Summary
본 프로토콜은 평면 단일층에서 인간 만능 줄기 세포 (hPSC)로부터 유래된 췌장 전구세포에서 PDX1 및 NKX6.1 전사 인자의 동시 발현을 증가시키는 향상된 방법을 기술한다. 이것은 신선한 매트릭스를 보충하고, 세포 밀도를 조작하고, 내배엽 세포를 해리시킴으로써 달성됩니다.
Abstract
인간 만능 줄기 세포 (hPSC)는 초기 췌장 발달을 연구하고 당뇨병의 유전 적 기여자를 조사하기위한 훌륭한 도구입니다. hPSC 유래 인슐린 분비 세포는 세포 치료 및 질병 모델링을 위해 생성될 수 있지만, 제한된 효율성 및 기능적 특성을 갖는다. 베타 세포 및 기타 내분비 세포의 전구체인 hPSC 유래 췌장 전구세포는 두 전사 인자 PDX1 및 NKX6.1을 동시 발현할 때 시험관 내 및 생체 내 모두에서 기능적인 인슐린 분비 베타 세포에 대한 전구세포를 지정합니다. hPSC 유래 췌장 전구 세포는 현재 임상 시험의 일환으로 제1형 당뇨병 환자의 세포 치료에 사용됩니다. 그러나 현재의 절차는 NKX6.1 및 췌장 전구 세포의 높은 비율을 생성하지 않아 비 기능성 내분비 세포의 공동 생성과 포도당 반응성, 인슐린 분비 세포가 거의 없습니다. 따라서 이 연구는 2D 단층에서 PDX1과 NKX6.1의 동시 발현을 최대화하는 hPSC 유래 췌장 전구세포를 생성하기 위한 향상된 프로토콜을 개발했습니다. 세포 밀도, 신선한 기질의 가용성 및 hPSC 유래 내배엽 세포의 해리와 같은 요인이 조절되어 생성된 췌장 전구 세포에서 PDX1 및 NKX6.1 수준을 증가시키고 대체 간 계통에 대한 헌신을 최소화합니다. 이 연구는 시험관 내 분화 중에 세포의 물리적 환경을 조작하는 것이 계통 사양 및 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있음을 강조합니다. 따라서, 현재 최적화된 프로토콜은 세포 치료 및 질병 모델링을 위한 PDX1 및 NKX6.1 공동-발현 전구세포의 스케일러블한 생성을 용이하게 한다.
Introduction
당뇨병은 전 세계적으로 수백만 명의 사람들에게 영향을 미치는 복잡한 대사 장애입니다. 인슐린 보충은 당뇨병의 유일한 치료 옵션으로 간주됩니다. 더 진행된 경우는 전체 사체 췌장 또는 섬 1,2의 이식을 통해 달성되는 베타 세포 대체 요법으로 치료됩니다. 이식 요법을 둘러싼 몇 가지 문제, 예를 들어 조직의 가용성 및 질에 대한 제한, 면역 억제제에 대한 지속적인 필요성 외에도 이식 절차의 침습성. 이를 위해서는 베타 세포 대체 요법 2,3에 대한 새롭고 대안적인 옵션을 발견 할 필요가 있습니다. 인간 만능 줄기 세포 (hPSC)는 최근 인간 췌장 생물학을 이해하기위한 유망한 도구로 부상했으며 이식 요법 4,5,6,7을위한 완전하지 않고 잠재적으로 개인화 된 소스로 부상했습니다. 인간 배아 줄기 세포 (hESC) 및 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)를 포함한 hPSC는 높은 자체 재생 능력을 가지며 인체의 모든 조직 유형을 생성합니다. hESC는 배아의 내부 세포 덩어리에서 파생되고 hiPSC는 모든 체세포 4,8에서 재 프로그래밍됩니다.
지시 분화 프로토콜은 시험관 내에서 췌장 발달 단계를 통해 hPSC를 순차적으로 지시하는 hPSC로부터 췌장 베타 세포를 생성하도록 최적화됩니다. 이러한 프로토콜은 hPSC 유래 췌도 오가노이드를 생성합니다. 그들은 그 안에 췌장 베타 세포의 비율을 증가시키는 데 크게 향상되었지만 프로토콜의 효율성은 매우 다양합니다. NKX40+/인슐린+ 또는 C-펩타이드+ 세포 5,9,10,11,12,13의 ~5,9% 이상으로 증가하지 않습니다. 그러나, 생성 된 베타 세포는 전사 및 대사 프로파일 및 포도당 4,5,14에 대한 반응 측면에서 성인 인간 베타 세포와 완전히 동일하지 않다. hPSC 유래 베타 세포는 성인 인간 섬5에 비해 PCSK2, PAX6, UCN3, MAFA, G6PC2 및 KCNK3와 같은 주요 베타 세포 마커의 유전자 발현이 부족합니다. 또한 hPSC 유래 베타 세포는 포도당에 대한 반응으로 칼슘 신호 전달을 감소시켰습니다. 그들은 포도당 수준 증가에 반응하여 적절한 양의 인슐린을 분비하지 않는 공동 생성 된 다 호르몬 세포로 오염됩니다5. 한편, 췌도 전구체인 hPSC 유래 췌장 전구체는 베타 세포에 비해 시험관 내에서 더 효율적으로 생성될 수 있고, 생체 내에 이식되면 기능적인 인슐린 분비 베타 세포(15,16)로 성숙할 수 있다. 임상 시험은 현재 T1D 피험자의 이식시 안전성과 효능을 입증하는 데 중점을두고 있습니다.
