Summary
Den nuværende protokol beskriver en forbedret metode til at øge co-ekspressionen af PDX1 og NKX6.1 transkriptionsfaktorer i bugspytkirtlen forfædre afledt af humane pluripotente stamceller (hPSC'er) i plane monolag. Dette opnås ved at genopfylde den friske matrix, manipulere celletæthed og dissociere de endodermale celler.
Abstract
Humane pluripotente stamceller (hPSC'er) er et glimrende værktøj til at studere tidlig udvikling af bugspytkirtlen og undersøge de genetiske bidragydere til diabetes. hPSC-afledte insulinudskillende celler kan genereres til celleterapi og sygdomsmodellering, dog med begrænset effektivitet og funktionelle egenskaber. hPSC-afledte bugspytkirtelforfædre, der er forstadier til betaceller og andre endokrine celler, når de to transkriptionsfaktorer PDX1 og NKX6.1 udtrykker hinanden, angiver stamfædrene til funktionelle, insulinudskillende betaceller både in vitro og in vivo. hPSC-afledte bugspytkirtelforfædre anvendes i øjeblikket til celleterapi hos type 1-diabetespatienter som en del af kliniske forsøg. Imidlertid genererer de nuværende procedurer ikke en høj andel af NKX6.1- og bugspytkirtelforfædre, hvilket fører til co-generation af ikke-funktionelle endokrine celler og få glukoseresponsive, insulinudskillende celler. Dette arbejde udviklede således en forbedret protokol til generering af hPSC-afledte bugspytkirtelforfædre, der maksimerer co-ekspressionen af PDX1 og NKX6.1 i et 2D-monolag. Faktorer som celletæthed, tilgængelighed af frisk matrix og dissociation af hPSC-afledte endodermale celler moduleres, der forstærkede PDX1- og NKX6.1-niveauer i de genererede forfædre i bugspytkirtlen og minimeret forpligtelse til alternativ leverafstamning. Undersøgelsen fremhæver, at manipulation af cellens fysiske miljø under in vitro-differentiering kan påvirke afstamningsspecifikation og genekspression. Derfor letter den nuværende optimerede protokol den skalerbare generering af PDX1 og NKX6.1 co-ekspressive forfædre til celleterapi og sygdomsmodellering.
Introduction
Diabetes er en kompleks metabolisk lidelse, der påvirker millioner af mennesker globalt. Tilskud af insulin betragtes som den eneste behandlingsmulighed for diabetes. Mere avancerede tilfælde behandles med betacelleudskiftningsterapi, opnået ved transplantation af enten hele kadaverbugspytkirtlen eller holme 1,2. Flere spørgsmål omgiver transplantationsterapi, såsom begrænsning med tilgængeligheden og kvaliteten af vævet, invasivitet af transplantationsprocedurer ud over det kontinuerlige behov for immunosuppressive midler. Dette nødvendiggør behovet for at opdage nye og alternative muligheder for betacelleudskiftningsterapi 2,3. Humane pluripotente stamceller (hPSC'er) er for nylig dukket op som et lovende værktøj til forståelse af humane bugspytkirtelbiologi og som en ikke-udtømmende og potentielt en mere personlig kilde til transplantationsterapi 4,5,6,7. hPSC'er, herunder humane embryonale stamceller (hESC'er) og menneskeskabte pluripotente stamceller (hiPSC'er), har en høj selvfornyelseskapacitet og giver anledning til enhver vævstype i det menneskelige legeme. hESC'er stammer fra embryonets indre cellemasse, og hiPSC'er omprogrammeres fra enhver somatisk celle 4,8.
Rettede differentieringsprotokoller er optimeret til at generere betaceller i bugspytkirtlen fra hPSC'er, der sekventielt leder hPSC'er gennem udviklingsstadier i bugspytkirtlen invitro. Disse protokoller genererer hPSC-afledte øorganoider. Mens de i høj grad er forbedret til at øge andelen af betaceller i bugspytkirtlen deri, er effektiviteten af protokoller meget variabel. Det øges ikke til mere end ~ 40% af NKX6.1 + / INSULIN + eller C-PEPTID + celler 5,9,10,11,12,13. De genererede betaceller er imidlertid ikke helt identiske med de voksne humane betaceller med hensyn til deres transkriptionelle og metaboliske profiler og deres respons på glucose 4,5,14. De hPSC-afledte betaceller mangler genekspression af vigtige betacellemarkører som PCSK2, PAX6, UCN3, MAFA, G6PC2 og KCNK3 sammenlignet med voksne mennesker øer5. Derudover har de hPSC-afledte betaceller formindsket calciumsignalering som reaktion på glukose. De er forurenet med de co-genererede polyhormonale celler, der ikke udskiller passende mængder insulin som reaktion på stigende glukoseniveauer5. På den anden side kunne hPSC-afledte bugspytkirtelforfædre, som er ø-prækursorer, genereres mere effektivt in vitro sammenlignet med betaceller og, når de transplanteres in vivo, modnes til funktionelle, insulinudskillende betaceller15,16. Kliniske forsøg er i øjeblikket fokuseret på at demonstrere deres sikkerhed og effektivitet ved transplantation hos T1D-forsøgspersoner.
