Summary
Oral administrering av dsRNA produsert av bakterier, en leveringsmetode for RNA-interferens (RNAi) som rutinemessig brukes i Caenorhabditis elegans, ble vellykket brukt her på voksne mygg. Vår metode muliggjør robuste omvendte genetikkstudier og overføringsblokkerende vektorstudier uten bruk av injeksjon.
Abstract
RNA-interferens har vært et tungt brukt verktøy for omvendt genetisk analyse i to tiår. I voksne mygg har dobbeltstrenget RNA (dsRNA) administrasjon blitt oppnådd hovedsakelig via injeksjon, noe som krever betydelig tid og ikke er egnet for feltapplikasjoner. For å overvinne disse begrensningene, her presenterer vi en mer effektiv metode for robust aktivering av RNAi ved muntlig levering av dsRNA til voksne Anopheles gambiae. Lange dsRNAer ble produsert i Escherichia coli stamme HT115 (DE3), og en konsentrert suspensjon av varme-drepte dsRNA-inneholdende bakterier i 10% sukrose ble tilbudt på bomull baller ad-libitum til voksne mygg. Bomullskuler ble erstattet hver annen dag i løpet av behandlingen. Bruk av denne metoden for å målrette doublesex (et gen involvert i kjønnsdifferensiering) eller gaffelhode (som koder en spyttkjerteltranskripsjonsfaktor) resulterte i redusert målgenuttrykk og / eller proteinimmunofluorescenssignal, målt ved kvantitativ sanntids PCR (qRT-PCR) eller fluorescens konfokal mikroskopi, henholdsvis. Defekter i spyttkjertelmorfologi ble også observert. Denne svært fleksible, brukervennlige, rimelige, tidseffektive metoden for dsRNA-levering kan være bredt anvendelig for målgener som er viktige for insektvektorfysiologi og utover.
Introduction
Mange sykdommer overføres av mygg, noe som gjør studiet av myggfysiologi og genetikk til et viktig foretak. Bruken av RNAi i disse organismene har vært fremtredende de siste 20 årene og har tillatt funksjonell karakterisering av mange mygggener 1,2,3,4,5. Den mest brukte teknikken for dsRNA-levering har vært mikroinjeksjon, som har ulempene at den kan skade myggene og krever betydelig tid og krefter. Oral leveringsmetoder for RNAi har blitt testet, men hovedsakelig i larvestadiet av myggene 6,7,8,9. Oral levering av dsRNA i voksne mygg har ikke blitt fullstendig utforsket og kan være et nyttig verktøy for studiet av vektorbiologi og vektorstyring.
Malaria overføres av Anopheles mygg når en infisert kvinnelig mygg tar et blodmåltid fra en uinfisert vert og injiserer spytt som inneholder malarial parasitter10. For å til slutt bli overført i spytt av en mygg, må parasitten overvinne mange hindringer, inkludert å unngå mygg immunforsvaret, traversering av midgutbarrieren og invasjon av spyttkjertlene11. Mygg spyttkjertel (SG) arkitektur er nøkkelen til parasitt invasjon og at arkitektur styres både av viktige spyttkjertel-uttrykte transkripsjonsfaktorer samt determinanter av seksuell dimorfisme. Flere svært konserverte transkripsjonsfaktorer er nødvendige for cellulær spesifikasjon og homeostatisk vedlikehold av spyttkjertlene og for produksjon og sekresjon av spyttproteiner som fungerer i blodfôring 12,13,14. Gaffelhode (Fkh) er en bevinget helix transkripsjonsfaktor som fungerer som en stor regulator av insekt SG struktur og funksjon (basert på studier i fruktfluer og silkeormmot)15,16,17,18,19,20. I Drosophila SGs fungerer Fkh med Sage, en SG-spesifikk grunnleggende helix-loop-helix (bHLH) transkripsjonsfaktor, for å fremme SG-overlevelse og spyttproduksjon19. En viktig, positiv medregulator for spyttproduksjon i Drosophila er CrebA, en godt studert leucin glidelås transkripsjon faktor som oppregulerer uttrykket av sekretoriske veigener 21,22,23. Det er også en sterk grad av morfologisk differensiering i kvinnelige spyttkjertler som sannsynligvis spiller en nøkkelrolle, ikke bare i blodfôring, men også i parasittenes evne til å invadere dette vevet24.
Mange av genene som er involvert i å bestemme spyttkjerteloverlevelse, struktur, fysiologi og seksuell dimorfisme har komplekse romlige uttrykksprofiler 25,26,27, og de tradisjonelle leveringsmetodene til dsRNA for å indusere RNAi er ikke alltid effektive til å målrette mot denne typen gener i dette eller andre vev. Imidlertid har oral levering av dsRNA i larvalstadiet Aedes aegypti og An. gambiae mygg blitt brukt med hell for å kneble den kvinnespesifikke formen av dsx-genet 9,28. Tidligere studier med dsRNA i mygg spyttkjertler fant at selv om store mengder dsRNA var nødvendig, var silencingeffekten relativt langvarig (minst 13 dager)29. Her ble evnen til varme-drept E. coli-stamme HT115 (DE3) som uttrykker sekvensspesifikk dsRNA for dsx, fkh eller CrebA for å indusere RNAi-silencing av disse genene i voksne kvinnelige mygg testet. Oral administrering av dsRNA indusert gen knockdown i An. gambiae, med klare reduksjoner i mRNA nivåer og med fenotyper i samsvar med tap av funksjon av disse genene. Dermed vil denne tilnærmingen sannsynligvis fungere for å slå ned funksjonen til en rekke spyttkjertelgener.
Protocol
1. Kloning dsRNA i E. coli uttrykk vektor
- Velg målgensekvensen som skal settes inn i en passende vektor for uttrykket dsRNA. Hent uttrykksverdiene fra Vectorbase.org ved hjelp av følgende metode.
- Søk etter et gen av interesse (f.eks. tabell 1) i søkefeltet på hjemmesiden.
- På den resulterende gensiden navigerer du til 8. Transkripsjonsseksjonen .
- Se etter de oppførte relevante genuttrykkseksperimentene RNA-seq og microarray.
