Summary
يصف البروتوكول الحالي طريقة محسنة لزيادة التعبير المشترك لعوامل النسخ PDX1 و NKX6.1 في أسلاف البنكرياس المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) في الطبقات الأحادية المستوية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تجديد المصفوفة الطازجة ، والتلاعب بكثافة الخلايا ، وفصل الخلايا الداخلية.
Abstract
الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) هي أداة ممتازة لدراسة تطور البنكرياس المبكر والتحقيق في المساهمين الوراثيين في مرض السكري. يمكن توليد الخلايا المفرزة للأنسولين المشتقة من hPSC للعلاج بالخلايا ونمذجة المرض ، مع كفاءة وخصائص وظيفية محدودة. السلف البنكرياس المشتقة من hPSC والتي هي سلائف لخلايا بيتا وخلايا الغدد الصماء الأخرى ، عندما تعبر عن عاملي النسخ PDX1 و NKX6.1 ، تحدد السلف لخلايا بيتا الوظيفية التي تفرز الأنسولين في كل من المختبر وفي الجسم الحي. تستخدم أسلاف البنكرياس المشتقة من hPSC حاليا للعلاج بالخلايا في مرضى السكري من النوع 1 كجزء من التجارب السريرية. ومع ذلك ، فإن الإجراءات الحالية لا تولد نسبة عالية من NKX6.1 وأسلاف البنكرياس ، مما يؤدي إلى التوليد المشترك لخلايا الغدد الصماء غير الوظيفية وعدد قليل من الخلايا المستجيبة للجلوكوز والتي تفرز الأنسولين. وهكذا طور هذا العمل بروتوكولا محسنا لتوليد أسلاف البنكرياس المشتقة من hPSC والتي تزيد من التعبير المشترك ل PDX1 و NKX6.1 في طبقة أحادية ثنائية الأبعاد. يتم تعديل عوامل مثل كثافة الخلايا ، وتوافر مصفوفة جديدة ، وتفكك خلايا الجلد الباطنة المشتقة من hPSC التي زادت من مستويات PDX1 و NKX6.1 في أسلاف البنكرياس المتولدة وتقليل الالتزام بالنسب الكبدي البديل. تسلط الدراسة الضوء على أن التلاعب بالبيئة المادية للخلية أثناء التمايز في المختبر يمكن أن يؤثر على مواصفات النسب والتعبير الجيني. لذلك ، يسهل البروتوكول المحسن الحالي التوليد القابل للتطوير من أسلاف التعبير المشترك PDX1 و NKX6.1 للعلاج الخلوي ونمذجة الأمراض.
Introduction
مرض السكري هو اضطراب استقلابي معقد يؤثر على ملايين الأشخاص على مستوى العالم. تعتبر مكملات الأنسولين الخيار العلاجي الوحيد لمرض السكري. يتم علاج الحالات الأكثر تقدما بالعلاج ببدائل خلايا بيتا ، والتي تتحقق من خلال زرع إما بنكرياس جثة كاملة أو جزر 1,2. تحيط العديد من القضايا بعلاج الزرع ، مثل الحد من توافر الأنسجة وجودتها ، وغزو إجراءات الزرع بالإضافة إلى الحاجة المستمرة لمثبطات المناعة. وهذا يستلزم الحاجة إلى اكتشاف خيارات جديدة وبديلة للعلاج ببدائل خلايا بيتا 2,3. ظهرت الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) مؤخرا كأداة واعدة لفهم بيولوجيا البنكرياس البشري وكمصدر غير شامل وربما أكثر تخصيصا لعلاج الزرع4،5،6،7. تتمتع hPSCs ، بما في ذلك الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) والخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSCs) ، بقدرة عالية على التجديد الذاتي وتؤدي إلى ظهور أي نوع من أنسجة جسم الإنسان. يتم اشتقاق hESCs من كتلة الخلية الداخلية للجنين ، ويتم إعادة برمجة hiPSCs من أي خلية جسدية 4,8.
تم تحسين بروتوكولات التمايز الموجه لتوليد خلايا بيتا البنكرياس من hPSCs التي توجه hPSCs بالتتابع من خلال مراحل نمو البنكرياس في المختبر. تولد هذه البروتوكولات عضويات جزيرة مشتقة من hPSC. في حين أنها تحسنت بشكل كبير في زيادة نسبة خلايا بيتا البنكرياس فيها ، فإن كفاءة البروتوكولات متغيرة للغاية. لا يزيد إلى أكثر من ~ 40٪من خلايا NKX6.1 + / INSULIN + أو C-PEPTIDE + 5،9،10،11،12،13. ومع ذلك ، فإن خلايا بيتا المتولدة ليست متطابقة تماما مع خلايا بيتا البشرية البالغة من حيث ملامحها النسخية والأيضية واستجابتها للجلوكوز4،5،14. تفتقر خلايا بيتا المشتقة من hPSC إلى التعبير الجيني لعلامات خلايا بيتا الرئيسية مثل PCSK2 و PAX6 و UCN3 و MAFA و G6PC2 و KCNK3 مقارنة بالجزر البشرية البالغة5. بالإضافة إلى ذلك ، فإن خلايا بيتا المشتقة من hPSC قد قللت من إشارات الكالسيوم استجابة للجلوكوز. وهي ملوثة بالخلايا متعددة الهرمونات المتولدة بشكل مشترك والتي لا تفرز كميات مناسبة من الأنسولين استجابة لزيادة مستويات الجلوكوز5. من ناحية أخرى ، يمكن توليد أسلاف البنكرياس المشتقة من hPSC ، والتي هي سلائف جزرية ، بشكل أكثر كفاءة في المختبر مقارنة بخلايا بيتا ، وعند زرعها في الجسم الحي ، يمكن أن تنضج إلى خلايا بيتا وظيفية تفرز الأنسولين15,16. تركز التجارب السريرية حاليا على إثبات سلامتها وفعاليتها عند الزرع في مواضيع T1D.