Især er ekspression af transkriptionsfaktorerne PDX1 (Pancreas og Duodenal Homeobox 1) og NKX6.1 (NKX6 Homeobox 1) inden for den samme pancreas stamcellecelle afgørende for engagement i en betacelleafstamning5. Pankreatiske forfædre, der ikke udtrykker NKX6.1, giver anledning til polyhormonelle endokrine celler eller ikke-funktionelle betaceller17,18. Derfor er en høj co-ekspression af PDX1 og NKX6.1 i bugspytkirtlens stamfaderstadium afgørende for i sidste ende at generere et stort antal funktionelle betaceller. Undersøgelser har vist, at en embryoid krop eller 3D-kultur forbedrer PDX1 og NKX6.1 i bugspytkirtelforfædre, hvor de differentierende celler aggregeres, varierende mellem 40% -80% af PDX1 + / NKX6.1 + population12,19. Sammenlignet med suspensionskulturer er 2D-differentieringskulturer imidlertid mere omkostningseffektive, gennemførlige og praktiske til anvendelse på flere cellelinjer5. Vi viste for nylig, at monolagsdifferentieringskulturer giver mere end op til 90% af PDX1+/NKX6.1+ co-ekspressive hPSC-afledte pancreasforfædre20,21,22. Den rapporterede metode gav en høj replikationskapacitet til de genererede bugspytkirtelforfædre og forhindrede alternative skæbnespecifikationer såsom leverafstamning21. Derfor demonstrerer denne protokol heri en yderst effektiv metode til differentiering af hPSC'er til beta-celleprækursorer i bugspytkirtlen, der co-udtrykker PDX1 og NKX6.1. Denne metode anvender teknikken til dissociering af hPSC-afledt endoderm og manipulation af celletætheden efterfulgt af en udvidet FGF- og retinoidsignalering samt pindsvinehæmning for at fremme PDX1 og NKX6.1 co-ekspression (figur 1). Denne metode kan lette en skalerbar generation af hPSC-afledte beta-celleprækursorer i bugspytkirtlen til transplantationsterapi og sygdomsmodellering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Undersøgelsen er godkendt af den relevante institutionelle videnskabsetiske komité og udført i overensstemmelse med de etiske standarder som fastsat i Helsingfors-erklæringen fra 1964 og dens senere ændringer eller sammenlignelige etiske standarder. Protokollen blev godkendt af Institutional Review Board (IRB) fra HMC (nr. 16260/16) og Qatar Biomedical Research Institute (QBRI) (nr. 2016-003). Dette arbejde er optimeret til hESC'er som H1, H9 og HUES8. Blodprøver blev indhentet fra raske personer fra Hamad Medical Corporation (HMC) hospital med fuldt informeret samtykke. IPSCC'erne genereres fra perifere blodmononukleære celler (PBMC'er) af kontrol, sundt individ23.
1. Forberedelse af kulturmedierne
- Forbered humane pluripotente stamceller (hPSC) kulturmedier
- Forbered hPSC-kulturmedier fra det kommercielt tilgængelige medium til vedligeholdelse og udvidelse af menneskelige embryonale stamceller ved at supplere 100 enheder / ml Penicillin og 100 ug / ml Streptomycin (se Materialetabel). Aliquot og opbevar hele mediet ved -20 °C på lang sigt eller 4 °C til øjeblikkelig brug.
- Forbered trin 1 differentieringsmedier (til endelig endoderm (DE)).
- Forbered basale medier fra MCDB 131-medier ved at supplere med 0,5% fedtsyrefrit bovinserumalbumin (FFA-BSA), 1,5 g / l natriumbicarbonat (NaHCO3), 10 mM glucose, 2 mM glutamax, 100 enheder / ml penicillin og 100 μg / ml Streptomycin (se materialetabel). Det tilberedte medie filtreres ved hjælp af et filter på 0,2 μm, og det opbevares ved 4 °C.
- Fase 1-medier indeholdende CHIR99021 fra basalmediet (fremstillet i trin 1.2.1) forberedes ved opvarmning af basalmediet ved 37 °C og derefter suppleres med 2 μM CHIR99021, 100 ng/ml Activin A, 10 μM stenhæmmer (Y-27632) og 0,25 mM C-vitamin (se materialetabel). Bland det supplerede medie godt og dæk det med aluminiumsfolie for at beskytte det mod lys.
BEMÆRK: Dette medie vil kun blive brugt på den første dag med differentiering. - Forbered trin 1-medier uden CHIR99021 fra basalmediet ved at opvarme det ved 37 ° C og supplere det med 100 ng / ml Activin A og 0,25 mM C-vitamin og bland godt.
BEMÆRK: 5 ng / ml grundlæggende FGF eller FGF2 kan eventuelt føjes til dette medie. Dette medie vil blive brugt i de resterende dage af fase 1.
- Forbered trin 2 differentieringsmedier (til primitivt tarmrør; PGT).
- Forbered trin 2 differentieringsmedier indeholdende stenhæmmer fra basalmediet ved at opvarme det ved 37 ° C og supplere med 50 ng / ml FGF10, 50 ng / ml NOGGIN, 0,25 μM CHIR99021, 10 μM Y-27632 (stenhæmmer) og 0,25 mM vitamin C.
BEMÆRK: Dette medie bruges på dagen for dissociation af endodermale celler. - Trin-2-differentieringsmedier uden stenhæmmer fremstilles efter samme procedure for de medier, der er fremstillet i trin 1.3.1, undtagen stenhæmmeren.
BEMÆRK: Dette medie bruges på andendagen af fase 2.
- Forbered trin 2 differentieringsmedier indeholdende stenhæmmer fra basalmediet ved at opvarme det ved 37 ° C og supplere med 50 ng / ml FGF10, 50 ng / ml NOGGIN, 0,25 μM CHIR99021, 10 μM Y-27632 (stenhæmmer) og 0,25 mM vitamin C.
- Forbered trin 3 differentieringsmedier (til posterior foregut).
- Forbered DMEM-medier indeholdende 4,5 g / l glucose, suppler derefter med 1% Penicillin-streptomycin og 2 mM glutamax og brug som basalmedie til trin 3 og 4.
- Varm DMEM-mediet (forberedt i trin 1.4.1) og suppler med 2 μM retinsyre, 0,25 μM SANT-1, 50 ng / ml FGF10, 50 ng / ml NOGGIN, 0,25 mM C-vitamin og 1% B27-tilskud uden vitamin A (se Materialetabel).
BEMÆRK: Dette medie bruges i 4 dage af fase 3 til P2-D (protokol 2, optimeret, dissocieret) og 2 dage i fase 3 til P1-ND (protokol 1, ikke-optimeret, ikke-dissocieret).
