 이들 서열은 클로닝 전에 동일성 확인을 위해 증폭되고 서열화되어야 한다. 본 연구에 사용된 선택된 유전자 영역, 플라스미드 및 프로모터는 보충 파일 1에 열거되어 있다. - 앞서설명한 9,31단계의 간단한 한 단계 절차에 따라 복제를 수행합니다. 이를 위해, PCR 산물을 정제하고 선형화된 플라스미드 DNA를 리게이트한다. 적격 대장균 세포(32)의 열충격 형질전환을 위해 라이게이션의 생성물을 사용한다. 파란색/흰색 스크리닝을 통해 변환된 세포를 선택합니다. T7-프라이머 PCR을 이용하여 삽입물의 배향을 확인하고 M13 프라이머를 이용하여 서열을 확인하였다.
참고: 형질전환을 위해 선택된 플라스미드가 β-갈락토시다제를 암호화하는 lacZ 유전자를 운반할 때 화이트/블루 스크리닝을 사용할 수 있습니다. 백색 콜로니는 lacZ 내에 원하는 삽입물을 함유해야 하며, 표적 서열(33)의 존재 및 배향을 추가로 확인하기 위해 선택될 수 있다. - 첫 번째 형질전환으로부터 플라스미드를 정제하고,앞서 기술된 바와 같이 적격 대장균 HT115 (DE3)를 형질전환시키는데 이를 사용한다. 삽입물을 가진 플라스미드가 적격 대장균 HT115 (DE3)에 존재한다는 것을 확인한 후, 일회용 박테리아의 글리세롤 스톡을 만드십시오.
참고: 적절한 비관련 대조군 dsRNA는 모든 실험에서 사용할 수 있도록 획득되거나 준비되어야 한다. 이 경우, 애기장대로부터의 관련없는 유전자 aintegumenta (ant)에 대한 서열이 사용된다.
2. dsRNA를 발현하는 열사멸균의 제조
- 100 μg/mL의 암피실린과 12.5 μg/mL의 테트라사이클린을 함유하는 루리아 브로스(LB)의 50 mL에 플라스미드를 발현하는 dsRNA를 함유하는 대장균 균주 HT115(DE3)의 단일 박테리아 콜로니로부터 배양물을 37°C에서 12시간 동안 플랫폼 진탕기(180 rpm)에서 성장시킨다.
- 박테리아 배양물(1:1000)을 암피실린 100μg/mL와 테트라사이클린 12.5μg/mL를 포함하는 2x 효모 트립톤(2x YT) 배지에 희석합니다.
- 40 μM (최종 농도) 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG)를 첨가하여 dsRNA 생산을 유도하였다.
- 세포가 O.D.600 = 0.4 에 도달하면, 대략 180 rpm에서 교반하면서 37°C에서 2시간 유도한 후, Taracena et al. 9에 의해 기술된 바와 같이 열-사멸된 박테리아의 농축된 현탁액을 제조하였다. 세포를 원심분리 (4000 x g, 4°C, 10분)에 의해 펠릿화하고 , 세포를 1 부피의 인산나트륨 완충액 (PBS)으로 세척한다.
- 동일한 조건 하에서 다시 스핀하고, PBS에서 초기 부피의 1/100으로 재현탁하고, 70°C에서 1시간 동안 배치한다.
- 열 사멸된 박테리아의 분취량 400 μL를 만들고, 추가로 사용할 때까지 이 분취량을 -20°C에 보관한다(일주일 이상 보관하지 않음). 열-사멸된 박테리아의 이러한 현탁액은 RNAi 실험을 위한 특이적 dsRNA를 함유한다. 각 실험에서 사용되는 표적 유전자 dsRNA-박테리아 및 관련되지 않은 dsRNA-대조군에 대해 모두 이 절차를 수행한다.
3. dsRNA를 발현하는 열사멸 박테리아로 모기에게 먹이기
- dsRNA (HT115 (DE3) 박테리아 현탁액)의 1 분취량을 해동하고 0.2% 메틸 파라벤을 함유하는 12% 당 용액 1.6 mL와 혼합한다.
- 이 용액에 작은 면봉을 담그고 흠뻑 젖은 면봉을 5 일 된 모기가 들어있는 케이지 안에 넣으십시오. 모기가이 용액을 먹고 설탕과 dsRNA 함유 박테리아를 동시에 집어 들도록하십시오.
- dsRNA-설탕 용액에 담근 코튼 볼을 격일로 8일 연속으로 바꿉니다.