والجدير بالذكر أن التعبير عن عوامل النسخ PDX1 (البنكرياس والاثني عشر Homeobox 1) و NKX6.1 (NKX6 Homeobox 1) داخل نفس الخلية السلفية للبنكرياس أمر بالغ الأهمية للالتزام تجاه سلالة خلية بيتا5. السلف البنكرياس التي تفشل في التعبير عن NKX6.1 تؤدي إلى خلايا الغدد الصماء متعددة الهرمونات أو خلايا بيتا غير الوظيفية17,18. لذلك ، فإن التعبير المشترك العالي ل PDX1 و NKX6.1 في مرحلة السلف البنكرياسي ضروري لتوليد عدد كبير من خلايا بيتا الوظيفية في النهاية. أظهرت الدراسات أن الجسم الجنيني أو الثقافة ثلاثية الأبعاد تعزز PDX1 و NKX6.1 في أسلاف البنكرياس حيث يتم تجميع الخلايا المتمايزة ، والتي تتراوح بين 40٪ -80٪ من سكان PDX1 + / NKX6.1 +12,19. ومع ذلك ، بالمقارنة مع ثقافات التعليق ، فإن ثقافات التمايز 2D أكثر فعالية من حيث التكلفة وممكنة وملائمة للتطبيق على خطوط خلايا متعددة5. لقد أظهرنا مؤخرا أن ثقافات التمايز أحادية الطبقة تنتج أكثر من 90٪ من أسلاف البنكرياس المشتقة من PDX1 + / NKX6.1 +20،21،22. منحت الطريقة المبلغ عنها قدرة تكرار عالية لأسلاف البنكرياس المتولدة ومنعت مواصفات المصير البديلة مثل السلالة الكبدية21. لذلك ، هنا ، يوضح هذا البروتوكول طريقة عالية الكفاءة للتمييز بين hPSCs وسلائف خلايا بيتا البنكرياسية التي تعبر عن PDX1 و NKX6.1. تستخدم هذه الطريقة تقنية فصل الأديم الباطن المشتق من hPSC والتلاعب بكثافة الخلية ، متبوعا بإشارات FGF و Retinoid الممتدة بالإضافة إلى تثبيط القنفذ لتعزيز التعبير المشترك PDX1 و NKX6.1 (الشكل 1). يمكن أن تسهل هذه الطريقة جيلا قابلا للتطوير من سلائف خلايا بيتا البنكرياسية المشتقة من hPSC لعلاج الزرع ونمذجة المرض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على الدراسة من قبل لجنة أخلاقيات البحث المؤسسي المناسبة وتم إجراؤها وفقا للمعايير الأخلاقية على النحو المنصوص عليه في إعلان هلسنكي لعام 1964 وتعديلاته اللاحقة أو المعايير الأخلاقية المماثلة. تمت الموافقة على البروتوكول من قبل مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) التابع لمؤسسة حمد الطبية (رقم 16260/16) ومعهد قطر لبحوث الطب الحيوي (رقم 2016-003). تم تحسين هذا العمل ل hESCs مثل H1 و H9 و HUES8. تم الحصول على عينات الدم من الأفراد الأصحاء من مستشفى مؤسسة حمد الطبية بموافقة كاملة مستنيرة. يتم إنشاء iPSCs من خلايا الدم أحادية النواة المحيطية (PBMCs) للتحكم ، الفرد السليم23.
1. إعداد الإعلام الثقافي
- تحضير وسائط زراعة الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSC)
- تحضير وسائط استزراع hPSC من الوسط المتاح تجاريا للحفاظ على الخلايا الجذعية الجنينية البشرية وتوسيعها عن طريق استكمال 100 وحدة / مل من البنسلين و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين (انظر جدول المواد). القسمة وتخزين الوسائط الكاملة في -20 درجة مئوية على المدى الطويل أو 4 درجة مئوية للاستخدام الفوري.
- تحضير وسائط تمايز المرحلة 1 (للأديم الباطن النهائي (DE)).
- تحضير الوسائط القاعدية من وسائط MCDB 131 عن طريق المكمل بنسبة 0.5٪ من ألبومين مصل الأبقار الخالي من الأحماض الدهنية (FFA-BSA) ، و 1.5 جم / لتر من بيكربونات الصوديوم (NaHCO3) ، و 10 مللي متر من الجلوكوز ، و 2 ملي متر من الجلوتاماكس ، و 100 وحدة / مل من البنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين (انظر جدول المواد). قم بتصفية الوسائط المعدة باستخدام مرشح 0.2 ميكرومتر وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- تحضير وسائط المرحلة الأولى التي تحتوي على CHIR99021 من الوسط القاعدي (المحضرة في الخطوة 1.2.1) عن طريق تسخين الوسط القاعدي عند 37 درجة مئوية ثم تكميله ب 2 ميكرومتر من CHIR99021 و 100 نانوغرام / مل من Activin A و 10 ميكرومتر من مثبط الصخور (Y-27632) و 0.25 مليمتر من فيتامين C (انظر جدول المواد). امزج الوسائط التكميلية جيدا وقم بتغطيتها بورق الألمنيوم لحمايتها من الضوء.
ملاحظة: سيتم استخدام هذه الوسائط فقط في اليوم الأول من التمايز. - تحضير وسائط المرحلة 1 بدون CHIR99021 من الوسائط القاعدية عن طريق تسخينها عند 37 درجة مئوية وتكميلها ب 100 نانوغرام / مل من Activin A و 0.25 مليمتر من فيتامين C وتخلط جيدا.
ملاحظة: يمكن إضافة 5 نانوغرام/مل من FGF أو FGF2 الأساسي اختياريا إلى هذه الوسائط. سيتم استخدام هذه الوسائط للأيام المتبقية من المرحلة 1.
- إعداد وسائط تمايز المرحلة 2 (لأنبوب الأمعاء البدائي ؛ PGT).
- تحضير وسائط تمايز المرحلة 2 التي تحتوي على مثبط الصخور من الوسط القاعدي عن طريق تسخينه عند 37 درجة مئوية وتكميله ب 50 نانوغرام / مل من FGF10 ، و 50 نانوغرام / مل من NOGGIN ، و 0.25 ميكرومتر من CHIR99021 ، و 10 ميكرومتر من Y-27632 (مثبط الصخور) ، و 0.25 مليمول من فيتامين C.
ملاحظة: يتم استخدام هذه الوسائط في يوم تفكك الخلايا الباطنة. - قم بإعداد وسائط تمايز المرحلة 2 بدون مثبط الصخور باتباع نفس الإجراء للوسائط المعدة في الخطوة 1.3.1 ، باستثناء مثبط الصخور.
ملاحظة: يتم استخدام هذه الوسائط في اليوم الثاني من المرحلة 2.
- تحضير وسائط تمايز المرحلة 2 التي تحتوي على مثبط الصخور من الوسط القاعدي عن طريق تسخينه عند 37 درجة مئوية وتكميله ب 50 نانوغرام / مل من FGF10 ، و 50 نانوغرام / مل من NOGGIN ، و 0.25 ميكرومتر من CHIR99021 ، و 10 ميكرومتر من Y-27632 (مثبط الصخور) ، و 0.25 مليمول من فيتامين C.
- إعداد وسائط تمايز المرحلة 3 (للمقدمة الخلفية).
- تحضير وسائط DMEM التي تحتوي على 4.5 جم / لتر من الجلوكوز ، ثم استكملها ب 1٪ من البنسلين - الستربتومايسين و 2 مليمتر من الجلوتاماكس واستخدامها كوسائط قاعدية للمرحلتين 3 و 4.