특히, 동일한 췌장 전구 세포 내에서 전사 인자 PDX1 (췌장 및 십이지장 호메오 박스 1) 및 NKX6.1 (NKX6 호메오 박스 1)의 발현은 베타 세포 계통5에 대한 헌신에 결정적이다. NKX6.1을 발현하지 못하는 췌장 전구 세포는 다 호르몬 내분비 세포 또는 비 기능성 베타 세포17,18을 생성합니다. 따라서, 췌장 전구 단계에서 PDX1과 NKX6.1의 높은 동시 발현은 궁극적으로 다수의 기능적 베타 세포를 생성하는 데 필수적이다. 연구에 따르면 배아 체 또는 3D 배양은 분화 세포가 응집되는 췌장 전구 세포에서 PDX1 및 NKX6.1을 향상 시키며 PDX1 + / NKX6.1+ 인구의 40 % -80 % 사이에서 다양합니다12,19. 그러나 현탁 배양에 비해 2D 분화 배양은 더 비용 효율적이고 실현 가능하며 여러 세포주에 적용하기에 편리합니다5. 우리는 최근에 단층 분화 배양이 hPSC 유래 췌장 전구 세포 20,21,22를 공동 발현하는 PDX1+/NKX6.1+ 동시 발현의 최대90% 이상을 산출한다는 것을 보여주었습니다. 보고된 방법은 생성된 췌장 전구체에 높은 복제 능력을 부여하고 간 계통21과 같은 대체 운명 사양을 방지했습니다. 따라서, 본원에서, 이 프로토콜은 hPSCs를 PDX1 및 NKX6.1을 공동-발현하는 췌장 베타-세포 전구체로 분화시키기 위한 매우 효율적인 방법을 입증한다. 이 방법은 hPSC 유래 내배엽을 해리하고 세포 밀도를 조작한 다음 확장된 FGF 및 레티노이드 신호 전달과 고슴도치 억제를 통해 PDX1 및 NKX6.1 동시 발현을 촉진하는 기술을 활용합니다(그림 1). 이 방법은 이식 요법 및 질병 모델링을 위한 hPSC 유래 췌장 베타-세포 전구체의 확장가능한 생성을 촉진할 수 있다.
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Protocol
이 연구는 적절한 기관 연구 윤리위원회의 승인을 받았으며 1964 년 헬싱키 선언 및 이후 개정안 또는 유사한 윤리 기준에 명시된 윤리적 기준에 따라 수행되었습니다. 이 프로토콜은 HMC (no. 16260/16) 및 카타르 생물 의학 연구소 (QBRI) (no. 2016-003)의 기관 검토위원회 (IRB)의 승인을 받았습니다. 이 작업은 H1, H9 및 HUES8과 같은 hESC에 최적화되어 있습니다. 혈액 샘플은 충분한 정보에 입각 한 동의하에 Hamad Medical Corporation (HMC) 병원의 건강한 개인으로부터 얻었습니다. iPSCs는 대조군, 건강한 개체23의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 생성된다.
1. 배양배지의 제조
- 인간 만능줄기세포(hPSC) 배양액 준비
- 100 units/mL의 페니실린과 100ug/mL의 스트렙토마이신을 보충하여 인간 배아 줄기 세포를 유지 및 확장하기 위해 시판되는 배지에서 hPSC 배양 배지를 준비합니다( 재료 표 참조). 전체 매체를 분취하여 장기간 -20°C 또는 즉시 사용을 위해 4°C에서 보관합니다.
- 1단계 분화 배지(최종 내배엽(DE)용)를 준비합니다.
- 0.5%의 지방산이 없는 소 혈청 알부민(FFA-BSA), 1.5g/L의 중탄산나트륨(NaHCO3), 10mM의 포도당, 2mM의 글루타맥스, 100단위/mL의 페니실린 및 100μg/mL의 스트렙토마이신을 보충하여 MCDB 131 배지에서 기초 배지를 준비합니다(재료 표 참조). 준비된 배지를 0.2 μm 필터를 사용하여 여과하고 4°C에서 보관한다.
- 기저 배지를 37°C에서 예열한 다음 2μM의 CHIR99021, 100ng/mL의 액티빈 A, 10μM의 암석 억제제(Y-27632) 및 0.25mM의 비타민 C를 보충하여 기초 배지(1.2.1단계에서 준비)에서 CHIR99021을 포함하는 1단계 배지를 준비합니다( 재료 표 참조). 보충 된 배지를 잘 섞고 알루미늄 호일로 덮어 빛으로부터 보호하십시오.
참고: 이 미디어는 차별화 첫날에만 사용됩니다. - CHIR99021이 없는 1단계 배지를 37°C에서 데우고 100ng/mL의 액티빈 A와 0.25mM의 비타민 C를 보충하여 기초 배지에서 준비하고 잘 혼합합니다.
참고: 5ng/mL의 기본 FGF 또는 FGF2를 이 매체에 선택적으로 추가할 수 있습니다. 이 미디어는 스테이지 1의 남은 기간 동안 사용됩니다.
- 2단계 분화 배지 준비(원시 내장 튜브용; 증권 시세 표시기)를 참조하십시오.
- 2 ° C에서 가온하고 FGF10의 50 ng / mL, NOGGIN의 50 ng / mL, CHIR99021의 0.25 μM, Y-27632 (암석 억제제)의 10 μM 및 0.25 mM의 비타민 C를 보충하여 기초 배지에서 암석 억제제를 함유 한 2 단계 분화 배지를 준비하십시오.