- 모기 케이지를 일정한 조건, 즉 27 ° C 및 80 % 상대 습도에서 12 h : 12 h 빛의 광주기로 유지하십시오 : 어두운 광주기, 새벽 30 분과 황혼 기간 30 분으로 구분하십시오.
4. 분석 대상 유전자 발현 수준
- 용기를 얼음 위에 잠시 두거나 모기가 움직이지 않을 때까지 모기를 냉간 마취하십시오. 모기가 마취되면 차가운 표면에 올려 놓고 암컷을 분리하여 해부하십시오.
- 모기에 70 % 에탄올을 뿌리고 PBS로 유리 표면에 놓습니다. 한 쌍의 포셉으로 모기 머리를 단단히 고정시키고 흉부를 매우 천천히 당겨 타액선이 PBS로 방출되도록하십시오.
- 타액선을 얼음처럼 차가운 PBS에 보관하여 10 명이 해부될 때까지 보관하십시오. 구아니디늄 티오시아네이트-페놀-클로로포름 방법을 이용한 RNA 추출을 위한 SGs를 풀텐. RNA 펠렛을 30 μL의 RNase-free 물에 현탁시킨다.
- 이전 단계에서 SG로부터 추출된 RNA의 1 μL 분취량을 사용하여, 260 및 280 nm에서 흡광도를 판독하고, 희석 인자와 곱하여 각 샘플의 RNA 농도를 계산한다. ~2.0의 260/280 비율은 좋은 품질의 RNA를 나타냅니다.
- 정제된 RNA 1 μg을 사용하여 상용 역전사 키트를 사용하여 상보성 DNA(cDNA)를 합성한다.
- cDNA를 1:10 희석하여 제조자의 권고에 따라 RT-PCR 반응을 준비한다. 각 샘플에 대해, 표적 유전자에 대한 반응을 준비하고, 병행하여, 하우스키핑(HK) 유전자와의 반응을 설정한다. 각 유전자 반응을 기술적 인 삼중으로 설정하여 방법에서 무작위 변이의 영향을 제거하십시오.
참고: 여기서, An. gambiae 리보솜 S7 유전자(GeneBank: L20837.1) 및 액틴(VectorBase: AGAP000651)이 HK 유전자로 사용되었다. - 모든 프라이머를 SYBR-녹색 제조업체의 적응증에 따라 300 nM의 최종 농도로 사용하십시오. 표준 PCR 조건으로 증폭: 95°C에서 10분 동안, 이어서 95°C에서 15초, 60°C에서 60초의 40 사이클을 가하였다.
참고: 유전자 발현을 정량화하기 위해, 델타-델타-Ct 방법(ΔΔCt)이 사용된다. 델타 Ct(ΔCt)는 표적 유전자의 Ct와 하우스키핑 유전자의 Ct의 차이이다. ΔΔCt는 실험군의 ΔCt와 대조군35의 ΔCt의 차이이다.
5. 표현형 평가 : 성공적인 혈액 공급
- 혈액 공급 능력을 평가하기 위해 작은 케이지 (직경 12cm)에서 표적 및 대조군 dsRNA로 처리 된 15 마리의 암컷 모기 그룹을 설정하고 4 시간 동안 굶어 죽입니다.
- 37 °C로 설정된 순환 수조, 유리 모기 피더 (직경 24 mm) 및 파라 필름 막을 사용하여 모기에 탈피 된 양 피를 제공합니다.
참고: 혈액은 미국 출신의 건강한 기증자 동물로부터 무균적으로 채취하여 항응고제나 첨가제 없이 수동으로 탈피시키는 상업 공급업체로부터 혈액을 채취할 수 있습니다. - 직접 관찰을 통해 처음 다섯 명의 여성으로부터 혈액 식사를 성공적으로 획득하여 각 그룹에 완전히 참여하려는 조사 시도 횟수를 계산하고 기록하십시오.
참고 : 모기의 중요한 신진 대사 변화를 피하기 위해 혈액 추구 행동에 영향을 미치는 에너지 자원을 방해 할 수 있으므로 기아를 최소 (4 시간)로 유지했습니다. 결과적으로, 모든 모기가 피를 흘리는 식사를 열렬히 찾는 것은 아니며, 우리는 인간의 냄새에 대한 노출, 챔버와 먹이 표면 사이의 온도 변화 등과 같은 시간 변수의 영향을 줄이기 위해 약혼 한 여성의 수를 다섯 명 (각 그룹의 총 수의 삼분의 일)으로 제한했습니다.