- قم بتسخين وسائط DMEM (المحضرة في الخطوة 1.4.1) وتكملة ب 2 ميكرومتر من حمض الريتينويك ، و 0.25 ميكرومتر من SANT-1 ، و 50 نانوغرام / مل من FGF10 ، و 50 نانوغرام / مل من NOGGIN ، و 0.25 مليمول من فيتامين C ، و 1٪ B27 مكمل بدون فيتامين A (انظر جدول المواد).
ملاحظة: يتم استخدام هذه الوسائط لمدة 4 أيام من المرحلة 3 ل P2-D (البروتوكول 2 ، محسن ، منفصل) ويومين من المرحلة 3 ل P1-ND (البروتوكول 1 ، غير محسن ، غير منفصل).
- تحضير وسائط تمايز المرحلة 4 (لأسلاف البنكرياس).
- أضف DMEM الذي يحتوي على 4.5 جم / لتر من الجلوكوز مع 100 نانوغرام / مل من EGF ، و 10 مليمتر من نيكوتيناميد ، و 50 نانوغرام / مل من NOGGIN ، و 0.25 ملي متر من فيتامين C ، و 1٪ من مكمل B27 بدون فيتامين A (انظر جدول المواد). استخدم هذه الوسائط لجميع أيام المرحلة 4.
ملاحظة: حافظ على جميع الكواشف في درجات حرارة مناسبة ، ويجب اقتباس جميع السيتوكينات والكواشف الحساسة. قم بإذابة الكواشف المقتبسة وإضافتها إلى الوسائط القاعدية في وقت تغيير وسائط التمايز. وترد تركيبات وسائط التمايز المختلفة في الجدول 1.
- أضف DMEM الذي يحتوي على 4.5 جم / لتر من الجلوكوز مع 100 نانوغرام / مل من EGF ، و 10 مليمتر من نيكوتيناميد ، و 50 نانوغرام / مل من NOGGIN ، و 0.25 ملي متر من فيتامين C ، و 1٪ من مكمل B27 بدون فيتامين A (انظر جدول المواد). استخدم هذه الوسائط لجميع أيام المرحلة 4.
2. إعداد الأطباق المطلية بمصفوفة غشاء الطابق السفلي
- ذوبان مصفوفة الطابق السفلي المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد) والقسمة على الجليد ؛ قم بتجميد القسمة عند -20 درجة مئوية.
- قبل طلاء أطباق زراعة الأنسجة ، قم بإذابة القسمة المجمدة على الجليد. أضف الحجم المناسب من محلول مصفوفة الغشاء إلى وسائط KO-DMEM / F-12 المبردة (KnockOut DMEM / F-12) (انظر جدول المواد) لتحقيق التركيز المخفف المطلوب والخلط جيدا. قم بتخزين محلول المصفوفة المخفف في درجة حرارة 4 درجات مئوية للاستخدام الفوري.
- قم بتغطية سطح الألواح المعالجة بزراعة الأنسجة (انظر جدول المواد) بمحلول مصفوفة الغشاء المخفف وضع الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة على الأقل قبل طلاء الخلايا. استخدم تخفيفا بنسبة 1:50 من محلول مصفوفة الغشاء في KO-DMEM / F-12 لخلايا الطلاء لتجربة تمايز البنكرياس و 1:80 لتوسيع hPSCs غير المتمايزة.
3. ثقافة hPSCs غير المتمايزة
- قم بتمرير hPSCs عندما تصل المستعمرات إلى التقاء 70٪ -80٪.
- للمرور ، اغسل hPSCs مرة واحدة باستخدام PBS الدافئ ، واستنشق باستخدام شفاط فراغ محمول داخل غطاء زراعة الأنسجة ، وأضف 0.5 مللي متر من محلول EDTA في PBS لتغطية سطح المستعمرة. احتضان عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 1 دقيقة أو حتى تنفصل حدود المستعمرات عن سطح اللوحة.
- قم بإزالة محلول EDTA واجمع مستعمرات الفصل باستخدام وسيط استزراع hPSC باستخدام ماصة P1000. الطرد المركزي للخلايا التي تم جمعها في 128 × ز لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية واستكمل الخلايا بوسائط زراعة hPSC التي تحتوي على 10 ميكرومتر من Y-27632 (مثبط الصخور)23,24.
ملاحظة: قم بتمرير hPSCs بنسبة 1: 3 على الأقل على الأطباق المطلية بمصفوفة الغشاء 1:80. ومع ذلك ، بالنسبة لتجارب التمايز ، قم بطبق hPSCs على أطباق مغلفة 1:50.
4. تحريض تمايز الأديم الباطن النهائي (DE) في hPSCs (المرحلة 1)
- عندما تصل مستعمرات hPSC إلى التقاء 70٪ -80٪ ، اغسلها مرتين باستخدام PBS الدافئ واستنشق باستخدام شفاط فراغ محمول داخل غطاء زراعة الأنسجة لبدء تمايز المرحلة 1.
- أضف وسيط تمايز المرحلة 1 الذي يحتوي على CHIR99021 (من الخطوة 1.2.2) إلى المستعمرات ، 2 مل لكل لوحة 6 آبار ، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
- في اليوم التالي، استبدل الوسائط المستهلكة بوسيط تمايز المرحلة 1 بدون CHIR99021 (الخطوة 1.2.3).
- كل 24 ساعة ، قم بشفط الوسائط المستهلكة باستخدام شفاط فراغ محمول داخل غطاء زراعة الأنسجة واستبدله بوسيط تمايز جديد من المرحلة 1 بدون CHIR99021.
ملاحظة: يمكن تمديد المرحلة 1 حتى 4 أيام. يعتمد طول المرحلة 1 على خط hPSC المستخدم ويجب تحسينه وفقا لذلك.
5. تحليل التألق المناعي ل DE المشتق من hPSC (المرحلة 1)
- من أجل التألق المناعي ، قم بشفط الوسائط المستهلكة باستخدام شفاط فراغ محمول داخل غطاء زراعة الأنسجة من الآبار واغسله مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني دافئ. حرك اللوحة للتخلص من أي حطام خلوي.
- تغطية سطح الآبار بنسبة 4٪ من بارافورمالدهيد (PFA) لإصلاح خلايا DE ؛ على سبيل المثال ، أضف 250 ميكرولتر من PFA لكل بئر من لوحة 24 بئر. ضع الطبق على شاكر ثنائي الأبعاد عند 20 × جم لمدة 20 دقيقة.
- بعد التثبيت ، اغسل خلايا DE بمحلول ملحي مخزن بنسبة 0.5٪ من Tween (TBST) (انظر جدول المواد) وضع الطبق على الخلاط عند 20 × جم لمدة 10 دقائق. كرر هذه الخطوة مرة أخرى.
- اختراق الخلايا الثابتة عن طريق إضافة حجم سخي من محلول ملحي مخزن بالفوسفات مع 0.5٪ من Triton X-100 (PBST) ؛ على سبيل المثال ، أضف 1 مل من PBST لكل بئر من لوحة 24 بئرا وضع اللوحة مرة أخرى على شاكر عند 20 × جم لمدة 20 دقيقة.