- Transkriber verdier av interesse i regnearkprogramvaren og opprett en datatabell.
- Velg en kommersielt tilgjengelig plasmid med minst én T7-promotor som skal brukes. Hvis den valgte plasmiden bare har en T7-promotor (som de fleste kommersielle plasmider gjør), inkluderer en annen T7-promotor i omvendt primer som skal brukes til forsterkning av dsDNA for genet av interesse.
MERK: dsRNA-sekvensen for målgenene kan velges ved hjelp av webapplikasjonen E-RNAi for utformingen av RNAi-reagenser30. Enten lang dsRNA (ca. 400 bp) eller korthåret dsRNA (shRNA) kan utformes basert på spesifikke gensekvenser. Disse sekvensene bør forsterkes og sekvenseres for identitetsbekreftelse før kloning. De utvalgte genregionene, plasmidene og promotorene som brukes i denne studien, er oppført i Tilleggsfil 1. - Utfør kloning i henhold til en enkel ett-trinns prosedyre beskrevet tidligere 9,31. Til dette formål, rense PCR-produktet og ligate til linearisert plasmid DNA. Bruk produktet av ligation for varme-sjokk transformasjon av kompetente E. coli celler32. Merk de transformerte cellene gjennom blå/hvit screening. Bekreft retningen på innsatsen ved hjelp av en T7-primer PCR og bekreft sekvensen ved hjelp av M13 primere.
MERK: Hvite/blå screeninger kan brukes når plasmidet som er valgt for transformasjon bærer lacZ-genet som koder for β-galaktosidase. Hvite kolonier bør inneholde ønsket innsats i laktzen og kan velges for å bekrefte tilstedeværelsen og orienteringen av målsekvensen33 ytterligere. - Rens plasmidet fra den første transformasjonen og bruk det til å transformere kompetent E. coli HT115 (DE3) som tidligere beskrevet34. Etter bekreftelse på at plasmidet med innsatsen er til stede i den kompetente E. coli HT115 (DE3), gjør glyserolbestandene av bakterier til engangsbruk.
MERK: En passende ikke-relatert kontroll dsRNA bør anskaffes eller klargjøres for bruk i hvert eksperiment. I dette tilfellet brukes sekvensen for det ikke-relaterte genet aintegumenta (myr) fra Arabidopsis thaliana .
2. Fremstilling av varme-drepte bakterier som uttrykker dsRNA
- Vokse en kultur fra en enkelt bakteriell koloni av E. coli stamme HT115 (DE3) som inneholder dsRNA uttrykker plasmid i 50 ml Luria Broth (LB) som inneholder 100 μg / ml ampicillin og 12,5 μg / ml tetracyklin, på en plattform shaker (180 rpm) ved 37 °C for 12 °C for 12 °C.
- Fortynn bakteriekulturen (1:1000) i 2x Gjær Tryptone (2x YT) medier som inneholder 100 μg/ml ampicillin og 12,5 μg/ml tetracyklin.
- Induser dsRNA-produksjon ved å tilsette 40 μM (endelig konsentrasjon) isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG).
- Når cellene når en O.D.600 = 0,4, omtrent etter 2 timers induksjon ved 37 °C med agitasjon ved 180 o/min, lag en konsentrert suspensjon av varmedren bakterier som beskrevet av Taracena et al 9. Pellet cellene ved sentrifugering (4000 x g, 4 °C, 10 min) og vask celler i ett volum natriumfosfatbuffer (PBS).
- Spinn igjen under de samme forholdene, re-suspendere i PBS til 1/100 av det opprinnelige volumet, og plasser ved 70 °C i 1 time.
- Lag 400 μL aliquots av de varme-drepte bakteriene og lagre disse aliquots ved -20 ° C til videre bruk (ikke lagre i mer enn en uke). Denne suspensjonen av varme-drepte bakterier inneholder den spesifikke dsRNA for RNAi-forsøkene. Utfør denne prosedyren både for målgenet dsRNA-bakterier og for at den ikke-relaterte dsRNA-kontrollen skal brukes i hvert eksperiment.
3. Fôring av mygg med varme-drepte bakterier som uttrykker dsRNA
- Avriming en aliquot av dsRNA (HT115 (DE3) bakterie suspensjon) og bland med 1,6 ml 12% sukkeroppløsning som inneholder 0,2% metylparaben.
- Soak en liten bomullsdott i denne løsningen og legg den gjennomvåte bomullskulen inne i et bur som inneholder 5-dagers gamle mygg. Forsikre deg om at myggene spiser på denne løsningen, og plukker opp både sukkeret og de dsRNA-inneholdende bakteriene samtidig.
- Bytt bomullsdotten gjennomvåt i dsRNA-sukkeroppløsning annenhver dag i 8 påfølgende dager.
- Hold myggbur under konstante forhold, det vil si 27 °C og 80 % relativ fuktighet med en fotoperiod på 12 t:12 t lys: mørk fotosyklus, adskilt med en 30 min daggry og 30 min skumringsperiode.
4. Analyse mål genuttrykk nivåer
- Kaldbedøvelse myggene ved å plassere beholderen på is i et minutt eller til myggene slutter å bevege seg. Når myggene er bedøvet, legg dem på en kald overflate for å isolere kvinner for disseksjon.
- Spray 70% etanol til myggene og legg dem på en glassoverflate med PBS. Med et par tang, fest mygghodet stødig og trekk thoraxen veldig sakte, slik at spyttkjertlene slippes ut i PBS.
- Hold spyttkjertlene i iskald PBS til 10 personer er dissekert. Pool Ten SGs for RNA ekstraksjon ved hjelp av guanidinium thiocyanate-fenol-kloroform metode. Suspender RNA-pelletsen i 30 μL RNase-fritt vann.
- Bruk 1 μL aliquot av RNA ekstrahert fra SG i forrige trinn, for å lese absorbans ved 260 og 280 nm og beregne RNA-konsentrasjonen av hver prøve ved å multiplisere med fortynningsfaktoren. Et 260/280-forhold på ~ 2,0 indikerer RNA av god kvalitet.