참고 :이 매체는 내배엽 세포의 해리 당일에 사용됩니다. - 암석 억제제를 제외한 단계 1.3.1에서 제조된 배지에 대해 동일한 절차에 따라 암석 억제제 없이 2단계 분화 배지를 준비합니다.
참고: 이 미디어는 스테이지 2의 둘째 날에 사용됩니다.
- 2 ° C에서 가온하고 FGF10의 50 ng / mL, NOGGIN의 50 ng / mL, CHIR99021의 0.25 μM, Y-27632 (암석 억제제)의 10 μM 및 0.25 mM의 비타민 C를 보충하여 기초 배지에서 암석 억제제를 함유 한 2 단계 분화 배지를 준비하십시오.
- 3단계 분화 배지(후방 포레거트용)를 준비합니다.
- 4.5g/L의 포도당을 함유한 DMEM 배지를 준비한 다음 1%의 페니실린-스트렙토마이신과 2mM의 글루타맥스를 보충하고 3단계 및 4단계의 기초 배지로 사용합니다.
- DMEM 배지(1.4.1단계에서 준비)를 데우고 2μM의 레티노산, 0.25μM의 SANT-1, 50ng/mL의 FGF10, 50ng/mL의 NOGGIN, 0.25mM의 비타민 C 및 비타민 A가 없는 27% B27 보충제를 보충합니다( 재료 표 참조).
참고: 이 미디어는 P2-D(프로토콜 2, 최적화, 해리)의 경우 3단계 4일 동안 사용되고 P1-ND의 경우 3단계의 2일(프로토콜 1, 최적화되지 않음, 해리되지 않음) 동안 사용됩니다.
- 4단계 분화 배지(췌장 전구체용)를 준비합니다.
- EGF 4.5ng/mL, 니코틴아미드 10mM, NOGGIN 50ng/mL, 비타민 C 0.25mM 및 비타민 A가 없는 B27 보충제 1%와 함께 포도당 27g/L를 함유한 DMEM을 추가합니다( 재료 표 참조). 스테이지 4의 모든 날 동안 이 미디어를 사용합니다.
참고: 모든 시약을 적절한 온도로 유지하고 모든 사이토카인 및 민감한 시약을 분취해야 합니다. 분취된 시약을 해동하고 분화 배지를 변경할 때 기본 배지에 추가합니다. 상이한 분화 매질의 조성이 표 1에 제공된다.
- EGF 4.5ng/mL, 니코틴아미드 10mM, NOGGIN 50ng/mL, 비타민 C 0.25mM 및 비타민 A가 없는 B27 보충제 1%와 함께 포도당 27g/L를 함유한 DMEM을 추가합니다( 재료 표 참조). 스테이지 4의 모든 날 동안 이 미디어를 사용합니다.
2. 기저막 매트릭스 코팅 접시의 제조
- 상업적으로 이용 가능한 지하 매트릭스 ( 재료 표 참조) 및 얼음 위의 부분 표본 해동; 분취량을 -20°C에서 동결시킨다.
- 조직 배양 접시를 코팅하기 전에 냉동 분취량을 얼음에서 해동하십시오. 냉각된 KO-DMEM/F-12 매체(녹아웃 DMEM/F-12)( 재료 표 참조)에 적절한 부피의 멤브레인 매트릭스 용액을 추가하여 원하는 희석 농도를 달성하고 잘 혼합합니다. 즉시 사용할 수 있도록 희석된 매트릭스 용액을 4°C에 보관하십시오.
- 조직 배양 처리된 플레이트( 재료 표 참조)의 표면을 희석된 막 매트릭스 용액으로 덮고 세포를 플레이팅하기 전에 플레이트를 37°C에서 최소 60분 동안 두십시오. 췌장 분화 실험용 도금액에는 KO-DMEM/F-12에 막 매트릭스 용액 1:50, 미분화 hPSC 확장에는 1:80의 희석액을 사용한다.
3. 미분화 hPSC의 배양
- 식민지가 70%-80% 컨플루언시에 도달하면 hPSC를 통과합니다.
- 통과하려면 따뜻한 PBS로 hPSC를 한 번 세척하고 조직 배양 후드 내부의 휴대용 진공 흡인기를 사용하여 흡인하고 PBS에 0.5mM의 EDTA 용액을 추가하여 콜로니 표면을 덮습니다. 37°C, 5%CO2 에서 1분 동안 또는 콜로니의 경계가 플레이트 표면에서 분리될 때까지 배양합니다.
- EDTA 용액을 제거하고 P1000 마이크로피펫을 사용하여 hPSC 배양액으로 분리된 콜로니를 수집한다. 수집된 세포를 실온에서 4분 동안 128 x g으로 원심분리합니다. 상청액을 버리고 10μM의 Y-27632(암석 억제제)23,24를 포함하는 hPSC 배양 배지로 세포를 보충합니다.
알림: hPSC를 1:3 멤브레인 매트릭스 코팅 접시에 최소 1:80 비율로 통과시킵니다. 그러나 분화 실험을 위해 hPSC를 1:50 코팅 접시에 플레이팅하십시오.
4. hPSC에서 최종 내배엽 (DE) 분화 유도 (1 단계)
- hPSC 콜로니가 70%-80%의 컨플루언스에 도달하면 따뜻한 PBS로 두 번 씻고 조직 배양 후드 내부의 휴대용 진공 흡인기를 사용하여 흡인하여 1단계 분화를 시작합니다.