- قم بإعداد 5٪ -6٪ من BSA حديثا في PBST كمخزن مؤقت للحظر وإضافته إلى الخلايا المخترقة. احتضان اللوحة لمدة 1 ساعة على الأقل في محلول الحجب على شاكر.
- تمييع الأجسام المضادة الأولية ضد SOX17 و FOXA2 معا (انظر جدول المواد) في 2٪ -3٪ BSA في محلول PBST. أضف الأجسام المضادة المدمجة إلى الخلايا المسدودة وضع اللوحة على الخلاط عند 4 درجات مئوية طوال الليل بسرعة منخفضة مع اهتزاز لطيف.
ملاحظة: SOX17 و FOXA2 هي علامات DE راسخة25,26. - في اليوم التالي ، استنشق الأجسام المضادة الأولية باستخدام مرشح فراغ محمول واغسل الآبار ب TBST ثلاث مرات ، كل غسل لمدة 10 دقائق على شاكر.
- قم بإعداد 1: 500 تخفيف من Alexa fluor 488- و 568- الأجسام المضادة الثانوية المترافقة (انظر جدول المواد) ضد الأنواع التي نشأت فيها الأجسام المضادة الأولية.
- أضف تركيبة الأجسام المضادة الثانوية إلى البئر الملون وقم بتغطية اللوحة بورق الألمنيوم للحماية من الضوء. ضع اللوحة على شاكر لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- قم بشفط محلول الأجسام المضادة الثانوي باستخدام مرشح فراغ محمول واغسل الآبار الملطخة باستخدام TBST على شاكر لمدة 10 دقائق ، مع تغطية اللوحة بورق الألمنيوم. كرر خطوة الغسيل ما مجموعه ثلاث مرات.
- قم بإعداد 1 ميكروغرام / مل من تخفيف Hoechst 33342 في PBS لتلطيخ النوى. أضف محلول Hoechst إلى الآبار وضع اللوحة على شاكر لمدة 2-3 دقائق.
- قم بشفط محلول Hoechst باستخدام مرشح فراغ محمول وشطف الآبار باستخدام PBS مرتين.
- أخيرا ، أضف PBS إلى الخلايا الملطخة وقم بتصويرها باستخدام مجهر مضان مقلوب (انظر جدول المواد) في الظلام. حافظ على اللوحة مغطاة بورق القصدير عند عدم التصوير لتقليل تبييض الفلوروفور.
ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن استخدام قياس التدفق الخلوي لتقييم كفاءة DE كما هو موضح في الخطوة 9.2.
6. توليد أنبوب الأمعاء البدائي (PGT) من hPSCs (المرحلة 2)
ملاحظة: إذا تم تحديد تحليل التألق المناعي في الخطوة 5.13 على أنه تعبير مشترك SOX17-FOXA2 بنسبة 80٪ وما فوق ، تنتقل التجربة إلى المرحلة 2. إذا كانت الكفاءة <80٪ ، فقم بتمديد مدة المرحلة 1 إلى 4 أيام.
- في اليوم 1 من المرحلة 2 ، افصل خلايا الجلد الباطنة المشتقة من hPSC باستخدام TrypLE أو Accutase (انظر جدول المواد) لبروتوكول P2-D الأمثل. اغسل الخلايا الملتصقة باستخدام PBS الدافئ وأضف 1 مل دافئ من محلول TrypLE أو Accutase لكل بئر من لوحة 6 آبار لمدة 3-5 دقائق عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ، أو حتى تبدأ الخلايا في الانفصال عن بعضها البعض.
- افصل الصفائح المنفصلة أو أحادية الطبقة من الخلايا في الآبار ثم اجمعها معا في أنبوب بولي بروبيلين سعة 15 مل باستخدام وسائط المرحلة 1/2 القاعدية بدون سيتوكينات تحتوي على 0.5٪ على الأقل من مصل الأبقار الجنينية (FBS) أو مصل KnockOut (KOSR) (انظر جدول المواد).
- قم بتدوير الخلايا لأسفل عند 800 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية. أضف 1 مل من PBS المعقم وأعد تعليق الحبيبات في خلايا مفردة.
- عد الخلايا باستخدام عداد آلي (انظر جدول المواد) عن طريق تحميل الحجم الموصى به من الخلايا في شريحة الغرفة. قم بتدوير الخلايا المعاد تعليقها عند 800 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية.
- أعد تعليق الحبيبات في الحجم المناسب من وسط التمايز من المرحلة 2 الذي يحتوي على مثبط الصخور بكثافة 2.5-3.5 × 105 خلايا / سم2.
ملاحظة: قد ينخفض هذا العدد إلى نسبة تقسيم 1: 2 لمعظم خطوط الخلايا ، اعتمادا على معدل الانتشار. سيكون الحجم الإجمالي 2 مل من الوسائط مع الخلايا المعاد تعليقها في 1 بئر من لوحة 6 آبار. - قم بطلاء الخلايا المعاد تعليقها على ألواح مغلفة بمصفوفة غشائية 1:50 (محضرة في الخطوة 2) واحتضانها عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 في الحاضنة.
- بعد 24 ساعة، استبدل الوسائط بوسط تمايز المرحلة 2 بدون مثبط الصخور (معد في الخطوة 1.3.2).
7. توليد الأمعاء الأمامية الخلفية من hPSCs (المرحلة 3)
- قم بشفط وسائط المرحلة 2 المستهلكة باستخدام شفاط فراغ محمول داخل غطاء زراعة الأنسجة واغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني دافئ.
- أضف وسائط تمايز المرحلة 3 من الخطوة 1.4 إلى الخلايا واحتضانها عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2.
- بعد 24 ساعة ، استبدل الوسائط المستهلكة بوسائط تمايز المرحلة 3 المعدة حديثا. كرر هذا لمدة 4 أيام لبروتوكول P2-D (المحسن) ويومين فقط لبروتوكول P1-ND غير المنفصل.
8. جيل أسلاف البنكرياس من hPSCs (المرحلة 4)
- بعد 4 أيام من علاج المرحلة 3 ، اغسل الخلايا باستخدام PBS الدافئ ، وقم بتدوير اللوحة برفق ، واستنشق باستخدام شفاط فراغ محمول. ثم أضف وسائط تمايز المرحلة 4 من الخطوة 1.5 إلى الخلايا.
- بعد 24 ساعة ، استبدل الوسائط المستهلكة بوسائط المرحلة 4 المعدة حديثا. كرر هذا لمدة 4 أيام.
9. تقييم كفاءة التمايز لتوليد أسلاف البنكرياس من hPSCs
- قم بإجراء تحليل التألق المناعي لأسلاف البنكرياس المشتقة من hPSC (المرحلة 4) للتعبير عن PDX1 و NKX6.1.