- Bruk 1 μg av den rensede RNA for å syntetisere komplementært DNA (cDNA) ved hjelp av et kommersielt omvendt transkripsjonssett.
- Lag en 1:10 fortynning av cDNA for å forberede en RT-PCR-reaksjon i henhold til produsentens anbefalinger. For hver prøve, lag en reaksjon for målgenet og parallelt, sett opp en reaksjon med rengjøringsgenet (HK). Sett hver genreaksjon i en teknisk triplikat for å eliminere virkningen av tilfeldig variasjon fra metoden.
MERK: Her har An. gambiae ribosomal S7-genet (GeneBank: L20837.1) og aktin (VectorBase: AGAP000651) blitt brukt som HK-gener. - Bruk alle primere med en endelig konsentrasjon på 300 nM, etter SYBR-green produsentens indikasjoner. Forsterke med standard PCR-forhold: 95 °C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser på 15 s ved 95 °C og 60 s ved 60 °C.
MERK: For å kvantifisere genuttrykk brukes delta-delta-Ct-metoden (ΔΔCt). Delta Ct (ΔCt) er forskjellen mellom Ct av målgenet og Ct av rengjøringsgenet. ΔΔCt er forskjellen mellom ΔCt i den eksperimentelle gruppen og ΔCt i kontrollgruppen35.
5. Fenotypisk evaluering: vellykket blodfôring
- For å evaluere evnen til blodfôr, sett grupper på 15 kvinnelige mygg behandlet med mål og kontroll dsRNA på små bur (12 cm diameter) og sult dem i 4 timer.
- Ved hjelp av et sirkulerende vannbad satt til 37 °C, tilbyr glass myggmatere (24 mm diameter) og parafilmmembran defibrinert saueblod til myggene.
MERK: Blod kan kjøpes fra en kommersiell leverandør som aseptisk trekker det fra sunne, donordyr av amerikansk opprinnelse og manuelt defibrinerer uten antikoagulantia eller tilsetningsstoffer. - Ved direkte observasjon, telle og registrere antall forsøk på å lykkes med å skaffe seg et blodmåltid fra de første fem kvinnene for å bli fullt oppslukt i hver gruppe.
MERK: For å unngå betydelige metabolske endringer i myggene, som kan forstyrre energiressurser som påvirker blodsøkende oppførsel, ble sult holdt til et minimum (4 t). Som et resultat ville ikke alle mygg ivrig søke blodmelet, og vi begrenset tellingen av de engorgede kvinnene til fem (en tredjedel av hver gruppes totale), for å redusere effekten av tidsvariabler som eksponering for menneskelig lukt, temperaturendring mellom kamrene og fôringsflatene, etc.
6. Fenotypisk evaluering: Salivarykjertelmorfologi og down-regulering av relevante proteiner
- Isoler friskt vev i 1x fosfatbufret saltvann (PBS) som beskrevet i trinn 4.2 og fest i iskald aceton i 90 s. Skyll flere ganger i 1x PBS etter at du har fjernet acetonen. Inkuber med primære antistoffer over natten ved 4 °C med antiserum (se Materialtabell) fortynnet til 1x PBS.
MERK: Se tabell over materialer for identifisering av de primære antistoffene som brukes til spyttproteiner (Anopheles anti-blodplateprotein, AAPP; Mucin 2, MUC2), SG transkripsjonsfaktorer (Gaffelhode, fkh; Salvie, salvie; Syklisk-AMP respons element-bindende protein A, CrebA), og en markør av sekretoriske vesikler (Rab11). Disse antistoffene brukes som avlesninger for SG-form og funksjon. Imidlertid bør ethvert antistoff som er egnet for immunfluorescens være egnet for denne protokollen. - Vask i 1x PBS flere ganger. Tilsett sekundære antistoffer (fluorescerende) fortynnet i 1x PBS, og inkuber i mørket ved romtemperatur i 2 timer. Legg til eventuelle tellere [for eksempel 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI; DNA), hvetekim agglutinin (WGA; for kitin), falloidin (for F-aktin) og/eller Nilrød (for lipider)] 30 min før slutten av 2 h inkubasjon.
- Vask tre ganger i 1x PBS. Monter deretter vevet i 100% glyserol på en standard mikroskopsklie med en 1 mm tykk dekslerlip og lagre ved -20 °C til avbildning ved hjelp av et fluorescenskonfokalt mikroskop.
MERK: For å få kvantitative data må bildebehandlingsinnstillingene holdes konstante. Her ble bare maksimale intensitetsprojeksjonsbilder gjennom hele 3D-volumet av vevet inkludert, og all bildekarantifisering ble normalisert mellom behandlinger (i et eksperiment) basert på DAPI-signal i ikke-SG-vevrester (fettlegeme, kutiklet eller hode) som også er til stede på lysbildet.
Representative Results
Til å begynne med ble mikroarrayuttrykksdata fra VectorBase brukt til å skanne potensielle mål på tvers av utviklingsstadier36,37 for å bestemme uttrykksstatusen til alle gener som er relevante for den nåværende studien (tabell 1). Som forventet viste alle våre valgte målgener uttrykk i voksne SGs. Nivåer av aapp og salvie var spesielt høye (tabell 1). Også oppmerksom var de høye nivåene av uttrykk for f-Agdsx hos voksne kvinnelige SGs9.
Spesifikke segmenter fra hvert gen ble evaluert for bruk som dsRNA ved hjelp av webapplikasjonen E-RNAi for design av RNAi reagenser30. ~400 bp-regionene som inneholder sekvenser som er unike for hvert målgen, ble deretter klonet (figur 1A), forvandlet til de aktuelle bakteriestammene, og brukes til å forberede suspensjoner av varme-drepte bakterier, som ble indusert til å produsere dsRNA. Voksne mygg ble matet i 8 dager på de sukrose-gjennomvåte bomullsbollene som inneholder bakterielle suspensjoner av dsRNA for f-Agdsx, fkh eller myr (den ikke-relaterte negative kontrollen).