6. 표현형 평가: 타액선 형태학 및 관련 단백질의 하향 조절
- 단계 4.2에 기재된 바와 같이 신선한 조직을 1x 포스페이트 완충 식염수(PBS)로 분리하고, 90초 동안 빙냉 아세톤에 고정시킨다. 아세톤을 제거한 후 1x PBS로 여러 번 헹구었다. 1x PBS로 희석된 항혈청 ( 물질의 표 참조)과 함께 4°C에서 밤새 일차 항체와 함께 인큐베이션한다.
참고: 타액 단백질에 사용되는 일차 항체의 동정을 위한 물질의 표 참조(Anopheles 항-혈소판 단백질, AAPP; 뮤신 2, MUC2), SG 전사 인자 (포크 헤드, fkh; 현자, 현자; 시클릭-AMP 반응 요소-결합 단백질 A, CrebA), 및 분비 소포(Rab11)의 마커를 포함한다. 이들 항체는 SG 형태 및 기능에 대한 판독값으로 사용된다. 그러나, 면역형광에 적합한 임의의 항체는 이러한 프로토콜에 적합해야 한다. - 1x PBS로 여러 번 세척한다. 1x PBS에 희석된 이차 항체(형광등)를 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 암흑에서 인큐베이션한다. 임의의 카운터 염색[예: 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI; DNA), 밀 배아 아글루티닌 (WGA; 키틴의 경우), 팔로이드 (F-액틴의 경우) 및 / 또는 나일 레드 (지질의 경우)] 2 시간 배양이 끝나기 30 분 전에.
- 1x PBS로 세 번 세척한다. 이어서, 조직을 1 mm 두께의 커버슬립이 있는 표준 현미경 슬라이드 상에 100% 글리세롤에 장착하고, 형광 공초점 현미경을 이용하여 이미징될 때까지 -20°C에서 보관하였다.
참고: 정량적 데이터를 얻으려면 이미징 설정을 일정하게 유지해야 합니다. 여기서, 조직의 전체 3D 부피를 통한 최대 강도 프로젝션 이미지만이 포함되었고, 모든 이미지 정량화는 슬라이드에 존재하는 비 SG 조직 잔재물(지방체, 큐티클 또는 머리)에서의 DAPI 신호에 기초하여 치료 사이(실험 내)로 정규화되었다.
Representative Results
시작하기 위해, VectorBase로부터의 마이크로어레이 발현 데이터는 현재 연구와 관련된 모든 유전자의 발현 상태를 결정하기 위해 발달 단계 36,37에 걸친 잠재적 표적을 스캔하는데 사용되었다(표 1). 예상대로, 우리가 선택한 모든 표적 유전자는 성인 SGs에서 발현을 보였다. aapp과 현자의 수준은 특히 높았다 (표 1). 또한 주목할 점은 성인 여성 SGs9에서 f-Agdxx의 높은 발현 수준이었다.
각 유전자로부터의 특정 세그먼트는 RNAi 시약30의 설계를 위해 웹 애플리케이션 E-RNAi를 사용하여 dsRNA로서 사용하기 위해 평가되었다. 각 표적 유전자에 고유한 서열을 함유하는 ∼400 bp 영역을 클로닝한 후(도 1A), 적절한 박테리아 균주로 형질전환하고, dsRNA 생성을 유도한 열 사멸 박테리아의 현탁액을 제조하는데 사용하였다. 성인 모기를 f-Agdsx, fkh, 또는 개미 (관련없는 음성 대조군)에 대한 dsRNA의 박테리아 현탁액을 함유하는 수크로오스 담근 면화 공에 8일 동안 공급하였다.
암컷 모기의 RNAi 먹이의 분석을 위해, 먼저 f-Agdsx 또는 fkh dsRNA-먹이가 유전자 침묵을 유도하는지 여부를 결정하였다. fkh-dsRNA를 공급한 군에서 fkh 전사체 수준의 98.8% 감소(±2.1)가 관찰되었는데(도 1B), 이는 dsRNA가 SGs에서 fkh 전사체의 풍부도를 매우 효과적으로 감소시켰음을 나타낸다. 놀랍게도, fkh mRNA 수준은 f-Agdsx에 대한 dsRNA로 처리된 모기에서 82.0%(±18.9) 감소하였고, 이는 f-Agdsx 감소의 89.86%(±4.48)를 가졌고, fkh가 타액선에서 F-Dsx의 표적이 될 수 있음을 시사합니다. fkh 발현 수준의 현저한 감소와 함께, fkh-knockdown 모기는 혈액 공급에 필요한 프로빙 시도의 수에서 상당한 증가를 나타냈다. 이들 모기는 평균적으로 대조군 또는 f-Agdsx dsRNA가 모기에 공급된 모기보다 혈액에 완전히 얽히게 하는 먹이 시도를 나타내었다(도 1C). 이로 인해 fkh 녹다운 RNAi 치료가 주요 전사 조절제 (SG TFs Sage 및 CrebA) (그림 2), 분비 단백질 (AAPP 및 뮤신) (그림 3) 및 분비 기계 [나일 레드 (지질) 및 Rab11 (분비 소포)]의 국소화 및 / 또는 분포의 변화를 유발했는지 여부를 묻습니다 (그림 4). 중요하게도, 염색 강도의 실질적인 차이가 상이한 로브 영역, 로브 및 개별 SGs에 걸쳐 관찰되었다.