ملاحظة: PDX1 و NKX6.1 هي علامات السلف البنكرياس راسخة17،18.- قم بإجراء التثبيت والنفاذية والحجب وحضانة الأجسام المضادة وغسلها وفقا للخطوة 5.
- قم بتلطيخ أسلاف البنكرياس المشتقة من hPSC بمزيج من الأجسام المضادة PDX1 و NKX6.1 (انظر جدول المواد) المخففة في 2٪ -3٪ BSA في PBST.
- استخدم 1: 500 تخفيفات من الأجسام المضادة الثانوية المناسبة Alexa fluor 488 و 568 (انظر جدول المواد).
- إجراء تحليل التدفق الخلوي لأسلاف البنكرياس المشتقة من hPSC للتعبير عن PDX1 و NKX6.1.
ملاحظة: يوفر تحليل التدفق الخلوي لعلامات البنكرياس في أسلاف البنكرياس المشتقة من hPSC طريقة لتحديد خلايا التعبير المشترك PDX1 و NKX6.1.- في نهاية المرحلة 4 ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS الدافئ وأضف ما يكفي من TrypLE أو Accutase لتغطية سطح الآبار ، على سبيل المثال ، 1 مل من TrypLE أو Accutase لكل بئر من لوحة 6 آبار. ضع اللوحة في الحاضنة لمدة 5-7 دقائق أو حتى تنفصل الخلايا عن السطح.
- افصل صفائح الخلايا الملتصقة داخل البئر باستخدام ماصة P1000 قبل جمعها في أنبوب بولي بروبيلين سعة 15 مل.
- قم بتدوير الخلايا في أسلاف البنكرياس المشتقة من hPSC عند 800 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، ثم تخلص من المادة الطافية. اغسل الخلايا باستخدام PBS عن طريق فصلها إلى خلايا مفردة. عد الخلايا باستخدام عداد آلي (انظر جدول المواد) ولاحظ التركيز في عدد الخلايا لكل مل.
- تدور على 800 × غرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية. أضف 200 ميكرولتر من PBS المبرد إلى الحبيبات وانفصل.
- أضف 2 مل من الإيثانول المبرد بنسبة 80٪ بالتنقيط ، مع وجود الأنبوب على دوامة بسرعة منخفضة إلى متوسطة (400 × جم في درجة حرارة الغرفة). أغلق الأغطية بإحكام وضع الأنابيب مائلة قليلا على الخلاط عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
- قم بتدوير الخلايا عند 800 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، واغسلها باستخدام PBS لفصل أي كتل من الخلايا الثابتة.
- قم بحظر الخلايا الثابتة بمحلول BSA بنسبة 5٪ -6٪ في PBST لمدة 1 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة أو 4 درجات مئوية طوال الليل على شاكر.
- وصمة عار لعلامات السلف البنكرياس باتباع الخطوات أدناه.
- توزيع 2,00,000 خلية لكل حالة ، بما في ذلك عناصر التحكم المناسبة في النمط المتماثل التي تعتمد على الفئة الفرعية IgG للأنواع المضيفة من الجسم المضاد الأساسي ، وضوابط الأجسام المضادة غير الملوثة والثانوية في لوحة سفلية 96 بئرا V أو أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 مل.
- قم بتدوير اللوحة لأسفل عند 800 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية واقلب اللوحة بحركة سريعة للتخلص من المادة الطافية دون فقد الكريات. تحضير تخفيفات الأجسام المضادة الأولية في محلول BSA بنسبة 3٪ (انظر جدول المواد).
ملاحظة: يمكن أن يكون تركيز الأجسام المضادة الأولية بين 1:50 إلى 1:200. - احتضان الخلايا الملطخة لمدة 2 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية على شاكر مع اهتزاز لطيف بسرعة منخفضة.
- اغسل الخلايا الملطخة ب TBST ثلاث مرات عن طريق سحب الخلايا لأعلى ولأسفل في الآبار. قم بتدوير وتجاهل المادة الطافية كما في الخطوة 9.2.8.2.
- أضف 1: 500 تخفيف الأجسام المضادة الثانوية (الأجسام المضادة المترافقة Alexa fluor 488 و 647) المحضرة في PBS (انظر جدول المواد). احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- اغسل الخلايا الملطخة ب TBST مرتين على الأقل عن طريق سحب الخلايا لأعلى ولأسفل. أدر اللوحة وتخلص من المادة الطافية كما في الخطوة 9.2.8.2.
- اجمع الخلايا الملطخة في 100 ميكرولتر على الأقل من PBS وانقلها إلى أنابيب FACS المحمية من الضوء (انظر جدول المواد). قم بتشغيل العينات على جهاز قياس التدفق الخلوي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تظهر النتائج أن البروتوكول المحسن P2-D (الأشكال 1A) عزز كفاءة تمايز السلف البنكرياس من خلال تنظيم التعبير المشترك PDX1 و NKX6.1 (الشكل 2A و B والشكل 3A). على وجه الخصوص ، أظهرت النتائج أن تفكك خلايا الجلد الباطن وإعادة طلائها على مصفوفة غشاء جديدة جنبا إلى جنب مع مدة أطول من المرحلة 3 عزز تعبير NKX6.1 في أسلاف البنكرياس المشتقة من hPSC (البروتوكول الأمثل ، P2-D) (الشكل 2 والشكل 3 أ) ، مقارنة بالبروتوكول غير المنفصل (P1-ND) الذي تم تعديله من دراسة منشورة مسبقا27 . كما أنتج البروتوكول المعزز الحالي أعلى نسبة من أسلاف PDX1 + / NKX6.1 + مقارنة ب "P1-D" (البروتوكول 1 ، S3 = يومان ، منفصل) و "P2-ND" (البروتوكول 2 ، S3 = 4 أيام ، غير منفصل) ، وقد تم نشر النتائج التفصيلية سابقا21. السلف البنكرياس التي تم إنشاؤها باستخدام P2-D لديها أيضا أعداد متزايدة من خلايا SOX9 + مقارنة ب P1-ND غير المنفصلة (الشكل 3B). أنتجت الطريقة المثلى أيضا نسبة أعلى من الخلايا التكاثرية NKX6.1 + التي تعبر عن علامة الانتشار Ki67 (الشكل 3C).
النتائج التمثيلية المقدمة هنا هي من iPSCs المتولدة من خلايا الدم أحادية النواة المحيطية (PBMCs) للتحكم ، الفرد السليم. ومع ذلك ، فقد طبقنا بشكل متكرر البروتوكول المحسن الحالي على خطوط hPSC متعددة مثل H1-hESCs و H9-hESCs و HUES8-hESCs والعديد من خطوط التحكم الأخرى iPSC لإنتاج ~ 90٪ PDX1 و NKX6.1 أسلاف البنكرياس20،21،28.