- CHIR99021(단계 1.2.2에서)을 포함하는 1단계 분화 배지를 콜로니에 6웰 플레이트당 2mL씩 추가하고 37°C에서 24시간 동안 배양합니다.
- 다음날, 사용한 배지를 CHIR1이 없는 99021단계 분화 배지로 교체합니다(단계 1.2.3).
- 24시간마다 조직 배양 후드 내부의 휴대용 진공 흡인기를 사용하여 사용한 배지를 흡입하고 CHIR99021이 없는 새로운 1단계 분화 배지로 교체합니다.
참고: 1단계는 최대 4일까지 연장할 수 있습니다. 스테이지 1의 길이는 사용 중인 hPSC 라인에 따라 다르며 그에 따라 최적화되어야 합니다.
5. hPSC 유래 DE의 면역형광 분석(1기)
- 면역형광의 경우, 웰에서 조직 배양 후드 내부의 휴대용 진공 흡인기를 사용하여 사용한 배지를 흡인하고 따뜻한 PBS로 두 번 세척합니다. 접시를 소용돌이 치면 세포 파편이 제거됩니다.
- DE 세포를 고정하기 위해 4 %의 파라 포름 알데히드 (PFA)로 웰 표면을 덮고; 예를 들어, 24웰 플레이트의 웰당 250uL의 PFA를 추가합니다. 플레이트를 2D 셰이커에 20 x g 로 20분 동안 놓습니다.
- 고정 후, DE 세포를 0.5%의 트윈(TBST)( 재료 표 참조)으로 트리스-완충 식염수로 세척하고, 플레이트를 20 x g 의 쉐이커에 10분 동안 놓는다. 이 단계를 한 번 더 반복합니다.
- 0.5 %의 Triton X-100 (PBST)과 함께 충분한 양의 인산염 완충 식염수를 첨가하여 고정 된 세포를 투과화합니다. 예를 들어, 24웰 플레이트의 웰당 PBST 1mL를 추가하고 플레이트를 20 x g 의 셰이커에 20분 동안 다시 놓습니다.
- 블로킹 완충액으로 PBST에 있는 BSA의 5%-6%를 새롭게 준비하고 투과화된 세포에 추가하십시오. 플레이트를 셰이커의 블로킹 용액에서 최소 1시간 동안 배양합니다.
- SOX17 및 FOXA2에 대한 1차 항체를 PBST 용액의 2%-3% BSA로 함께 희석합니다( 재료 표 참조). 결합된 항체를 차단된 세포에 첨가하고, 플레이트를 4°C에서 부드러운 진탕과 함께 저속으로 밤새 쉐이커 위에 놓는다.
참고: SOX17 및 FOXA2는 잘 정립된 DE 마커25,26입니다. - 다음날, 휴대용 진공 필터를 사용하여 1차 항체를 흡인하고, TBST로 웰을 3회 세척하고, 각각 쉐이커에서 10분 동안 세척한다.
- 1차 항체가 제기된 종에 대해 Alexa fluor 488- 및 568-접합된 2차 항체( 재료 표 참조)의 1:500 희석물을 준비합니다.
- 염색된 웰에 2차 항체 조합을 추가하고 빛으로부터 보호하기 위해 플레이트를 알루미늄 호일로 덮습니다. 접시를 실온에서 1 시간 동안 셰이커에 놓습니다.
- 휴대용 진공 필터를 사용하여 2차 항체 용액을 흡인하고 염색된 웰을 셰이커에서 TBST로 10분 동안 세척하고 플레이트를 호일로 덮습니다. 세척 단계를 총 3회 반복합니다.
- 핵을 염색하기 위해 PBS에서 1 μg/mL의 Hoechst 33342 희석액을 준비합니다. Hoechst 용액을 우물에 넣고 플레이트를 셰이커에 2-3 분 동안 놓습니다.
- 휴대용 진공 필터를 사용하여 Hoechst 용액을 흡입하고 PBS로 웰을 두 번 헹굽니다.
- 마지막으로 염색된 세포에 PBS를 추가하고 어두운 곳에서 도립 형광 현미경( 재료 표 참조)을 사용하여 이미지를 촬영합니다. 형광단 표백을 최소화하기 위해 이미징하지 않을 때는 플레이트를 호일로 덮으십시오.
참고: 대안적으로, 유동-세포분석은 단계 9.2에 설명된 바와 같이 DE 효율을 평가하기 위해 사용될 수 있다.
6. hPSC에서 원시 내장 관 (PGT) 생성 (2 단계)
참고: 5.13단계의 면역형광 분석에서 SOX17-FOXA2 동시 발현이 80% 이상인 것으로 결정되면 실험은 2단계로 진행합니다. 효율이 <80%이면 1단계의 기간을 4일로 연장합니다.
- 2단계 1일차에 최적화된 P2-D 프로토콜을 위해 TrypLE 또는 Accutase( 재료 표 참조)를 사용하여 hPSC 유래 내배엽 세포를 해리합니다. 부착 세포를 따뜻한 PBS로 세척하고 6웰 플레이트의 웰당 따뜻한 1mL의 TrypLE 또는 Accutase 용액을 37°C, 5%CO2 에서 또는 세포가 서로 분리되기 시작할 때까지 3-5분 동안 추가합니다.