- Forbered trin 4 differentieringsmedier (til pancreasprogenitorer).
- Tilsæt DMEM indeholdende 4,5 g / l glucose med 100 ng / ml EGF, 10 mM nicotinamid, 50 ng / ml NOGGIN, 0,25 mM C-vitamin og 1% B27-tilskud uden vitamin A (se materialetabel). Brug dette medie til alle dage i fase 4.
BEMÆRK: Oprethold alle reagenser ved passende temperaturer, og alle cytokin- og følsomme reagenser skal være aliciterede. Optø de aliciterede reagenser og tilføj til basalmediet på tidspunktet for ændring af differentieringsmediet. Sammensætningerne af de forskellige differentieringsmedier fremgår af tabel 1.
- Tilsæt DMEM indeholdende 4,5 g / l glucose med 100 ng / ml EGF, 10 mM nicotinamid, 50 ng / ml NOGGIN, 0,25 mM C-vitamin og 1% B27-tilskud uden vitamin A (se materialetabel). Brug dette medie til alle dage i fase 4.
2. Tilberedning af kældermembranmatrixbelagte tallerkener
- Optøning kommercielt tilgængelig kældermatrix (se Materialetabel) og aliquot på is; alikvoterne fryses ved -20 °C.
- Før du belægger vævskulturretterne, optøes de frosne aliquots på is. Der tilsættes passende volumen af membranmatrixopløsningen til det kølede KO-DMEM/F-12-medie (KnockOut DMEM/F-12) (se Materialetabel) for at opnå den ønskede fortyndede koncentration og blandes godt. Fortyndet matrixopløsning opbevares ved 4 °C til øjeblikkelig brug.
- Overfladen af de vævskulturbehandlede plader dækkes (se Materialetabel) med fortyndet membranmatrixopløsning, og pladerne anbringes ved 37 °C i mindst 60 minutter, før cellerne pletteres. Brug en fortynding på 1:50 af membranmatrixopløsningen i KO-DMEM/F-12 til plettering af celler til pancreasdifferentieringsforsøg og 1:80 til ekspansion af udifferentierede hPSC'er.
3. Kultur af udifferentierede hPSC'er
- Passage hPSC'erne, når kolonierne når en 70% -80% sammenløb.
- For at passere vaskes hPSC'erne en gang med varm PBS, aspireres ved hjælp af en bærbar vakuumaspirator inde i vævskulturhætten, og der tilsættes 0,5 mM EDTA-opløsning i PBS for at dække kolonioverfladen. Der inkuberes ved 37 °C, 5 % CO2 i 1 minut, eller indtil koloniernes grænser løsner sig fra pladeoverfladen.
- EDTA-opløsningen fjernes, og de løsrevne kolonier opsamles med hPSC-kulturmedium ved hjælp af en P1000-mikropipette. Centrifuge de opsamlede celler ved 128 x g i 4 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten kasseres, og cellerne suppleres med hPSC-kulturmedier indeholdende 10 μM Y-27632 (Stenhæmmer)23,24.
BEMÆRK: Passage af hPSC'erne i mindst 1: 3-forhold på 1:80 membranmatrixbelagte tallerkener. For differentieringseksperimenter skal du dog plade hPSC'erne på 1:50 overtrukne retter.
4. Induktion af endelig endodermdifferentiering (DE) i hPSC'er (trin 1)
- Når hPSC-kolonierne når et sammenløb på 70%-80%, vaskes de to gange med varm PBS og aspireres ved hjælp af en bærbar vakuumaspirator inde i vævskulturhætten for at begynde trin 1-differentiering.
- Der tilsættes trin 1-differentieringsmedium indeholdende CHIR99021 (fra trin 1.2.2) til kolonierne, 2 ml pr. 6-brøndsplade, og inkuberes ved 37 °C i 24 timer.
- Den næste dag skal du erstatte det brugte medie med trin 1-differentieringsmedium uden CHIR99021 (trin 1.2.3).
- Hver 24. time skal du opsuge de brugte medier ved hjælp af en bærbar vakuumaspirator inde i vævskulturhætten og erstatte den med et nyt trin 1-differentieringsmedium uden CHIR99021.
BEMÆRK: Trin 1 kan forlænges op til 4 dage. Længden af trin 1 afhænger af den hPSC-linje, der anvendes, og bør optimeres i overensstemmelse hermed.
5. Immunofluorescensanalyse af hPSC-afledt DE (trin 1)
- For immunfluorescens skal du aspirere de brugte medier ved hjælp af en bærbar vakuumaspirator inde i vævskulturhætten fra brøndene og vaske to gange med varm PBS. Hvirvl pladen for at slippe af med celleaffald.
- Dæk overfladen af brøndene med 4% paraformaldehyd (PFA) for at fastgøre DE-cellerne; tilsæt f.eks. 250 uL PFA pr. brønd af en 24-brøndsplade. Placer pladen på en 2D-ryster ved 20 x g i 20 min.
- Efter fiksering vaskes DE-cellerne med tris-bufferet saltvand med 0,5% Tween (TBST) (se Materialetabel) og pladen placeres på rysteren ved 20 x g i 10 min. Gentag dette trin igen.
- Permeabilisere de faste celler ved at tilsætte et generøst volumen fosfatbufferet saltvand med 0,5% Triton X-100 (PBST); tilføj f.eks. 1 ml PBST pr. brønd af en 24-brønds plade og læg pladen tilbage på rysteren ved 20 x g i 20 min.
- Forbered 5% -6% af BSA i PBST som blokerende buffer og tilsæt det til de permeabiliserede celler. Inkuber pladen i mindst 1 time i blokeringsopløsningen på rysteren.
- De primære antistoffer mod SOX17 og FOXA2 fortyndes sammen (se Materialetabel) i 2-3 % BSA i PBST-opløsning. Tilsæt de kombinerede antistoffer til blokerede celler, og læg pladen på rysteren ved 4 °C natten over ved lav hastighed med skånsom omrystning.