예측된 바와 같이, 세이지 및 CrebA 염색의 수준은 개미 대조군 RNAi와 비교하여 fkh RNAi (도 2B) 다음에 모든 SG 로브에서 현저하게 감소하였다 (도 2A). 라인 스캔 프로파일에서 가장 높은 최대 강도 값(빨간색 파선 및 숫자 레이블)과 가장 낮은 최대 강도 값(파란색 파선 및 숫자 레이블)의 감소는 조직 내의 신호 및 낮은 신호 영역의 감소를 암시했습니다(그림 2A,B). 이러한 데이터는 An. gambiae fkh RNAi가 효과적 이며 fkh가 Drosophila SGs 19,38,39에서의 유전 적 관계와 유사하게 An. gambiae에서 SG TFs Sage 및 CrebA의 생산 및 / 또는 안정성을 조절한다는 것을 시사합니다.
고도로 풍부한 타액 성분 단백질을 고려할 때, 아노펠레 항혈소판 단백질(AAPP)40,41의 수준은 대조군 RNAi 처리와 비교하여 fkh RNAi 이후 3개의 SG 엽 모두에서 감소하였다(도 3A, B; 녹색). 반면, Mucin 수준의 변화는 관찰되지 않았다 (도 3A,B; 보라색). 이들 데이터는 Fkh가 상이한 타액 단백질 유전자의 발현에 다르게 기여한다는 것을 시사한다.
마지막으로, 분비의 두 마커가 관찰되었다 (도 4A,B): Rab11 (정점 재활용 엔도솜과 관련된 소포)42 및 나일 레드 (지질). 감소된 Rab11 형광은 fkh RNAi 처리 후 원위 측방(DL) 엽에서 관찰되었다(도 4A v 대 4B v; 녹색). 그러나, 내측(M) 및 근위 측방(PL) 로브에서 증가된 Rab11 신호(도 4A vii, ix vs. 4B vii, ix; 녹색)도 또한 발생하였다. 대조군 RNAi 처리와 비교하여 fkh RNAi 후 나일 레드 신호(도 4A,B; 보라색)에서는 뚜렷한 차이가 관찰되지 않았다. 이러한 데이터는 fkh 감소가 SG 로브 간에 다른 복잡한 방식으로 일부 분비 기계 작용을 변경할 수 있음을 시사합니다.
| 데이터 세트: | 골트세프 | 나이라 오비에도 | 나이라 오비에도 | 빵 굽는 사람 | 빵 굽는 사람 | 빵 굽는 사람 | 빵 굽는 사람 | ||
| 유전자 기호 | 기능 | AGAP ID | 배아 (25 시간) | L3 애벌레 | L3 SG | 성인 여성 본체 (3일) |
성인 남성 본체 (3일) |
성인 여성 SG (3일) |
성인 남성 SG (3일) |
| 증권 시세 표시기 | 타액 단백질 | AGAP009974 | 3.92 | 4.38 | 4.33 | 3.81 | 2.46 | 11.92 | 2.69 |
| 크레바 | txn 계수 | AGAP001464 | 6.28 | 5.22 | 5.92 | 2.99 | 2.96 | 3.27 | 3.13 |
| " | txn 계수 | AGAP011038 | 4.50 | 4.46 | 5.23 | 2.96 | 2.86 | 3.05 | 2.88 |
| 증권 시세 표시기 | txn 계수 | AGAP004050 | 4.91 | 5.39 | 5.55 | 3.72 | 4.00 | 4.57 | 4.01 |
| 증권 시세 표시기 | txn 계수 | AGAP001671 | 5.18 | 4.67 | 5.25 | 2.99 | 3.09 | 3.21 | 3.05 |
| MUC2 | 타액 단백질 | AGAP012020 | 4.59 | 5.53 | 5.63 | 2.96 | 3.07 | 3.08 | 3.26 |
| 랍11 | 수포 인신 매매 | AGAP004559 | 10.21 | 7.47 | 8.60 | 4.90 | 3.79 | 3.38 | 2.96 |
| 현자 | txn 계수 | AGAP013335 | 5.32 | 5.96 | 8.89 | 3.40 | 3.33 | 7.37 | 7.23 |
표 1: An에 대한 평균 log2 마이크로어레이 발현 프로필. 감비아에 관심있는 유전자. 나타낸 것은 유전자 이름, 기능적 카테고리, 벡터베이스(AGAP) 식별자, 및 벡터베이스로부터 수집된 평균 log2 마이크로어레이 발현 데이터이다. 이 데이터는 관심있는 유전자 (타액선 (SG) 세포 생물학 및 분비에 관여)가 전체 개체와 비교하여 애벌레 3 단계 (L3) 및 성인 SG에서 발현되고 풍부하다는 것을 나타냅니다.