- 분리된 시트 또는 웰의 세포 단층을 해리한 다음 최소 0.5%의 소 태아 혈청(FBS) 또는 녹아웃 혈청(KOSR)을 함유한 사이토카인이 없는 기저 단계 1/2 배지를 사용하여 15mL 폴리프로필렌 튜브에 함께 수집합니다( 재료 표 참조).
- 세포를 4°C에서 5분 동안 800 x g 으로 스핀다운하고 상청액을 버린다. 1mL의 멸균 PBS를 추가하고 펠릿을 단일 세포에 재현탁합니다.
- 자동 카운터( 재료 표 참조)를 사용하여 챔버 슬라이드에 권장 부피의 세포를 로드하여 세포를 계수합니다. 재현탁된 세포를 4°C에서 5분 동안 800 x g 로 스핀하고 상청액을 버린다.
- 펠릿을 암석 억제제를 함유하는 적절한 부피의 2단계 분화 배지에 2.5-3.5 x 105 cells/cm2의 밀도로 재현탁시킨다.
참고: 이 수는 증식 속도에 따라 대부분의 세포주에 대해 1:2 분할 비율로 내려갈 수 있습니다. 총 부피는 6웰 플레이트의 웰 1개에 재현탁된 세포가 있는 배지 2mL입니다. - 재현탁된 세포를 1:50 막 매트릭스-코팅된 플레이트(단계 2에서 제조)에 플레이트하고, 이를 인큐베이터에서 37°C, 5%CO2 에서 배양한다.
- 24시간 후, 배지를 암석 억제제가 없는 단계 2 분화 배지로 교체합니다(단계 1.3.2에서 제조).
7. hPSC에서 후방 소장 생성 (3 단계)
- 조직 배양 후드 내부의 휴대용 진공 흡인기를 사용하여 사용한 2단계 배지를 흡인하고 따뜻한 PBS로 세포를 세척합니다.
- 단계 1.4로부터의 단계 3 분화 배지를 세포에 첨가하고 37°C, 5%CO2에서 배양한다.
- 24시간 후, 사용한 배지를 새로 준비된 3단계 분화 배지로 교체합니다. P2-D 프로토콜(최적화)의 경우 총 4일 동안, 해리되지 않은 P1-ND의 경우 2일 동안만 이 작업을 반복합니다.
8. hPSC에서 췌장 전구 세포의 생성 (4 단계)
- 3단계 치료 4일 후 따뜻한 PBS로 세포를 씻고 플레이트를 부드럽게 소용돌이치며 휴대용 진공 흡인기를 사용하여 흡인합니다. 그런 다음 1.5단계의 4단계 분화 배지를 세포에 추가합니다.
- 24시간 후 사용한 배지를 새로 준비된 4단계 배지로 교체합니다. 총 4 일 동안이 작업을 반복하십시오.
9. hPSC로부터 췌장 전구 세포를 생성하는 분화 효율 평가
- PDX1 및 NKX6.1의 발현에 대한 hPSC 유래 췌장 전구세포(4기)의 면역형광 분석을 수행한다.
참고: PDX1 및 NKX6.1은 잘 확립된 췌장 전구 마커17,18입니다.- 고정, 투과화, 차단, 및 항체 배양을 수행하고 단계 5에 따라 세척합니다.
- PBST에서 2%-3% BSA로 희석된 PDX1 및 NKX6.1 항체( 재료 표 참조)의 조합으로 hPSC 유래 췌장 전구세포를 염색합니다.
- 적절한 Alexa fluor 488- 및 568- 접합된 2차 항체의 1:500 희석액을 사용하십시오( 재료 표 참조).
- PDX1 및 NKX6.1의 발현에 대한 hPSC 유래 췌장 전구세포의 유세포분석 분석을 수행한다.
참고: 생성된 hPSC-유래 췌장 전구세포에서 췌장 마커의 유세포분석 분석은 PDX1 및 NKX6.1 공동-발현 세포를 정량화하는 방법을 제공한다.- 4단계가 끝나면 따뜻한 PBS로 세포를 두 번 세척하고 웰 표면을 덮기에 충분한 TrypLE 또는 Accutase(예: 6웰 플레이트의 웰당 1mL의 TrypLE 또는 Accutase)를 추가합니다. 플레이트를 인큐베이터에 5-7 분 동안 또는 세포가 표면에서 분리 될 때까지 놓습니다.
- 15mL 폴리프로필렌 튜브에 수집하기 전에 P1000 마이크로피펫을 사용하여 웰 내에서 부착된 세포 시트를 해리합니다.
- hPSC 유래 췌장 전구 세포의 세포를 800 x g 에서 4 ° C에서 5 분 동안 스핀 다운 한 다음 상청액을 버립니다. 세포를 단일 세포로 해리시켜 PBS로 씻으십시오. 자동 카운터( 재료 표 참조)를 사용하여 세포를 계수하고 mL당 세포 수의 농도를 기록합니다.
- 4°C에서 5분 동안 800 x g 으로 스핀시키고, 상청액을 버린다. 냉각된 PBS 200μL를 펠릿에 넣고 해리합니다.
- 냉각된 80% 에탄올 2mL를 튜브를 저속(실온에서 400 x g )의 와류에 놓고 적가합니다. 캡을 단단히 닫고 셰이커에 약간 기울어진 튜브를 4°C에서 밤새 놓습니다.
- 세포를 4°C에서 5분 동안 800 x g 로 스핀다운하고, PBS로 세척하여 고정된 세포의 임의의 덩어리를 해리시킨다.