For analyse av RNAi-fôring av kvinnelige mygg ble det først bestemt om f-Agdsx eller fkh dsRNA-feedings indusert genaktivering. En reduksjon på 98,8 % (±2,1) i fkh-transkripsjonsnivåer ble observert i gruppen som ble matet med fkh-dsRNA (figur 1B), noe som indikerer at dsRNA effektivt reduserte overfloden av fkh-transkripsjoner i bærekraftsmålene. Overraskende nok ble fkh mRNA-nivåene redusert med 82,0% (±18,9) i myggene behandlet med dsRNA for f-Agdsx, som hadde en 89,86% (±4,48) f-Agdsx reduksjon , antyder at fkh kan være et mål for F-Dsx i spyttkjertelen. Samtidig med den betydelige reduksjonen i fkh-uttrykksnivåer , viste fkh-knockdown mygg en betydelig økning i antall sonde forsøk som trengs for å mate blod. Disse myggene viste i gjennomsnitt fem ganger flere fôringsforsøk enn kontrollgruppen eller f-Agdsx dsRNA matet mygg for å bli fullstendig oppslukt med blod (figur 1C). Dette førte til at man spurte om fkh knockdown RNAi-behandlingene forårsaket endringer i lokalisering og/eller distribusjon av sentrale transkripsjonsregulatorer (SG TFs Sage og CrebA) (figur 2), utskilte proteiner (AAPP og mucin) (figur 3) og sekretoriske maskiner [Nilrøde (lipider) og Rab11 (sekretoriske vesikler)] (figur 4). Det er viktig at det ble observert betydelige forskjeller i fargeintensitet på tvers av ulike loberegioner, lober og individuelle SGs.
Som spådd ble nivåene av salvie og CrebA-farging markert redusert i alle SG-lober etter fkh RNAi (figur 2B) sammenlignet med myrkontroll RNAi (figur 2A). Reduksjoner i både de høyeste maksimumsintensitetsverdiene (røde stiplede linjer og numeriske etiketter) og laveste maksimale intensitetsverdier (blå stiplede linjer og numeriske etiketter) i linjeskanningsprofiler foreslo reduksjoner i områder med både høyt og lavt signal i vevet (figur 2A, B). Disse dataene antyder at An. gambiae fkh RNAi er effektiv og at fkh regulerer produksjonen og / eller stabiliteten til SG TFs Sage og CrebA i An. gambiae, analogt med deres genetiske forhold i Drosophila SGs 19,38,39.
Når man vurderer svært rikelig spytt-komponent proteiner, nivåer av Anopheles anti-blodplater protein (AAPP)40,41 ble redusert i alle tre SG lobes etter fkh RNAi, sammenlignet med kontroll RNAi behandling (Figur 3A, B; grønn). På den annen side ble det ikke observert noen endringer i nivåene av Mucin (figur 3A, B; lilla). Disse dataene tyder på at Fkh bidrar annerledes til uttrykket av forskjellige spyttproteingener.
Til slutt ble det observert to sekresjonsmarkører (figur 4A,B): Rab11 (vesikler assosiert med apikale resirkuleringsdosomer)42 og Nilrød (lipider). Redusert Rab11 fluorescens ble observert i distale laterale (DL) lober etter fkh RNAi-behandling (figur 4A v vs. 4B v; grønn). Imidlertid oppstod også økte Rab11-signaler i medial (M) og proksimale laterale (PL) lober (figur 4A vii, ix vs. 4B vii, ix; grønn). Ingen merkbar forskjell ble observert i Nilrødt signal (figur 4A,B; lilla) etter fkh RNAi sammenlignet med kontrollen RNAi behandling. Disse dataene tyder på at fkh reduksjon kan endre noen sekretoriske maskiner handling på en kompleks måte som er forskjellig mellom SG lobes.
| Dataset: | Goltsev | Neira Oviedo | Neira Oviedo | Baker | Baker | Baker | Baker | ||
| gensymbol | funksjon | AGAP-ID | embryo (25 timer) | L3 larver | L3 SG | voksen kvinne kropp (3 dager siden) |
voksen mann kropp (3 dager siden) |
voksen kvinne SG (3 dager siden) |
voksen mann SG (3 dager siden) |
| AAPP | spytt protein | AGAP009974 | 3.92 | 4.38 | 4.33 | 3.81 | 2.46 | 11.92 | 2.69 |
| CrebA | txn-faktor | AGAP001464 | 6.28 | 5.22 | 5.92 | 2.99 | 2.96 | 3.27 | 3.13 |
| " | txn-faktor | AGAP011038 | 4.50 | 4.46 | 5.23 | 2.96 | 2.86 | 3.05 | 2.88 |
| dsx | txn-faktor | AGAP004050 | 4.91 | 5.39 | 5.55 | 3.72 | 4.00 | 4.57 | 4.01 |
| fkh | txn-faktor | AGAP001671 | 5.18 | 4.67 | 5.25 | 2.99 | 3.09 | 3.21 | 3.05 |
| MUC2 | spytt protein | AGAP012020 | 4.59 | 5.53 | 5.63 | 2.96 | 3.07 | 3.08 | 3.26 |
| Rab11 | bilhandel | AGAP004559 | 10.21 | 7.47 | 8.60 | 4.90 | 3.79 | 3.38 | 2.96 |
| salvie | txn-faktor | AGAP013335 | 5.32 | 5.96 | 8.89 | 3.40 | 3.33 | 7.37 | 7.23 |
Tabell 1: Gjennomsnittlige log2 microarray-uttrykksprofiler for An. gambiae gener av interesse. Vist er gennavn, funksjonskategori, Vectorbase (AGAP)-identifikatorer og gjennomsnittlige log2 mikroarrayuttrykksdata samlet inn fra Vectorbase. Disse dataene indikerer at våre gener av interesse (involvert i spyttkjertel (SG) cellebiologi og sekresjon) uttrykkes og berikes i larvetrinn 3 (L3) og voksne SGs, sammenlignet med hele individer.