BEMÆRK: SOX17 og FOXA2 er veletablerede DE-markører25,26. - Den næste dag skal du opsuge de primære antistoffer ved hjælp af et bærbart vakuumfilter og vaske brøndene med TBST tre gange, hver vask i 10 minutter på rysteren.
- Forbered 1:500 fortynding af Alexa fluor 488- og 568- konjugerede sekundære antistoffer (se Materialetabel) mod den art, de primære antistoffer blev rejst i.
- Tilsæt den sekundære antistofkombination til den farvede brønd, og dæk pladen med aluminiumsfolie for at beskytte mod lys. Anbring pladen på rysteren i 1 time ved stuetemperatur.
- Aspirer den sekundære antistofopløsning ved hjælp af et bærbart vakuumfilter, og vask de farvede brønde med TBST på rysteren i 10 minutter og dæk pladen med folie. Gentag vasketrinnet i alt tre gange.
- Der fremstilles en 1 μg/ml Hoechst 33342-fortynding i PBS for at plette kernerne. Tilsæt Hoechst-opløsningen til brøndene og læg pladen på rysteren i 2-3 min.
- Hoechst-opløsningen aspireres ved hjælp af et bærbart vakuumfilter, og brøndene skylles med PBS to gange.
- Til sidst tilsættes PBS til de farvede celler og afbildes ved hjælp af et omvendt fluorescensmikroskop (se Materialetabel) i mørke. Hold pladen dækket med folie, når den ikke billeddannes, for at minimere fluoroforblegningen.
BEMÆRK: Alternativt kan flowcytometri bruges til at vurdere DE-effektivitet som beskrevet i trin 9.2.
6. Generering af det primitive tarmrør (PGT) fra hPSC'er (trin 2)
BEMÆRK: Hvis immunfluorescensanalysen i trin 5.13 bestemmes til at være en SOX17-FOXA2-co-ekspression på 80% og derover, fortsætter eksperimentet til trin 2. Hvis effektiviteten er <80%, forlænges varigheden af fase 1 til 4 dage.
- På dag 1 i trin 2 skal du adskille de hPSC-afledte endodermale celler ved hjælp af TrypLE eller Accutase (se Materialetabel) til den optimerede P2-D-protokol. Klæbecellerne vaskes med varm PBS, og der tilsættes varm 1 ml TrypLE- eller Accutase-opløsning pr. brønd med en 6-brønds plade i 3-5 minutter ved 37 °C, 5 % CO2, eller indtil cellerne begynder at løsne sig fra hinanden.
- Dissocier de løsrevne ark eller monolag af celler i brøndene og saml dem derefter sammen i et 15 ml polypropylenrør ved hjælp af basalt trin 1/2-medie uden cytokiner, der indeholder mindst 0,5% af enten føtalt bovint serum (FBS) eller KnockOut serum (KOSR) (se materialetabel).
- Drej cellerne ned ved 800 x g i 5 minutter ved 4 °C, og kassér supernatanten. Tilsæt 1 ml steril PBS og suspender pelleten i enkeltceller.
- Tæl cellerne ved hjælp af en automatiseret tæller (se Materialetabel) ved at indlæse det anbefalede volumen af celler i kammerdiaset. Centrifugering af de resuspenderede celler ved 800 x g i 5 minutter ved 4 °C og kassér supernatanten.
- Pelleten resuspenderes i det passende volumen af trin 2-differentieringsmedium indeholdende stenhæmmer ved en densitet på 2,5-3,5 x 105 celler/cm2.
BEMÆRK: Dette tal kan komme ned på et 1: 2 opdelingsforhold for de fleste cellelinjer afhængigt af spredningshastigheden. Det samlede volumen vil være 2 ml medier med resuspenderede celler i 1 en brønd med 6-brøndsplade. - De resuspenderede celler hældes på 1:50 membranmatrixbelagte plader (fremstillet i trin 2) og inkuberes ved 37 °C, 5 % CO2 i inkubatoren.
- 24 timer senere udskiftes mediet med trin 2-differentieringsmedium uden stenhæmmer (fremstillet i trin 1.3.2).
7. Generering af bageste foregut fra hPSC'er (trin 3)
- Aspirer de brugte fase 2-medier ved hjælp af en bærbar vakuumaspirator inde i vævskulturhætten og vask cellerne med varm PBS.
- Der tilsættes trin 3-differentieringsmedier fra trin 1.4 til cellerne, og der inkuberes ved 37 °C, 5 % CO2.
- Efter 24 timer udskiftes det brugte medie med frisklavet trin 3-differentieringsmedie. Gentag dette i alt 4 dage for P2-D-protokollen (optimeret) og kun 2 dage for den ikke-dissocierede P1-ND.
8. Generering af pancreasforfædre fra hPSC'er (fase 4)
- Efter 4 dages fase 3-behandling vaskes cellerne med varm PBS, forsigtigt hvirvles pladen og aspireres ved hjælp af en bærbar vakuumaspirator. Tilføj derefter trin 4-differentieringsmedier fra trin 1.5 til cellerne.
- Efter 24 timer skal du udskifte de brugte medier med frisklavede trin 4-medier. Gentag dette i alt 4 dage.
9. Vurdering af differentieringseffektiviteten ved generering af pancreasprogenitorer fra hPSC'er
- Udføre immunfluorescensanalysen af de hPSC-afledte bugspytkirtelforfædre (trin 4) til ekspression af PDX1 og NKX6.1.
BEMÆRK: PDX1 og NKX6.1 er veletablerede pancreas stamfadermarkører17,18.- Udfør fiksering, permeabilisering, blokering og antistofinkubation og vask i henhold til trin 5.
- Plette de hPSC-afledte bugspytkirtelforfædre med en kombination af PDX1- og NKX6.1-antistoffer (se Materialetabel) fortyndet i 2%-3% BSA i PBST.