도 1: 성인 An. 감비아에서 f-Agdsx 및 fkh 녹다운은 SGs에서 fkh mRNA 수준을 감소시키고 혈액 공급에 대한 여성의 능력에 영향을 미친다. (a) 이 방법론에서 dsRNA 생산에 활용된 플라스미드 설계의 대표적인 이미지. 두 번째 T7 프로모터 서열은 pGEMT 플라스미드 내로 클로닝될 삽입물을 증폭하는데 사용되는 3' 프라이머에 이를 포함시킴으로써 플라스미드에 첨가된다. 플라스미드는 이어서 대장균 HT115 (DE3) 박테리아로 형질전환되고, 먹이 용액은 10% 당 물에서 유도된 열 사멸 박테리아의 현탁액으로 제조된다. (b) f-Agdsx 또는 fkh에 대한 dsRNA 공급 용액을 공급받은 동물은 fkh 전사체의 상당히 낮은 수준을 보였다 (다중 비교를 갖는 편도 ANOVA; n = 15). 그러나, fkh dsRNA (C)를 먹인 그룹만이 혈액 식사를 획득하는데 필요한 물기 시도의 수에서 유의한 차이를 보였다. 이 그룹의 모기는 대조군 또는 dsx-dsRNA 공급 그룹에 의해 필요한 것보다 성공적인 혈액 식사를 얻기 위해 평균 5 배의 조사 시도 횟수가 필요했습니다 (다중 비교가있는 단방향 ANOVA; n = 15). 오차 막대는 평균의 표준 오차(SEM)를 나타냅니다. 각각의 실험은 세 개의 분리된 생물학적 반복실험으로 진행되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 성인 An. 감비아 타액선에서의 fkh 녹다운은 SG 전사 인자 수준을 감소시킨다. 도 13일째 성인 여성 안감비아 SGs를 경구 노출시킨 후 8일째(5-13일째) (A) 관련 없는 dsRNA 대조군(ant) 또는 (B) SG TF 포크헤드(fkh, AGAP001671)를 표적으로 하는 dsRNA 중 어느 하나에 경구 노출시킨 후 10% 수크로오스에서 DAPI 염료로 염색된 DAPI(DNA; 적색), 표지된 밀배아 아글루티닌(WGA, 키틴/O-GlcNAcylation; 파란색), SG TFs 세이지 (녹색) 및 CrebA (보라색)에 대한 항혈청. 표시된 스케일 바 길이는 미크론입니다. SG(i)는 흰색 대시로 윤곽선이 그려져 있습니다. 확대된 로브 이미지의 노란색 선(노란색 상자로 둘러싸이고 "inset"으로 레이블이 지정된 영역)은 신호 강도의 라인 스캔이 수행된 위치를 나타냅니다. 각 확대 된 로브에 대한 라인 스캔에 해당하는 녹색 및 자주색 채널 강도는 이미지 아래의 그래프에 (SG에서 항상 왼쪽에서 오른쪽으로) 플롯됩니다. X축 = 거리(픽셀 단위)이고 Y축 = 회색 단위(픽셀 강도). 픽셀 강도의 동적 범위는 빨간색(최대)과 파란색(최소) 점선으로 구분되며 해당 값이 각 그래프에 표시됩니다. MIP = 전체 SG 깊이를 통한 최대 강도 3D 프로젝션. DL: 원위 측엽; M: 내측엽; PL: 근위 측엽; SD: 타액관. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 성인 An. 감비아 타액선에서의 fkh 녹다운은 SG 분비 단백질 수준을 감소시킨다. 도 13일째 성인 여성 안감비아 SGs를 경구 노출시킨 후 8일째(5-13일째) (A) 비관련 dsRNA 대조군(ant) 또는 (B) SG TF 포크헤드(fkh, AGAP001671)를 표적으로 하는 dsRNA를 10% 수크로오스 염료로 염색한 DAPI(DNA; 적색), 표지된 밀배아 아글루티닌(WGA, 키틴/O-GlcNAcylation; 파란색), 타액 단백질 AAPP (녹색)와 뮤신 (MUC2, 보라색)을 포함한다. 표시된 스케일 바 길이는 미크론입니다. SG(i)는 흰색 대시로 윤곽선이 그려져 있습니다. 확대된 로브 이미지(노란색 상자로 둘러싸인 영역)의 노란색 선은 신호 강도의 라인 스캔이 수행된 위치를 나타냅니다. 