بعد تحريض DE في hPSCs ، من المتوقع حدوث مستويات خفيفة من موت الخلايا. ومع ذلك ، إذا لوحظ ارتفاع معدل موت الخلايا ، تم إيقاف التجربة وبدأت مرة أخرى مع مجموعة جديدة من الخلايا. يجب أن تكون كفاءة تحريض DE أعلى من 70٪ -80٪ لضمان نسبة عالية من خلايا DE في المزرعة التي ستكون بمثابة مصدر انطلاق مثالي لتحريض السلف البنكرياس (الشكل 1C).
يمكن التلاعب بكثافة إعادة طلاء خلايا الجلد الباطن بعد التفكك بناء على معدل نمو تلك الخلية المعينة. على سبيل المثال ، يمكن إعادة طلاء الخلايا بطيئة النمو بكثافة أعلى من الموصى بها. سيؤدي ذلك إلى تقليل فرص الحصول على مجموعات البنكرياس غير ذات الصلة في المرحلة 4. يمكن الحصول على تعبير مشترك عالي ل PDX1 و NKX6.1 بعد التفكك بعد المرحلة 1 وإعادة الطلاء بنصف الكثافة (الشكل 1 أ ، الشكل 2 أ ، ب ، والشكل 3 أ). إذا لوحظ تعبير مرتفع عن PDX1 ولكن فقط تعبير معتدل عن NKX6.1 ، فيمكن تمديد المرحلة 4 لمدة يومين لتعزيز تعبير NKX6.1 في خلايا التعبير عن PDX1.
الشكل 1: الجدول الزمني لإضافة السيتوكينات وعوامل النمو أثناء تمايز السلف البنكرياس. (أ) تمثيل تخطيطي للبروتوكول الأمثل (P1-D) لتوليد PDX1 و NKX6.1 من hPSCs. يتم فصل الأديم الباطن النهائي المشتق من hPSC وإعادة طلائه بنصف الكثافة ثم يتم توجيهه بالتتابع نحو مصير السلف البنكرياس. (ب) صور hPSCs في برايت فيلد قبل بدء التمايز في اليوم 0. (ج) تحليل التلوين المناعي للتعبير عن علامات الجلد الباطن SOX17 و FOXA2 في خلايا الأديم الباطن المشتقة من hPSC (المرحلة 1). SOX17 ، أخضر ؛ FOXA2 ، أحمر. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: توليد أسلاف البنكرياس المشتقة من hPSC ، والتعبير المشترك PDX1 و NKX6.1. تحليل التلوين المناعي لمقارنة تعبير PDX1 و NKX6.1 في أسلاف البنكرياس المشتقة من hPSC باستخدام البروتوكول المحسن (P2-D) (A) وبروتوكول غير محسن تم نشره مسبقا (P1-ND) (B). حقق البروتوكول المحسن أعلى تعبير مشترك ل PDX1 و NKX6.1. PDX1 ، أخضر ؛ NKX6.1 ، أحمر. يتم توفير الصور المكبرة في اللوحة الثانية لكل بروتوكول. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: القياس الكمي لعلامات البنكرياس في أسلاف البنكرياس المتولدة باستخدام البروتوكول المحسن. أدى تحليل التدفق الخلوي في أسلاف البنكرياس المشتقة من hPSC إلى استخدام P2-D مقارنة ب P1-ND غير المنفصل. (أ) الرسوم البيانية لتعبير PDX1 و NKX6.1 والرسوم البيانية للتلطيخ المزدوج الموجب. (ب) الرسوم البيانية لتعبير SOX9 و (C) التعبير المشترك ل NKX6.1 مع علامة الانتشار Ki67. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| مرحلة | وسائط | السيتوكينات | أيام | ||||||
| 1 | MCDB 131 وسائط + 0.5٪ ألبومين مصل بقري خال من الأحماض الدهنية (FFA-BSA) ، 1.5 جم / لتر بيكربونات الصوديوم (NaHCO3) ، 10 مليمتر من الجلوكوز | اليوم الأول: 2 ميكرومتر CHIR99021 ، 100 نانوغرام / مل أكتيفين أ ، 10 ميكرومتر مثبط الصخور (Y-27632) ، 0.25 مليمتر فيتامين ج. اليوم الثاني فصاعدا: 100 نانوغرام / مل أكتيفين أ ، 0.25 مليمتر فيتامين ج | 3 أو 4 | ||||||
| 2 | MCDB 131 وسائط + 0.5٪ ألبومين مصل بقري خال من الأحماض الدهنية (FFA-BSA) ، 1.5 جم / لتر بيكربونات الصوديوم (NaHCO3) ، 10 مللي مول جلوكوز | اليوم الأول (التفكك): 50 نانوغرام / مل FGF10 ، 50 نانوغرام / مل NOGGIN ، 0.25 ميكرومتر CHIR99021 ، 10 ميكرومتر Y-27632 (مثبط الصخور) ، 0.25 مللي متر فيتامين ج. اليوم 2: 50 نانوغرام / مل FGF10 ، 50 نانوغرام / مل NOGGIN ، 0.25 ميكرومتر CHIR99021 ، 0.25 مللي مول فيتامين سي. | 2 | ||||||
| 3 | DMEM + 4.5 جم / لتر جلوكوز | 2 ميكرومتر حمض الريتينويك ، 0.25 ميكرومتر SANT-1 ، 50 نانوغرام / مل FGF10 ، 50 نانوغرام / مل NOGGIN ، 0.25 مللي متر فيتامين ج ، 1٪ مكمل B27 بدون فيتامين أ | 4 | ||||||
| 4 | DMEM + 4.5 جم / لتر جلوكوز | 100 نانوغرام / مل EGF ، 10 مللي متر نيكوتيناميد ، 50 نانوغرام / مل NOGGIN ، 0.25 مليمتر فيتامين ج ، 1٪ مكمل B27 بدون فيتامين أ. | 4 | ||||||
الجدول 1: تركيبات وسائط التمايز المختلفة المستخدمة في الدراسة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف هذا العمل بروتوكولا محسنا لتوليد أسلاف البنكرياس من hPSCs مع تعبير مشترك عالي عن PDX1 و NKX6.1. أدى تفكك وإعادة طلاء الأديم الباطن المشتق من hPSC بنصف كثافة على مصفوفة جديدة إلى ارتفاع PDX1 و NKX6.1 في أسلاف البنكرياس المشتقة من hPSC.