- Brug 1:500 fortyndinger af passende Alexa fluor 488- og 568- konjugerede sekundære antistoffer (se Materialetabel).
- Udfør flowcytometrianalyse af hPSC-afledte bugspytkirtelforfædre til ekspression af PDX1 og NKX6.1.
BEMÆRK: Flowcytometrianalyse af bugspytkirtelmarkører i de genererede hPSC-afledte pancreasprogenitorer giver en måde at kvantificere PDX1- og NKX6.1-co-ekspressionscellerne på.- I slutningen af trin 4 vaskes cellerne to gange med varm PBS og tilsættes nok TrypLE eller Accutase til at dække overfladen af brøndene, for eksempel 1 ml TrypLE eller Accutase pr. Brønd med 6-brøndsplade. Placer pladen i inkubatoren i 5-7 minutter, eller indtil cellerne løsner sig fra overfladen.
- Dissocier de vedhæftede plader af celler i brønden ved hjælp af en P1000 mikropipette, før de samles i et 15 ml polypropylenrør.
- Drej cellerne ned i hPSC-afledte pancreasprogenitorer ved 800 x g i 5 minutter ved 4 °C, og kassér derefter supernatanten. Vask cellerne med PBS ved at adskille dem i enkeltceller. Tæl cellerne ved hjælp af en automatiseret tæller (se Materialetabel), og noter koncentrationen i antallet af celler pr. ml.
- Drej ved 800 x g i 5 minutter ved 4 °C, og kassér supernatanten. Tilsæt 200 μL kølet PBS til pelleten og dissocier.
- Tilsæt 2 ml kølet 80% ethanol dråbevis med røret på en hvirvel ved lav medium hastighed (400 x g ved stuetemperatur). Luk hætterne tæt, og placer rørene let vippet på rysteren ved 4 °C natten over.
- Drej cellerne ned ved 800 x g i 5 minutter ved 4 °C, og vask med PBS for at adskille eventuelle klumper af faste celler.
- De faste celler blokeres med 5-6 % BSA-opløsning i PBST i mindst 1 time ved stuetemperatur eller 4 °C natten over på shakeren.
- Plet for bugspytkirtlens stamfadermarkører ved at følge nedenstående trin.
- Distribuer 2,00,000 celler pr. tilstand, inklusive passende isotypekontroller afhængigt af IgG-underklassen af værtsarten af det primære antistof, ufarvede og sekundære antistofkontroller i en 96-brønds V-bundplade eller 1,5 ml centrifugerør.
- Drej pladen ned ved 800 x g i 5 minutter ved 4 °C, og vend pladen med en hurtig bevægelse for at kassere supernatanten uden at miste pillerne. Der fremstilles primære antistoffortyndinger i 3% BSA-opløsning (se Materialetabel).
BEMÆRK: Koncentrationen af primære antistoffer kan være mellem 1:50 og 1:200. - De farvede celler inkuberes i mindst 2 timer ved stuetemperatur eller natten over ved 4 °C på en ryster med forsigtig omrystning ved lav hastighed.
- Vask de farvede celler med TBST tre gange ved at pipettere cellerne op og ned i brøndene. Centrifugering og kassér supernatanten som i trin 9.2.8.2.
- Tilsæt 1:500 fortynding af sekundære antistoffer (Alexa fluor 488- og 647-konjugerede antistoffer) fremstillet i PBS (se Materialetabel). Inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Vask de farvede celler med TBST mindst to gange ved at pipettere cellerne op og ned. Centrifugering af pladen, og kassér supernatanten som i trin 9.2.8.2.
- De farvede celler samles i mindst 100 μL PBS og overføres til lysbeskyttede FACS-rør (se Materialetabel). Prøverne køres på en flowcytometrimaskine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaterne viser, at optimeret protokol P2-D (figur 1A) forbedrede pancreas stamfaderdifferentieringseffektivitet ved at opregulere PDX1 og NKX6.1 co-ekspression (figur 2A, B og figur 3A). Resultaterne viste især, at dissociation af endodermale celler og deres replating på frisk membranmatrix sammen med en længere varighed af trin 3 forbedrede NKX6.1-ekspression i hPSC-afledte bugspytkirtelforfædre (optimeret protokol, P2-D) (figur 2 og figur 3A) sammenlignet med den ikke-dissocierede protokol (P1-ND), der blev ændret fra en tidligere offentliggjort undersøgelse27 . Den nuværende forbedrede protokol genererede også den højeste andel af PDX1+/NKX6.1+ forfædre sammenlignet med "P1-D" (protokol 1, S3 = 2 dage, dissocieret) og "P2-ND" (protokol 2, S3 = 4 dage, ikke-dissocieret), og de detaljerede resultater er tidligere offentliggjort21. Pankreatiske forfædre genereret ved hjælp af P2-D har også øget antal SOX9+ celler sammenlignet med den ikke-dissocierede P1-ND (figur 3B). Den optimerede metode genererede også en højere andel af proliferative NKX6.1+ celler, der co-udtrykker proliferationsmarkøren Ki67 (figur 3C).
De repræsentative resultater, der præsenteres her, er fra iPSC'er genereret fra perifere blodmononukleære celler (PBMC'er) af kontrol, sundt individ. Vi har dog reproducerbart anvendt den nuværende forbedrede protokol på flere hPSC-linjer såsom H1-hESC'er, H9-hESC'er, HUES8-hESC'er og flere andre kontrol-iPSC-linjer for at give ~ 90% PDX1 og NKX6.1 co-ekspressive pancreasforfædre20,21,28.
Efter DE-induktion i hPSC'er forventes milde niveauer af celledød. Men hvis der blev observeret en høj celledødelighed, blev eksperimentet stoppet og startet igen med et nyt parti celler. Effektiviteten af DE-induktion bør være højere end 70% -80% for at sikre en høj andel af DE-celler i kulturen, der vil tjene som en ideel startkilde til induktion af forfædre i bugspytkirtlen (figur 1C).