각 로브에 대한 라인 스캔에 해당하는 녹색 및 보라색 채널 강도는 이미지 아래의 그래프에 (SG에서 항상 왼쪽에서 오른쪽으로) 플로팅됩니다. X축 = 거리(픽셀 단위)이고 Y축 = 회색 단위(픽셀 강도). 픽셀 강도의 동적 범위는 빨간색(최대) 및 파란색(최소) 파선으로 구분되며 해당 값이 각 그래프에 표시됩니다. MIP = 전체 SG 깊이를 통한 최대 강도 3D 프로젝션. DL: 원위 측엽; M: 내측엽; PL: 근위 측엽; SD: 타액관. 기울임꼴 "DL" 라벨(Bi)은 동일한 DL 엽의 두 가시적 영역을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 성인 An. 감비아 타액선에서 fkh 녹다운은 SG 분비 마커를 감소시킨다. 도 13일째 성인 여성 An. gambiae SGs를 경구 노출시킨 후 8일(5-13일째) (A) 비관련 dsRNA 대조군(ant) 또는 (B) SG TF 포크헤드(fkh, AGAP001671)를 표적으로 하는 dsRNA 중 어느 하나에 경구 노출시킨 후 10% 수크로오스 염료 DAPI(DNA; 적색), 표지된 밀배아 아글루티닌(WGA, 키틴/O-GlcNAcylation; 파란색), 나일 레드 (지질; 보라색) 및 재활용 엔도솜 소포 마커 Rab11 (녹색)에 대한 항혈청. 표시된 스케일 바 길이는 미크론입니다. SG(i)는 흰색 대시로 윤곽선이 그려져 있습니다. 확대된 로브 이미지(노란색 상자로 둘러싸인 영역)의 노란색 선은 신호 강도의 라인 스캔이 수행된 위치를 나타냅니다. 각 로브에 대한 라인 스캔에 해당하는 녹색 및 보라색 채널 강도는 이미지 아래의 그래프에 플롯됩니다 (SG에서 항상 왼쪽에서 오른쪽으로). X축 = 거리(픽셀 단위)이고 Y축 = 회색 단위(픽셀 강도). 픽셀 강도의 동적 범위는 빨간색(최대) 및 파란색(최소) 파선으로 구분되며 해당 값이 각 그래프에 표시됩니다. MIP = 전체 SG 깊이를 통한 최대 강도 3D 프로젝션. DL: 원위 측엽; M: 내측엽; PL: 근위 측엽; SD: 타액관. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
경구 공급을 통해 An. gambiae 모기에 dsRNA를 효과적으로 전달하는 능력은 실험실과 현장 모두에서 벡터 생물학 연구에 광범위한 영향을 미칩니다. 미세주사는 모기(43,44)에서 화학물질, 항체, RNAi 및 유전자 변형 전략의 바람직한 전달 방식으로 오랫동안 받아들여져 왔다. 실질적인 물리적 조작, 세포 손상 및 스트레스의 결과는 경구 전달의 사용으로 피할 수 있으며, 이는 또한 대규모 또는 현장 적용에 잠재적으로 적합 할 수 있습니다. 이전의 연구는 RNAi가 개별 성인 모기(29) 내에서 유비쿼터스하게 작용하여 타액선을 포함한 모든 조직에 영향을 미친다고 제안했다. 오랜 기간 동안 비동기적으로 소화되는 많은 수의 dsRNA 발현 대장균을 모기에게 먹이면 케이지의 모든 개인에 걸쳐 RNAi에 일관되고 균일 한 노출을 잠재적으로 달성 할 수 있습니다. 이 방법은 많은 수의 모기를 먹이고 표적 유전자에 따라 결과 표현형의 잠재적 인 변동성을 분석 할 수있게합니다. 그러나, 한 가지 중요한 고려사항은 면섬유에서 박테리아 및 그에 따른 dsRNA의 이질적인 분포의 가능성이다. 모기 설탕 공급에 매일 사용되는 400 μL의 박테리아에는 앞서 9 번 기술하고 계산 한 바와 같이 약 ≤4.6 μg의 dsRNA가 포함되지만 각 모기가 섭취 한 dsRNA의 양은 개별적으로 결정되지 않았습니다. dsRNA 구축물을 구축하는 것이 일상화되면,이 간단한 처리 프로토콜은 모기 연구자에 의해이 기술을 신속하게 동화시킬 수 있습니다. 선험적으로, 치료 중 시간 지출 (하루 30 분)은 비슷한 샘플 크기에 미세 주입을 배우고 적용하는 데 걸리는 시간에 비해 사소합니다.