Figur 1: f-Agdsx og fkh knockdown hos voksne An. gambiae reduserer fkh mRNA nivåer i bærekraftsmålene og påvirker den kvinnelige evnen til blodfôr. (A) Representativt bilde av plasmiddesignet som brukes til dsRNA-produksjon i denne metodikken. Den andre T7-promotorsekvensen legges til plasmidet ved å inkludere den i 3's primer som brukes til å forsterke innsatsen som skal klones inn i pGEMT-plasmidet. Plasmiden omdannes deretter til E. coli HT115 (DE3) bakterier og en fôringsløsning er laget av en suspensjon av induserte varme drepte bakterier i 10% sukkervann. (B) Dyr matet med en dsRNA fôringsløsning for enten f-Agdsx eller fkh, viste betydelig lavere nivåer av fkh transkripsjoner (enveis ANOVA med flere sammenligninger; n = 15). Imidlertid viste bare gruppen matet med fkh dsRNA (C) en betydelig forskjell i antall biteforsøk som trengs for å skaffe seg et blodmåltid. Mygg i denne gruppen trengte i gjennomsnitt fem ganger antall forsøk på å oppnå et vellykket blodmåltid enn det som var nødvendig av kontrollen eller dsx-dsRNA-matet grupper (enveis ANOVA med flere sammenligninger; n = 15). Feilfelt angir standardfeilen for gjennomsnittet (SEM). Hvert eksperiment ble utført i tre separate biologiske repliker. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: fkh knockdown hos voksne An. gambiae spyttkjertler reduserer SG transkripsjonsfaktornivåer. Vist er representative bilder fra dag 13 voksen kvinne An. gambiae SGs etter 8 dager (dager 5-13) av oral eksponering for enten (A) ikke-relatert dsRNA kontroll (myr) eller (B) dsRNA rettet mot SG TF gaffelhodet (fkh, AGAP001671) i 10% sukrose farget med fargestoffene DAPI (DNA; rød), merket hvetekim agglutinin (WGA, chitin / O-GlcNAcylation; blå), antisera mot SG TFs salvie (grønn) og CrebA (lilla). Skaleringslinjens lengder som vises, er mikroner. SGs (i) er omrisset med hvite streker. Gule linjer i zoomede lobebilder (av regionene som er omsluttet av gule bokser, og merket "innfelt") angir hvor linjeskanningene av signalintensitet ble utført. Grønne og lilla kanalintensiteter som tilsvarer linjeskanninger for hver zoomede lobe er plottet (alltid fra venstre til høyre i SG) i grafene under bildene; X-akse = avstand (i piksler) og Y-akse = grå enhet (pikselintensitet). Pikselintensitetens dynamiske område er avgrenset med røde (maksimum) og blå (minimum) prikkede linjer, og de tilsvarende verdiene vises i hvert diagram. MIP = maksimal intensitet 3D-projeksjon gjennom hele SG-dybden. DL: distal lateral lobe; M: medial lobe; PL: proksimal lateral lobe; SD: spyttkanal. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: fkh knockdown hos voksne An. gambiae spyttkjertler reduserer SG utskilt protein nivåer. Vist er representative bilder fra dag 13 voksen kvinne An. gambiae SGs etter 8 dager (dager 5-13) av muntlig eksponering for enten (A) ikke-relatert dsRNA kontroll (maur), eller (B) dsRNA rettet mot SG TF gaffel hodet (fkh, AGAP001671) i 10% sukrose farget med fargestoffene DAPI (DNA; rød), merket hvetekim agglutinin (WGA, chitin / O-GlcNAcylation; blå), og spyttproteinene AAPP (grønn) og Mucin (MUC2, lilla). Skaleringslinjens lengder som vises, er mikroner. SGs (i) er omrisset med hvite streker. Gule linjer i zoomede lobebilder (av regionene som er omsluttet av gule bokser) angir hvor linjeskanningene av signalintensiteten ble utført. Grønne og lilla kanalintensiteter som tilsvarer linjeskanninger for hver lobe er plottet (alltid fra venstre til høyre i SG) i grafene under bildene; X-akse = avstand (i piksler) og Y-akse = grå enhet (pikselintensitet). Pikselintensitetens dynamiske område er avgrenset med røde (maksimum) og blå (minimum) stiplede linjer, og de tilsvarende verdiene vises i hvert diagram. MIP = maksimal intensitet 3D-projeksjon gjennom hele SG-dybden. DL: distal lateral lobe; M: medial lobe; PL: proksimal lateral lobe; SD: spyttkanal. Kursiv "DL"-etiketter (Bi) angir to synlige områder med samme DL-lobe. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: fkh knockdown hos voksne An. gambiae spyttkjertler reduserer SG sekresjon markører. Vist er representative bilder fra dag 13 voksen kvinne An. gambiae SGs etter 8 dager (dager 5-13) av oral eksponering for enten (A) ikke-relatert dsRNA kontroll (myr), eller (B) dsRNA rettet mot SG TF gaffelhodet (fkh, AGAP001671) i 10% sukrose farget med fargestoffene DAPI (DNA; rød), merket hvetekim agglutinin (WGA, chitin / O-GlcNAcylation; blå), Nile Red (lipider; lilla) og antisera mot resirkulering endosome vesicle Rab11 (grønn). Skaleringslinjens lengder som vises, er mikroner. SGs (i) er omrisset med hvite streker. Gule linjer i zoomede lobebilder (av regionene som er omsluttet av gule bokser) angir hvor linjeskanningene av signalintensiteten ble utført. Grønne og lilla kanalintensiteter som tilsvarer linjeskanninger for hver lobe er plottet (alltid fra venstre mot høyre i SG) i grafene under bildene; X-akse = avstand (i piksler) og Y-akse = grå enhet (pikselintensitet). Pikselintensitetens dynamiske område er avgrenset med røde (maksimum) og blå (minimum) stiplede linjer, og de tilsvarende verdiene vises i hvert diagram. MIP = maksimal intensitet 3D-projeksjon gjennom hele SG-dybden. DL: distal lateral lobe; M: medial lobe; PL: proksimal lateral lobe; SD: spyttkanal. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil 1. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Evnen til effektivt å levere dsRNA til An. gambiae mygg ved oral fôring har brede implikasjoner for studier av vektorbiologi både i laboratoriet og i feltet. Mikroinjeksjon har lenge vært akseptert som den foretrukne leveringsmåten for kjemikalier, antistoffer, RNAi og genetiske modifikasjonsstrategier i mygg43,44. Konsekvensen av betydelig fysisk manipulasjon, cellulær skade og stress kan unngås ved bruk av oral levering, som også kan være potensielt egnet for store eller feltapplikasjoner. Tidligere arbeid har antydet at RNAi virker allestedsnærværende i en individuell voksen mygg29, noe som gir effekter i alle vev, inkludert spyttkjertler. Ved å mate mygg med et stort antall dsRNA-uttrykkende E. coli som fordøyes asynkront over lang tid, kan man potensielt oppnå konsistent og jevn eksponering for RNAi på tvers av alle individer i et bur. Denne metoden gjør det mulig å mate et stort antall mygg og analysere potensiell variasjon av de resulterende fenotypene avhengig av målgenet. En viktig vurdering er imidlertid muligheten for heterogen fordeling av bakteriene, og dermed dsRNA, i bomullsfiberen. De 400 μL bakteriene som brukes daglig til myggsukkerfôring, vil inneholde omtrent ≤4,6 μg dsRNA, som beskrevet og beregnet tidligere9, men mengden dsRNA inntatt av hver mygg ble ikke individuelt bestemt. Hvis bygging av dsRNA-konstruksjoner blir rutine, gir denne enkle behandlingsprotokollen rask assimilering av denne teknikken av enhver myggforsker. A priori, tidsutgiftene under behandling (30 min per dag) er trivielle sammenlignet med tiden det tar å lære og bruke mikroinjeksjon på lignende utvalgsstørrelser.