Tætheden af replating endodermale celler efter dissociation kan manipuleres baseret på væksthastigheden for den pågældende celle. For eksempel kan langsomt voksende celler omlægges med en højere densitet end anbefalet. Dette vil minimere chancerne for at opnå irrelevante bugspytkirtelpopulationer i fase 4. En høj co-ekspression af PDX1 og NKX6.1 kan opnås efter dissociation efter trin 1 og replating ved halv densitet (figur 1A, figur 2A, B og figur 3A). Hvis der observeres et højt udtryk for PDX1, men kun et moderat udtryk for NKX6.1, kan trin 4 forlænges med 2 dage for at forbedre NKX6.1-ekspression i PDX1-ekspressive celler.
Figur 1: Tidslinje for tilsætning af cytokiner og vækstfaktorer under pancreas stamfaderdifferentiering. (A) Skematisk repræsentation af den optimerede protokol (P1-D) til generering af PDX1 og NKX6.1 fra hPSC'er. hPSC-afledt definitiv endoderm (DE) dissocieres og replateres ved halv densitet og rettes derefter sekventielt mod en pancreas stamfaderskæbne. (B) Billeder af hPSC'er i brightfield, før differentieringen påbegyndes på dag 0. (C) Immunostaining analyse til ekspression af endodermale markører SOX17 og FOXA2 i hPSC-afledte endoderm (trin 1) celler. SOX17, grøn; FOXA2, rød. Skalabjælker = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Generering af hPSC-afledte bugspytkirtelforfædre, co-ekspressive PDX1 og NKX6.1. Immunostaininganalyse til sammenligning af PDX1- og NKX6.1-ekspression i hPSC-afledte bugspytkirtelforfædre ved hjælp af den forbedrede protokol (P2-D) (A) og en ikke-optimeret, tidligere offentliggjort protokol (P1-ND) (B). Den forbedrede protokol opnåede den højeste co-ekspression af PDX1 og NKX6.1. PDX1, grøn; NKX6.1, rød. Forstørrede billeder findes i det andet panel for hver protokol. Skalabjælker = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Kvantificering af bugspytkirtelmarkører i bugspytkirtelforfædre genereret ved hjælp af den forbedrede protokol. Flowcytometrianalyse i hPSC-afledte bugspytkirtelforfædre gav ved anvendelse af P2-D sammenlignet med den ikke-dissocierede P1-ND. (A) Histogrammer for PDX1- og NKX6.1-ekspression og dobbeltpositive farvningsgrafer. (B) Histogrammerne for SOX9-ekspression og (C) co-ekspression af NKX6.1 med spredningsmarkøren Ki67. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Stadie | Medie | Cytokiner | Dage | ||||||
| 1 | MCDB 131 media + 0,5% fedtsyrefrit bovint serumalbumin (FFA-BSA), 1,5 g / l natriumbicarbonat (NaHCO3), 10 mM glucose | Dag 1: 2 μM CHIR99021, 100 ng/ml Activin A, 10 μM Stenhæmmer (Y-27632), 0,25 mM Vitamin C. Dag 2 og fremefter: 100 ng/ml Activin A, 0,25 mM C-vitamin | 3 eller 4 | ||||||
| 2 | MCDB 131 media + 0,5% fedtsyrefrit bovint serumalbumin (FFA-BSA), 1,5 g / L natriumbicarbonat (NaHCO3), 10 mM glucose | Dag 1 (Dissociation): 50 ng/ml FGF10, 50 ng/ml NOGGIN, 0,25 μM CHIR99021, 10 μM Y-27632 (Stenhæmmer), 0,25 mM C-vitamin. Dag 2: 50 ng/ml FGF10, 50 ng/ml NOGGIN, 0,25 μM CHIR99021, 0,25 mM C-vitamin. | 2 | ||||||
| 3 | DMEM + 4,5 g / L glucose | 2 μM Retinsyre, 0,25 μM SANT-1, 50 ng/ml FGF10, 50 ng/ml NOGGIN, 0,25 mM C-vitamin, 1% B27 tilskud uden vitamin A | 4 | ||||||
| 4 | DMEM + 4,5 g / L glucose | 100 ng/ml EGF, 10 mM nicotinamid, 50 ng/ml NOGGIN, 0,25 mM C-vitamin, 1% B27 tilskud uden vitamin A. | 4 | ||||||
Tabel 1: Sammensætningerne af de forskellige differentieringsmedier, der anvendes i undersøgelsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette arbejde beskriver en forbedret protokol til generering af pancreasprogenitorer fra hPSC'er med en høj co-ekspression af PDX1 og NKX6.1. Dissociation og replating af den hPSC-afledte endoderm ved halv densitet på frisk matrix resulterede i højere PDX1 og NKX6.1 i hPSC-afledte bugspytkirtelforfædre.
Selvom vækstfaktorcocktailen for hvert trin ligner meget P1-ND 27, har det vist sig, at en mere udvidet fase 3-behandling, herunder FGF og retinoid signalering og BMP og pindsvinehæmning øger NKX6.1-ekspression, hvilket er i modsætning til Nostro et al.'s resultater27. Mens PDX1-ekspression i bugspytkirtlen under embryonal udvikling er positivt reguleret af FGF og retinoid signalering og BMP og pindsvinehæmning27,29,30, viste de nuværende resultater, at udvidelsen af denne signalcocktail også opregulerer NKX6.1. Ikke desto mindre blev effekten af en udvidet fase 3-behandling hjulpet af dissociation og replating af endodermale celler, der førte til øget PDX1- og NKX6.1-ekspression. Desuden øgede denne metode (P2-D) også SOX9-ekspressive celler i hPSC-afledte bugspytkirtelforfædre ud over andelen af proliferative NKX6.1+ celler, der co-udtrykker proliferationsmarkøren Ki67.