- 셰이커에서 실온 또는 4°C에서 밤새 적어도 1 시간 동안 PBST에 있는 5%-6% BSA 해결책으로 고정된 세포를 막으십시오.
- 아래 단계에 따라 췌장 전구 마커에 대한 염색.
- 1차 항체의 숙주 종의 IgG 서브클래스에 의존하는 적절한 이소형 대조군, 염색되지 않은 및 2차 항체 대조군을 포함하는 조건당 2,00,000개의 세포를 96웰 V 바닥 플레이트 또는 1.5mL 원심분리 튜브에 분배합니다.
- 플레이트를 800 x g 에서 4°C에서 5분 동안 스핀다운하고 펠릿을 잃지 않고 상청액을 버리기 위해 빠른 동작으로 플레이트를 뒤집습니다. 3% BSA 용액에서 1차 항체 희석액을 준비합니다( 재료 표 참조).
참고: 1차 항체의 농도는 1:50에서 1:200 사이일 수 있습니다. - 염색된 세포를 실온에서 적어도 2시간 동안 또는 4°C에서 밤새 쉐이커에서 저속으로 부드럽게 흔들면서 배양한다.
- 웰에서 세포를 위아래로 피펫팅하여 TBST로 염색된 세포를 세 번 세척합니다. 단계 9.2.8.2에서와 같이 상청액을 돌리고 폐기한다.
- PBS에서 준비된 2차 항체(Alexa fluor 488- 및 647-접합 항체)를 1:500 희석하여 추가합니다( 재료 표 참조). 실온에서 30 분 동안 배양하십시오.
- 염색된 세포를 위아래로 피펫팅하여 TBST로 적어도 두 번 세척합니다. 플레이트를 돌리고 단계 9.2.8.2에서와 같이 상청액을 버립니다.
- 염색된 세포를 최소 100μL의 PBS에 수집하고 빛 보호 FACS 튜브로 옮깁니다( 재료 표 참조). 유세포분석 기계에서 샘플을 실행합니다.
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Representative Results
결과는 최적화된 프로토콜 P2-D(그림 1A)가 PDX1 및 NKX6.1 동시 발현을 상향조절하여 췌장 전구체 분화 효율성을 향상시켰음을 보여줍니다(그림 2A, B 및 그림 3A). 특히, 결과는 내배엽 세포의 해리와 새로운 막 기질에서의 재 도금이 이전에 발표 된 연구에서 수정 된 비 해리 프로토콜 (P1-ND)과 비교하여 hPSC 유래 췌장 전구 세포 (최적화 된 프로토콜, P2-D)에서 3 단계 NKX6.1 발현을 향상 시켰음을 보여주었습니다(그림 2 및 그림 3A) . 본 강화된 프로토콜은 또한 "P1-D"(프로토콜 1, S3 = 2일, 해리됨) 및 "P2-ND"(프로토콜 2, S3 = 4일, 비해리됨)에 비해 PDX1+/NKX6.1+ 전구체의 가장 높은 비율을 생성했으며, 상세한 결과는 이전에 공개되었다21. P2-D를 사용하여 생성된 췌장 전구세포는 또한 해리되지 않은 P1-ND에 비해 SOX9+ 세포의 수가 증가했습니다(그림 3B). 최적화된 방법은 또한 증식 마커 Ki6.1을 공동 발현하는 증식성 NKX67+ 세포의 더 높은 비율을 생성했습니다(그림 3C).
여기에 제시된 대표적인 결과는 대조군, 건강한 개체의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에서 생성 된 iPSCs입니다. 그러나 우리는 H1-hESCs, H9-hESC, HUES8-hESC 및 기타 여러 제어 iPSC 라인과 같은 여러 hPSC 라인에 현재의 향상된 프로토콜을 재현 가능하게 적용하여 ~ 90 % PDX1 및 NKX6.1 동시 발현 췌장 전구 세포20,21,28을 산출했습니다.
hPSC에서 DE 유도 후, 경미한 수준의 세포 사멸이 예상됩니다. 그러나, 높은 세포 사멸률이 관찰되면, 실험을 중단하고 새로운 세포 배치로 다시 시작하였다. DE 유도의 효율은 췌장 전구 유도를 위한 이상적인 출발 공급원이 될 배양에서 DE 세포의 높은 비율을 보장하기 위해 70%-80% 이상이어야 합니다(그림 1C).
해리 후 재도금 내배엽 세포의 밀도는 특정 세포의 성장 속도에 따라 조작될 수 있습니다. 예를 들어, 느리게 성장하는 세포는 권장보다 높은 밀도로 재 도금 될 수 있습니다. 이것은 4 단계에서 관련없는 췌장 인구를 얻을 가능성을 최소화합니다. PDX1과 NKX6.1의 높은 공동 발현은 1 단계 후 해리되고 반밀도로 재 도금 된 후에 얻을 수 있습니다 (그림 1A, 그림 2A, B 및 그림 3A). PDX1의 높은 발현이 관찰되지만 NKX6.1의 중간 발현만이 관찰되는 경우, 4단계는 PDX1-발현 세포에서 NKX6.1 발현을 향상시키기 위해 2일까지 연장될 수 있다.