Feeding dsRNA brukes rutinemessig til omvendte genetikkstudier i modellorganismen Caenorhabditis elegans45. Dette tunge bruksnivået understreker verdien av den muntlige leveringsmåten. Bygging av et An. gambiae genom-bredt bibliotek i transformert E. coli, lik det som eksisterer i C. elegans46,47, ville tillate rask omvendt genetisk screening i mygg i økt skala. Det er imidlertid viktig å merke seg at effektiviteten av metoden avhenger i stor grad av de endogene nivåene av transkripsjon, og hvis uttrykket ikke er begrenset til målvevet, men uttrykt mer bredt 4,8,44. I tillegg er det bevis på at noen insektmidler kan indusere atferdsunngåelse fra mygg48, og fôring med bakterier som potensielt induserer bivirkninger i dem, kan utløse lignende unngåelsesmønstre. I laboratoriets kontrollerte innstilling, hvor myggene ikke hadde en alternativ matkilde, hadde de ikke noe valg for å unngå sukkervannet med E. coli, og behovet for en næringsrik kilde ville sannsynligvis overstyre instinktet for å unngå bakteriene. Dette bør imidlertid vurderes dersom strategien skulle brukes i mindre kontrollerte omgivelser.
Det kan være mulig å målrette flere gener samtidig (ved hjelp av en konstruksjon, flere konstruksjoner eller en blanding av transformerte bakterieisolasjoner), men ytterligere studier er nødvendig for å vurdere effektiviteten. Et annet viktig hensyn til dette punktet er evalueringen av mulige off-target eller synergistiske effekter når du bruker enkelt eller flere mål. Etablering av hensiktsmessige kontrollgener og grupper er en viktig del av eksperimentell design. Videre er det fristende å spekulere i at denne tilnærmingen kan brukes til å målrette mot andre patogener eller virus49. Tidligere arbeid mot RNAi induksjon i mygg ble utført under forhold der reagenset ble direkte injisert, så E. coli var ikke til stede. E. coli kan gi et beskyttende rom som gir langsommere frigjøring av dsRNA over tid, noe som sikrer at eksponeringen er mer eller mindre kontinuerlig over en mye lengre periode29.
Til slutt viser disse resultatene at effektene av denne teknikken er justerbare ved å justere tidsrammen (lengde og startdag) for eksponering og mengden E. coli som brukes. Denne funksjonen tillot oss å studere funksjonene til essensielle gener (dsx og fkh) ved å identifisere optimale knockdown-forhold ved prøving og feiling. Dette øker sannsynligheten for at målgener av interesse kan undersøkes ved hjelp av denne teknikken.
Oppsummert ble det funnet at oral levering av RNAi til voksne mygg kan være enkel, allsidig og en kraftig tilnærming til å studere mygggenfunksjon og for å skape nye og formbare verktøy for vektorkontroll av myggbårne sykdommer.