على الرغم من أن كوكتيل عامل النمو لكل مرحلة يشبه إلى حد كبير P1-ND 27 ، فقد ثبت أن علاج المرحلة 3 الأكثر امتدادا بما في ذلك FGF وإشارات الريتينويد وتثبيط BMP والقنفذ يزيد من تعبير NKX6.1 ، وهو ما يتناقض مع نتائج Nostro et al.27. في حين أن تعبير PDX1 في البنكرياس أثناء التطور الجنيني يتم تنظيمه بشكل إيجابي بواسطة FGF وإشارات الريتينويد وتثبيط BMP والقنفذ27،29،30 ، أظهرت النتائج الحالية أن امتداد كوكتيل الإشارات هذا ينظم أيضا NKX6.1. ومع ذلك ، فقد ساعد تأثير علاج المرحلة 3 الممتد من خلال تفكك وإعادة طلاء خلايا الأديم الباطن التي أدت إلى زيادة تعبير PDX1 و NKX6.1. علاوة على ذلك ، زادت هذه الطريقة (P2-D) أيضا من الخلايا المعبرة عن SOX9 في أسلاف البنكرياس المشتقة من hPSC ، بالإضافة إلى نسبة الخلايا التكاثرية NKX6.1 + التي تعبر عن علامة الانتشار Ki67.
عامل حاسم آخر يؤثر على كفاءة التمايز هو توافر مصفوفة غشاء جديدة للخلايا المنفصلة. تم إثبات مكونات المصفوفة خارج الخلية سابقا لتنظيم مواصفات مصير الخلايا الجذعية31,32. بشكل عام ، تم تسجيل التأثيرات الإيجابية لمكونات المصفوفة خارج الخلية على تطور البنكرياس 33،34،35 ، خاصة بالنسبة لمصفوفة الغشاء ، والتي ، جنبا إلى جنب مع اللامينين ، ثبت أن لها تأثيرا مؤيدا للغدد الصماء على خلايا سلالة البنكرياس 36. لذلك ، قد تكون إعادة طلاء خلايا الجلد الباطن على مصفوفة الغشاء الطازج قد عززت تعبير NKX6.1 في أسلاف البنكرياس المشتقة من hPSC.
تتحكم كثافة الخلايا المتمايزة أيضا في التعبير الجيني. أظهرت دراسات متعددة أهمية الاتصال بين الخلية والخلية في تنظيم نمو البنكرياس37،38،39. وقد تبين أن التجميع الخلوي أو تكوين الجسم الجنيني يحفز التعبير الجيني للغدد الصماء في البنكرياس أعلى من الثقافات 2D19. ومع ذلك ، تظهر النتائج أنه يمكن الحصول على تعبير أعلى للبنكرياس ، وخاصة NKX6.1 ، عن طريق زراعة الخلايا في طبقة أحادية ثنائية الأبعاد بنصف كثافة الأديم الباطن باستخدام بروتوكولناالمحسن 21. ومن المثير للاهتمام ، أن هذه الطريقة تثبط أيضا مصير الخلايا الكبدية (المصير البديل ل DE المشتق من hPSC) كما لوحظ من خلال انخفاض التعبير عن الجينات الكبدية AFP (Alpha-fetoprotein) و ALB (Albumin)21 ، مما يشير إلى أن العوامل الفيزيائية تلعب دورا في مواصفات نسب hPSCs.
بشكل عام ، تظهر النتائج أن تعديل البيئة المادية للخلايا المتمايزة يمكن أن يعزز التعبير الجيني للبنكرياس21. على وجه التحديد ، يمكن أن يؤدي تفكك الأديم الباطن المشتق من hPSC وإعادة الطلاء على مصفوفة غشاء جديدة مع FGF أطول وإشارات الريتينويد وتثبيط القنفذ و BMP إلى تعزيز التعبير المشترك PDX1 و NKX6.1 في أسلاف البنكرياس المشتقة من hPSC. ومع ذلك ، فإن البروتوكول الأمثل هو على الأقل 2 أيام أطول من البروتوكولات المنشورة سابقا. أيضا ، يمكن تمديد طول المرحلة 4 إلى ما بعد الحد الأدنى الموصى به ، أي 4 أيام ، بناء على خط الخلية المستخدم. يتم استخدام عوامل نمو بشرية متعددة مؤتلفة في البروتوكول الأمثل الذي يمكن استبداله بمركبات الجزيئات الصغيرة الأقل تكلفة التي تؤدي نفس الإجراء. ومع ذلك ، يمكن لهذا البروتوكول الأمثل تسهيل الجيل القابل للتطوير من أسلاف البنكرياس من hPSCs للعلاج الخلوي ونمذجة المرض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل بمنحة من الصندوق القطري لرعاية البحث العلمي (QNRF) (Grant No. NPRP10-1221-160041).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL, conical, centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
| 20X TBS Tween 20 | Thermo Scientific | 28360 | |
| 24-well culture plates, flat bottom with lid | Costar | 3524 | |
| 50 mL, conical, centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | |
| 6- well culture plates, multidish | Thermo Scientific | 140685 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 0-7920 | |
| Activin A | R&D | 338-AC | Reconstituted in 4 mM HCl |
| Anti NKX6.1 antibody, mouse monoclonal | DSHB | F55A12-C | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining |
| Anti-PDX1 antibody, guinea pig polyclonal | Abcam | ab47308 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:1000 for immunostaining |
| B27 minus Vit A | ThermoFisher | 12587010 | |
| Bovine serum albumin, heat shock fraction, fatty acid free | Sigma | A7030 | |
| CHIR 99021 | Tocris | 4423 | Reconstituted in DMSO |
| DMEM, high glucose | ThermoFisher | 41965047 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | A-21206 | ||
| DPBS 1X | ThermoFisher | 14190144 | |
| EGF | ThermoFisher | PHG0313 | Reconstituted in 0.1% BSA in PBS |
| FGF10 | R&D | 345-FG | Reconstituted in PBS |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8644 | |
| Hoechst 33258 | Sigma | 23491-45-4 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX73 | |
| KnockOut DMEM/F-12 (1X) | Gibco | 12660-012 | |
| KnockOut SR serum replacement | Gibco | 10828-028 | |
| L-Ascorbic acid (vitamin C) | Sigma | A92902 | Reconstituted in distilled water |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 354230 | Aliquot the thawed stock and freeze at -20C. |
| MCDB131 | ThermoFisher | 10372019 | |
| Mouse anti-SOX17 | ORIGENE | CF500096 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining |
| mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 85850 | Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use |
| Nalgene filter units, 0.2 µm PES | ThermoFisher | 566-0020 | |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | Reconstituted in distilled water |
| NOGGIN | R&D | 6057-NG | Reconstituted in 0.1% BSA in PBS |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | ChemCruz | sc-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140122 | |
| Portable vacuum aspirator | |||
| Rabbit anti-FOXA2 | Cell signaling technology | 3143 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:500 for immunostaining |
| Retinoic Acid | Sigma Aldrich | R2625 | Reconstituted in DMSO |
| Rock inhibitor (Y-27632) | ReproCell | 04-0012-02 | Reconstituted in DMSO |
| Round Bottom Polystyrene FACS Tubes with Caps, STERILE | Stellar Scientific | FSC-9010 | |
| SANT-1 | Sigma Aldrich | S4572 | Reconstituted in DMSO |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| StemFlex | ThermoFisher | A3349401 | Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use |
| TALI Cellular Analysis Slide | Invitrogen | T10794 | |
| Tali image-based cytometer automated cell counter | Invitrogen | T10796 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
| TrypLE 100 mL | ThermoFisher | 12563011 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 |
References
- Rickels, M. R., Robertson, R. P. Pancreatic islet transplantation in humans: Recent progress and future directions. Endocrine Reviews. 40 (2), 631-668 (2019).