먹이는 dsRNA는 모델 유기체 예쁜꼬마선충 45에서 역유전학 연구에 일상적으로 사용된다. 이 무거운 사용 수준은 구강 전달 접근법의 가치를 강조합니다. C. elegans46,47에 존재하는 것과 유사한 변형 된 대장균에 An. gambiae 게놈 전체 라이브러리를 구축하면 모기에서 증가 된 규모로 신속한 역 유전자 스크리닝이 가능합니다. 그러나, 상기 방법의 효율은 전사체의 내인성 수준에 크게 의존하고, 발현이 표적 조직에 한정되지 않고4,8,44 보다 광범위하게 발현되는 경우에 의존한다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 또한, 일부 살충제가 모기48의 행동 회피를 유도 할 수 있다는 증거가 있으며, 잠재적으로 부작용을 유발하는 박테리아를 먹이면 유사한 회피 패턴이 유발 될 수 있습니다. 모기가 대체 식량 공급원이없는 실험실의 통제 된 환경에서 그들은 대장균으로 설탕 물을 피할 수있는 선택권이 없었으며 영양가있는 공급원의 필요성은 아마도 박테리아를 피하기위한 본능을 무시할 것입니다. 그러나 전략이 덜 통제 된 환경에서 사용하기위한 경우 고려해야합니다.
여러 유전자를 동시에 표적화하는 것이 가능할 수도 있지만(하나의 구축물, 다중 구축물 또는 형질전환된 박테리아 분리물의 혼합물 사용), 효과를 평가하기 위해서는 추가 연구가 필요하다. 이 점에 대한 또 다른 중요한 고려 사항은 단일 또는 다중 대상을 사용할 때 가능한 오프 타겟 또는 시너지 효과를 평가하는 것입니다. 적절한 대조군 유전자 및 그룹의 확립은 실험 설계의 중요한 부분이다. 또한, 이 접근법이 다른 병원체 또는 바이러스(49)를 표적으로 삼는데 사용될 수 있다고 추측하는 것이 유혹적이다. 모기에서 RNAi 유도를 향한 이전의 연구는 시약이 직접 주입 된 조건 하에서 수행되었으므로 대장균 이 존재하지 않았습니다. 대장균 은 시간에 따른 dsRNA의 느린 방출을 허용하는 보호 구획을 제공할 수 있고, 노출이 훨씬 더 긴 기간에 걸쳐 다소 연속적일 수 있도록 보장한다(29).
마지막으로, 이러한 결과는 이 기술의 효과가 노출의 기간(길이 및 시작일)과 사용된 대장균 의 양을 조정함으로써 조정가능하다는 것을 보여준다. 이 기능을 통해 우리는 시행 착오를 통해 최적의 녹다운 조건을 확인함으로써 필수 유전자 (dsx 및 fkh)의 기능을 연구 할 수있었습니다. 이것은 관심있는 표적 유전자가이 기술을 사용하여 조사 될 수있는 가능성을 크게 향상시킵니다.
요약하면, 성인 모기에 RNAi를 경구 전달하면 모기 유전자 기능을 연구하고 모기 매개 질병의 벡터 제어를위한 새롭고 가단성 도구를 만드는 간단하고 다재다능하며 강력한 접근 방식 일 수 있음을 발견했습니다.
Disclosures
저자들은 공개 할 이해 상충이 없다고보고합니다.