Disclosures
Forfatterne rapporterer at de ikke har noen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke de ansatte og forskerne innen Entomology Branch og Divisjon for parasittiske sykdommer og malaria ved CDC, og Brian Trigg og Michelle Chiu for hjelp med bakterieforberedelse ved JHU og/eller nyttige diskusjoner om dette arbeidet. Vi takker JHMRI Insectary og manager Chris Kizito for tilgang til, og oppdrett av, An. gambiae mygg. Vi takker Wei Huang (JHSPH) for hjelp til å skaffe plasmider PJet GFP og pPB47 GFP for bruk i denne studien. Støtten til dette arbeidet ble gitt av: NIH R21AI153588 (til DJA), et Johns Hopkins Malaria Research Institute Postdoctoral Fellowship (til MW); og ved et stipend fra Good Ventures Foundation og Open Philanthropy Project til CDC Foundation med tittelen Support cryopreservation and suppression of female development in mosquitoes to assist research for malaria, Open Philanthropy Project, 2017. Vi setter stor pris på hjelp fra JHU Microscope Facility ansatte og gjeldende NIH gi støtte til mikroskopet som brukes (NIH Grant #: S10OD016374). Funnene og konklusjonene i dette manuskriptet er forfatternes og representerer ikke nødvendigvis CDCs synspunkter. Bruk av varenavn er kun til identifikasjon og innebærer ikke godkjenning fra Centers for Disease Control and Prevention, Public Health Service eller US Department of Health and Human Services.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 Kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | 10787018 | |
| 2x Yeast Extract Tryptone (2xYT) Medium | BD Difco | DF0440-17 | |
| AAPP | n/a | n/a | Antisera. 1:50 dilution (rabbit); gift from Fabrizio Lombardo |
| AccuStart II PCR Supermix | Quantabio | 95137-100 | |
| Agarose | Millipore Sigma | A9539 | |
| Ampicillin | Millipore Sigma | A5354 | |
| Anopheles gambiae G3 | BioDefense and Emerging Infections (BEI) Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4) | MRA-112 | |
| BugDorm | BioQuip | 1452 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | P022628181 | |
| CrebA | DSHB | CrebA Rbt-PC | Antisera. 1:50 dilution (rabbit); generated by the Andrew Lab |
| Damiens diet | BioServ | ||
| DAPI | Life Technologies | n/a | 4′,6-diamidino-2-phenylindole; 1:200 dilution. |
| Defibrinated sheep blood | HemoStat | DSB050 | |
| Escherichia coli HT115 (DE3) | |||
| Ethidium bromide | Millipore Sigma | E7637 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4368814 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Millipore Sigma | I5502 | |
| JM109 Competent cells | Promega | L2005 | |
| Luria Broth Media | Thermo Fisher Scientific | 10855001 | |
| Mucin 2 | Proteintech | Muc2; 27 675-1-AP | Antisera. 1:100 dilution (mouse). |
| Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | ||
| Nile Red | Sigma | n/a | Lipid dye; 1:50 dilution. |
| Owl EasyCast B2 Mini Gel Horizontal Electrophoresis | Thermo Fisher Scientific | Model B2 | |
| pGEMT easy | Promega | A3600 | |
| Power SYBR-green PCR master MIX | Applied Biosystems | 4367659 | |
| PureLink PCR purification kit | Thermo Fisher Scientific | K31001 | |
| QuantaStudio 6 | Applied Biosystems | ||
| QuantStudio6 Real Time PCR System | Applied Biosystems | ||
| Rab11 | n/a | n/a | Antisera. 1:100 dilution (rabbit); generated by the Andrew Lab |
| Rh-WGA | Vector Labs | n/a | Rhodamine-conjugated wheat germ agglutinin (chitin, O-GlcNAcylation dye); 1:40 dilution |
| Sage | n/a | n/a | Antisera. 1:50 dilution (rat); generated by the Andrew Lab |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 | |
| Tetracycline | Millipore Sigma | 87128 | |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Zeiss LSM700 fluorescence confocal microscope | Zeiss | ||
| ANTIBODIES | |||
| Chicken anti-Rat IgG (H+L), Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A21472 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A28181 | |
| IgG (H+L) Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A27034 | |
| Rabbit anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A27012 | |
| PRIMERS | |||
| ACT-2f: TACAACTCGATCATGAAGTGCGA | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
| ACT-3r: CCCGGGTACATGGTGGTACCGC CGGA |
CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
| FKH_RNAi_F: GCCGACTTATGCTTAGCCCA | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
| FKH_RNAi_R: TAGCCGTCAATTCCTCCTGC | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
| newDSX-f: AGAGGGCGGGGAAATTCTAGT | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
| newDSX-r: GGGCTTGTGGCAGTACGAATA | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
| S7qf1: AGAACCAGCAGACCACCATC | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
| S7qr1: GCTGCAAACTTCGGCTATTC | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
References
- Hoa, N. T., Keene, K. M., Olson, K. E., Zheng, L. Characterization of RNA interference in an Anopheles gambiae cell line. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 33, 949-957 (2003).
- Caplen, N., Zheng, Z., Falgout, B., Morgan, R. Inhibition of viral gene expression and replication in mosquito cells by dsRNA-triggered RNA interference | Elsevier enhanced reader. Molecular Therapy. 6, 243-251 (2002).
- Brown, A. E., Catteruccia, F. Toward silencing the burden of malaria: progress and prospects for RNAi-based approaches. BioTechniques. , Suppl 38-44 (2006).
- Airs, P. M., Bartholomay, L. C. RNA interference for mosquito and mosquito-borne disease control. Insects. 8, (2017).
- Blandin, S., et al. Reverse genetics in the mosquito Anopheles gambiae: targeted disruption of the Defensin gene. EMBO Reports. 3 (9), 852-856 (2002).
- Garver, L., Dimopoulos, G. Protocol for RNAi assays in adult mosquitoes (A. gambiae). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (5), e230 (2007).
- Whyard, S., et al. Silencing the buzz: a new approach to population suppression of mosquitoes by feeding larvae double-stranded RNAs. Parasites & Vectors. 8, 96 (2015).
- Wiltshire, R. M., Duman-Scheel, M. Advances in oral RNAi for disease vector mosquito research and control. Current Opinion in Insect Science. 40, 18-23 (2020).
- Taracena, M. L., Hunt, C. M., Benedict, M. Q., Pennington, P. M., Dotson, E. M. Downregulation of female doublesex expression by oral-mediated RNA interference reduces number and fitness of Anopheles gambiae adult females. Parasites & Vectors. 12, 170 (2019).
- Grassi, B. Studi di uno zoologo sulla malaria. Real Accademia dei Lincei. 3, 229 (1901).
- Smith, R. C., Jacobs-lorena, M. Plasmodium - Mosquito interactions: A tale of roadblocks and detours. Advances in Insect Physiology. 39, (2010).
- Das, S., et al. Transcriptomic and functional analysis of the Anopheles gambiae salivary gland in relation to blood feeding. BMC Genomics. 11, 1-14 (2010).
- Francischetti, I. M. B., Valenzuela, J. G., Pham, V. M., Garfield, M. K., Ribeiro, J. M. C. Toward a catalog for the transcripts and proteins (sialome) from the salivary gland of the malaria vector Anopheles gambiae. Journal of Experimental Biology. 205, 2429-2451 (2002).
- Henderson, K. D., Isaac, D. D., Andrew, D. J. Cell fate specification in thedrosophila salivary gland: The integration of homeotic gene function with the DPP signaling cascade. Developmental Biology. 205, 10-21 (1999).