En anden afgørende faktor, der påvirker effektiviteten af differentiering, var tilgængeligheden af frisk membranmatrix til de dissocierede celler. De ekstracellulære matrixkomponenter er tidligere blevet demonstreret at regulere stamcelleskæbnespecifikation31,32. Samlet set er de gunstige virkninger af ekstracellulære matrixkomponenter på bugspytkirteludvikling blevet registreret 33,34,35, især for membranmatrixen, som sammen med laminin viste sig at have en pro-endokrin virkning på bugspytkirtelafstamningsceller 36. Derfor kan replating af endodermale celler på frisk membranmatrix have forbedret NKX6.1-ekspression i hPSC-afledte bugspytkirtelforfædre.
Celletætheden af differentierende celler styrer også genekspression. Flere undersøgelser har vist betydningen af celle-cellekontakt i regulering af bugspytkirteludvikling37,38,39. Cellulær aggregering eller embryoid kropsdannelse har vist sig at inducere højere endokrine genekspression i bugspytkirtlen end 2D-kulturer19. Resultaterne viser imidlertid, at højere pancreasekspression, især NKX6.1, kan opnås ved at dyrke celler i et 2D-monolag ved halvdelen af den endodermale tæthed ved hjælp af vores optimerede protokol21. Interessant nok hæmmede denne metode også levercelleskæbne (den alternative skæbne for hPSC-afledt DE) som bemærket ved den nedsatte ekspression af levergener AFP (Alpha-fetoprotein) og ALB (Albumin)21, hvilket indikerer, at fysiske faktorer spiller en rolle i afstamningsspecifikation af hPSC'er.
Samlet set viser resultaterne, at modulering af det fysiske miljø i de differentierende celler kan forbedre pancreas genekspression21. Specifikt kan dissociationen af hPSC-afledt endoderm og replating på frisk membranmatrix med en længere FGF og retinoid signalering og pindsvin og BMP-hæmning forbedre PDX1- og NKX6.1-co-ekspression i hPSC-afledte bugspytkirtelforfædre. Den optimerede protokol er dog mindst 2 dage længere end tidligere offentliggjorte protokoller. Længden af trin 4 kan også forlænges ud over det anbefalede minimum, dvs. 4 dage, baseret på den cellelinje, der anvendes. Flere rekombinante menneskelige vækstfaktorer anvendes i den optimerede protokol, der kan erstattes af deres billigere, små molekyleforbindelser, der udfører den samme handling. Ikke desto mindre kan denne optimerede protokol lette den skalerbare generering af bugspytkirtelforfædre fra hPSC'er til celleterapi og sygdomsmodellering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af et tilskud fra Qatar National Research Fund (QNRF) (Grant No. NPRP10-1221-160041).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL, conical, centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
| 20X TBS Tween 20 | Thermo Scientific | 28360 | |
| 24-well culture plates, flat bottom with lid | Costar | 3524 | |
| 50 mL, conical, centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | |
| 6- well culture plates, multidish | Thermo Scientific | 140685 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 0-7920 | |
| Activin A | R&D | 338-AC | Reconstituted in 4 mM HCl |
| Anti NKX6.1 antibody, mouse monoclonal | DSHB | F55A12-C | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining |
| Anti-PDX1 antibody, guinea pig polyclonal | Abcam | ab47308 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:1000 for immunostaining |
| B27 minus Vit A | ThermoFisher | 12587010 | |
| Bovine serum albumin, heat shock fraction, fatty acid free | Sigma | A7030 | |
| CHIR 99021 | Tocris | 4423 | Reconstituted in DMSO |
| DMEM, high glucose | ThermoFisher | 41965047 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | A-21206 | ||
| DPBS 1X | ThermoFisher | 14190144 | |
| EGF | ThermoFisher | PHG0313 | Reconstituted in 0.1% BSA in PBS |
| FGF10 | R&D | 345-FG | Reconstituted in PBS |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8644 | |
| Hoechst 33258 | Sigma | 23491-45-4 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX73 | |
| KnockOut DMEM/F-12 (1X) | Gibco | 12660-012 | |
| KnockOut SR serum replacement | Gibco | 10828-028 | |
| L-Ascorbic acid (vitamin C) | Sigma | A92902 | Reconstituted in distilled water |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 354230 | Aliquot the thawed stock and freeze at -20C. |
| MCDB131 | ThermoFisher | 10372019 | |
| Mouse anti-SOX17 | ORIGENE | CF500096 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining |
| mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 85850 | Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use |
| Nalgene filter units, 0.2 µm PES | ThermoFisher | 566-0020 | |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | Reconstituted in distilled water |
| NOGGIN | R&D | 6057-NG | Reconstituted in 0.1% BSA in PBS |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | ChemCruz | sc-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140122 | |
| Portable vacuum aspirator | |||
| Rabbit anti-FOXA2 | Cell signaling technology | 3143 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:500 for immunostaining |
| Retinoic Acid | Sigma Aldrich | R2625 | Reconstituted in DMSO |
| Rock inhibitor (Y-27632) | ReproCell | 04-0012-02 | Reconstituted in DMSO |
| Round Bottom Polystyrene FACS Tubes with Caps, STERILE | Stellar Scientific | FSC-9010 | |
| SANT-1 | Sigma Aldrich | S4572 | Reconstituted in DMSO |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| StemFlex | ThermoFisher | A3349401 | Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use |
| TALI Cellular Analysis Slide | Invitrogen | T10794 | |
| Tali image-based cytometer automated cell counter | Invitrogen | T10796 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
| TrypLE 100 mL | ThermoFisher | 12563011 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 |
References
- Rickels, M. R., Robertson, R. P. Pancreatic islet transplantation in humans: Recent progress and future directions. Endocrine Reviews. 40 (2), 631-668 (2019).
- Latres, E., Finan, D. A., Greenstein, J. L., Kowalski, A., Kieffer, T. J. Navigating two roads to glucose normalization in diabetes: Automated insulin delivery devices and cell therapy. Cell Metabolism. 29 (3), 545-563 (2019).
- Vaithilingam, V., Tuch, B. E. Islet transplantation and encapsulation: An update on recent developments. Review of Diabetic Studies. 8 (1), 51-67 (2011).