- Latres, E., Finan, D. A., Greenstein, J. L., Kowalski, A., Kieffer, T. J. Navigating two roads to glucose normalization in diabetes: Automated insulin delivery devices and cell therapy. Cell Metabolism. 29 (3), 545-563 (2019).
- Vaithilingam, V., Tuch, B. E. Islet transplantation and encapsulation: An update on recent developments. Review of Diabetic Studies. 8 (1), 51-67 (2011).
- Abdelalim, E. M. Modeling different types of diabetes using human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (6), 2459-2483 (2021).
- Memon, B., Abdelalim, E. M. Stem cell therapy for diabetes: Beta cells versus pancreatic progenitors. Cells. 9 (2), 283 (2020).
- Balboa, D., Iworima, D. G., Kieffer, T. J. Human pluripotent stem cells to model islet defects in diabetes. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 12, 642152 (2021).
- Gaertner, B., Carrano, A. C., Sander, M. Human stem cell models: Lessons for pancreatic development and disease. Genes & Development. 33 (21-22), 1475-1490 (2019).
- Abdelalim, E. M., Bonnefond, A., Bennaceur-Griscelli, A., Froguel, P. Pluripotent stem cells as a potential tool for disease modelling and cell therapy in diabetes. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 327-337 (2014).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Nair, G. G., et al. Recapitulating endocrine cell clustering in culture promotes maturation of human stem-cell-derived β cells. Nature Cell Biology. 21 (2), 263-274 (2019).
- Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).
- Veres, A., et al. Charting cellular identity during human in vitro β-cell differentiation. Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).
- Hrvatin, S., et al. Differentiated human stem cells resemble fetal, not adult, β cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3038-3043 (2014).
- Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
- Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells Journal. 31 (11), 2432-2442 (2013).
- Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells Journal. 31 (11), 2432-2442 (2013).
- Bruin, J. E., et al. Characterization of polyhormonal insulin-producing cells derived in vitro from human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 12 (1), 194-208 (2014).
- Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
- Memon, B., Abdelalim, E. M. Highly efficient differentiation of human pluripotent stem cells into pancreatic progenitors co-expressing PDX1 and NKX6.1. Methods in Molecular Biology. , (2020).
- Memon, B., Karam, M., Al-Khawaga, S., Abdelalim, E. M. Enhanced differentiation of human pluripotent stem cells into pancreatic progenitors co-expressing PDX1 and NKX6.1. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 15 (2018).
- Aigha, I. I., Memon, B., Elsayed, A. K., Abdelalim, E. M. Differentiation of human pluripotent stem cells into two distinct NKX6.1 populations of pancreatic progenitors. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 83 (2018).
- Ali, G., et al. Keratinocytes derived from patient-specific induced pluripotent stem cells recapitulate the genetic signature of psoriasis disease. Stem Cells and Development. 29 (7), 383-400 (2020).
- Elsayed, A. K., et al. Generation of a human induced pluripotent stem cell line (QBRIi009-A) from a patient with a heterozygous deletion of FOXA2. Stem Cell Research. 42, 101705 (2020).
- Davenport, C., Diekmann, U., Budde, I., Detering, N., Naujok, O. Anterior-posterior patterning of definitive endoderm generated from human embryonic stem cells depends on the differential signaling of retinoic acid, Wnt-, and BMP-signaling. Stem Cells. 34 (11), 2635-2647 (2016).
- Schroeder, I. S., et al. Induction and selection of Sox17-expressing endoderm cells generated from murine embryonic stem cells. Cells Tissues Organs. 195 (6), 507-523 (2012).
- Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
- Elsayed, A. K., Younis, I., Ali, G., Hussain, K., Abdelalim, E. M. Aberrant development of pancreatic beta cells derived from human iPSCs with FOXA2 deficiency. Cell Death & Disease. 12 (1), 103 (2021).
- Mfopou, J. K., Chen, B., Mateizel, I., Sermon, K., Bouwens, L. Noggin, retinoids, and fibroblast growth factor regulate hepatic or pancreatic fate of human embryonic stem cells. Gastroenterology. 138 (7), 1-14 (2010).
- Mfopou, J. K., De Groote, V., Xu, X., Heimberg, H., Bouwens, L. Sonic hedgehog and other soluble factors from differentiating embryoid bodies inhibit pancreas development. Stem Cells. 25 (5), 1156-1165 (2007).
- Gattazzo, F., Urciuolo, A., Bonaldo, P. Extracellular matrix: A dynamic microenvironment for stem cell niche. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (8), 2506-2519 (2014).
- Watt, F. M., Huck, W. T. Role of the extracellular matrix in regulating stem cell fate. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (8), 467-473 (2013).
- Shih, H. P., Panlasigui, D., Cirulli, V., Sander, M. ECM signaling regulates collective cellular dynamics to control pancreas branching morphogenesis. Cell Reports. 14 (2), 169-179 (2016).
- Raza, A., Ki, C. S., Lin, C. C. The influence of matrix properties on growth and morphogenesis of human pancreatic ductal epithelial cells in 3D. Biomaterials. 34 (21), 5117-5127 (2013).
- Lin, H. Y., et al. Fibronectin and laminin promote differentiation of human mesenchymal stem cells into insulin producing cells through activating Akt and ERK. Journal of Biomedical Science. 17, 56 (2010).
- Boretti, M. I., Gooch, K. J. Effect of extracellular matrix and 3D morphogenesis on islet hormone gene expression by Ngn3-infected mouse pancreatic ductal epithelial cells. Tissue Engineering Part A. 14 (12), 1927-1937 (2008).
- Boretti, M. I., Gooch, K. J. Induced cell clustering enhances islet beta cell formation from human cultures enriched for pancreatic ductal epithelial cells. Tissue Engineering. 12 (4), 939-948 (2006).
- Beattie, G. M., Rubin, J. S., Mally, M. I., Otonkoski, T., Hayek, A. Regulation of proliferation and differentiation of human fetal pancreatic islet cells by extracellular matrix, hepatocyte growth factor, and cell-cell contact. Diabetes. 45 (9), 1223-1228 (1996).
- Gage, B. K., Webber, T. D., Kieffer, T. J. Initial cell seeding density influences pancreatic endocrine development during in vitro differentiation of human embryonic stem cells. PLoS One. 8 (12), 82076 (2013).