Acknowledgments
저자는 곤충학 지부 (Entomology Branch)와 CDC의 기생충 질병 및 말라리아 부서 (Division of Parasitic Diseases and Malaria)의 직원과 과학자, JHU에서의 박테리아 준비 및 / 또는이 작업에 대한 유용한 토론에 도움을 준 Brian Trigg와 Michelle Chiu에게 감사하고 싶습니다. 우리는 JHMRI 곤충과 관리자 인 Chris Kizito에게 An. gambiae 모기에 접근하고 양육 한 것에 대해 감사드립니다. 본 연구에 사용하기 위해 플라스미드 PJet GFP 및 pPB47 GFP를 수득하는 데 도움을 주신 Wei Huang (JHSPH)에게 감사드립니다. 이 작업에 대한 기금은 NIH R21AI153588 (DJA에게), 존스 홉킨스 말라리아 연구소 박사 후 펠로우십 (MW에); 그리고 굿벤처 재단과 CDC 재단에 대한 오픈 자선 프로젝트의 보조금으로 말라리아 연구를 돕기 위해 모기의 여성 발달 억제를 지원하고 동결 보존 및 억제를 지원한다는 제목의 보조금, Open Philanthropy Project, 2017. 우리는 JHU 현미경 시설 직원의 도움과 사용 된 현미경에 대한 적용 가능한 NIH 보조금 지원 (NIH 그랜트 번호 : S10OD016374)에 깊이 감사드립니다. 이 원고의 발견과 결론은 저자의 결론이며 반드시 CDC의 견해를 나타내는 것은 아닙니다. 상표명 사용은 신원 확인용일 뿐이며 질병 통제 예방 센터, 공중 보건 서비스 또는 미국 보건 복지부의 승인을 의미하지는 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 Kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | 10787018 | |
| 2x Yeast Extract Tryptone (2xYT) Medium | BD Difco | DF0440-17 | |
| AAPP | n/a | n/a | Antisera. 1:50 dilution (rabbit); gift from Fabrizio Lombardo |
| AccuStart II PCR Supermix | Quantabio | 95137-100 | |
| Agarose | Millipore Sigma | A9539 | |
| Ampicillin | Millipore Sigma | A5354 | |
| Anopheles gambiae G3 | BioDefense and Emerging Infections (BEI) Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4) | MRA-112 | |
| BugDorm | BioQuip | 1452 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | P022628181 | |
| CrebA | DSHB | CrebA Rbt-PC | Antisera. 1:50 dilution (rabbit); generated by the Andrew Lab |
| Damiens diet | BioServ | ||
| DAPI | Life Technologies | n/a | 4′,6-diamidino-2-phenylindole; 1:200 dilution. |
| Defibrinated sheep blood | HemoStat | DSB050 | |
| Escherichia coli HT115 (DE3) | |||
| Ethidium bromide | Millipore Sigma | E7637 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4368814 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Millipore Sigma | I5502 | |
| JM109 Competent cells | Promega | L2005 | |
| Luria Broth Media | Thermo Fisher Scientific | 10855001 | |
| Mucin 2 | Proteintech | Muc2; 27 675-1-AP | Antisera. 1:100 dilution (mouse). |
| Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | ||
| Nile Red | Sigma | n/a | Lipid dye; 1:50 dilution. |
| Owl EasyCast B2 Mini Gel Horizontal Electrophoresis | Thermo Fisher Scientific | Model B2 | |
| pGEMT easy | Promega | A3600 | |
| Power SYBR-green PCR master MIX | Applied Biosystems | 4367659 | |
| PureLink PCR purification kit | Thermo Fisher Scientific | K31001 | |
| QuantaStudio 6 | Applied Biosystems | ||
| QuantStudio6 Real Time PCR System | Applied Biosystems | ||
| Rab11 | n/a | n/a | Antisera. 1:100 dilution (rabbit); generated by the Andrew Lab |
| Rh-WGA | Vector Labs | n/a | Rhodamine-conjugated wheat germ agglutinin (chitin, O-GlcNAcylation dye); 1:40 dilution |
| Sage | n/a | n/a | Antisera. 1:50 dilution (rat); generated by the Andrew Lab |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 | |
| Tetracycline | Millipore Sigma | 87128 | |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Zeiss LSM700 fluorescence confocal microscope | Zeiss | ||
| ANTIBODIES | |||
| Chicken anti-Rat IgG (H+L), Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A21472 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A28181 | |
| IgG (H+L) Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A27034 | |
| Rabbit anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A27012 | |
| PRIMERS | |||
| ACT-2f: TACAACTCGATCATGAAGTGCGA | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
| ACT-3r: CCCGGGTACATGGTGGTACCGC CGGA |
CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
| FKH_RNAi_F: GCCGACTTATGCTTAGCCCA | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
| FKH_RNAi_R: TAGCCGTCAATTCCTCCTGC | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
| newDSX-f: AGAGGGCGGGGAAATTCTAGT | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
| newDSX-r: GGGCTTGTGGCAGTACGAATA | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
| S7qf1: AGAACCAGCAGACCACCATC | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
| S7qr1: GCTGCAAACTTCGGCTATTC | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
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