- Abdelalim, E. M. Modeling different types of diabetes using human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (6), 2459-2483 (2021).
- Memon, B., Abdelalim, E. M. Stem cell therapy for diabetes: Beta cells versus pancreatic progenitors. Cells. 9 (2), 283 (2020).
- Balboa, D., Iworima, D. G., Kieffer, T. J. Human pluripotent stem cells to model islet defects in diabetes. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 12, 642152 (2021).
- Gaertner, B., Carrano, A. C., Sander, M. Human stem cell models: Lessons for pancreatic development and disease. Genes & Development. 33 (21-22), 1475-1490 (2019).
- Abdelalim, E. M., Bonnefond, A., Bennaceur-Griscelli, A., Froguel, P. Pluripotent stem cells as a potential tool for disease modelling and cell therapy in diabetes. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 327-337 (2014).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Nair, G. G., et al. Recapitulating endocrine cell clustering in culture promotes maturation of human stem-cell-derived β cells. Nature Cell Biology. 21 (2), 263-274 (2019).
- Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).
- Veres, A., et al. Charting cellular identity during human in vitro β-cell differentiation. Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).
- Hrvatin, S., et al. Differentiated human stem cells resemble fetal, not adult, β cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3038-3043 (2014).
- Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
- Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells Journal. 31 (11), 2432-2442 (2013).
- Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells Journal. 31 (11), 2432-2442 (2013).
- Bruin, J. E., et al. Characterization of polyhormonal insulin-producing cells derived in vitro from human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 12 (1), 194-208 (2014).
- Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
- Memon, B., Abdelalim, E. M. Highly efficient differentiation of human pluripotent stem cells into pancreatic progenitors co-expressing PDX1 and NKX6.1. Methods in Molecular Biology. , (2020).
- Memon, B., Karam, M., Al-Khawaga, S., Abdelalim, E. M. Enhanced differentiation of human pluripotent stem cells into pancreatic progenitors co-expressing PDX1 and NKX6.1. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 15 (2018).
- Aigha, I. I., Memon, B., Elsayed, A. K., Abdelalim, E. M. Differentiation of human pluripotent stem cells into two distinct NKX6.1 populations of pancreatic progenitors. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 83 (2018).
- Ali, G., et al. Keratinocytes derived from patient-specific induced pluripotent stem cells recapitulate the genetic signature of psoriasis disease. Stem Cells and Development. 29 (7), 383-400 (2020).
- Elsayed, A. K., et al. Generation of a human induced pluripotent stem cell line (QBRIi009-A) from a patient with a heterozygous deletion of FOXA2. Stem Cell Research. 42, 101705 (2020).
- Davenport, C., Diekmann, U., Budde, I., Detering, N., Naujok, O. Anterior-posterior patterning of definitive endoderm generated from human embryonic stem cells depends on the differential signaling of retinoic acid, Wnt-, and BMP-signaling. Stem Cells. 34 (11), 2635-2647 (2016).
- Schroeder, I. S., et al. Induction and selection of Sox17-expressing endoderm cells generated from murine embryonic stem cells. Cells Tissues Organs. 195 (6), 507-523 (2012).
- Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
- Elsayed, A. K., Younis, I., Ali, G., Hussain, K., Abdelalim, E. M. Aberrant development of pancreatic beta cells derived from human iPSCs with FOXA2 deficiency. Cell Death & Disease. 12 (1), 103 (2021).
- Mfopou, J. K., Chen, B., Mateizel, I., Sermon, K., Bouwens, L. Noggin, retinoids, and fibroblast growth factor regulate hepatic or pancreatic fate of human embryonic stem cells. Gastroenterology. 138 (7), 1-14 (2010).
- Mfopou, J. K., De Groote, V., Xu, X., Heimberg, H., Bouwens, L. Sonic hedgehog and other soluble factors from differentiating embryoid bodies inhibit pancreas development. Stem Cells. 25 (5), 1156-1165 (2007).
- Gattazzo, F., Urciuolo, A., Bonaldo, P. Extracellular matrix: A dynamic microenvironment for stem cell niche. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (8), 2506-2519 (2014).
- Watt, F. M., Huck, W. T. Role of the extracellular matrix in regulating stem cell fate. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (8), 467-473 (2013).
- Shih, H. P., Panlasigui, D., Cirulli, V., Sander, M. ECM signaling regulates collective cellular dynamics to control pancreas branching morphogenesis. Cell Reports. 14 (2), 169-179 (2016).
- Raza, A., Ki, C. S., Lin, C. C. The influence of matrix properties on growth and morphogenesis of human pancreatic ductal epithelial cells in 3D. Biomaterials. 34 (21), 5117-5127 (2013).
- Lin, H. Y., et al. Fibronectin and laminin promote differentiation of human mesenchymal stem cells into insulin producing cells through activating Akt and ERK. Journal of Biomedical Science. 17, 56 (2010).
- Boretti, M. I., Gooch, K. J. Effect of extracellular matrix and 3D morphogenesis on islet hormone gene expression by Ngn3-infected mouse pancreatic ductal epithelial cells. Tissue Engineering Part A. 14 (12), 1927-1937 (2008).
- Boretti, M. I., Gooch, K. J. Induced cell clustering enhances islet beta cell formation from human cultures enriched for pancreatic ductal epithelial cells. Tissue Engineering. 12 (4), 939-948 (2006).
- Beattie, G. M., Rubin, J. S., Mally, M. I., Otonkoski, T., Hayek, A. Regulation of proliferation and differentiation of human fetal pancreatic islet cells by extracellular matrix, hepatocyte growth factor, and cell-cell contact. Diabetes. 45 (9), 1223-1228 (1996).
- Gage, B. K., Webber, T. D., Kieffer, T. J. Initial cell seeding density influences pancreatic endocrine development during in vitro differentiation of human embryonic stem cells. PLoS One. 8 (12), 82076 (2013).