그림 1: 췌장 전구세포 분화 동안 사이토카인 및 성장 인자의 첨가를 위한 타임라인. (A) hPSC로부터 PDX1 및 NKX6.1의 생성을 위한 최적화된 프로토콜(P1-D)의 개략적 표현. hPSC 유래 최종 내배엽 (DE)은 해리되고 절반 밀도로 재 도금 된 다음 순차적으로 췌장 전구 운명을 향하게됩니다. (B) 0일차에 분화를 시작하기 전의 명시야에서의 hPSC 이미지. (C) hPSC 유래 내배엽(1기) 세포에서 내배엽 마커 SOX17 및 FOXA2의 발현에 대한 면역염색 분석. SOX17, 녹색; 폭스타2, 레드. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: PDX1과 NKX6.1을 동시 발현하는 hPSC 유래 췌장 전구세포의 생성. 강화된 프로토콜 (P2-D) (A) 및 최적화되지 않은, 이전에 공개된 프로토콜 (P1-ND) (B)을 사용하여 hPSC 유래 췌장 전구세포에서 PDX1 및 NKX6.1 발현의 비교를 위한 면역염색 분석. 향상된 프로토콜은 PDX1 및 NKX6.1의 가장 높은 동시 발현을 달성했습니다. PDX1, 녹색; NKX6.1, 빨간색. 확대된 이미지는 각 프로토콜에 대한 두 번째 패널에 제공됩니다. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 향상된 프로토콜을 사용하여 생성된 췌장 전구세포의 췌장 마커 정량화. hPSC 유래 췌장 전구 세포에서의 유세포 분석 분석은 해리되지 않은 P1-ND와 비교하여 P2-D를 사용하여 산출되었다. (A) PDX1 및 NKX6.1 발현에 대한 히스토그램 및 이중 양성 염색 그래프. (B) SOX9 발현 및 (C) 증식 마커 Ki67과 NKX6.1의 동시 발현에 대한 히스토그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 무대 | 미디어 | 사이토카인 | 일 | ||||||
| 1 | MCDB 131 배지 + 0.5% 지방산 무함유 소 혈청 알부민(FFA-BSA), 1.5g/L 중탄산나트륨(NaHCO3), 포도당 10mM | 1일차: 2 μM CHIR99021, 100 ng/mL 액티빈 A, 10 μM 암석 억제제(Y-27632), 0.25 mM 비타민 C. 2일째 이후: 100 ng/mL 액티빈 A, 0.25 mM 비타민 C | 3 또는 4 | ||||||
| 2 | MCDB 131 배지 + 0.5% 지방산 무함유 소 혈청 알부민(FFA-BSA), 1.5g/L 중탄산나트륨(NaHCO3), 10mM 포도당 | 1 일째 (해리) : 50 ng / mL FGF10, 50 ng / mL 노긴, 0.25 μM CHIR99021, 10 μM Y-27632 (암석 억제제), 0.25 mM 비타민 C. 2 일째 : 50 ng / mL FGF10, 50 ng / mL 노긴, 0.25 μM CHIR99021, 0.25 mM 비타민 C. | 2 | ||||||
| 3 | DMEM + 4.5 g / L 포도당 | 2 μM 레티노산, 0.25 μM SANT-1, 50 ng/mL FGF10, 50 ng/mL 노긴, 0.25 mM 비타민 C, 비타민 A 없는 1% B27 보충제 | 4 | ||||||
| 4 | DMEM + 4.5 g / L 포도당 | 100 ng / mL EGF, 10 mM 니코틴 아미드, 50 ng / mL NOGGIN, 0.25 mM 비타민 C, 비타민 A가없는 1 % B27 보충제. | 4 | ||||||
표 1: 연구에 사용된 상이한 분화 매질의 조성물.
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Discussion
이 연구는 PDX1 및 NKX6.1의 높은 공동 발현을 갖는 hPSC로부터 췌장 전구 세포를 생성하기위한 향상된 프로토콜을 설명합니다. 신선한 매트릭스에서 절반 밀도에서 hPSC 유래 내배엽의 해리 및 재 도금은 hPSC 유래 췌장 전구 세포에서 더 높은 PDX1 및 NKX6.1을 초래했습니다.
각 단계에 대한 성장 인자 칵테일은 P1-ND 27과 매우 유사하지만, FGF 및 레티노이드 신호 전달 및 BMP 및 고슴도치 억제를 포함한보다 확장 된 3 단계 처리가 NKX6.1 발현을 증가시키는 것으로 나타 났으며, 이는 Nostro et al.의 연구 결과27과 대조된다. 배아 발달 동안 췌장에서의 PDX1 발현은 FGF 및 레티노이드 신호 전달 및 BMP 및 고슴도치 억제27,29,30에 의해 긍정적으로 조절되는 반면, 본 결과는이 신호 전달 칵테일의 확장이 NKX6.1을 상향 조절한다는 것을 입증했다. 그럼에도 불구하고, 연장 된 3 단계 치료의 효과는 PDX1 및 NKX6.1 발현을 증가시키는 내배엽 세포의 해리 및 재 도금에 의해 도왔다. 또한, 이 방법(P2-D)은 증식 마커 Ki67을 공동 발현하는 증식성 NKX6.1+ 세포의 비율 외에도 hPSC 유래 췌장 전구세포에서 SOX9 발현 세포를 증가시켰습니다.
분화 효율에 영향을 미치는 또 다른 중요한 요소는 해리 된 세포에 대한 신선한 막 매트릭스의 가용성이었습니다. 세포외 매트릭스 성분은 이전에 줄기 세포 운명 사양31,32를 조절하는 것으로 입증되었다. 전반적으로, 췌장 발달에 대한 세포외 기질 성분의 유리한 효과는 33,34,35 로 기록되었으며, 특히 라미닌과 함께 췌장 계통 세포(36)에 대한 전내분비 효과를 갖는 것으로 나타난 막 매트릭스에 대해 기록되었다. 따라서 신선한 막 매트릭스에 내배엽 세포를 재 도금하면 hPSC 유래 췌장 전구 세포에서 NKX6.1 발현이 향상 될 수 있습니다.