- Mach, V., Ohno, K., Kokubo, H., Suzuki, Y. The Drosophila fork head factor directly controls larval salivary gland-specific expression of the glue protein gene Sgs3. Nucleic Acids Research. 24 (12), 2387-2394 (1996).
- Weiserova, M., et al. Mini-Mu transposition of bacterial genes on the transmissible plasmid. Folia Microbiologica. 32 (5), 368-375 (1987).
- Abrams, E. W., Mihoulides, W. K., Andrew, D. J. Fork head and Sage maintain a uniform and patent salivary gland lumen through regulation of two downstream target genes, PH4αSG1 and PH4αSG2. Development. 133, 3517-3527 (2006).
- Myat, M. M., Isaac, P. P., Andrew, D. J. Early genes required for salivary gland fate determination and morphogenesis in Drosophila melanogaster. Advances in Dental Research. 14, 89-98 (2000).
- Fox, R. M., Vaishnavi, A., Maruyama, R., Andrew, D. J. Organ-specific gene expression: the bHLH protein Sage provides tissue specificity to Drosophila FoxA. Development of Cell Biology. 140, 2160-2171 (2013).
- Maruyama, R., Grevengoed, E., Stempniewicz, P., Andrew, D. J. Genome-wide analysis reveals a major role in cell fate maintenance and an unexpected role in endoreduplication for the Drosophila FoxA gene fork head. PLOS ONE. 6, 20901 (2011).
- Johnson, D. M., et al. CrebA increases secretory capacity through direct transcriptional regulation of the secretory machinery, a subset of secretory cargo, and other key regulators. Traffic. 21, 560-577 (2020).
- Fox, R. M., Hanlon, C. D., Andrew, D. J. The CrebA/Creb3-like transcription factors are major and direct regulators of secretory capacity. Journal of Cell Biology. 191, 479-492 (2010).
- Abrams, E. W., Andrew, D. J. CrebA regulates secretory activity in the Drosophila salivary gland and epidermis. Development. 132, 2743-2758 (2005).
- Wells, M. B., Andrew, D. J. Anopheles salivary gland architecture shapes plasmodium sporozoite availability for transmission. mBio. 10 (4), 01238 (2019).
- Pei-Wen, L., Xiao-Cong, L., Jin-Bao, G., Yan, L., Xiao-Guang, C. Molecular cloning, characterization and expression analysis of sex determiantion gene doublesex from Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae). Acta Entomologica Sinica. 58 (2), 122-131 (2015).
- Scali, C., Catteruccia, F., Li, Q., Crisanti, A. Identification of sex-specific transcripts of the Anopheles gambiae doublesex gene. The Journal of Experimental Biology. 208, 3701-3709 (2005).
- Price, D. C., Egizi, A., Fonseca, D. M. Characterization of the doublesex gene within the Culex pipiens complex suggests regulatory plasticity at the base of the mosquito sex determination cascade. BMC Evolutionary Biology. 15, 1-13 (2015).
- Mysore, K., et al. siRNA-mediated silencing of doublesex during female development of the dengue vector mosquito Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9, 1-21 (2015).
- Boisson, B., et al. Gene silencing in mosquito salivary glands by RNAi. FEBS Letters. 580, 1988-1992 (2006).
- Horn, T., Boutros, M. E-RNAi: a web application for the multi-species design of RNAi reagents-2010 update. Nucleic Acids Research. 38, 332-339 (2010).
- Taracena, M. L., et al. Genetically modifying the insect gut microbiota to control chagas disease vectors through systemic RNAi. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9, (2015).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
- Ullmann, A., Jacob, F., Monod, J. Characterization by in vitro complementation of a peptide corresponding to an operator-proximal segment of the β-galactosidase structural gene of Escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 24, 339-343 (1967).
- Timmons, L. Bacteria-mediated RNAi-General outline. Carnegie Institution of Washington. , (2000).
- Pfaffl, M. W. Relative quantification. Real-time PCR. , 63-82 (2004).
- Neira-Oviedo, M., et al. The RNA-Seq approach to studying the expression of mosquito mitochondrial genes. Insect Molecular Biology. 20, 141-152 (2011).
- Baker, D. A., et al. A comprehensive gene expression atlas of sex- and tissue-specificity in the malaria vector, Anopheles gambiae. BMC Genomics. 12, (2011).
- Loganathan, R., Hoon, J., Wells, M. B., Andrew, D. J. Secrets of secretion - How studies of the Drosophila salivary gland have informed our understanding of the cellular networks underlying secretory organ form and function. Cellular Networks in Development. , Elsevier Inc. 143 (2021).
- Chung, S., Hanlon, C. D., Andrew, D. J. Building and specializing epithelial tubular organs: The Drosophila salivary gland as a model system for revealing how epithelial organs are specified, form and specialize. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 3, 281-300 (2014).
- Yoshida, S., et al. Inhibition of collagen-induced platelet aggregation by anopheline antiplatelet protein, a saliva protein from a malaria vector mosquito. Blood. 111, 2007-2014 (2008).
- Wells, M. B., Villamor, J., Andrew, D. J. Salivary gland maturation and duct formation in the African malaria mosquito Anopheles gambiae. Scientific Reports. 7 (1), 601 (2017).
- Takahashi, S., et al. Rab11 regulates exocytosis of recycling vesicles at the plasma membrane. Journal of Cell Science. 125, 4049-4057 (2012).
- Catteruccia, F., Levashina, E. A. RNAi in the malaria vector, Anopheles gambiae. Methods in Molecular Biology. 555, 63-75 (2009).
- Balakrishna Pillai, A., et al. RNA interference in mosquito: understanding immune responses, double-stranded RNA delivery systems and potential applications in vector control. Insect Molecular Biology. 26, 127-139 (2017).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30, 313-321 (2003).
- Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
- Carrasco, D., et al. Behavioural adaptations of mosquito vectors to insecticide control. Current Opinion in Insect Science. 34, 48-54 (2019).
- Magalhaes, T., et al. Induction of RNA interference to block Zika virus replication and transmission in the mosquito Aedes aegypti. Insect Biochemistry and Molecular Biology. , 111 (2019).