분화 세포의 세포 밀도는 또한 유전자 발현을 조절합니다. 여러 연구에서 췌장 발달을 조절하는 데 세포-세포 접촉의 중요성이 입증되었습니다37,38,39. 세포 응집 또는 배아체 형성은 2D 배양물보다 더 높은 췌장 내분비 유전자 발현을 유도하는 것으로 나타났다19. 그러나, 상기 결과는 더 높은 췌장 발현, 특히 NKX6.1이 우리의 최적화된 프로토콜 21을 사용하여 내배엽 밀도의 절반에서2D 단층에서 세포를 배양함으로써 수득될 수 있음을 입증한다. 흥미롭게도, 이 방법은 또한 간 유전자 AFP(알파-태아단백) 및 ALB(알부민)21의 발현 감소에 의해 알 수 있듯이 간세포 운명(hPSC 유래 DE의 대체 운명)을 억제했으며, 이는 물리적 요인이 hPSC의 계통 지정에 역할을 한다는 것을 나타냅니다.
전반적으로, 상기 결과는 분화 세포의 물리적 환경을 조절하는 것이 췌장 유전자 발현을 향상시킬 수 있음을 입증한다21. 구체적으로, hPSC 유래 내배엽의 해리 및 더 긴 FGF 및 레티노이드 신호 전달 및 고슴도치 및 BMP 억제를 갖는 신선한 막 매트릭스 상의 재도금은 hPSC 유래 췌장 전구세포에서 PDX1 및 NKX6.1 동시 발현을 향상시킬 수 있습니다. 그러나 최적화된 프로토콜은 이전에 게시된 프로토콜보다 최소 2일 더 깁니다. 또한, 스테이지 4의 길이는 사용되는 세포주에 기초한 최소 권장, 즉 4일 이상으로 연장될 수 있다. 다수의 재조합 인간 성장 인자는 동일한 작용을 수행하는 그들의 더 저렴한 소분자 화합물에 의해 대체될 수 있는 최적화된 프로토콜에 채용된다. 그럼에도 불구하고, 이 최적화된 프로토콜은 세포 치료 및 질병 모델링을 위해 hPSC로부터 췌장 전구세포의 확장 가능한 생성을 촉진할 수 있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 카타르 국립 연구 기금 (QNRF) (보조금 번호. NPRP10-1221-160041).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL, conical, centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
| 20X TBS Tween 20 | Thermo Scientific | 28360 | |
| 24-well culture plates, flat bottom with lid | Costar | 3524 | |
| 50 mL, conical, centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | |
| 6- well culture plates, multidish | Thermo Scientific | 140685 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 0-7920 | |
| Activin A | R&D | 338-AC | Reconstituted in 4 mM HCl |
| Anti NKX6.1 antibody, mouse monoclonal | DSHB | F55A12-C | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining |
| Anti-PDX1 antibody, guinea pig polyclonal | Abcam | ab47308 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:1000 for immunostaining |
| B27 minus Vit A | ThermoFisher | 12587010 | |
| Bovine serum albumin, heat shock fraction, fatty acid free | Sigma | A7030 | |
| CHIR 99021 | Tocris | 4423 | Reconstituted in DMSO |
| DMEM, high glucose | ThermoFisher | 41965047 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | A-21206 | ||
| DPBS 1X | ThermoFisher | 14190144 | |
| EGF | ThermoFisher | PHG0313 | Reconstituted in 0.1% BSA in PBS |
| FGF10 | R&D | 345-FG | Reconstituted in PBS |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8644 | |
| Hoechst 33258 | Sigma | 23491-45-4 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX73 | |
| KnockOut DMEM/F-12 (1X) | Gibco | 12660-012 | |
| KnockOut SR serum replacement | Gibco | 10828-028 | |
| L-Ascorbic acid (vitamin C) | Sigma | A92902 | Reconstituted in distilled water |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 354230 | Aliquot the thawed stock and freeze at -20C. |
| MCDB131 | ThermoFisher | 10372019 | |
| Mouse anti-SOX17 | ORIGENE | CF500096 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining |
| mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 85850 | Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use |
| Nalgene filter units, 0.2 µm PES | ThermoFisher | 566-0020 | |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | Reconstituted in distilled water |
| NOGGIN | R&D | 6057-NG | Reconstituted in 0.1% BSA in PBS |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | ChemCruz | sc-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140122 | |
| Portable vacuum aspirator | |||
| Rabbit anti-FOXA2 | Cell signaling technology | 3143 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:500 for immunostaining |
| Retinoic Acid | Sigma Aldrich | R2625 | Reconstituted in DMSO |
| Rock inhibitor (Y-27632) | ReproCell | 04-0012-02 | Reconstituted in DMSO |
| Round Bottom Polystyrene FACS Tubes with Caps, STERILE | Stellar Scientific | FSC-9010 | |
| SANT-1 | Sigma Aldrich | S4572 | Reconstituted in DMSO |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| StemFlex | ThermoFisher | A3349401 | Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use |
| TALI Cellular Analysis Slide | Invitrogen | T10794 | |
| Tali image-based cytometer automated cell counter | Invitrogen | T10796 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
| TrypLE 100 mL | ThermoFisher | 12563011 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 |
References
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